CN118434839A - 提升芯片探针数量的dna文库序列及其应用 - Google Patents

Abstract

一种提升芯片探针数量的DNA文库序列及其应用。所述DNA文库序列包含两个以上位置信息标记序列和三个以上固定序列，其中所述位置信息标记序列和固定序列间隔设置。利用所述的DNA文库序列能够提升时空组学所用芯片的探针数量，进而提高转录本基因捕获数；具有很高的应用前景。

Description

提升芯片探针数量的DNA文库序列及其应用 技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种提升芯片探针数量的DNA文库序列及其应用。

背景技术

时空组学通过自主研发的空间阵列芯片与基因组学相结合，将空间信息和分子信息相对应，结合临床的解剖学和影像学知识积累，形成基因组学和临床医学之间的桥梁，为精准医学领域开辟新的突破方向。时空组学所使用的捕获芯片主要利用自主研发的国产第二代高通量测序平台测序技术及开放式特征，构建序列特异性的文库，经过滚环扩增(RCA)形成DNA纳米球(DNB)后装载到测序芯片上，通过杂交寡核苷酸链对DNB进行测序和延伸，并对DNB进行消化，最终每个DNB所在位置将得到完整的、有唯一位置信息标记、可捕获转录本的探针序列。

目前制作时空组学捕获芯片所用的文库在生成DNB后，每个拷贝只对一段位置信息标记进行测序，理论上最终一个拷贝只能生成一根探针，在拷贝数较为一定的情况下探针的数量难以提升，而探针数量则会对最终捕获的转录本基因数产生影响，探针数量的提升会相应促进基因数的提升，因此有必要寻找提升捕获芯片探针数量的方法。

发明内容

针对在现有文库制作捕获芯片难以提升探针数量的问题，本发明提供了一种新的文库构建方法，通过设计不同文库，使其在生成DNB后每个拷贝带有两段以上位置信息标记，理论上每个拷贝最终能生成两根以上探针，从而提升捕获芯片的探针数量。

以上技术方案使使用该文库制作出来的DNB最终每个拷贝生成多个探针序列，相比于原有文库每个拷贝只生成一个探针序列，该方法具有提升探针数量、提高转录本基因捕获数等优点。

本发明通过增加文库中的位置信息标记数目，在装载完芯片后DNB测序时对每一段位置信息标记序获取相应信息，完成后对DNB进行消化，随后以每段经过测序的位置信息标记为基础生成探针，最终每个DNB拷贝可以得到多个完整的、有唯一位置信息标记、可捕获转录本的探针序列，而目前所用的位置信息标记文库，每个DNB拷贝只能生成一个探针序列。

本发明主要通过以下技术方案解决上述技术问题。

本发明提供一种提升芯片探针数量的DNA文库序列，其包含两个以上位置信息标记序列和三个以上固定序列，其中所述位置信息标记序列和固定序列间隔设置。

当位置信息标记序列的个数为两个时，DNA文库序列所述从5’到3’的方向依次包含：第一固定序列、第一位置信息标记序列、第二固定序列、第二位置信息标记序列以及第三固定序列。

所述位置信息标记序列个数可为3个、4个或者5个，甚至更多。

任选地，所述第三固定序列之后连接第三位置信息标记序列、第四固定序列；以及任选地直至第n位置信息标记序列和第n+1固定序列；所述n为大于3的整数。

所述位置信息标记序列，是由随机碱基(NNNNNN…)构成，其中每个N各自独立地为A、T、C或者G。每个随机序列各不相同。所述的随机序列长度可以是1个碱基至成千上万个碱基，可以根据位置信息标记序列的数量选择，并且优选5个碱基至50个碱基之间。

所述固定序列较佳地包括用于位置信息标记序列解码所需的测序引物以及将位置信息与后续单细胞转录组的cDNA连接在一起的序列，可以按照实验目的自由合成。所述的文库序列可以是单链DNA也可以是双链DNA。

在本发明一个较佳的实施方案中，所述DNA文库序列的第一个固定序列和最后一个固定序列分别连接扩增位点以用于进行分子扩增。DNA文库可以在装载至固体表面前进行分子扩增，也可以在固体表面上进行扩增，也可以在装载前后都进行分子扩增。所述的扩增方法可以是桥式PCR扩增，滚环扩增(RCA)，多重链置换扩增(MDA)及乳液PCR扩增。

在本发明另一个较佳的实施方案中，所述DNA文库序列与核酸分子连接，所述核酸分子包含能够捕获样品中的核酸的捕获序列。

本发明还提供一种试剂盒，其包含：

(1)如上所述的DNA文库序列；

(2)用于进行扩增的反应体系。

本发明还提供一种制备具有提升的探针数量的芯片的方法，所述方法包括：

(1)合成如上所述的DNA文库序列；

(2)对所述DNA文库序列进行扩增；

(3)通过测序对所述位置信息标记序列进行解码；

(4)添加捕获序列。

较佳地，步骤(3)中所述测序为连接法测序或合成法测序。

较佳地，所述扩增为桥式PCR扩增、滚环扩增、多重链置换扩增或者乳液PCR扩增。

本发明还提供一种通过如上所述的方法制备得到的具有提升的探针数量的芯片。

本发明还提供一种如上所述的DNA文库序列、如上所述试剂盒或如上所述的芯片在检测样品中核酸的空间信息的方法中的用途。

本发明中，获得探针序列的方法可为本领域常规方法，例如可通过如下流程(图1)获得：

(1)合成含有组织定位区的DNA文库序列。

(2)位置信息标记序列的扩增。将合成的具有位置信息的DNA文库装载至固体表面，每个DNA分子可以标记固体表面的位置信息。

(3)通过测序对位置信息进行解码。根据(1)所述文库的固定序列，设计测序引物，通过测序对空间定位的随机碱基序列解码，用DNA序列信息标记芯片上的位置信息。所述的测序方法，可以是连接法测序，也可以是合成法测序。

(4)添加捕获序列。为捕获细胞内的RNA信息，在每个含有位置信息序列的DNA分子上通过连接或聚合的方法连接或合成具有捕获细胞RNA分子的序列。捕获序列中包含用于RNA分子数定量的唯一分子标识符(UMI)。

本发明的积极进步效果：

借助本发明提供的包含多段位置信息标记序列的DNA文库以及使用其制备具有提升的探针数量的芯片的方法，能够提升时空组学所用芯片的探针数量，进而提高转录本基因捕获数。

附图说明

图1示出了使用本发明的DNA文库制备具有提升的探针数量的芯片的流程图。

图2示出了本发明的芯片的探针信号检测结果。

图3示出了分别使用本发明的包含多段位置信息标记序列的DNA文库和现有技术包含一段位置信息标记序列的DNA文库制备的芯片的探针信号检测值的对比图。

具体实施方式

实施例1

1.设计并合成含有多段分子标签的DNA文库序列，碱基序列如下所示。 委托华大六合进行序列合成。

5’GAACGACATGGCGAGAT(第一固定序列)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(第一位置信息标记序列，N表示任意碱基，例如C、G、A或T)GCCATGCCTCTCAGTACGTCAGCAGACCTATGCTGATAAGGTCTT(第二固定序列)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(第二位置信息标记序列)GCCATGCCTCTCAGTACGTCAGCAGCCTTGGCTCACA(第三固定序列)3’

2.文库原位扩增，DNA纳米球(DNB)制备：配制下面的反应体系40μl，投入80fmol含有位置序列信息的DNA文库

将上述反应体积放置于PCR仪反应，反应条件如下：95℃3min，40℃3min；反应结束后，放于冰上，加入40μl DNBSEQ测序试剂盒中DNB制备所需的混合酶I，2μl混合酶II，及1μl ATP(母液100mM，Thermo Fisher)，0.1μl T4 ligase(BGI自产)，混匀后，将上述反应体系至于PCR仪30℃，反应20min，形成DNB。将所述的DNB按照BGISEQ500SE50试剂盒所述的方法将DNB装载至BGISEQ500测序芯片上。

3.位置信息标记序列的测序解码。按照BGISEQ500PE50测序试剂盒说明书进行测序，SE设置读长25bp，PE设置读长25bp，并把BGISEQ500PE50测序试剂盒中的MDA试剂替换成甲酰胺。测序形成的fq文件储存待用。

4.MDA扩增。测序完成后，在测序芯片内泵入BGISEQ500PE50试剂 盒中的切除试剂，57℃孵育5min，随后杂交序列ATGCCTCTCAGTACGTCAG，接着加入PE50测序试剂盒中的MDA试剂，37℃孵育30min后，5×SSC清洗芯片。

5.偶联芯片表面修饰NHS-N3(Thermo Fisher)，孵育30min后，泵入DBCO修饰的序列CTGCTGACGTACTGAGAGGCATGGC，常温过夜孵育。

6.聚合35bp碱基，在BGISEQ 500平台上按照BGISEQ500PE50测序试剂盒说明书进行聚合反应，SE设置读长35bp，将拍照选项勾除。

7.消化DNB，配制如下S1核酸内切酶(Thermo Fisher)体系200μl，泵入测序芯片内，室温孵育1h，随后高温变形去除残留片段。

成分	体积(μl)
S1	1
5×反应缓冲液	40
无核酸酶水(NucleaseFree water)	159

8.杂交六合合成的序列BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNNNACGACATGGCGAGAT，BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNNNTGCTGATAAGGTCTT，随后加入BGISEQ500PE50试剂盒中的MDA试剂，30℃孵育15min。

9.探针检测，高温变性使探针变成单链结构，泵入cy5修饰的序列AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，室温孵育10min，随后在BGISEQ500上进行拍照检测(图2)。本发明通过染料标记探针互补序列，与探针杂交后通过荧光信号表示探针的相对数量。本发明使用ImageJ软件读取照片的亮度，然后换算成平均值作为探针信号检测值。使用前述同样的方法对现有技术包含一段位置信息标记序列的DNA文库制备的芯片进行检测。结果显示：在现有技术使用一段位置信息标记的情况下，探针信号为10500。而通过多段位置信息标记的改进，相同检测条件下，探针信号提 高到了21200，表明探针数量提高了近100％(图3)。即两段位置信息标记都生成探针。通过增加位置信息标记数量的方法，提高了探针的产量。在实验条件下，位置信息标记段数提高了一倍，探针数量也提高了一倍，符合设计预期。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。

Claims (10)

1. 一种提升芯片探针数量的DNA文库序列，其包含两个以上位置信息标记序列和三个以上固定序列，其中所述位置信息标记序列和固定序列间隔设置。
2. 如权利要求1所述的DNA文库序列，其特征在于，所述DNA文库序列从5’到3’的方向依次包含：第一固定序列、第一位置信息标记序列、第二固定序列、第二位置信息标记序列以及第三固定序列；

   任选地，所述第三固定序列之后连接第三位置信息序列、第四固定序列；以及任选地直至第n位置信息标记序列和第n+1固定序列；所述n为大于3的整数。
3. 如权利要求2所述的DNA文库序列，其特征在于，所述位置信息标记序列由至少1个N组成，每个N各自独立地为A、T、C或者G；所述位置信息标记序列优选含有5个以上N，更优选含有5～50个N。
4. 如权利要求1所述的DNA文库序列，其特征在于，所述DNA文库序列的第一个固定序列和最后一个固定序列分别连接扩增位点。
5. 如权利要求1所述的DNA文库序列，其特征在于，所述DNA文库序列与核酸分子连接，所述核酸分子包含能够捕获样品中的核酸的捕获序列。
6. 如权利要求1～5任一项所述的DNA文库序列，其特征在于，所述固定序列包括用于位置信息标记序列解码所需的测序引物以及将位置信息与后续单细胞转录组的cDNA连接在一起的序列。
7. 一种试剂盒，其包含：

   (1)如权利要求1～6任一项所述的DNA文库序列；

   (2)用于进行扩增的反应体系。
8. 一种制备具有提升的探针数量的芯片的方法，所述方法包括：

   (1)合成权利要求1～6任一项所述的DNA文库序列；

   (2)对所述DNA文库序列进行扩增；所述扩增优选为桥式PCR扩增、滚环扩增、多重链置换扩增或者乳液PCR扩增；

   (3)通过测序对所述位置信息标记序列进行解码；所述测序优选为连接法测序或合成法测序；

   (4)添加捕获序列。
9. 一种通过如权利要求8所述的方法制备得到的具有提升的探针数量的芯片。
10. 如权利要求1～6任一项所述的DNA文库序列、权利要求7所述的试剂盒或权利要求9所述的芯片在检测样品中核酸的空间信息的方法中的用途。