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CN118460485A - 一种用于合成l-天冬酰胺的天冬酰胺合成酶a突变体及应用 - Google Patents

一种用于合成l-天冬酰胺的天冬酰胺合成酶a突变体及应用 Download PDF

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CN118460485A
CN118460485A CN202410553982.0A CN202410553982A CN118460485A CN 118460485 A CN118460485 A CN 118460485A CN 202410553982 A CN202410553982 A CN 202410553982A CN 118460485 A CN118460485 A CN 118460485A
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宋伟
魏婉清
刘立明
刘佳
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Shandong Kaimis New Material Technology Co ltd
Jiangnan University
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Shandong Kaimis New Material Technology Co ltd
Jiangnan University
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Abstract

本发明公开了一种用于生产L‑天冬酰胺的天冬酰胺合成酶A突变体及应用，属于生物工程技术领域。本发明以L‑天冬氨酸和ATP为原料，利用活性被提高的天冬酰胺合成酶A(EcAsnA)突变体进行L‑天冬酰胺的生物合成，整体催化过程简单高效。利用纯化酶进行氨连接反应，L‑天冬酰胺生产强度达到20.28g/L/h。相较于目前能够催化L‑天冬氨酸生成L‑天冬酰胺的亲本，EcAsnAL109K/K58R具有更高的催化效率，其催化活性提升至2603.64U/mg，是亲本的(497.15U/mg)的4.24倍。本发明为快速合成L‑天冬酰胺提供了新的合成方法，为L‑天冬酰胺工业化生产提供了新思路。

Description

一种用于合成L-天冬酰胺的天冬酰胺合成酶A突变体及应用
技术领域
本发明涉及一种用于生产L-天冬酰胺的天冬酰胺合成酶A突变体及应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
天冬酰胺作为20种常见氨基酸之一，广泛应用于医药、食品等领域。近年来研究表明，由天冬酰胺转化得到的化合物具有很高的药用价值，在消炎、降血压、止血等方面都体现出良好的生物活性，如卡托普利(ACEI)类降血压药物、内吗啡肽-2(EM2)类镇痛药物和消炎药物N-[β-(对取代苯甲酰基)乙基]天冬酰胺等。L-天冬酰胺合成方法主要为化学合成、植物提取和生物合成，其中生物合成具有工艺简单、设备要求低、生产效率高、能耗低、污染小等优点，但仍然存在关键酶活性较低等问题。鉴于L-天冬酰胺的重要性，急需开发高效合成L-天冬酰胺的方法，推动L-Asn的生产及应用。
现有的生物法合成中，以L-天冬氨酸为底物，利用天冬酰胺合成酶A对其侧链羧基进行氨连接反应以合成L-天冬酰胺。天冬酰胺合成酶A是一类以ATP为辅因子，对氨基酸C-O键进行功能化的多功能酶，被认为是氨基酸酰胺化的重要催化剂之一。目前，在L-天冬酰胺的合成中，程池在2015年报道了一种大肠杆菌来源的天冬酰胺合成酶A将L-天冬氨酸与NH4 +进行氨连接反应合成L-天冬酰胺，其中底物投量为0.1-0.2M L-天冬氨酸和0.1-0.2M ATP，37℃反应，其L-天冬酰胺生产强度为15.81g/L/h；马江锋在2016年报道了一种共表达富马酸酶、天冬氨酸酶和天冬酰胺合成酶A的工程菌，能够在天冬氨酸酶的催化下将富马酸转化为L-天冬氨酸，继而在天冬酰胺合成酶A的催化下将L-天冬氨酸转化为L-天冬酰胺，L-天冬酰胺的生产强度为6.93g/L/h；罗玮在2021年报道了一种唾液乳杆菌来源的天冬酰胺合成酶A，能够将L-天冬氨酸转化为L-天冬酰胺，其中L-天冬酰胺生产强度达到1.44g/L/h。虽然催化L-天冬酰胺合成的相关生物酶已被大量报道，但普遍存在酶活及L-天冬酰胺生产强度较低的问题。面对这些问题，期待能够通过蛋白质工程手段对大肠杆菌来源的天冬酰胺合成酶A进行改造，以获得活性提升的天冬酰胺合成酶A，完成L-天冬酰胺的低成本工业化合成。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供用于生产L-天冬酰胺的天冬酰胺合成酶A突变体及应用，目的在于以期廉价的底物L-天冬氨酸和辅因子ATP通过基因工程菌高效合成L-天冬酰胺，解决现有生物法合成中天冬酰胺合成酶A活性较低，导致L-天冬酰胺的产量过低，使其生产强度仍有待进一步提升的技术问题。
本发明提供的第一个技术方案为一种天冬酰胺合成酶A突变体，所述突变体是对天冬酰胺合成酶A亲本的第109位亮氨酸和/或第58位赖氨酸突变，所述天冬酰胺合成酶A(EcAsnA)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在某些实施方式中，编码所述EcAsnA的基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在某些实施方式中，所述突变体是对所述亲本进行了如下(a)-(c)任一项所示的突变：
(a)将第109位的亮氨酸L突变为赖氨酸K；
(b)将第58位的赖氨酸K突变为精氨酸R；
(c)将第109位的亮氨酸L突变为赖氨酸K和将第58位的赖氨酸K突变为精氨酸R。
所述突变体相对于EcAsnA亲本，将其第109位氨基酸发生突变，获得突变体EcAsnAL109K。
所述突变体相对于EcAsnA亲本，将其第58位氨基酸发生突变，获得突变体EcAsnAK58R。
所述突变体相对于EcAsnA亲本，将其第109位氨基酸和第58位氨基酸发生突变，获得突变体EcAsnAL109K/K58R。
在某些实施方式中，所述突变体EcAsnAL109K、EcAsnAL109K/K58R的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6所示。
获得所述EcAsnA突变体的方法包括以下步骤：
(1)在大肠杆菌(Escherichia coli)中天冬酰胺合成酶A (EcAsnA)氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计饱和突变的突变引物，以携带编码EcAsnA基因的载体为模板进行饱和突变；构建含突变体的质粒载体；
(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化EcAsnA。
本发明提供的第二个技术方案为编码第一技术方案所述突变体的基因。
本发明提供的第三个技术方案为携带第二个技术方案所述基因的表达载体。
在某些实施方式中，以pET-28a(+)为表达载体。
本发明提供的第四个技术方案是表达有第一个技术方案所述突变体，或者含有第二个技术方案所述基因，或者转化有第三个技术方案所述表达载体的基因工程菌。
在某些实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为出发菌株。
优选的，以Escherichia coli BL21(DE3)为表达宿主。
在某些实施方式中，将编码EcAsnA的基因连入表达载体pET28a中，成功构建重组载体EcAsnA-pET-28a，转入E.coli BL21(DE3)，获得基因工程菌EcAsnA-pET-28a-BL21(DE3)。
在某些实施方式中，构建携带编码EcAsnAL109K/K58R的基因的表达载体EcAsnAL109K /K58R-pET-28a，将EcAsnAL109K/K58R-pET-28a导入大肠杆菌BL21(DE3)，形成EcAsnAL109K/K58R-pET-28a-BL21(DE3)基因工程菌。
本发明提供的第五个技术方案为一种L-天冬酰胺的制备方法，以L-天冬氨酸和NH4Cl作为底物，利用第一个技术方案所述的突变体或第四个技术方案所述的基因工程菌作为催化剂组成催化体系，催化生成L-天冬酰胺。
在某些实施方式中，催化体系10mL，其中，L-天冬氨酸为200mM，NH4Cl为200mM，ATP200为mM，MgCl2为200mM，所述催化剂的投加量为30μM突变体或20g/L基因工程菌。
在某些实施方式中，所述催化体系的缓冲液为200mM Tris-HCl。
在某些实施方式中，所述催化体系的pH为8.0，催化反应温度为37℃，催化反应时间0.5h。
本发明提供的第六个技术方案为第一个技术方案所述的突变体，或者第二技术方案所述的基因，或者第三个技术方案所述的表达载体，或者第四个技术方案所述的基因工程菌，或者第五个技术方案所述的方法在制备L-天冬酰胺或含L-天冬酰胺产品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明设计了一种以L-天冬氨酸和ATP为原料，利用活性被提高的天冬酰胺合成酶A(EcAsnA)突变体进行L-天冬酰胺的生物合成，整体催化过程简单高效。利用纯化酶进行氨连接反应，在10mL反应体系中，对200mM L-天冬氨酸反应0.5h，L-天冬酰胺生产强度达到20.28g/L/h。相较于目前能够催化L-天冬氨酸生成L-天冬酰胺的EcAsnA，本发明中的EcAsnAL109K/K58R具有更高的催化效率，其催化活性提升至2603.64U/mg，是EcAsnA的(497.15U/mg)的4.24倍。本发明为快速合成L-天冬酰胺提供了新的合成方法，为L-天冬酰胺工业化生产提供了新思路。
附图说明
图1为酶EcAsnA催化合成L-天冬酰胺合成方法。
图2为EcAsnA亲本酶表达情况分析结果；M：Marker，空载：E.coli BL21破碎液上清，AsnA：EcAsnA-BL21破碎液上清。
图3为酶EcAsnA利用辅因子ATP将L-天冬氨酸转化为L-天冬酰胺的LC-MS图，A为L-天冬酰胺标准品，B为EcAsnA反应液。
图4为酶EcAsnA在第109位氨基酸(A)和第109位/第58位氨基酸(B)饱和突变初筛结果。
图5为突变酶EcAsnAL109K，EcAsnAL109K/K58R和EcAsnA在10mL制备规模下催化生产L-天冬酰胺产量图。
图6 109位点的Leu突变成其它氨基酸时的L-天冬酰胺的生产强度。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
基因来源：本发明所涉及到的生物酶EcAsnA基因来源于Escherichia coli，pET-28a(+)质粒购自Novagen(Madison,WI,U.S.A.)，ClonExpress IIOne Step Cloning Kit、Primer Star Max、DpnI等购自TaKaRa(Dalian,China)。EcAsnA突变体均为分子改造所得。
所用宿主为E.coli BL21(DE3)，载体为pET-28a(+)，抗性为卡那抗性。下述实施对亲本基因工程菌株E.coli-EcAsnA-pET-28a进行突变，以筛选高产菌株。
配制LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，在121℃灭菌20min。
配制TB发酵培养基：胰蛋白胨12g/L，安琪酵母粉FM 802 24g/L，甘油4g/L，KH2PO42.31g/L和K2HPO4 12.31g/L。
HPLC法测定L-天冬氨酸和L-天冬酰胺：具体步骤参见文献Anal.Biochem.,1984,136(1):195-201(Ahigh-performance liquid chromatography assay for asparaginesynthetase)。
产物L-天冬酰胺含量测定：反应产物采用高效液相色谱法(HPLC)测定。液相检测条件参见上述HPLC法测定L-天冬氨酸和L-天冬酰胺。
酶学参数测定：设置底物浓度为1、2、4、6、、8、10、12、14、16、18、20mM，与200mM L-天冬氨酸，200mM NH4Cl，200mM MgCl2，200mM ATP混匀后，用氨水将pH调至8.0，加入终浓度为0.1mg/ml的EcAsnA后于37℃反应30min，转速为220rpm，反应结束后用50mM HCl终止反应。经HPLC检测L-天冬酰胺含量，并利用Origin中非线性回归的MichaelisMenten拟合分析酶动力学(Km，Vmax)，kcat＝Vmax/E，E为酶分子的摩尔浓度。
实施例1
一、EcAsnA-pET28a-BL21(DE3)工程菌的构建与表达
提取大肠杆菌(Escherichia coli)基因组并以其为模板，通过引物AsnA-F(ATGGGTCGC GGATCCATGAAAACCGCTTACATTGCCA)和AsnA-R(ACGGAGCTCGAATTCTTACAGCAGAGAAGGGACGCT)将目的蛋白序列AsnA扩增出来(SEQ ID NO.1所示)并连接在pE T-28a(+)载体上。获得重组表达质粒EcAsnA-pET-28a后将其转入E.coli BL21(DE3)中，获得阳性的工程菌命名为EcAsnA-pET-28a-BL21(DE3)。将EcAsnA-pET28a-BL21(DE3)菌株转移至3mLLB液体培养基中，37℃下过夜培养。随后，以2:100的接种量转接于150mL TB液体培养基中，并于220rpm、37℃条件下恒温培养，当OD600值在0.4-0.8之间时，加入终浓度为0.4mM的IPTG，于25℃下诱导培养16h，离心后收集菌体。加入10mL结合液A(25mM Tris-HCl、250mMNaCl、20mM咪唑，用HCl调pH至8.0)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间3.5s，间隔时间2.5s，共计5min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、10000rpm离心30mi n，然后经SDS-PAGE电泳鉴定发现目标酶AsnA成功表达(图2)。接下来，利用重组菌转化生产L-天冬酰胺，反应过程如图1所示。将20g/L重组菌湿菌体与200mM L-天冬氨酸，200mM NH4Cl，200mM MgCl2，200mM ATP混匀，用氨水将pH调至8.0后于37℃反应30min，转速为220rpm。转化反应结束后向其中加入50mM HCl终止反应；12000rp m离心10min后，过0.22μmol的滤膜并用邻苯二甲醛OPA(体积比1:1)对产物进行衍生，经LC-MS检测发现EcAsnA反应生成目标产物L-天冬酰胺(图3)。
二、亲本酶EcAsnA催化活性测定
测定亲本酶EcAsnA的催化活性之前先将EcAsnA经镍柱纯化。首先，在4℃环境下利用恒流泵，向镍离子亲和层析柱里泵入超纯水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用10mL结合液A平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用结合液A冲洗杂蛋白至基线平衡，再用洗脱液B(25mM Tris-HCl、250mM NaCl、500mM咪唑)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，测定酶活。
亲本酶EcAsnA催化活性测定体系包含0.5mg/ml纯酶，200mM L-天冬氨酸，200mMNH4Cl，200mM MgCl2，200mM ATP，反应温度为37℃，pH为8.0，转化时间为30min，转速为220rpm。转化反应结束后向其中加入50mM HCl终止反应；12000rpm离心10min后，过0.22μmol滤膜并经OPA衍生，利用HPLC紫外检测器在338nm下检测产物L-天冬酰胺的生成。酶活定义：1U为每分钟生成1μM产物所消耗的酶量。经计算得知亲本酶EcAsnA的比酶活为497.15U/mg。
三、单突和双突变体的构建
突变体的构建：设计EcAsnA单突变位点和双突变位点的引物，如表1，通过全质粒PC R进行突变体构建。
表1突变引物序列
构建反应PCR扩增体系时使用Prime Star Max体系，分别以含EcAsnA-pET-28a和EcAsnAL109K-pET-28a为模板，采用表1所示引物进行PCR。Prime Star Max体系见表2。PCR反应条件为：①98℃30s；②98℃10s；③55℃30s；④72℃1min 20s；⑤将②～④三个步骤循环34次；⑥72℃10min；⑦12℃保温。
表2Prime Star Max体系表
将上述PCR反应体系在37℃金属浴中孵育30min以消化质粒模板(消化体系为：DpnI quick 0.3μL、上述反应PCR产物8.7μL、10×T Buffer 1μL)，消化结束后即得到消化产物。
转化：将上述消化产物通过热激法导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，转化具体步骤：
(1)将10μL PCR产物导入100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞；
(2)冰浴30min；
(3)42℃水浴热激60s，取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min；
(4)加入600μL无抗性LB培养基混匀，于37℃，220rpm培养1h；
(5)4000rpm离心2min；
(6)弃去上清，利用剩余100-200μL LB培养基将菌体吹吸混匀并涂布至含0.05mg/mL卡那霉素抗性平板上，37℃恒温培养12h左右。
四、突变体菌株EcAsnAL109K-pET-28a-BL21(DE3)及EcAsnAL109K/K58R-pET-28a-BL21(DE3)的筛选
挑取单克隆于含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB液体培养基的96深孔板中，220rpm、37℃恒温培养12h后加入TBA液体培养基，220rpm、37℃培养；培养2～3h后转至25℃诱导16h，然后10,000rpm离心30min。
筛选条件：将含200mM的L-天冬氨酸，200mM NH4Cl，200mM MgCl2，200mM ATP的反应液(pH 8.0)加入96孔板中，于37℃反应30min。反应结束后10,000rpm离心30min，取90μL反应液上清以9:1(体积比)与1g/L儿茶酚紫水溶液混匀显色，结果如图4A和4B所示，结果显示L109位点的42个突变子和L109位点/K58位点的17个组合突变子反应液能使儿茶酚紫变为黄色，随后将这些突变子送至天霖生物科技公司测序。
将测序正确的突变体菌株接种至LB种子培养基，220rpm，37℃培养培养8～12h，分别以2％接种量接种至摇瓶发酵培养基，在220rpm、37℃培养至OD600＝0.6～0.8左右，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，诱导条件为220rpm、25℃诱导16h。将诱导表达后的菌体细胞进行超声破碎、纯化后测定催化活性。催化活性测定体系为：0.5mg/mL纯酶，200mM的L-天冬氨酸，200mM NH4Cl，200mM MgCl2，200mM ATP(pH 8.0)，反应温度为37℃，pH为8.0，转化时间为30min，转速为220rpm。反应结束后取部分转化液10,000rpm离心30min，上清液用0.22μm的微滤膜过滤后使用HPLC法进行测定，结果显示突变体EcAsnAL109K和EcAsnAL109K/K58R的比酶活分别达到2079.84U/mg和2603.64U/mg，较野生型提高了3.18倍和4.24倍；两者的kcat值分别为1.46s-1和1.71s-1，较野生型(kcat＝1.04s-1)提升了40.38％和64.42％；Km值分别为2.18mM和2.74mM，较野生型(Km＝2.65mM)变化不大；kcat/Km值分别为669.13M-1s-1和624.34M-1s-1，较野生型(kcat/Km＝393.74M-1s-1)分别提高了69.94％和36.94％。
实施例2
EcAsnAL109K/K58R规模化反应制备L-天冬酰胺
本实施例使用实施例1中的EcAsnAL109K/K58R-pET-28a-BL21(DE3)在10mL反应体系进行全细胞催化。转化条件为：基因工程菌体添加量为20g/L，200mM的L-天冬氨酸，200mMNH4Cl，200mM MgCl2，200mM ATP(pH 8.0)，反应温度为37℃，pH为8.0，反应时间为30min，转速为220rpm。反应结束后取部分转化液10,000rpm离心30min，上清液用0.22μm的微滤膜过滤后使用HPLC法进行产量测定，结果如图5所示，结果显示突变体EcAsnAL109K/K58R的生产强度达到20.28g/L/h。
实施例3
参照实施例1的方法将109位点的Leu突变成其他氨基酸，并按照实施例2的方法进行全细胞催化，结果如图6所示，当Leu突变为Lys时，L-天冬酰胺的生产强度达到最高17.08g/L/h；其次是突变为Ala、Thr、Cys、Gly、Ser、Gln、Ile、Met、Arg、Trp、Tyr，生产强度分别为16.01g/L/h、15.98g/L/h、15.97g/L/h、15.95g/L/h、15.95g/L/h、15.21g/L/h、15.19g/L/h、15.03g/L/h、14.00g/L/h、13.88g/L/h、13.65g/L/h；当Leu突变为Val时，L-天冬酰胺生产强度为10.49g/L/h。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种天冬酰胺合成酶A突变体，其特征在于，所述突变体是对天冬酰胺合成酶A亲本的第109位亮氨酸和/或第58位赖氨酸突变，所述亲本的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是对所述亲本进行了如下(a)-(c)任一项所示的突变：
(a)将第109位的亮氨酸L突变为赖氨酸K；
(b)将第58位的赖氨酸K突变为精氨酸R；
(c)将第109位的亮氨酸L突变为赖氨酸K和将第58位的赖氨酸K突变为精氨酸R。
3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，以pET-28a(+)为表达载体。
6.表达有权利要求1或2所述突变体，或者含有权利要求3所述基因，或者转化有权利要求4或5所述表达载体的基因工程菌。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大肠杆菌为出发菌株。
8.一种L-天冬酰胺的制备方法，其特征在于，以L-天冬氨酸和NH4Cl作为底物，利用权利要求1或2所述的突变体作为催化剂组成催化体系，催化生成L-天冬酰胺。
9.一种L-天冬酰胺的制备方法，其特征在于，以L-天冬氨酸和NH4Cl作为底物，利用权利要求6或7所述的基因工程菌作为催化剂组成催化体系，催化生成L-天冬酰胺。
10.权利要求1或2所述的突变体，或者权利要求3所述的基因，或者有权利要求4或5的表达载体，或者权利要求6或7所述的基因工程菌，或者权利要求8或9所述的方法在制备L-天冬酰胺或含L-天冬酰胺产品中的应用。
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