CN118460648A - 一种qpi-1002的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种QPI‑1002的制备方法。该QPI‑1002为由互补配对的正义链和反义链组成的双链RNA；该制备方法包括：将正义链底物片段、反义链底物片段和RNA连接酶混合，其中，正义链底物片段能够组成正义链，反义链底物片段能够组成反义链；正义链底物片段和反义链底物片段以碱基互补形成的氢键连接，正义链底物片段和反义链底物片段的头尾碱基之间均未互相连接，形成含有缺刻的双链核苷酸结构；利用RNA连接酶将缺刻两端的碱基以磷酸二酯键连接，形成QPI‑1002。能够解决现有技术中制备QPI‑1002纯度较低的问题，适用于药物生物合成技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及药物生物合成领域，具体而言，涉及一种QPI-1002的制备方法。
背景技术
小干扰RNA(Small interfering RNA, siRNA)是长度为19-25nt的双链RNA，siRNA进入细胞后能够解离成单链，其中正义链通过碱基匹配能够同靶基因的信使RNA(messenger RNA, mRNA)特异性结合，诱发一系列作用，最终降解靶基因的mRNA，阻止mRNA的翻译以达到阻碍靶基因表达效果。近年来siRNA药物的研发获得的广泛的关注，siRNA药物的作用于mRNA，可成药的靶点要显著大于作用位点是蛋白质的传统小分子药物；此外，siRNA药物可以通过变换序列而作用于新的靶点，研发时间相对较短。
QPI-1002是Quark公司开发的siRNA类双链RNA药物，目前处于临床3期实验阶段。QPI-1002可用于肾脏相关的疾病，例如抑制主要肾脏不良事件(Major Adverse KidneyEvents，MAKE)。
目前，制备QPI-1002的方法为化学法，使用固相载体如可控微孔玻璃珠(Controlled Pore Glass, CPG)或聚苯乙烯树脂，通过亚磷酰胺三酯法循环合成，使寡核苷酸链沿3’至5’方向延伸，当合成循环结束后，通过氨解将QPI-1002链从固相载体切除，再经过纯化获得纯品。固相合成法为循环方法，合成的收率随着合成链长的增加而降低，而合成过程产生的杂质，如比目标序列多一个核苷酸的杂质(N+1杂质)或比目标序列少一个核苷酸的杂质(N-1杂质)，也会随着合成链长的增加而增多，此种杂质不易去除，导致纯化过程复杂，效率低下。因此QPI-1002制备的成本高昂，难以放大生产，因此需要开发一种更为高效的QPI-1002合成方法。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种QPI-1002的制备方法，以解决现有技术中制备获得的QPI-1002纯度较低的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种QPI-1002的制备方法，该QPI-1002为由互补配对的正义链和反义链组成的双链RNA；该制备方法包括：将正义链底物片段、反义链底物片段和RNA连接酶混合，其中，正义链底物片段能够组成正义链，反义链底物片段能够组成反义链；正义链底物片段和反义链底物片段以碱基互补形成的氢键连接，正义链底物片段和反义链底物片段的头尾碱基之间均未互相连接，形成含有缺刻的双链核苷酸结构；利用RNA连接酶将缺刻两端的碱基以磷酸二酯键连接，形成QPI-1002；缺刻两端的碱基分别为不同底物片段的5’端和3’端，5’为磷酸根，3’端为羟基；利用RNA连接酶连接缺刻上下游的5’端的磷酸根和3’端的羟基，形成磷酸二酯键，获得QPI-1002；RNA连接酶包括RNA连接酶家族1和\或RNA连接酶家族2的RNA连接酶；优选地，RNA连接酶家族1的RNA连接酶为SEQ ID NO：5所示的RNA连接酶；RNA连接酶家族2的RNA连接酶选自：SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的RNA连接酶中的一种或多种；或与SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5中所示的任一RNA连接酶具有70%以上同一性，且具有催化磷酸二酯键形成活性的酶。
进一步地，正义链的核苷酸序列为具有SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列的多聚核苷酸，反义链的核苷酸序列为具有SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列的多聚核苷酸。
进一步地，正义链底物片段包括2条或更多条，反义链底物片段包括2条或更多条；优选地，正义链底物片段的长度为5-12nt，更优选为6-11nt；优选地，反义链底物片段的长度为2-16nt，更优选为3-14nt。
进一步地，正义链底物片段和反义链底物片段均包括2条，正义链底物片段包括第一正义链底物片段和第二正义链底物片段，反义链底物片段包括第一反义链底物片段和第二反义链底物片段；制备方法包括：S1）将第一正义链底物片段、第二正义链底物片段、第一反义链底物片段、第二反义链底物片段和RNA连接酶混合；S2）在RNA连接酶的催化作用下，第一正义链底物片段和第二正义链底物片段连接形成正义链，催化第一反义链底物片段和第二反义链底物片段连接形成反义链，正义链和反义链通过碱基互补配对形成QPI-1002；优选地，将正义链底物片段和反义链底物片段退火后与RNA连接酶混合，获得QPI-1002；优选地，第一正义链底物片段和第一反义链底物片段退火形成第一双链RNA片段，第二正义链底物片段和第二反义链底物片段退火形成第二双链RNA片段，第一双链RNA片段和第二双链RNA片段中均有≥3nt的碱基互补配对；优选地，第一双链RNA片段和第二双链RNA片段之间能够形成粘性末端，粘性末端的长度≥2nt。
进一步地，S1中），第一正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，第二正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；优选地，第一反义链底物片段的核苷酸序列SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列，第二反义链底物片段的核苷酸序列SEQ ID NO：11序列所示的核苷酸序列。
进一步地，S1中），第一正义链底物片段的核苷酸序列SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列，第二正义链底物片段的核苷酸序列SEQ ID NO：14序列所示的核苷酸序列；优选地，第一反义链底物为SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列，第二反义链底物为SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。
进一步地，S1中），第一正义链底物片段的3’端与第二正义链底物片段的5’端在RNA连接酶的催化下连接，形成正义链；第一反义链底物片段的3’端与第二反义链底物片段的5’端在RNA连接酶的催化下连接，形成反义链；优选地，第一正义链底物片段的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；第二正义链底物片段的5’端为磷酸基团，3’端为羟基基团；优选地，第一反义链底物片段的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；第二反义链底物片段的5’端为磷酸基团，3’端为羟基基团。
进一步地，正义链底物片段和反义链底物片段均包括3条，正义链底物片段包括第一正义链底物片段、第二正义链底物片段和第三正义链底物片段；反义链底物片段包括第一反义链底物片段、第二反义链底物片段和第三反义链底物片段；优选地，制备方法包括：S1）将第一正义链底物片段、第二正义链底物片段、第三正义链底物片段、第一反义链底物片段、第二反义链底物片段、第三反义链底物片段和RNA连接酶混合；S2）在RNA连接酶的催化作用下，第一正义链底物片段和第二正义链底物片段连接形成正义链，催化第一反义链底物片段和第二反义链底物片段连接形成反义链，正义链和反义链通过碱基互补配对形成QPI-1002；优选地，将正义链底物片段和反义链底物片段退火后与RNA连接酶混合，获得QPI-1002；优选地，S1）中，第一正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列；第二正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列；第三正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列；优选地，S1）中，第一反义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列；第二反义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列；第三反义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列。
进一步地，正义链底物片段及反义链底物片段浓度各自独立选自0.1-4.5mM，优选为0.8-1.6mM；优选地，正义链底物片段、反义链底物片段和RNA连接酶混合形成的反应体系中，还包括ATP、Tris-HCl、MgCl2和DTT；优选地，制备方法的反应温度为0℃~60℃，更优选为4℃~37℃；优选地，制备方法的反应时间为0.5h~24h，更优选为12-16h；优选地，制备方法的pH为6~8.5。
应用本发明的技术方案，利用上述制备方法，在RNA连接酶的催化下，正义链底物片段之间连接形成QPI-1002正义链，反义链底物片段之间连接形成QPI-1002反义链，从而实现了利用生物合成的方式制备此种siRNA药物。与化学合成制备QPI-1002的方法相比，本申请的制备方法获得的产物纯度高，产生的杂质少，制备过程简易，且反应条件温和，有机试剂用量低，降低生产成本，便于实现规模放大的工业化生产。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明实施例1的酶催化连接反应示意图。
图2示出了根据本发明实施例1的RNA连接酶Ligase 31、Ligase 25和Ligase 11催化产物的电泳结果图。
图3示出了根据本发明实施例2的RNA连接酶Ligase 25催化产物的HPLC检测结果图。
图4示出了根据本发明实施例2的RNA连接酶Ligase 25催化产物的LC-MS检测结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
术语解释：
N+1杂质：相较于目标合成序列具有单个核苷酸额外连接的核酸杂质。
N-1杂质：相较于目标合成序列具有单个核苷酸缺失的核酸杂质。
如背景技术所提到的，现有技术对于QPI-1002的制备采用化学合成的制备方法进行，不仅过程复杂，成本过高，而且产生的N+1和N-1杂质较多，影响后续对于产物的纯化。在本申请中发明人尝试开发一种QPI-1002的制备方法，利用酶催化合成对QPI-1002进行制备，因而提出了本申请的一系列保护方案。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种QPI-1002的制备方法，该QPI-1002为由互补配对的正义链和反义链组成的双链RNA；该制备方法包括：将正义链底物片段、反义链底物片段和RNA连接酶混合，其中，正义链底物片段能够组成正义链，反义链底物片段能够组成反义链；正义链底物片段和反义链底物片段以碱基互补形成的氢键连接，正义链底物片段和反义链底物片段的头尾碱基之间均未互相连接，形成含有缺刻的双链核苷酸结构；利用RNA连接酶将缺刻两端的碱基以磷酸二酯键连接，形成QPI-1002；缺刻两端的碱基分别为不同底物片段的5’端和3’端，5’为磷酸根，3’端为羟基；利用RNA连接酶连接缺刻上下游的5’端的磷酸根和3’端的羟基，形成磷酸二酯键，获得QPI-1002；RNA连接酶包括RNA连接酶家族1和\或RNA连接酶家族2的RNA连接酶；优选地，RNA连接酶家族1的RNA连接酶为SEQ ID NO：5所示的RNA连接酶；RNA连接酶家族2的RNA连接酶选自：SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的RNA连接酶中的一种或多种；或与SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5中所示的任一RNA连接酶具有70%以上同一性，且具有催化磷酸二酯键形成活性的酶。
在上述的制备方法中，正义链底物片段为能够组成正义链的2条或更多条的核苷酸序列，即正义链底物片段的多条核苷酸序列可拼接组成与正义链序列相同的序列，与正义链的区别在于正义链底物片段之间存在缺刻，未以磷酸二酯键相连接。同理，反义链底物片段及反义链具有上述的特征。利用RNA连接酶将2条或多条正义链底物片段或反义链底物片段之间以磷酸二酯键相连接，获得QPI-1002的正义链及反义链。
在上述的制备方法中，将正义链底物片段、反义链底物片段与RNA连接酶混合，能够制备获得QPI-1002。在此制备方法中，正义链底物片段及反义链底物片段之间能够进行互补配对，形成含有粘性末端的双链结构的核苷酸，该含有粘性末端的双链结构核苷酸继续与其他底物片段结合，形成含有缺刻的双链核苷酸，RNA连接酶可识别此种双链结构的缺刻，以磷酸二酯键对缺刻进行连接，从而制备获得目标产物QPI-1002。
在一种优选的实施例中，正义链的核苷酸序列为具有SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列的多聚核苷酸，反义链的核苷酸序列为具有SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列的多聚核苷酸。
SEQ ID NO：23：
GAmGAmAUmAUmUUmCAmCCmCUmUCmA。
SEQ ID NO：24：
UmGAmAGmGGmUGmAAmAUmAUmUCmUCm。
本申请中，A、C、G或U后的m表述对该核糖核苷酸的2’甲氧基修饰。
在一种优选的实施例中，RNA连接酶包括RNA连接酶家族1和\或RNA连接酶家族2的RNA连接酶；优选地，RNA连接酶家族1的RNA连接酶为SEQ ID NO：5所示的RNA连接酶；RNA连接酶家族2的RNA连接酶选自：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的RNA连接酶中的一种或多种；或与SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5中所示的任一RNA连接酶具有70%以上同一性，包括但不限于75%、80%、85%、90%、95%、99%以上（比如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%以上，甚至99.9%以上）且具有催化磷酸二酯键形成活性的酶。
上述RNA连接酶均能够识别底物片段互补配对形成的、带有缺刻的双链结构，从而实现催化磷酸基团与羟基基团形成磷酸二酯键。
SEQ ID NO：1（Ligase 25，Vibrio phage NT-1）：
MSFVKYTSLENSYRQAFVDKCDMLGVRDWVALEKIHGANFSFIVEFDGGYTVTPAKRTSIIGATATGDYDFYGCTSVVEAHKEKVELVANFLWLNEYINLYEPIIIYGELAGKGIQKEVNYGDKDFWAFDIFLPQREEFVDWDTCVAAFTNAEIKYTKELARGTLDELLRIDPLFKSLHTPAEHEGDNVAEGFVVKQLHSEKRLQSGSRAILKVKNEKFKEKKKKEGKTPTKLVLTPEQEKLHAEFSCYLTENRLKNVLSKLGTVNQKQFGMISGLFVKDAKDEFERDELNEVAIDRDDWNAIRRSLTNIANEILRKNWLNILDGNF。
SEQ ID NO：2（Ligase 26，Escherichia phage AR1）：
MQELFNNLMELCKDSQRKFFYSDDVSASGRTYRIFSYNYASYSDWLLPDALECRGIMFEMDGEKPVRIASRPMEKFFNLNENPFTMNIDLNDVDYILTKEDGSLVSTYLDGDEILFKSKGSIKSEQALMANGILMNINHHQLRDRLKELAEDGFTANFEFVAPTNRIVLAYQEMKIILLNIRENETGEYISYDDIYKDAALRPYLVERYEIDSPKWVEEAKNAENIEGYVAVMKDGSHFKIKSDWYVSLHSTKSSLDNPEKLFKTIIDGASDDLKAMYADDEYSYRKIEAFETTYLKYLDRALFLVLDCHNKHCGKDRKTYAMEAQGVAKGAGMDHLFGIIMSLYQGYDSQEKVMCEIEQNFLKNYKKFIPEGY。
SEQ ID NO：3（Ligase 31，Vibrio phage VH12019）：
MTTQELYNHLMTLTDDAEGKFFFADHISPLGEKLRVFSYHIASYSDWLLPGALEARGIMFQLDEQDKMVRIVSRPMEKFFNLNENPFTMDLDLTTTVQLMDKADGSLISTYLTGENFALKSKTSIFSEQAVAANRYIKLPENRDLWEFCDDLTQAGCTVNMEWCAPNNRIVLEYPEAKLVILNIRDNETGDYVSFDDIPLPALMRVKKWLVDEYDPETAHADDFVEKLRATKGIEGMILRLANGQSVKIKTQWYVDLHSQKDSVNVPKKLVTTILNNNHDDLYALFADDKPTIDRIREFDSHVSKTVSASFHAVSQFYVKNRHMSRKDYAIAGQKTLKPWEFGVAMIAYQNQTVEGVYEALVGAYLKRPELLIPEKYLNEA。
SEQ ID NO：4:（Ligase 41，Vibrio phage VH7D）：
MNVQELYKNLMSLADDAEGKFFFADHLSPLGEKFRVFSYHIASYSDWLLPGALEARGIMFQLDDNDEMIRIVSRPMEKFFNLNENPFTMELDLTTTVQLMDKADGSLISTYLSGENFALKSKTSIFSEQAVAANRYIKKPENRDLWEFCDDCTQAGLTVNMEWCAPNNRIVLEYPEAKLVILNIRDNETGDYVSFDDIPQSALMRVKQWLVDEYDPATAHEPDFVEKLRDTKGIEGMILRLANGQSVKIKTQWYVDLHSQKDSVNVPKKLVTTILNGNHDDLYALFADDKPTIERIREFDSHVTKTLTNSFNAVRQFYARNRHLARKDYAIAGQKVLKPWEFGVAMIAYQKQTVEGVYESLVTAYLKRPELAIPEKYLNGV。
SEQ ID NO：5（Ligase 42，Escherichia phage JN02）：
MEKLYYNLLSLCKSSSDRKFFYSDDVSPIGKKYRIFSYNFASYSDWLLPDALECRGIMFEMDGETPVRIASRPMEKFFNLNENPFTLSINLDDVKYLMTKEDGSLVSTYLDGGTVRFKSKGSIKSDQAVSATSILLDIDHKNLADRLLELCNDGFTANFEYVAPTNKIVLTYPEKRLILLNIRDNNTGEYIEYDDIYLDPVFRKYLVDRFEVPEGDWTSDVKSSTNIEGYVAVMKDGSHFKLKTDWYVALHTTRDSISSPEKLFLAIVNGASDDLKAMYADDEFSFKKVELFEKAYLDFLDRSFYICLDTYDKHKGKDRKTYAIEAQAVCKGAQTPWLFGIIMNLYQGGSKEQMMTALESVFIKNHKNFIPEGY。
SEQ ID NO：6：（Ligase 11，Thermococcus）：
MVSSYFRNLLLKLGLPEERLEVLEGKGALAEDEFEGIRYVRFRDSARNFRRGTVVFETGEAVLGFPHIKRVVQLENGIRRVFKNKPFYVEEKVDGYNVRVVKVKDKILAITRGGFVCPFTTERIEDFVNFDFFKDYPNLVLVGEMAGPESPYLVEGPPYVKEDIEFFLFDIQEKGTGRSLPAEERYRLAEEYGIPQVERFGLYDSSKVGELKELIEWLSEEKREGIVMKSPDMRRIAKYVTPYANINDIKIGSHIFFDLPHGYFMGRIKRLAFYLAENHVRGEEFENYAKALGTALLRPFVESIHEVANGGEVDETFTVRVKNITTAHKMVTHFERLGVKIHIEDIEDLGNGYWRITFKRVYPDATREIRELWNGLAFVD。
SEQ ID NO：7：（Ligase 20，Archaea）：
MVVPLKRIDKIRWEIPKFDKRMRVPGRVYADEVLLEKMKNDRTLEQATNVAMLPGIYKYSIVMPDGHQGYGFPIGGVAAFDVKEGVISPGGIGYDINCGVRLIRTNLTEKEVRPRIKQLVDTLFKNVPSGVGSQGRIKLHWTQIDDVLVDGAKWAVDNGYGWERDLERLEEGGRMEGADPEAVSQRAKQRGAPQLGSLGSGNHFLEVQVVDKIFDPEVAKAYGLFEGQVVVMVHTGSRGLGHQVASDYLRIMERAIRKYRIPWPDRELVSVPFQSEEGQRYFSAMKAAANFAWANRQMITHWVRESFQEVFKQDPEGDLGMDIVYDVAHNIGKVEEHEVDGKRVKVIVHRKGATRAFPPGHEAVPRLYRDVGQPVLIPGSMGTASYILAGTEGAMKETFGSTCHGAGRVLSRKAATRQYRGDRIRQELLNRGIYVRAASMRVVAEEAPGAYKNVDNVVKVVSEAGIAKLVARMRPIGVAKGAAALEH。
SEQ ID NO：8：（Ligase 32，Bacteria）：
MVSLHFKHILLKLGLDKERIEILEMKGGIVEDEFEGLRYLRFKDSAKGLRRGTVVFNESDIILGFPHIKRVVHLRNGVKRIFKSKPFYVEEKVDGYNVRVAKVGEKILALTRGGFVCPFTTERIGDFINEQFFKDHPNLILCGEMAGPESPYLVEGPPYVEEDIQFFLFDIQEKRTGRSIPVEERIKLAEEYGIQSVEIFGLYSYEKIDELYELIERLSKEGREGVVMKSPDMKKIVKYVTPYANVNDIKIGSRIFFDLPHGYFMQRIKRLAFYIAEKRIRREDFDEYAKALGKALLQPFVESIWDVAAGEMIAEIFTVRVKKIETAYKMVSHFERMGLNIHIDDIEELGNGYWKITFKRVYDDATKEIRELWNGHAFVD。
本申请中的同一性（Identity）是指氨基酸序列或核苷酸序列之间的“同一性”，即氨基酸序列或核苷酸序列中的种类相同的氨基酸残基或核苷酸的比率的总计。氨基酸序列或核苷酸序列的同一性可以利用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）、FASTA等比对程序来确定。
70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%以上（比如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%以上，甚至99.9%以上）同一性且具有相同功能的蛋白质，其活性位点、活性口袋、活性机制、蛋白结构等均和上述序列提供的蛋白质大概率相同。
如本文所用，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸（Ala；A）、天冬酰胺（Asn；N）、天冬氨酸（Asp；D）、精氨酸（Arg；R）、半胱氨酸（Cys；C）、谷氨酸（Glu；E）、谷氨酰胺（Gln；Q）、甘氨酸（Gly；G）、组氨酸（His；H）、异亮氨酸（Ile；I）、亮氨酸（Leu；L）、赖氨酸（Lys；K）、蛋氨酸（Met；M）、苯丙氨酸（Phe；F）、脯氨酸（Pro；P），丝氨酸（Ser；S）、苏氨酸（Thr；T）、色氨酸（Trp；W）、酪氨酸（Tyr；Y）和缬氨酸（Val；V）。
取代、替换等规则，一般情况下，哪些氨基酸性质类似，替换后的效果也类似。例如，在上述同源蛋白中，可发生保守的氨基酸替换。“保守的氨基酸替换”包括但不限于：
疏水性氨基酸（Ala、Cys、Gly、Pro、Met、Val、Ile、Leu）被其他疏水性氨基酸取代；
侧链粗大的疏水性氨基酸（Phe、Tyr、Trp）被其他侧链粗大的疏水性氨基酸取代；
侧链带正电的氨基酸（Arg、His、Lys）被其他侧链带正电的氨基酸取代；
侧链有极性不带电的氨基酸（Ser、Thr、Asn、Gln）被其他侧链有极性不带电的氨基酸取代。
本领域技术人员也可以根据现有技术中的“blosum62评分矩阵”等本领域技术人员熟知的氨基酸替换规则对氨基酸进行保守替换。
本申请中只能通过SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5所示的RNA连接酶，或与SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5中所示的任一RNA连接酶具有70%以上同一性的酶催化本申请中底物的磷酸集团与羟基集团形成磷酸二酯键，获得产物QPI-1002。在本申请的相关实验中，发明人通过从大量的酶中进行筛选，获得了能够合成QPI-1002的上述SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5所示的RNA连接酶。而实验中占比极大的阴性结果显示大多数RNA连接酶难以催化QPI-1002的合成，包括但不限于SEQ ID NO：6~SEQ ID NO：8中所示的RNA连接酶，在本申请说明书只以SEQID NO：6~SEQ ID NO：8为例体现该类没有催化QPI-1002合成活性的RNA连接酶。
在一种优选的实施例中，正义链底物片段包括2条或更多条，反义链底物片段包括2条或更多条；优选地，正义链底物片段的长度为5-12nt，更优选为6-11nt；优选地，反义链底物片段的长度为2-16nt，更优选为3-14nt。
在一种优选的实施例中，正义链底物片段和反义链底物片段均包括2条，正义链底物片段包括第一正义链底物片段和第二正义链底物片段，反义链底物片段包括第一反义链底物片段和第二反义链底物片段；制备方法包括：S1）将第一正义链底物片段、第二正义链底物片段、第一反义链底物片段和第二反义链底物片段混合；S2）在RNA连接酶的催化作用下，第一正义链底物片段和第二正义链底物片段连接形成正义链，催化第一反义链底物片段和第二反义链底物片段连接形成反义链，正义链和反义链通过碱基互补配对形成QPI-1002；优选地，将正义链底物片段和反义链底物片段退火后与RNA连接酶混合，获得QPI-1002；优选地，第一正义链底物片段和第一反义链底物片段退火形成第一双链RNA片段，第二正义链底物片段和第二反义链底物片段退火形成第二双链RNA片段，第一双链RNA片段和第二双链RNA片段中均有≥3nt的碱基互补配对；优选地，第一双链RNA片段和第二双链RNA片段之间能够形成粘性末端，粘性末端的长度≥2nt。
在上述制备方法中，可以先将正义链底物片段和反义链底物片段进行混合进行退火，正义链底物片段和反义链底物片段之间能够通过碱基互补配对形成双链RNA结构，在该双链RNA结构中存在不同底物片段之间的缺刻。再将退火后的反应体系与RNA连接酶混合，利用RNA连接酶将缺刻两侧的磷酸基团和羟基基团以磷酸二酯键相连接，修复缺刻，从而获得双链结构完整的目标产物QPI-1002。
在一种优选的实施例中，S1）中，第一正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，第二正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。优选地，第一反义链底物的核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列，第二反义链底物的核苷酸序列为SEQ ID NO：11序列所示的核苷酸序列。
在一种优选的实施例中，S1）中，第一正义链底物的核苷酸序列为SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列，第二正义链底物的核苷酸序列为SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。优选地，第一反义链底物的核苷酸序列为SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列，第二反义链底物的核苷酸序列为SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。
在一种优选的实施例中，S2）中，第一正义链底物片段的3’端与第二正义链底物片段的5’端在RNA连接酶的催化下连接，形成正义链；第一反义链底物片段的3’端与第二反义链底物片段的5’端在RNA连接酶的催化下连接，形成反义链；优选地，第一正义链底物片段的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；第二正义链底物片段的5’端为磷酸基团，3’端为羟基基团；优选地，第一反义链底物片段的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；第二反义链底物片段的5’端为磷酸基团，3’端为羟基基团。
利用上述制备方法和SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：16所示的底物片段，能够制备QPI-1002。但需要说明的是，对于底物片段的选择并非仅限于上述SEQ ID NO：9-12或SEQ ID NO：13-16所示的底物片段，能够组合形成正义链和反义链的底物片段均能够应用于上述制备方法中，上述制备方法适用于QPI-1002的制备但不局限于底物片段连接位置的不同，上述制备对于QPI-1002的正义链序列和反义链序列的连接均具有较好的连接效果。正义链底物片段或反义链底物片段的数量包括但不限于2条、3条、4条乃至更多条。
SEQ ID NO：9：GAmGAmAUmAUmUUmCAmC。
SEQ ID NO：10：CmCUmUCmA。
SEQ ID NO：11：AUmAUmUCmUCm。
SEQ ID NO：12：UmGAmAGmGGmUGmAAm。
SEQ ID NO：13：GAmGAmAUmAUm。
SEQ ID NO：14：UUmCAmCCmCUmUCmA。
SEQ ID NO：15：UmUCmUCm。
SEQ ID NO：16：UmGAmAGmGGmUGmAAmAUmA。
在一种优选的实施例中，正义链底物片段和反义链底物片段均包括3条，正义链底物片段包括第一正义链底物片段、第二正义链底物片段和第三正义链底物片段；反义链底物片段包括第一反义链底物片段、第二反义链底物片段和第三反义链底物片段；优选地，制备方法包括：S1）将第一正义链底物片段、第二正义链底物片段、第三正义链底物片段、第一反义链底物片段、第二反义链底物片段、第三反义链底物片段和RNA连接酶混合；S2）在RNA连接酶的催化作用下，第一正义链底物片段和第二正义链底物片段连接形成正义链，催化第一反义链底物片段和第二反义链底物片段连接形成反义链，正义链和反义链通过碱基互补配对形成QPI-1002；优选地，将正义链底物片段和反义链底物片段退火后与RNA连接酶混合，获得QPI-1002；优选地，S1）中，第一正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列；第二正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列；第三正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列；优选地，S1）中，第一反义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列；第二反义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列；第三反义链底物片段的核苷酸序列为SEQID NO：20所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO：17：GAmGAmAUm。
SEQ ID NO：18：AUmUUmCAmC。
SEQ ID NO：19：CmCUmUCmA。
SEQ ID NO：20：CmUCm。
SEQ ID NO：21：AAmAUmAUmU。
SEQ ID NO：22：UmGAmAGmGGmUGm。
在一种优选的实施例中，正义链底物片段及反义链底物片段浓度各自选自为0.1-4.5mM，优选为0.8-1.6mM；优选地，正义链底物片段、反义链底物片段和RNA连接酶混合形成的反应体系中，还包括ATP、Tris-HCl、MgCl2和DTT；优选地，制备方法的反应温度为0℃~60℃，更优选为4℃~37℃；优选地，制备方法的反应时间为0.5h~24h，更优选为12-16h；优选地，制备方法的pH为6~8.5。
上述正义链底物片段和反义链底物片段的浓度各自选自包括但不限于0.1、0.5、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0或4.5mM；上述制备方法的反应温度包括但不限于10、15、16、20、25、30、35或40℃；上述制备方法的反应时间包括但不限于2、5、10、15、16、20、24、25、30、35、40、45或48h；上述制备方法的pH包括但不限于6、6.5、7、7.5、8或8.5。
下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。
实施例1
基于QPI-1002的序列设计如表1所示的4个单链RNA片段，长度单位为nt。
表1
。
其中，A、C、G或U后的m表示对该核糖核苷酸的2’甲氧基修饰。
底物1的第2、4、6、8、10和12位核糖核苷酸具有2’甲氧基修饰。
底物2的第1、3和5位核糖核苷酸具有2’甲氧基修饰。
底物3的第2、4、6和8位核糖核苷酸具有2’甲氧基修饰。
底物4的第1、3、5、7、9和11位核糖核苷酸具有2’甲氧基修饰。
使用固相合成方法制备上述4个单链RNA片段。
将4个单链RNA片段以等摩尔比例混匀后得到终浓度2.5mM（每种底物均为2.5mM）的底物混合物，退火，获得退火后的RNA片段混合液。将退火后的RNA片段混合液进行酶催化连接反应，反应体系设置为10μL，反应体系中包括反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、MgCl2、二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，分别加RNA连接酶Ligase 25、Ligase 26、Ligase 31、Ligase 41、Ligase 42、Ligase 11、Ligase 20和Ligase 32。将反应体系于16℃反应16h。得到的反应体系经80℃ 5min失活连接酶，经12000rpm离心去除沉淀。酶催化连接反应示意图如图1所示。
将RNA连接酶Ligase 25、Ligase 26、Ligase 31、Ligase 41、Ligase 42 Ligase11、Ligase 20和Ligase 32催化得到的产物进行SDS-PAGE检测。RNA连接酶Ligase31、Ligase25和Ligase11催化得到的产物电泳结果图如图2所示，图2中M泳道代表RNA分子标准（marker），1泳道表示Ligase31的反应体系，2泳道表示Ligase25的反应体系，3泳道表示Ligase 11的反应体系。产率根据Urea-PAGE结果中目标条带的灰度分析结果估算，最终产率结果如表2所示。
对10种RNA连接酶进行活力筛选，发现Ligase25连接效果较好，能够将大部分底物转化为QPI-1002。
制备获得的QPI-1002的正义链为GAmGAmAUmAUmUUmCAmCCmCUmUCmA（SEQ ID NO：23）；反义链为UmGAmAGmGGmUGmAAmAUmAUmUCmUCm（SEQ ID NO：24）。
反应结果如表2所示。
表2
。
备注：
1）反应条件：底物片段100μM，ATP 10eq，MgCl2 100eq，DTT 10eq（1eq=100μM），终浓度为0.2mg/mL酶，2385V、50 mM Tris-HCl pH 7.5，16℃，16 h；
2）N.D.表示未检测到产品生成，++表示25~50%（不包括50%的端点值），+++表示50~75%，++++表示>75%。
通过Urea-PAGE凝胶电泳结果图片的灰度分析得到的产品和底物的灰度数据，此实施例中产率计算公式为：产率=产品灰度数据/(产品灰度数据+底物灰度数据)。
实施例2：
挑选反应活性较好的Ligase 25，使用退火后的底物片段进行酶催化连接反应，反应条件如下：在50μL反应器中依次加入反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、MgCl2、二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)和RNA连接酶，16℃反应16h。
反应结束后80℃加热5min使蛋白失活，离心取上清。送检HPLC和LC-MS检测，其中Ligase 25催化产物的HPLC结果如图3所示，“产率以反应体系样品的HPLC数据中产物峰的粗估占比进行衡量，结果如表3所示。
表3
。
备注：
1）反应条件：底物片段800μM，ATP 4eq，MgCl2 100eq，DTT 10eq（1eq=800μM），终浓度为0.2mg/mL酶，298V、50mM Tris-HCl pH 7.5，16℃，16h；
2）+表示＜50%。
用LC-MS鉴定正义链产品分子量为6089.9，反义链产品分子量为6223.9，正义链产品理论值为6089.96±8，反义链产品理论值为6224.0±8，表明Ligase 25连接生成了QPI-1002，检测结果图如图4所示。
实施例3
使用退火后的底物片段和Ligase 25进行酶催化连接反应，反应条件如下：在10mL反应器中依次加入反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5)、三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，ATP)、MgCl2、二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)和RNA连接酶，16℃反应16h。过夜反应结束后，50℃加热15min灭活蛋白，离心取上清，使用Nano-Q柱纯化，NaCl梯度洗脱，膜包(截留分子量1kDa)脱盐，冻干机内冻干得干粉，计算收率68.73%，纯度(HPLC检测)：95.44%。
实施例4
基于QPI-1002的序列设计如表4所示的4个单链RNA片段，长度单位为nt。
表4
。
其中，A、C、G或U后的m表示对该核糖核苷酸的2’甲氧基修饰。
底物5的第2、4、6和8位核糖核苷酸具有2’甲氧基修饰。
底物6的第2、4、6、8和10位核糖核苷酸具有2’甲氧基修饰。
底物7的第1、3和5位核糖核苷酸具有2’甲氧基修饰。
底物8的第1、3、5、7、9、11和13位核糖核苷酸具有2’甲氧基修饰。
使用固相合成方法制备上述4个单链RNA片段。
制备获得的QPI-1002的正义链为GAmGAmAUmAUmUUmCAmCCmCUmUCmA（SEQ ID NO：23）；反义链为UmGAmAGmGGmUGmAAmAUmAUmUCmUCm（SEQ ID NO：24）。
使用退火后的底物片段和连接酶Ligase 25进行酶催化连接反应，反应条件如下：将反应体系设置为50μL，在反应器中依次加入底物片段800μM，ATP 4eq，MgCl2 12.5eq，DTT1.25eq（1eq=800μM），终浓度为0.2mg/mL的Ligase 25，239V 50mM Tris-HCl pH 7.5，于16℃反应16 h。反应结束后80℃加热5min使蛋白失活，离心取上清。送检HPLC检测，产率以反应体系样品的HPLC数据中产物峰的粗估占比进行衡量。结果显示样品中目标峰占比为72.3%，即产率为+++。
实施例5
基于QPI-1002的序列设计如表5所示的6个单链RNA片段，长度单位为nt。
表5
。
其中，A、C、G或U后的m表示对该核糖核苷酸的2’甲氧基修饰。
底物9的第2、4和6位核糖核苷酸具有2’甲氧基修饰。
底物10的第2、4和6位核糖核苷酸具有2’甲氧基修饰。
底物11的第1、3和5位核糖核苷酸具有2’甲氧基修饰。
底物12的第1和3位核糖核苷酸具有2’甲氧基修饰。
底物13的第2、4和6位核糖核苷酸具有2’甲氧基修饰。
底物14的第1、3、5、7和9位核糖核苷酸具有2’甲氧基修饰。
使用固相合成方法制备上述6个单链RNA片段。
制备获得的QPI-1002的正义链为GAmGAmAUmAUmUUmCAmCCmCUmUCmA（SEQ ID NO：23）；反义链为UmGAmAGmGGmUGmAAmAUmAUmUCmUCm（SEQ ID NO：24）。
使用退火后的底物片段和连接酶Ligase 25进行酶催化连接反应，反应条件如下：将反应体系设置为50μL，在反应器中依次加入底物片段800μM，ATP 4eq，MgCl2 12.5eq，DTT1.25eq（1eq=800μM），终浓度为0.2mg/mL的LigSase 25，239V 50mM Tris-HCl pH 7.5，于16℃反应16 h。反应结束后80℃加热5min使蛋白失活，离心取上清。送检HPLC检测，产率以反应体系样品的HPLC数据中产物峰的粗估占比进行衡量。结果显示样品中目标峰占比为79.6%，即产率为+++。
对比例1
利用固相合成全长QPI-1002产品的平均收率为29.5%，N+1和N-1杂质总占比为1.50%。
利用本发明中的酶连法制备获得的QPI-1002产品收率为66.18%，所用底物的固相合成收率平均值为45.9%，相乘可得整体流程的收率为30.3%，高于固相合成法中获得的产品平均收率，且N+1和N-1杂质总占比为0.38%低于固相合成法合成QPI-1002的过程该种杂质占比。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：在本申请的制备方法中，首先合成4个短底物片段(长度小于19nt)，之后经酶连接合成全长的QPI-1002，从而实现利用生物合成的方式制备此种siRNA药物，由于缩短了合成片段的长度，合成过程产生的N+1和N-1杂质也相应减少；底物片段中的N+1和N-1杂质的连接效率降低，进一步降低了全长产品中的N+1和N-1杂质；此外，底物片段中的N+1和N-1杂质的链长同全长产品差异较大，易于在纯化过程中去除，最终N+1和N-1杂质的含量<0.5%。与化学合成制备法相比，本申请的制备方法获得的产物纯度高，产生的杂质少，制备过程简易，且反应条件温和，有机试剂用量低，降低生产成本，便于实现规模放大的工业化生产。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种QPI-1002的制备方法，其特征在于，所述QPI-1002为由互补配对的正义链和反义链组成的双链RNA；
所述制备方法包括：
将正义链底物片段、反义链底物片段和RNA连接酶混合，其中，所述正义链底物片段能够组成所述正义链，所述反义链底物片段能够组成所述反义链；
所述正义链底物片段和所述反义链底物片段以碱基互补形成的氢键连接，所述正义链底物片段和所述反义链底物片段的头尾碱基之间均未互相连接，形成含有缺刻的双链核苷酸结构；
利用所述RNA连接酶将所述缺刻两端的碱基以磷酸二酯键连接，形成所述QPI-1002；
所述缺刻两端的所述碱基分别为不同底物片段的5’端和3’端，所述5’端为磷酸根，所述3’端为羟基；
利用所述RNA连接酶连接所述缺刻上下游的所述5’端的磷酸根和所述3’端的羟基，形成所述磷酸二酯键，获得所述QPI-1002；
所述RNA连接酶包括RNA连接酶家族1和\或RNA连接酶家族2的RNA连接酶；
所述RNA连接酶家族1的RNA连接酶为SEQ ID NO：5所示的RNA连接酶；
所述RNA连接酶家族2的RNA连接酶选自：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的RNA连接酶中的一种或多种；
或与SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5中所示的任一RNA连接酶具有70%以上同一性，且具有催化所述磷酸二酯键形成活性的酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正义链的核苷酸序列为具有SEQID NO：23所示的核苷酸序列的多聚核苷酸，所述反义链的核苷酸序列为具有SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列的多聚核苷酸。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段包括2条或更多条，反义链底物片段包括2条或更多条；
所述正义链底物片段的长度为5-12nt；
所述反义链底物片段的长度为2-16nt。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段和所述反义链底物片段均包括2条，所述正义链底物片段包括第一正义链底物片段和第二正义链底物片段，所述反义链底物片段包括第一反义链底物片段和第二反义链底物片段；
所述制备方法包括：
S1）将所述第一正义链底物片段、所述第二正义链底物片段、所述第一反义链底物片段、所述第二反义链底物片段和所述RNA连接酶混合；
S2）在所述RNA连接酶的催化作用下，所述第一正义链底物片段和所述第二正义链底物片段连接形成所述正义链，催化所述第一反义链底物片段和所述第二反义链底物片段连接形成所述反义链，所述正义链和所述反义链通过碱基互补配对形成所述QPI-1002；
所述第一正义链底物片段和所述第一反义链底物片段退火形成第一双链RNA片段，所述第二正义链底物片段和所述第二反义链底物片段退火形成第二双链RNA片段，所述第一双链RNA片段和所述第二双链RNA片段中均有≥3nt的碱基互补配对；
所述第一双链RNA片段和所述第二双链RNA片段之间能够形成粘性末端，所述粘性末端的长度≥2nt。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述S1）中，所述第一正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，所述第二正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；
所述第一反义链底物片段的核苷酸序列SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列，所述第二反义链底物片段的核苷酸序列SEQ ID NO：11序列所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述S1中），所述第一正义链底物片段的核苷酸序列SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列，所述第二正义链底物片段的核苷酸序列SEQ ID NO：14序列所示的核苷酸序列；
所述第一反义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列，所述第二反义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述S1）中，所述第一正义链底物片段的3’端与所述第二正义链底物片段的5’端在所述RNA连接酶的催化下连接，形成所述正义链；所述第一反义链底物片段的3’端与所述第二反义链底物片段的5’端在所述RNA连接酶的催化下连接，形成所述反义链。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；所述第二正义链底物片段的5’端为磷酸基团，3’端为羟基基团；
所述第一反义链底物片段的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；所述第二反义链底物片段的5’端为磷酸基团，3’端为羟基基团。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段和所述反义链底物片段均包括3条，
所述正义链底物片段包括第一正义链底物片段、第二正义链底物片段和第三正义链底物片段；
所述反义链底物片段包括第一反义链底物片段、第二反义链底物片段和第三反义链底物片段。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段和所述反义链底物片段均包括3条，所述制备方法包括：S1）将所述第一正义链底物片段、所述第二正义链底物片段、所述第三正义链底物片段、所述第一反义链底物片段、所述第二反义链底物片段、所述第三反义链底物片段和所述RNA连接酶混合；
S2）在所述RNA连接酶的催化作用下，所述第一正义链底物片段和所述第二正义链底物片段连接形成所述正义链，催化所述第一反义链底物片段和所述第二反义链底物片段连接形成所述反义链，所述正义链和所述反义链通过碱基互补配对形成所述QPI-1002。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述S1）中，所述第一正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列；
所述第二正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列；
所述第三正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列；
所述第一反义链底物片段为SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列；
所述第二反义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列；
所述第三反义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列。
12.根据权利要求1-2中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段及所述反义链底物片段浓度各自独立选自0.1-4.5mM；
所述正义链底物片段、所述反义链底物片段和所述RNA连接酶混合形成的反应体系中，还包括ATP、Tris-HCl、MgCl2和DTT。
13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的反应温度为0℃~60℃；
所述制备方法的反应时间为0.5h~24h；
所述制备方法的pH为6~8.5。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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