CN118453522A - 一种重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂及其制备方法 - Google Patents
一种重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂及制备方法。所述冻干制剂按冻干前液体的质量体积百分比计，包括重组新型冠状病毒、冻干保护剂5.0～24.5％(w/v)、pH调节剂和溶媒，其中，所述重组新型冠状病毒的病毒滴度范围为5.5～9.0LgEID50/ml；所述冻干制剂的pH值为5.6‑7.5。本发明所述的重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂无防腐剂、白色块状，在较长时间内能维持重组新型冠状病毒的物理和化学稳定性。
Description
技术领域
本发明属于冠状病毒疫苗技术领域，特别涉及重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂及其制备方法。
背景技术
目前针对疫苗的研发管线主要分5大类：减毒活疫苗、灭活病毒疫苗，DNA疫苗、RNA疫苗和蛋白疫苗。目前我国处于临床领先状态的是腺病毒介导的DNA疫苗和灭活病毒疫苗。
细菌，病毒等引起的感染发生在胃肠道、呼吸道及生殖道等粘膜表面。疫苗注射免疫虽然产生较强的系统免疫反应，但对粘膜感染无保护作用。为有效预防粘膜感染，疫苗须经粘膜途径刺激免疫系统才有效，因此该重组新型冠状病毒减毒活疫苗预开发为鼻黏膜给药途径的疫苗。结合该病毒自身特性，将其剂型定为冻干剂型。
发明内容
减毒疫苗在生产、运输、储备和使用过程中会经历各种破坏条件，如高温、光照和冻融等。为了确保药品的安全及稳定，必须能够保持药品结构的完整性。经鼻粘膜给药的减毒疫苗需要有一定的粘度，才能保证其在鼻腔粘膜保留一定的时间使病毒载体在复制的同时，也表达RBD蛋白，从而提高免疫保护效果的作用。衡量减毒疫苗效力的检测项目为病毒滴度。血凝试验的结果以出现++稀释度的倒数为判定终点，也就是一个血凝单位。它表明此浓度的病毒能引起等量的红细胞发生凝集，此稀释度的倒数为红细胞凝集滴度，简称血凝滴度，其可预测对人的保护作用。
有鉴于此，本发明旨在通过粘度、病毒滴度及血凝滴度研究不同条件下样品的稳定性，筛选出一种重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂，以保证重组新型冠状病毒减毒活疫苗顺利通过鼻粘膜，并解决重组新型冠状病毒减毒活疫苗稳定性差的问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂，所述冻干制剂按冻干前液体的质量体积百分比计，包括重组新型冠状病毒、冻干保护剂5.0～24.5％(w/v)、pH调节剂和溶媒，其中，所述重组新型冠状病毒的病毒滴度范围为5.5～9.0LgEID50/ml，优选6.4～8.2LgEID50/ml，更优选6.8～7.5LgEID50/ml；所述冻干制剂的pH值为5.6-7.5。
作为优选，所述冻干制剂的pH值为6.0～7.5；进一步的，所述冻干制剂的pH为6.4～7.2，例如6.4、6.5、6.8、7.0、7.2等。
进一步的，所述pH调剂不与重组冠状病毒本身发生作用，能提供稳定的环境，使制剂的pH值始终维持在6.0～7.5。
更进一步的，所述pH调节剂可为柠檬酸钠-柠檬酸缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液、醋酸钠-醋酸缓冲溶液中的任意一种；优选的，所述pH调节剂为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，保持制剂pH值为6.4～7.2。
进一步的，所述冻干保护剂为人血白蛋白、谷氨酸钠、精氨酸、甘氨酸、甘露醇、山梨醇、蔗糖、尿素及壳聚糖中的至少一种或多种的组合。所述冻干保护剂的各组分浓度为0％～8.5％。
更进一步的，所述冻干保护剂包括人血白蛋白、谷氨酸钠、精氨酸、甘氨酸、山梨醇、甘露醇、蔗糖、尿素及壳聚糖，各组分浓度(g/100ml)分别为：
pH5.6～7.4
再进一步的，所述冻干保护剂包括人血白蛋白、谷氨酸钠、精氨酸、甘氨酸、山梨醇、甘露醇、蔗糖、尿素，各组分浓度分别为：
进一步的经过冻干工艺优化，所述稳定剂组合为人血白蛋白、谷氨酸钠、精氨酸、甘氨酸、山梨醇、蔗糖、尿素，各组分浓度分别为：
进一步的，所述溶媒选自下述至少一种：注射用水、纯化水。
在本发明的一个实施方式中，上述冻干制剂按冻干前液体的质量体积百分比(g/100ml)计，包括重组新型冠状病毒、人血清白蛋白1.0％、蔗糖7.5％、谷氨酸钠0.1％、精氨酸0.5％、甘氨酸2.0％、甘露醇3.0％、尿素0.3％，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液补足100％；其中，所述重组新型冠状病毒的病毒滴度为7.4LgEID50/ml，所述冻干制剂的pH值为7.0。
在本发明的一个实施方式中，上述冻干制剂按冻干前液体的质量体积百分比(g/100ml)计，包括重组新型冠状病毒、人血清白蛋白1.0％、蔗糖7.5％、谷氨酸钠0.1％、精氨酸0.5％、山梨醇3.0％、甘氨酸2.0％、尿素0.3％，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液补足100％；其中，所述重组新型冠状病毒的病毒滴度为6.3LgEID50/ml，所述冻干制剂的pH值为7.0。
在本发明的一个实施方式中，上述冻干制剂按冻干前液体的质量体积百分比(g/100ml)计，包括重组新型冠状病毒、人血清白蛋白1.0％、蔗糖5％、谷氨酸钠0.1％、精氨酸0.5％、山梨醇3.0％、甘氨酸2.0％、尿素0.3％，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液补足100％；其中，所述重组新型冠状病毒的病毒滴度为6.0LgEID50/ml，所述冻干制剂的pH值为7.0。
本发明所述的缓冲溶液不含任何对鼻粘膜有刺激性的防腐剂。因此，上述重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂可通过鼻黏膜给药；所述鼻黏膜给药进一步可为滴鼻给药或雾化吸入给药。
所述重组冠状病毒减毒疫苗冻干制剂的剂型可为滴鼻剂、喷雾剂。
所述重组新型冠状病毒是将流感病毒的NS1基因敲除并插入新型冠状病毒的表面蛋白(S)的受体结合区的编码基因得到的重组病毒；
优选的，所述流感病毒为甲型流感病毒；
优选的，所述新型冠状病毒的表面蛋白(S)的受体结合区的编码基因插入NS1基因敲除区域；
更优选的，所述重组新型冠状病毒为在甲型流感病毒CA4-DelNS1的NS1基因敲除区域插入新型冠状病毒(2019-nCoV)表面蛋白(S)的受体结合区(Receptor BindingDomain，RBD)编码基因得到的重组病毒。
本发明还提供了上述重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂的制备方法。
本发明所提供的重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂的制备方法，包括下述步骤：
1)按比例称取处方量的冻干保护剂、pH调节剂和溶媒；
2)在配置容器中加入溶媒、pH调节剂使pH值至制剂预设值，作为溶液A；
3)取部分溶液A并加入所述冻干保护剂，搅拌溶解，作为溶液B；
4)使用超滤法将重组新型冠状病毒样品超滤换液至溶液A中，作为溶液C；将所述溶液A、B、C混合，经0.22μm滤膜过滤后，灌装；将灌装后的样品进行冷冻干燥。
上述方法步骤3)中，所述搅拌的时间为15-30min。
上述方法步骤4)中，所述超滤法是使用100KD超滤管，将重组新型冠状病毒样品超滤换液至部分溶液A中。
上述方法步骤4)中，所述冷冻干燥的工艺条件见下表：
表1冻干工艺设计表
根据本发明工艺优化的结果，灌装时，将样品分装至2ml西林瓶中，分装规格优选0.4ml/瓶和0.5ml/瓶。
本发明还提供了一种用于鼻黏膜给药的重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂的使用方法。
该冻干制剂使用时加入适量溶解液溶解，加入任意一款鼻腔喷雾装置中使用即可，也可加入任意一款鼻腔冲洗装置或滴鼻器中使用。
进一步的，该制剂使用时所用的溶解液可以是注射用水、纯化水中的任意一种。
本发明还提供一种预防冠状病毒的方法，其包括对受试者施用(特别是通过鼻黏膜给药)有效量的本发明上述疫苗的步骤。
上述鼻黏膜给药进一步为滴鼻给药或雾化吸入给药。
本发明所述的鼻粘膜给药的重组新型冠状病毒减毒活疫苗制剂组分是有相互协同作用的：人血白蛋白属于非专一性的运输蛋白，能与体内许多难溶性的小分子有机物和无机离子可逆地结合形成易溶性的复合物，成为这些物质在血液循环中的运输形式。同时人血白蛋白对球蛋白起到一种胶体保护的稳定作用，且白蛋白具有黏性、胶质性，可用于喷鼻制剂的研究，且人血白蛋白是很好的冻干赋形剂；精氨酸能够改变鼻黏膜的电位和阻抗，使上皮细胞之间的紧密连接暂时疏松，增加细胞间的通透性，促进抗原的吸收；谷氨酸钠和甘氨酸可作为氢键供体或受体，能够与蛋白质形成多个氢键使蛋白质更加稳定；醇类(甘露醇、山梨醇)和糖类(蔗糖)不仅能与蛋白形成氢键增加蛋白稳定性，同时能增加药物粘度，并作为药物渗透压调节剂、冻干保护剂；重组新型冠状病毒联合使用，既增加了病毒抗原在鼻腔中的停留时间，又增加了抗原的免疫原性，从而显著的增加了疫苗的有效性，还减少了疫苗对鼻腔粘膜的刺激性。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为实施例1中25℃稳定性实验病毒滴度结果对比图，每个处方组中从左至右分别代表T0、1W、2W、4W；
图2为实施例1中25℃稳定性实验血凝滴度结果对比图，每个处方组中从左至右分别代表T0、1W、2W、4W、2M；
图3为实施例1中动物体内的免疫原性评价实验ELISA抗体效价结果图；
图4为实施例2中25℃稳定性实验病毒滴度结果对比图；
图5为实施例2中37℃稳定性实验病毒滴度结果对比图；
图6为实施例2中冻干工艺优化实验结果对比图。
图7为实施例3中第2冻干工艺优化实验结果对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
下述实施例中使用的重组新型冠状病毒是由重组新型冠状病毒(CA4-DelNS1-2019-nCoV-RBD)毒株接种SPF鸡胚，经培养、收获病毒液、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心、超滤脱糖后获得。
下述实施例中使用的的重组新型冠状病毒(CA4-DelNS1-2019-nCoV-RBD)是在甲型流感病毒CA4-DelNS1的NS1基因敲除区域插入新型冠状病毒(2019-nCoV)表面蛋白(S)的受体结合区(Receptor Binding Domain，RBD)编码基因得到的重组病毒。
其中，甲型流感病毒CA4-DelNS1是香港大学的流感减毒活疫苗CA4-DelNS1中的毒株。
实施例1、液体制剂配方筛选
表2配方设计表
注：表2中％指g/100ml，溶剂是注射用水或纯化水都可
使用100KD超滤管，将重组新型冠状病毒样品分别超滤换液至磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中。根据表1配制样品，将配制好的样品分别分装至西林瓶中，并进行25℃稳定性实验和动物体内免疫原性评价实验。
表3 25℃稳定性实验结果汇总表
注：血凝滴度：采用直接直接血凝法检测；
蛋白质含量：采用酶联免疫法检测；
病毒滴度：采用鸡胚半数感染剂量法(EID50)检测。
动物体内的免疫原性评价研究：
上述14个配制好的减毒活疫苗，每个疫苗分高低两个剂量，即高剂量为原倍组、低剂量为两倍稀释组，并设制剂对照组(仅F1、F4、F8和F13组制剂，无病毒)和空白对照组(0.9％氯化钠溶液)。各试验组动物(使用Balb/c小鼠，每组8只)分别经鼻腔免疫，40μl/只，0天免疫；各空白对照组动物按同法滴鼻等量无菌0.9％氯化钠溶液，第10天各组动物摘眼球取血，离心分离血清，以间接ELISA法和血凝抑制试验(HI)分别测定血清中IgG抗体效价和HI效价，采用T检验比较各组血清效价之间的差异性，并通过比较，确定初步的制剂处方。
动物体内的免疫原性评价研究结果表明：
4个制剂对照组(F1、F4、F8和F13组)和空白对照组免疫血清ELISA抗体效价均为阴性，14个疫苗原倍组(从F1-F14)免疫小鼠血清ELISA抗体效价几何平均值(GMT)分别为：3044、5120、3620、5120、3620、3044、8611、10240、7896、4305、3620、3320、3320和1660，两倍稀释组(从F1-F14)免疫小鼠血清ELISA抗体效价几何平均值(GMT)分别为：2826、3948、3948、4305、4305、4695、10240、9390、9390、3320、2560、3044、2348和2153。14个制剂组(高剂量和低剂量)小鼠免疫血清ELISA抗体阳转率均为100％。经T检验分析，除F11和F13组外，其他组高、低剂量免疫血清ELISA抗体之间均无显著性差异(P>0.05)；14个制剂中，F7、F8和F9组整体抗体水平最高，三组中两两之间无显著性差异(P>0.05)，且三组均显著高于其他11个制剂组。
4个制剂对照组(F1、F4、F8和F13组)和空白对照组免疫血清HI效价均为阴性，14个疫苗原倍组免疫小鼠血清HI效价几何平均值(GMT)分别为：28、44、44、57、40、40、40、57、34、34、57、34、44和48，两倍稀释组免疫小鼠血清HI效价几何平均值(GMT)分别为：31、44、44、37、37、31、34、44、48、40、44、44、40和31。14个制剂组(高剂量和低剂量)小鼠免疫血清HI抗体阳转率均为100％。经T检验分析，除F4和F14组外，其他组高、低剂量免疫血清ELISA抗体之间均无显著性差异(P>0.05)；14个制剂中，两两之间均无显著性差异(P>0.05)。
综合考虑动物体内的免疫原性评价实验结果、25℃稳定性实验结果得出样品F7和F8为较优的制剂处方。
实施例2、制剂配方优化实验
表4配方设计表
使用100KD超滤管，将重组新型冠状病毒样品超滤换液至磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中。根据表3配制样品，将配制好的样品分别分装至西林瓶中，并进行25℃、37℃稳定性实验和冻干工艺优化实验。
表5 25℃稳定性实验结果汇总表
表6 37℃稳定性实验结果汇总表
在进行冷冻干燥工艺优化实验时，对冻干前灌装液体样品的体积进行探索(分别为：0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml)，其冻干工艺在公司冻干工艺平台基础上进行优化，具体平台冻干工艺见表7，冻干结果图见图6。
由25℃和37℃稳定性实验结果显示，样品F18和F19病毒滴度无明显差异，且由冻干工艺优化实验筛选出的冻干外观较好的样品为F19(装量为0.4ml和0.5ml)。
表7制剂配方优化实验冻干工艺设计表
实施例3、第2轮冻干工艺优化实验
表8第2轮冻干工艺优化实验实验设计
使用100KD超滤管，将重组新型冠状病毒样品超滤换液至磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中。根据表6的制剂配方配制样品，将配制好的样品分装至2ml西林瓶中，分装规格分别为0.4ml/瓶和0.5ml/瓶，并进行冷冻干燥，具体冻干工艺见表9，得到的冻干样品图见图7。
由冻干样品结果图可知，体积为0.5ml的样品冻干结果较好。
表9第2轮冻干工艺优化实验冻干工艺表
Claims (10)
1.一种重组新型冠状病毒减毒疫苗冻干制剂，所述冻干制剂按冻干前液体的质量体积百分比计，包括重组新型冠状病毒、冻干保护剂5.0～24.5％(w/v)、pH调节剂和溶媒；
其中，所述冻干保护剂选自人血白蛋白、谷氨酸钠、精氨酸、甘氨酸、甘露醇、山梨醇、蔗糖、尿素及壳聚糖中的至少一种或多种的组合；所述保护剂中的各组分浓度均为0％～8.5％；
所述重组新型冠状病毒的病毒滴度范围为5.5～9.0LgEID50/ml；所述冻干制剂的pH值为5.6-7.5。
2.根据权利要求1所述的重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂，其特征在于：所述重组新型冠状病毒的病毒滴度范围为6.4～8.2LgEID50/ml，优选6.8～7.5
LgEID50/ml。
3.根据权利要求1或2所述的重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂，其特征在于：所述冻干制剂的pH值为6.0～7.5；优选pH值为6.4～7.2。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂，其特征在于：所述pH调节剂为柠檬酸钠-柠檬酸缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液、醋酸钠-醋酸缓冲溶液中的任意一种；优选的，所述pH调节剂为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，保持制剂pH值为6.4～7.2。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂，其特征在于：所述冻干保护剂包括人血白蛋白、谷氨酸钠、精氨酸、甘氨酸、山梨醇、甘露醇、蔗糖、尿素及壳聚糖，各组分含量按冻干前液体的质量体积百分比计分别为：
优选的，所述冻干保护剂包括人血白蛋白、谷氨酸钠、精氨酸、甘氨酸、山梨醇、甘露醇、蔗糖、尿素，各组分含量按冻干前液体的质量体积百分比计分别为：
更优选的，所述冻干保护剂组合为人血白蛋白、谷氨酸钠、精氨酸、甘氨酸、山梨醇、蔗糖、尿素，各组分含量按冻干前液体的质量体积百分比计分别为：
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组冠状病毒减毒疫苗冻干制剂，其特征在于：所述溶媒选自下述至少一种：注射用水、纯化水。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂，其特征在于：所述重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂通过黏膜给药，优选通过鼻粘膜给药；所述鼻黏膜给药进一步为滴鼻给药或雾化吸入给药；
所述重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂的剂型选自下述任一种：滴鼻剂、气雾剂、喷雾剂。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂，其特征在于：所述重组新型冠状病毒是将流感病毒的NS1基因敲除并插入新型冠状病毒的表面蛋白(S)的受体结合区的编码基因得到的重组病毒；
优选的，所述流感病毒为甲型流感病毒；
优选的，所述新型冠状病毒的表面蛋白(S)的受体结合区的编码基因插入NS1基因敲除区域；
更优选的，所述重组新型冠状病毒为在甲型流感病毒CA4-DelNS1的NS1基因敲除区域插入新型冠状病毒(2019-nCoV)表面蛋白(S)的受体结合区(Receptor Binding Domain，RBD)编码基因得到的重组病毒。
9.权利要求1-8中任一项所述的重组新型冠状病毒减毒活疫苗冻干制剂的制备方法，包括下述步骤：
1)按比例称取所述冻干保护剂、pH调节剂和溶媒；
2)在配置容器中加入溶媒、pH调节剂使pH值至冻干制剂预设值，作为溶液A；
3)取部分溶液A并加入所述保护剂，搅拌溶解，作为溶液B；
4)使用超滤法将重组新型冠状病毒样品超滤换液至部分溶液A中，作为溶液C；将所述溶液A、B、C混合，经0.22μm滤膜过滤后，灌装；将灌装后的样品进行冷冻干燥。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤3)中，所述搅拌的时间为15-30min；
所述步骤4)中，所述超滤法是使用100KD超滤管，将重组新型冠状病毒样品超滤换液至部分溶液A中；
优选的，所述步骤4)中，所述冷冻干燥的工艺条件见下表：
所述灌装时，将样品分装至2ml西林瓶中，分装规格优选0.4ml/瓶和0.5ml/瓶。
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