CN118434764A

CN118434764A - 抗c3抗体及其抗原结合片段及其用于治疗眼疾病的用途

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Publication number: CN118434764A
Application number: CN202280084174.3A
Authority: CN
Inventors: L·博拉斯; P·古普塔; S·霍埃尔; S·荣米歇尔; C·莱斯纳; S·雷因德尔; P·R·里歇尔; F·施埃菲勒; A·索比拉杰
Original assignee: Cdr Biotechnology Co ltd; Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Cdr Biotechnology Co ltd; Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2022-12-21
Publication date: 2024-08-02
Also published as: EP4453028A1; US20230257455A1; JP2024546183A; AR128065A1; CR20240265A; IL313655A; CA3239286A1; DOP2024000117A; PE20250390A1; WO2023118312A1; CL2024001615A1; AU2022420788A1; CO2024007361A2; KR20240117157A; TW202342515A

Abstract

本发明涉及靶向补体C3的抗体及其片段。更具体而言，公开了抗C3抗体以及用于治疗各种疾病或病症的方法。

Description

抗C3抗体及其抗原结合片段及其用于治疗眼疾病的用途

技术领域

本发明大体上关于靶向补体C3的抗体及其片段。更具体而言，公开了抗C3抗体及其抗原结合片段以及用于治疗各种疾病或病症的方法。亦公开了包含抗C3抗体的药物组合物。

背景技术

年龄相关性黄斑变性(AMD)通常分为两大类，干性AMD及湿性AMD。干性AMD(也称为非渗出性AMD)的特征在于黄斑区域中存在疣(黄色沉积物)。湿性AMD(也称为渗出性AMD或新生血管性AMD)的特征在于自黄斑下方的脉络膜生长异常血管。此过程也称为脉络膜新生血管且新的血管可使体液(诸如血液)渗漏至视网膜中及视网膜周围。

地理萎缩(GA)也称为萎缩性AMD或晚期干性AMD，为AMD的一种晚期形式，其特征在于黄斑中的视网膜色素上皮及感光体损失。一旦GA涉及中央窝，则发生不可逆的视力损失。患有早期阶段GA的患者通常甚至在视力受影响之前就会经历视觉功能缺陷。

尚未完全知晓地理萎缩的潜在病理生理学；然而，认为补体活性失调为一种促成因素。已显示与对照物相比，GA患者的玻璃体样品、布鲁赫膜(Bruch's membrane)及脉络膜的其他部分中的若干补体活化产物(包括C3a、C5a、C5b-9及补体因子H(CFH))的含量升高。此外，已报导在GA中，补体抑制剂(如CD59，一种膜攻击复合物(MAC)形成的膜结合抑制剂)及膜辅因子蛋白质(MCP，一种对补体因子I(CFI)具有辅因子活性的膜结合补体调节剂)的含量降低。

GA治疗中的一个主要挑战为所观测到的在较深视网膜层中发生的补体活性失调。目前，还没有具有可接受的功效及患者接受度及依从性的针对GA的合适的治疗方法。

因此，对于有效治疗眼或眼部疾病(诸如地理萎缩)并恢复或预防患有此类疾病的患者的视力损失的新的及改进的治疗方法仍然存在未满足的需求。

发明内容

人类先天系统由补体途径构成。补体途径用于抵御化脓性细菌感染，桥接先天免疫及适应性免疫；以及处理免疫复合物及发炎损伤的产物。补体为一个由超过30种蛋白质构成的系统，参与血浆及细胞表面的级联反应。补体系统及其补体组分参与各种免疫过程。举例而言，补体C5b-9复合物，也称为末端复合物或膜攻击复合物(MAC)，通过诱导膜渗透性损伤在细胞死亡中发挥重要作用。

存在三种已知的补体活化途径：经典途径、凝集素途径及替代途径。所有三种途径均导致C3转化酶对C3的切割，以及随后C5转化酶对C5的切割，释放出C3a、C3b、C5a及C5b。

补体C3为由13个不同域构成的大型蛋白质且分子尺寸为185千道尔顿(kilodalton)。在补体活化期间，C3经历蛋白水解切割及不同位点处的结构修饰。C3衍生的片段发挥不同效应功能且形成转化酶，所述转化酶有助于三种补体途径的放大环路。为避免疑义，且除非另有说明，否则本文所用的C3是指UniProt P01024的人类补体组分3及编码该蛋白质的核酸序列。人类补体C3的序列描述于SEQ ID NO:47中，且可在UniProt P01024下在线获得。

C3b衍生自原生C3，且为切割C3形成的两个元素中较大的一个。

经典途径及凝集素途径C3转化酶C4bC2a使全长C3切割成C3b及过敏毒素(anaphylatoxin)C3a。替代途径亦产生C3b及C3a，但利用替代途径C3转化酶C3bBb。此外，可在补体途径中产生其他C3降解产物。补体因子I(CFI)为能够将C3b永久性不活化成iC3b的血浆丝氨酸蛋白酶。接着，iC3b由CFI切割成其他片段(C3dg及C3c)。另一种C3蛋白水解产物C3d结合补体受体2(CR2)且可在B细胞的细胞周期控制中起重要作用。除C3衍生的蛋白质产物以外，补体途径包括(但不限于)C1、C2、C4、C4b、C4a C5、C5b、C5a、C6、C7、C8、C9、C1q、C1r、C1s、因子B、因子D、因子P、因子H、因子I、CD46(MCP)、CD55(DAF)、CD59(MAC-IP)、CR1(CD35)、CR2(CD21)、CR3、CR4、C3aR、C5aR1、C5aR2、CRIg、C4BPα链、C4BPβ链、纤维胶凝蛋白(ficolin)-1、甘露糖结合凝集素(MBL)、MBL相关丝氨酸蛋白酶-1(MASP-1)及MBL相关丝氨酸蛋白酶-2(MASP-2)。补体途径及各种补体途径组分进一步详细描述于Noris等人,SeminNephrol.2013；33(6):479-492中。

最近的研究表明，补体组分C3及C5为AMD患者中隐结的主要成分。所述组分的存在以及膜攻击复合物(MAC)C5b-9及其他急性期反应蛋白在隐结上方的RPE细胞中的存在被推测参与了可以触发补体活化及MAC形成的过程。

已经表明，在患有GA的患者中，脉络膜及视网膜中补体系统的增加及不受控制的活化导致脉络膜毛细血管的破坏、RPE细胞及感光体的损伤及损失。发明人假设并说明了视网膜中C3的中和会阻断替代补体途径的放大环路，从而减少细胞毒性膜攻击复合物的产生及促发炎补体组分(C3a、C3b、iC3b、C5a)的产生，改善GA患者的临床结果。

然而，治疗眼或眼部疾病特别具有挑战性，因为由于多种障碍，包括但不限于血液-视网膜障壁，诸如RPE，治疗剂向眼睛的递送受到限制。穿透RPE并进入眼睛脉络膜的能力将增强药物的治疗潜力。

为了解决此临床情况，发明人开发了能够穿透RPE及眼睛脉络膜区域的布鲁赫膜的新抗体及其片段，从而靶向脉络膜区域的补体C3。本发明的抗体及其片段显示增强的特征以改善患有眼或眼部疾病的患者的临床结果。

在一个方面，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其包含可变重链(VH)及可变轻链(VL)，

-其中该VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、选自由SEQ ID NO:2及15组成的组的CDR-H2序列、SEQ ID NO:3的CDR-H3序列；及

-其中该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5及18组成的组的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列。

在一个实施方案中，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其包含：

-重链可变区，其包含与SEQ ID NO:20、22或24的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列；及

-轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:21、23或25的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列。

在另一实施方案中，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其包含：

-轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:21、23或25的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列；

其中：

-该VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、选自由SEQ ID NO:2及15组成的组的CDR-H2序列、SEQ ID NO:3的CDR-H3序列；及

-该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5及18组成的组的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列。

-重链可变区，其包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列；及

-轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列；

其中：

-该VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、SEQ ID NO:2的CDR-H2序列及SEQ ID NO:3的CDR-H3序列；及

-该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:5的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列。

-重链可变区，其包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列；及

-轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列；

其中：

-该VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、SEQ ID NO:15的CDR-H2序列及SEQ ID NO:3的CDR-H3序列；及该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:5的CDR-L2序列及SEQID NO:6的CDR-L3序列。

-重链可变区，其包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列；及

-轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列；

其中：

-该VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、SEQ ID NO:15的CDR-H2序列及SEQ ID NO:3的CDR-H3序列；及该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:18的CDR-L2序列及SEQID NO:6的CDR-L3序列。

在一个实施方案中，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其包含：包含SEQ IDNO:20、22或24的氨基酸序列的重链可变区；及包含SEQ ID NO:21、23或25的氨基酸序列的轻链可变区。

a.可变重链及可变轻链，其分别包含SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21的氨基酸序列；

b.可变重链及可变轻链，其分别包含SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:23的氨基酸序列；或

c.可变重链及可变轻链，其分别包含SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25的氨基酸序列。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段为选自由以下组成的组：单链可变片段(scFv)、Fab片段、Fab'片段、Fv片段、双功能抗体、小抗体模拟物。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段为单链可变片段(scFv)，其包含以下或由以下组成：由多肽接头连接的可变重链及可变轻链。scFv自N端至C端可包含以下或由以下组成：可变轻链、接头及可变重链。scFv自N端至C端可包含以下或由以下组成：可变重链、接头及可变轻链。接头可包含选自SEQ ID NO:43-46及56-65，优选SEQID NO:46的多肽。

在一替代实施方案中，抗C3抗体或其抗原结合片段为选自由以下组成的组：单域抗体，诸如sdAb、sdFv、纳米抗体、V-Nar及VHH。在此特定实施方案中，该抗C3抗体或其抗原结合片段包含可变重链。在一个实施方案中，该可变重链包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、选自由SEQ ID NO:2及15组成的组的CDR-H2序列、SEQ ID NO:3的CDR-H3序列。在另一实施方案中，该可变重链包含SEQ ID NO:20、22或24的氨基酸序列。

在一个实施方案中，该抗原结合片段为单链可变片段(scFv)，更优选人源化scFv。

在另一实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段为单链可变片段，其包含与选自由SEQ ID NO:26、27、28、29、30及31组成的组的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致性的多肽。

在另一实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段为单链可变片段，其包含一个选自由SEQ ID NO:26、27、28、29、30及31组成的组的序列。

在另一实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段为单链可变片段，其由以下组成：一个选自由SEQ ID NO:26、27、28、29、30及31组成的组的序列。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段能够抑制补体活化途径，包括经典途径(CP)、凝集素途径(LP)及替代途径(AP)。在某些实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段能够大致等效地抑制CP、LP及AP补体途径的活性。例如但不限于，抗C3抗体或其抗原结合片段能够将CP途径的活性抑制至少80％，能够将LP的活性抑制至少80％并且能够将AP的活性抑制至少80％。在某些实施方案中，CP、LP及AP补体途径的活性抑制为至少80％、至少85％、至少约90％或至少约95％。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段能够结合补体C3及C3b。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段能够阻止C3转化酶的形成。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段能够穿透布鲁赫膜。

在一特定实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段与人类C3结合的KD<50nM，优选KD<15nM，优选KD<10nM，优选KD<7nM，优选KD<1nM，优选KD<0.5nM，优选KD<0.2nM，优选KD<0.15nM，优选KD<0.10nM，优选KD<0.05nM，优选KD<0.04nM，更优选K_D<0.03nM。

在另一实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段与人类C3b结合的K_D<50nM，优选K_D<15nM，优选K_D<10nM，优选K_D<7nM，优选K_D<1nM，优选K_D<0.5nM，优选K_D<0.2nM，优选K_D<0.15nM，优选K_D<0.10nM，更优选K_D<0.05nM。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段对C3及C3b具有大致相等的结合亲和力。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段对C3a、iC3b、C4、C4b、C5和/或C5b的结合亲和力为约10-4M或更低(亦即，更弱)。

在另一实施方案中，相较于对C3及C3b的结合亲和力，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段对C3a、iC3b、C4、C4b、C5和/或C5b的结合亲和力更弱。

在一特定实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段对C3a、iC3b、C4、C4b、C5和/或C5b不具有结合亲和力。如本文中所使用，“不具有结合亲和力”是指在本领域已知的一种或多种结合亲和力分析法(诸如(但不限于)ELISA分析法)中，相对于背景不具有可检测的结合亲和力。

在某些实施方案中，本发明的抗体能够以阻止C3转化酶形成的方式结合补体C3。在一特定实施方案中，本发明的抗体抑制C3转化酶的活性。在一特定实施方案中，本发明的抗体能够抑制C3转化酶放大环路。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段能够抑制脉络膜C3活性。

在某些实施方案中，预期本发明的抗C3抗体由于下文所叙述的性质与其他疗法相比在治疗GA或其他眼或眼部疾病方面具有更好的功效及安全性。

在一优选实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段能够结合补体C3上的抗原决定基，其中此类结合阻止C3转化酶的形成。

在一个实施方案中，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其结合SEQ ID NO:47中所示的氨基酸区域内的至少一个氨基酸残基。在一优选实施方案中，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其结合如SEQ ID NO:48中所示的氨基酸区域。

在一个方面，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其结合如SEQ ID NO:47中所示的人类补体C3的氨基酸366至氨基酸478的残基内的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其结合如SEQ IDNO:47中所示的人类补体C3的选自由残基366、392-396、413-421、425、427、442、453及478组成的组的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其结合如SEQ IDNO:47中所示的人类补体C3的氨基酸残基366、392-396、413-421、425、427、442、453及478中的所有残基。

在一个方面，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其用作药物。

在一个实施方案中，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其用于治疗或预防视网膜或眼睛疾病。优选地，该视网膜或眼睛疾病为补体C3介导的疾病或病症。更优选地，该疾病是指症状或疾病的发作、发展或持续需要C3参与的任何病症。

在另一实施方案中，本发明涉及一种用于治疗一种或多种视网膜或眼睛疾病的方法，该方法包含根据有需要的患者施用药学上有效量的抗体或抗原结合片段。

在一个方面，本发明提供该抗C3抗体或该其抗原结合片段用于制造供治疗或预防眼或眼部疾病用的药物的用途。

在一个方面，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其用于治疗或预防选自由以下组成的组的疾病：视网膜病变、增生性视网膜病变(PR)，诸如早产儿视网膜病变、缺血性视网膜病变；糖尿病性视网膜病变(DR)，包括增生性糖尿病性视网膜病变(PDR)及非增生性糖尿病性视网膜病变；糖尿病性黄斑水肿(DME)、糖尿病性黄斑缺血(DMI)；年龄相关的黄斑部变性(AMD)，包括干性AMD及湿性AMD；地理萎缩(GA)、色素性视网膜炎、遗传性视网膜营养不良、近视性变性、网膜静脉阻塞、网膜动脉阻塞、眼内炎、眼色素层炎、囊样黄斑水肿、继发于任何视网膜疾病的脉络膜新生血管膜、视神经病变、青光眼、视网膜脱落、中毒性视网膜病变、放射性视网膜病变、外伤性视网膜病变、药物诱发的视网膜血管病变、视网膜新生血管形成、息肉状脉络膜血管病变、视网膜血管炎、视网膜微动脉瘤、晶状体后纤维组织增生、脉络膜视网膜炎、福斯氏营养不良(Fuch'sdystrophy)、黄斑毛细血管扩张、尤塞氏综合征(usher syndrome)、阵发性夜间血红素尿症(PNH)及斯特格病(Stargardt disease)。

在另一实施方案中，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其用于治疗或预防选自由以下组成的组的疾病：年龄相关的黄斑部变性、地理萎缩、新生血管性青光眼及糖尿病性视网膜病变。在又一优选实施方案中，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其用于治疗或预防地理萎缩。

在一个方面，本发明的抗体抑制补体经典途径(CP)、凝集素途径(LP)及替代途径(AP)的活性。因此，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其用于通过抑制补体经典途径(CP)、凝集素途径(LP)及替代途径(AP)的活性来治疗眼或眼部疾病的方法。本发明亦提供了一种如上所述的抗原结合蛋白或其片段，其用于通过抑制定位于脉络膜的补体C3的活性来治疗补体C3介导的疾病或病症的方法。

在一个实施方案中，本发明提供一种使用根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段诊断与生物样品中的补体C3相关的病症的方法。

在一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含抗C3抗体或其抗原结合片段及药学上可接受的载体。

在一个实施方案中，本发明提供一种抗C3抗体或其抗原结合片段或一种包含抗C3抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中该抗体或其抗原结合片段通过非经肠途径、静脉内途径、玻璃体内(IVT)途径或皮下给药途径，优选通过玻璃体内途径施用。

在一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含编码根据本发明的抗体或抗原结合片段的一种或多种聚核苷酸及药学上可接受的载体。

在一个实施方案中，本发明提供编码根据本发明的抗体或抗原结合片段的一种或多种经分离聚核苷酸。

在一个方面，本发明提供一种或多种经分离聚核苷酸，其包含：

-编码SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24中所示的重链可变区的序列，和/或

-编码SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25中所示的轻链可变区的序列。

在一个方面，本发明提供一种经分离聚核苷酸，其包含编码SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31中所示的scFv的序列。

在一个实施方案中，本发明提供一种表达载体，其包含一种或多种经分离聚核苷酸，该一种或多种经分离聚核苷酸包含编码SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24中所示的重链可变区的序列，和/或编码SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25中所示的轻链可变区的序列。

在一个实施方案中，本发明提供一种表达载体，其包含经分离聚核苷酸，该经分离聚核苷酸包含编码SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30或SEQ ID NO:31中所示的scFv的序列。

在一个实施方案中，本发明提供一种病毒载体，其包含一种或多种经分离聚核苷酸，该一种或多种经分离聚核苷酸包含编码SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24中所示的重链可变区的序列，和/或编码SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25中所示的轻链可变区的序列。

在一个实施方案中，本发明提供一种病毒载体，其包含经分离聚核苷酸，该经分离聚核苷酸包含编码SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30或SEQ ID NO:31中所示的scFv的序列。

在一个实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含表达载体或一种或多种经分离聚核苷酸，该表达载体或一种或多种经分离聚核苷酸包含编码SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22或SEQ ID NO:24中所示的重链可变区的序列，和/或编码SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25中所示的轻链可变区的序列。

在一个实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含表达载体或经分离聚核苷酸，该表达载体或经分离聚核苷酸包含编码SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31中所示的scFv的序列。

在一个实施方案中，本发明提供一种用于产生抗C3抗体或其抗原结合片段的方法，其包含获得包含表达载体或一种或多种经分离聚核苷酸的宿主细胞，该表达载体或一种或多种经分离聚核苷酸包含编码SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24中所示的重链可变区的序列，和/或编码SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25中所示的轻链可变区的序列；以及培养该宿主细胞。

在一个实施方案中，本发明提供一种用于产生抗C3抗体或其抗原结合片段的方法，其包含获得包含表达载体或经分离聚核苷酸的宿主细胞，该表达载体或经分离聚核苷酸包含编码SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31中所示的scFv的序列。

在一个实施方案中，用于产生抗C3抗体或其抗原结合片段的方法进一步包含回收及纯化抗C3抗体或其抗原结合片段。

附图说明

图1：在食蟹猕猴中的等摩尔IVT注射后，scFv可更好地渗透视网膜。图1A描绘了scFv玻璃体内注射(40nmol scFv，溴珠单抗(brolucizumab)，1mg)的视网膜暴露水平。数据改编自溴珠单抗BLA。图1B描绘了Fab玻璃体内注射(40nmol Fab，兰尼单抗(ranibizumab)，2mg)的视网膜暴露水平。数据改编自：Invest Ophthalmol Vis Sci.2005年2月；46(2):726-33。

图2：此图说明了克隆系I与人类补体C3的结合。图2A显示了SEQ ID NO:55，其为如SEQ ID NO:47中所示的C3序列的一部分，其中抗原决定基残基以粗体显示并加下划线。图2B显示了C3c:克隆系I复合物的EM结构，其中分别地，C3c结构以灰色描绘，而scFv结构以黑带表示。最终的EM图显示为半透明的表面，等高线水平为0.214。

图3：此图显示了克隆系I及比较化合物A2经由猪布鲁赫膜的体外扩散。在尤斯室(Ussing chamber)中经72小时测量扩散，且经由布鲁赫膜扩散的化合物量作为在扩散质室中测量的化合物与总化合物量(样品及扩散质室)的比较给出。总化合物量设为100％。

图4：此图显示比较化合物A3及比较化合物A2经由猪布鲁赫膜的体外扩散。在尤斯室中经72小时测量扩散，且经由布鲁赫膜扩散的化合物量作为在扩散质室中测量的化合物与总化合物量(样品及扩散质室)的比较给出。总化合物量设为100％。

具体实施方式

定义

抗体或免疫球蛋白的通用结构为本领域技术人员所熟知，这些分子为通常约150,000道尔顿的由两个相同轻(L)链及两个相同重(H)链构成的杂四聚糖蛋白。各轻链通过一个二硫键共价连接至重链以形成杂二聚体，且杂三聚分子经由杂二聚体的两个相同重链之间的共价二硫键形成。尽管所述轻链及重链通过一个二硫键连接在一起，但两个重链之间的二硫键数目因免疫球蛋白同型而不同。各条重链及轻链亦具有有规律地间隔的链内二硫桥键。各条重链在氨基末端均具有可变域(V_H＝可变重链)，随后为三个或四个恒定域(C_H1、C_H2、C_H3及C_H4)，以及C_H1及C_H2之间的铰链区。各条轻链具有两个域，亦即氨基末端可变域(V_L＝可变轻链)及羧基末端恒定域(C_L)。V_L域与V_H域非共价缔合，然而C_L域通常经由二硫键共价连接至C_H1域。特定氨基酸残基被认为可在轻链及重链可变域之间形成界面(Chothia等人,1985,J.Mol.Biol.186:651-663)。

可变域内的某些域在不同抗体之间差异很大，亦即“高变”。这些高变域含有直接参与各特定抗体与其特异性抗原决定子的结合及特异性的残基。轻链可变域与重链可变域中的高变性集中于三个称为互补决定区(CDR)或高变环(HVL)的区段中。CDR通过Kabat等人,1991,于:Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.中的序列比较定义，而HVL根据可变域的三维结构在结构上定义，如由Chothia及Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917所描述。

给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用额外的命名法进一步确定，诸如Honegger A及Pluckthun A,“Yet another numbering scheme for immunoglobulinvariable domains:an automatic modeling and analysis tool”,J Mol Biol,2001年6月8日；309(3):657-70中描述的AHo编号方案，或如Lefranc M P等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variabledomains and Igsuperfamily V-like domains”,Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77中描述的“IMGT”编号方案。

重链及轻链中的各者内的三个CDR通过构架区(FR)隔开，所述构架区含有往往不太可变的序列。自重链及轻链可变域的氨基末端至羧基末端，FR及CDR排列顺序为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。FR的主要β片状构型使各条链中的CDR彼此非常接近，亦使来自另一条链的CDR非常接近。产生的构象有助于抗原结合位点(参见Kabat等人,1991,NIH出版号91-3242,第I卷,第647-669页)，尽管并非所有CDR残基均必然直接参与抗原结合。

FR残基及Ig恒定域可能有助于抗原结合和/或介导抗体效应功能。认为一些FR残基以至少三种方式对抗原结合产生显著作用：非共价直接结合于抗原决定基、与一个或多个CDR残基相互作用及影响重链与轻链之间的界面。恒定域不直接参与抗原结合，但介导各种Ig效应功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)及抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。

根据恒定域的氨基酸序列，脊椎动物免疫球蛋白的轻链被分配至两个明显不同的类别之一，亦即kappa(κ)及lambda(λ)。相比之下，根据恒定域的序列将哺乳动物免疫球蛋白的重链分配至五个主要类别中之一者：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。IgG及IgA进一步划分成子类(同型)，例如分别为IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ及μ。所述类别的原生免疫球蛋白的次单元结构及三维构型已为所熟知的。

术语“抗体”、“抗C3抗体”、“人源化抗C3抗体”及“变体人源化抗C3抗体”在本文中以最广泛的含义使用并且具体地涵盖单克隆系抗体(包括全长单克隆系抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及抗体片段，诸如可变域及表达出所需生物活性(例如，结合C3)的抗体的其他部分。

术语“单克隆系抗体”(mAb)是指基本上均质的抗体群体中的一种抗体；亦即，该群体中的个别抗体为相同的，除了可能存在少量的自然发生的突变。单克隆系抗体具有高度特异性，针对单个抗原决定位，亦即“抗原决定基”。因此，修饰语“单克隆系”指示针对相同抗原决定基的基本上均质的抗体群体，且不应解释为需要利用任何特定方法产生抗体。应当理解，可以利用本领域已知的任何技术或方法制备单克隆系抗体；包括例如杂交瘤方法(Kohler等人,1975,Nature 256:495)，或本领域已知的重组DNA方法(参见例如，美国专利第4,816,567号)，或使用噬菌体抗体库分离重组产生的单克隆系抗体的方法，使用Clackson等人,1991,Nature 352:624-628及Marks等人,1991,J.Mol.Biol.222:581-597中所述的技术。

嵌合抗体由来自一个物种(例如，非人类哺乳动物，诸如小鼠)的抗体的重链及轻链可变区以及另一物种(例如，人类)抗体的重链及轻链恒定区组成，并且可以为通过以下方式获得：将编码来自第一物种(例如小鼠)的抗体可变区的DNA序列与来自第二物种(例如人类)的抗体恒定区的DNA序列连接，并用含有所连接序列的表达载体对宿主进行转形，以使其产生嵌合抗体。替代地，嵌合抗体亦可为重链和/或轻链的一个或多个区或域与单克隆系抗体中来自另一免疫球蛋白类别或同型或来自共有或生殖系序列的对应序列一致、同源或为其变体的抗体。嵌合抗体可以包括此类抗体的片段，其限制条件为该抗体片段表达出其亲本抗体的所需生物学活性，例如结合相同的抗原决定基(参见例如美国专利第4,816,567号；及Morrison等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。

术语“抗体片段”、“抗原结合片段”、“抗C3抗体片段”、“人源化抗C3抗体片段”、“变体人源化抗C3抗体片段”是指全长抗C3抗体的一部分，其中保留了可变区或功能能力，例如特异性C3抗原决定基结合。抗体片段或抗原结合片段的实施例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv、scFv及scFv-Fc片段、双功能抗体、线性抗体、单链抗体、微型抗体、由抗体片段形成的双功能抗体、单域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体、VHH)片段及由抗体片段形成的多特异性抗体。

全长抗体可用诸如木瓜酶或胃蛋白酶的酶处理，以产生适用抗体片段。使用木瓜酶消化以产生各自具有单一抗原结合位点的两种相同的抗原结合抗体片段(称为“Fab”片段)，及残余“Fc”片段。Fab片段亦含有轻链的恒定域及重链的C_H1域。胃蛋白酶处理产生F(ab')₂片段，该片段具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。

Fab'片段与Fab片段的不同之处在于存在额外的残基，包括来自C_H1域C端抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab')₂抗体片段为成对的Fab'片段，由铰链区的半胱氨酸残基连接。抗体片段的其他化学偶联亦为已知的。

“Fv”片段含有由紧密非共价缔合的一个重链可变域及一个轻链可变域的二聚体组成的完整抗原识别及结合位点。在此构型中，各可变域的三个CDR相互作用以界定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个CDR共同地赋予抗体以抗原结合特异性。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段为包含抗体的VH域及VL域的单链Fv变体，其中所述域存在于单一多肽链中。单链Fv能够识别且结合抗原。scFv多肽亦可以任选含有位于VH及VL域之间的多肽接头，以便于利用scFv形成抗原结合所需的三维结构(参见例如，Pluckthun,1994,于:The Pharmacology of monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg及Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页)。此类接头包括但不限于重复的GGGGS氨基酸序列(SEQ ID NO:43)或其变体。此类scFv分子可以具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。scFv通常不含抗体恒定域区，尽管本发明的scFv可以连接或附接至抗体恒定域区(例如，抗体Fc域)以改变scFv的各种性质，包括但不限于延长血清或组织半衰期。scFv通常具有约25kDa的分子量及约2.5nm的流体动力学半径。

在一个实施方案中，本发明的抗体及抗体片段为单链抗体(scFv)或Fab片段。在scFv抗体的情况下，选定的VL域可以利用可挠性接头以任一取向连接至选定的VH域。如本文所设想的，可挠性接头为长度至少为1个氨基酸的肽或多肽接头。优选地，接头为1至100个氨基酸长。更优选地，接头为5至50个氨基酸长，更优选10至40个氨基酸长，且甚至更优选地，接头为15至30个氨基酸长。通常使用的小接头的非限制性实施例包括甘氨酸及丝氨酸氨基酸的序列，称为GS微型接头。接头序列的优选实施例为不同长度的Gly/Ser接头，诸如(gly_xser_y)_z接头，包括(gly₄ser)₃(SEQ ID NO:45)、(gly₄ser)₄(SEQ ID NO:46)、(gly₄ser)(SEQ ID NO:44)、(gly₃ser)(SEQ ID NO:56)、gly₃及(gly₃ser₂)₃(SEQ ID NO:65)。这些接头中的氨基酸数量可以变化，例如，其可以为4(例如，GGGS)(SEQ ID NO:56)、6(例如，GGSGGS)(SEQ ID NO:57)、7(例如，GGGSGGS)(SEQ ID NO:58)，或其倍数，例如此四个、六个或七个氨基酸的两个或三个或更多个重复。在一个实施方案中，本发明的抗体包含选自由以下组成的组的接头：SEQ ID NO:43(GGGGS)、SEQ ID NO:44(GGGGSGGGGS)、SEQ ID NO:45(GGGGSGGGGSGGGGS)及SEQ ID NO:46(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)中所示的序列。在一特定实施方案中，该接头为SEQ ID NO:46。该接头亦可以为如Holliger等人(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448中所述的变体。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi等人.(2001),Eur.J.Immunol.31:94-106,Hu等人(1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov等人(1999),J.Mol.Biol.293:41-56及Roovers等人(2001),Cancer Immunol.Immunother.50:51-59描述。接头的进一步实施例包括以下：7GS接头：SGGSGGS(SEQ ID NO:59)；8GS接头：9GS接头：GGGGSGGGS(SEQ IDNO:60)；18GS接头：GGGGSGGGGSGGGGGGGS(SEQ ID NO:61)；25GS接头：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:62)；30GS接头：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:63)；及35GS接头：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:64)。

在根据本发明的scFv中，VL及VH排列可以为VL-接头-VH或VH-接头-VL，前一种取向为优选的。然而，亦考虑了单个VH或VL域抗体。在Fab片段的情况下，选定的轻链可变域VL融合至人类Igκ链的恒定区，而合适的重链可变域VH融合至人类IgG的第一个(N端)恒定域CH1。在恒定域的C端或可变域或恒定域的其他位点，可以形成链间二硫键。

如本文中所使用，“VHH”、“纳米抗体”或“仅重链抗体”为包含衍生自包括骆驼、美洲驼、羊驼的骆驼科(Camelidae family)物种的单一重链可变域的抗原结合蛋白。VHH的分子量通常为约15kDa。

其他识别的抗体片段包括包含一对串联Fd区段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)以形成一对抗原结合区的那些抗体片段。这些“线性抗体”可为双特异性的或单特异性的，如例如Zapata等人.1995,Protein Eng.8(10):1057-1062中所描述的。

人源化抗体或人源化抗体片段为特定类型的嵌合抗体，其包括免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段，其能够结合于预定抗原且其包含一个或多个实质上具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的FR及一个或多个实质上具有非人类免疫球蛋白的氨基酸序列的CDR。通常称为“导入”序列的此非人类氨基酸序列通常获自“导入”抗体域，尤其可变域。一般而言，人源化抗体至少包括插入人类重链或轻链可变域的FR之间的非人类抗体的CDR或HVL。

本发明描述了特定的人源化抗C3抗体，其含有源自鼠、兔、美洲驼或嵌合抗体的CDR，插入在人类生殖系序列重链及轻链可变域的FR之间。应当理解，某些非人类FR残基(例如来自鼠、兔、美洲驼或嵌合抗体等)可能对人源化抗体的功能很重要，且因此某些人类生殖系序列重链及轻链可变域残基被修饰为与相应的非人类序列的残基相同。

如本文所用，表述“本发明的抗体”及“本发明的抗C3抗体”是指本文所描述的针对C3的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明的该抗体为scFv。在一具体实施方案中，本发明的抗体包含可变重链(VH)及可变轻链(VL)，其中该VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、选自由SEQ ID NO:2及15组成的组的CDR-H2序列、SEQ ID NO:3的CDR-H3序列；及其中该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5及18组成的组的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列。

在一个实施方案中，本发明涉及一种人源化抗C3抗体或其片段。人源化抗体基本上包含至少一个，且通常两个可变域(诸如含在Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc及Fv片段中)，其中所有或基本上所有CDR对应于非人类免疫球蛋白的那些，并且在本文中具体而言，CDR为兔来源的，并且FR为人类免疫球蛋白共有序列或生殖系序列的那些。在另一方面，人源化抗C3抗体亦包括免疫球蛋白Fc区的至少一部分，通常为人类免疫球蛋白的Fc区。通常，抗体将含有轻链以及至少重链的可变域两者。适当时，抗体亦可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和/或CH4区中之一或多者。

人源化抗C3抗体可以选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，以及任何同型，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。举例而言，恒定域可以为补体固定恒定域，其中期望人源化抗体表达出细胞毒活性，并且同型通常为IgG1。当不期望此类细胞毒活性时，恒定域可以为另一同型，例如IgG2，或者为缺乏细胞毒活性的修饰的IgG1序列，例如含有突变N297A或L234A及L235A。替代的人源化抗C3抗体可以包含来自超过一种免疫球蛋白类别或同型的序列，并且选择特定的恒定域以优化所需的效应功能在本领域的一般技术范围内。在具体实施方案中，本发明提供作为IgG1抗体，且更特别是作为特征在于减小的效应功能的IgG1抗体的抗体。

人源化抗C3抗体或其片段(包括scFv)的FR及CDR或HVL不需要与亲本序列精确对应。举例而言，导入CDR或HVL或共有或生殖系FR序列中的一个或多个残基可能会通过取代、插入或缺失而改变(例如，诱变)，使得所得氨基酸残基不再与亲本序列中相应位置的原始残基相同，但抗体仍保留结合C3的功能。此类改变通常不会为广泛的并且将为保守的改变。通常，至少75％的人源化抗体残基将对应于亲本共有或生殖系FR及导入CDR序列的那些，更常见的为至少90％，最常见的为大于95％，或大于98％或大于99％。

术语“共有序列”及“共同抗体”是指在任何特定类别、同型或次单元结构的所有免疫球蛋白中的各位置，例如人类免疫球蛋白可变域处包含最通常出现的氨基酸残基的氨基酸序列。共有序列可基于特定物种或许多物种的免疫球蛋白。应了解，“共有”序列、结构或抗体涵盖如某些实施方案中所描述的共有人类序列，且是指在任何特定类别、同型或次单元结构的所有人类免疫球蛋白中的各位置包含最通常出现的氨基酸残基的氨基酸序列。因此，共有序列含有在各位置具有存在于一个或多个已知免疫球蛋白中的氨基酸的氨基酸序列，但其不可精确重复任何单一免疫球蛋白的整个氨基酸序列。可变区共有序列不获自任何天然产生的抗体或免疫球蛋白。Kabat等人,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.及其变体。重链及轻链共有序列及其变体的FR为制备人源化抗C3抗体提供了有用的序列。参见例如，美国专利第6,037,454号及第6,054,297号。

人类生殖系序列天然存在于人群中。人类生殖系序列对应于由可变(V)、多样性(D)及连接(J)基因区段编码的抗体蛋白分子，其被重新排列，且形成重组基因。VDJ重组导致产生大量但最终数目有限的未突变抗体蛋白，称为生殖系库。那些生殖系基因的组合产生抗体多样性。抗体的轻链的生殖系抗体序列来自保守人类生殖系κ或λv基因及j基因。类似地，重链序列来自生殖系v基因、d基因及j基因(LeFranc,M-P及LeFranc,G,“TheImmunoglobulin Facts Book”Academic Press,2001)。

“经分离”抗体为已自其天然环境的组分识别出且分离和/或回收的抗体。抗体天然环境的污染物成分为那些可能干扰抗体诊断或治疗用途的物质，且可以为酶、激素或其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一个方面，抗体将被纯化至按抗体重量计至少大于95％的分离。

术语“抗体效能”是指有助于抗原的抗体识别的因素/性质或抗体的体内效用。在一优选实施方案中，抗体效能是指抗体阻止视网膜细胞的细胞骨架塌陷的能力。抗体的氨基酸序列的变化可影响诸如折叠的抗体性质，且可影响物理因素，诸如抗体结合于抗原的初始速率(ka)、抗体自抗原的解离常数(kd)、抗体对于抗原的亲和力常数(Kd)、抗体的构象、蛋白质稳定性及抗体的半衰期。如本文中所使用，术语“亲和力”是指抗体的抗原结合位点与其所结合的抗原决定基之间的相互作用的强度。如本领域技术人员易于理解，抗体或抗原结合蛋白亲和力可报导为解离常数(KD)，以摩尔浓度(M)为单位。抗原结合域结合特定抗原决定位的能力可以经由酶联免疫吸附分析(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术，例如表面等离子共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)，例如在25℃下进行(Liljeblad等人,Glyco J 17,323-329(2000))，以及传统的结合分析(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))。

如本文所使用，术语“一致”或“一致性百分比”在两个或更多个核酸或多肽序列的情形下是指针对最大对应性比较及比对时相同的两个或更多个序列或子序列或具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基。为确定一致性百分比，出于最佳比较目的而比对序列(例如，可在第一氨基酸序列或核酸序列中引入间隙以与第二氨基酸或核酸序列最佳比对)。随后比较相对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。若第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据，则分子在该位置处一致。两个序列之间之一致性百分比为序列共有的相同位置数的函数(亦即，一致性％＝相同位置数/位置总数(例如，重叠位置)×100)。在一些实施方案中，被比较的两个序列具有相同的长度，任选适当时在序列内引入空位之后(例如，排除延伸超出被比较的序列的额外序列)。举例而言，当比较可变区序列时，不考虑前导和/或恒定域序列。对于两个序列之间的序列比较，“对应”CDR是指两个序列中相同位置中的CDR(例如，各序列的CDR-H1)。

可使用数学算法实现测定两个序列之间的一致性百分比或类似性百分比。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实施例为Karlin and Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268的算法，如Karlin and Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中修改。此类算法被纳入Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST及XBLAST程序中。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜寻，评分＝100，字长＝12，以获得与编码感兴趣的蛋白质的核酸同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序进行BLAST蛋白检索，评分＝50，字长＝3，以获得与感兴趣的蛋白质同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等人,1997,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402中所描述使用空位BLAST。或者，PSI-Blast可用于执行叠代检索，以检测分子之间的远距离关系(Id.)。当使用BLAST、空位BLAST及PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST及NBLAST)的预设参数。用于比较序列的数学算法的另一优选非限制性实施例为Myers及Miller,CABIOS(1989)的算法。此类算法被纳入ALIGN程序(2.0版)中，该程序为GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表，空位长度罚分12，及空位罚分4。用于序列分析的其他算法在本领域为已知的并且包括如Torellis及Robotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10:3-5中描述的ADVANCE及ADAM；及Pearson及Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-8中描述的FASTA。在FASTA中，ktup为一个控制选项，用于设置检索的灵敏度及速度。若ktup＝2，则通过查看对齐的残基对找到被比较的两个序列中的相似区域；若ktup＝1，则检查单个对齐的氨基酸。对于蛋白质序列，ktup可以设置为2或1，或对于DNA序列，可以设置为1到6。若ktup未规定，则对于蛋白质默认值为2，且对于DNA为6。替代地，可使用CLUSTAL W算法进行蛋白质序列比对，如Higgins等人,1996,Methods Enzymol.266:383-402所描述。

如本文所用，表述“细胞”、“细胞株”及“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称包括其后代。因此，“转形体”及“转形细胞”包括主要个体细胞及来源于其的培养物，而与转移数目无关。

出于治疗的目的，术语“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家畜与农畜及动物园、竞技或宠物动物，诸如狗、马、猫、奶牛及其类似动物。哺乳动物优选为人类。

如本文所用，“疾病”或“病症”为将受益于用本文所描述的人源化抗C3抗体治疗的任何病况。此病况包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论的病症的那些病理病况。

术语“玻璃体内注射”具有本领域的通常含义，且是指将抗C3抗体或其抗原结合片段引入患者的玻璃体中。

术语“皮下施用”是指通过相对缓慢的持续递送将抗C3抗体或其抗原结合片段自药物容器引入至动物或人类患者的皮肤下，优选皮肤与下层组织之间的凹穴内。捏起或拉起皮肤且远离下层组织可产生凹穴。

术语“皮下输注”是指通过相对缓慢的持续递送将药物自药物容器引入至动物或人类患者的皮肤下，优选皮肤与下层组织之间的凹穴内，保持一段时间，包括(但不限于)30分钟或更短、或90分钟或更短。任选地输注可通过植入于动物或人类患者的皮肤下的药物递送泵的皮下植入来进行，其中泵递送预定量的药物，保持预定时段，诸如30分钟、90分钟或横跨治疗方案长度的时段。

术语“皮下推注”是指在动物或人类患者的皮肤下施用，其中推注药物递送短于大约15分钟；在另一方面，短于5分钟，且在又一方面，短于60秒。甚至在又一方面，施用为在皮肤与下层组织之间的凹穴内进行的，其中可以通过捏起或拉起皮肤且远离下层组织来产生凹穴。

术语“治疗有效量”用于指减轻或改善所治疗病症的一种或多种症状的抗C3抗体或其抗原结合片段的量。在如此做的过程中，正为此量具有有益患者结果。功效可视待治疗的病况而定以常规方式测量。举例而言，在以表达C3的细胞系特征的眼或眼部疾病中，可以通过确定反应率(例如视力恢复)或通过评估延迟直至疾病进展的时间来测量功效。

如本文中所用，术语“治疗”及“疗法”及其类似术语意谓包括疾病或病症的治疗性以及防治性或抑制措施，从而产生任何临床上需要或有益的作用，包括(但不限于)缓解或减轻一种或多种症状、消退、减缓或停止疾病或病症的进展。因此，例如，术语治疗包括在疾病或病症的症状发作之前或之后施用抗C3抗体或其抗原结合片段，从而预防或消除疾病或病症的一种或多种征象。作为另一实施例，该术语包括在疾病的临床表达之后施用抗C3抗体或其抗原结合片段以对抗疾病的症状。此外，在发病后及出现临床症状后施用抗C3抗体或其抗原结合片段(其中施用影响疾病或病症的临床参数)，无论治疗是否导致疾病的改善，均构成如本文所用的“治疗”或“疗法”。此外，只要与在不使用抗C3抗体组合物或其抗原结合片段的情况下的症状相比，本发明的组合物单独或与另一种治疗剂组合减轻或改善所治疗病症的至少一种症状，结果应该被认为为对潜在病症的有效治疗，而不管疾病的所有症状是否均得到缓解。

术语“药品说明书”用以指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有关于适应症、用法、给药、禁忌和/或关于使用此类治疗产品的警告的信息。

本发明的抗体

在一个实施方案中，本发明涉及抗C3抗体或其抗原结合片段。在一特定实施方案中，本发明提供人源化抗C3抗体或其抗原结合片段。在另一实施方案中，本发明提供人源化单克隆系抗C3抗体或其抗原结合片段。

在最初的表征中，生成了靶向C3的抗体库，特别为靶向C3的scFv。发明人已将这些scFv人源化并优化，如实施例4所示。发明人还进一步对具有不同改变的CDR及FR进行工程改造，以提高亲和力并优化人类抗体中罕见的氨基酸。经由多样化及彻底的优化步骤，发明人开发了非常有前景的治疗分子，特别为针对C3的人源化scFv，其具有本文公开的增强性质。

本发明抗体的CDR序列示于下表1中。表1描述了根据Kabat命名法的CDR。

表1：

名称	氨基酸序列	SEQ ID NO:
			CDR-H1	NYAMN	1
CDR-H2	VISYDGSNKYYADSVKG	2
			CDR-H2	IINVGGGTNYADSVKG	15
CDR-H3	AVGYHHARLDP	3
			CDR-L1	TLSSAHKTYTID	4
CDR-L2	LKSDGSYTKGS	5
			CDR-L2	LKSEGSYTKGS	18
CDR-L3	GTEGVGGYV	6

在一个实施方案中，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其包含可变重链(VH)及可变轻链(VL)，

在一特定实施方案中，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其包含：可变重链(VH)及可变轻链(VL)，其中该VH包含：SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少80％、至少90％或至少95％一致的氨基酸序列的CDR-H1序列,SEQ ID NO:2或15或与SEQ IDNO:2或15的氨基酸序列至少80％、至少90％或至少95％一致的氨基酸序列的CDR-H2序列，和/或SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少80％或至少90％一致的氨基酸序列的CDR-H3序列；和/或其中该VL包含：SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少80％、至少90％或至少95％一致的氨基酸序列的CDR-L1序列,SEQ ID NO:5或18或与SEQ IDNO:5或18的氨基酸序列至少80％、至少90％或至少95％一致的氨基酸序列的CDR-L2序列，和/或SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少80％或至少85％一致的氨基酸序列的CDR-L3序列。

在一特定实施方案中，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段

-其中该VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、SEQ ID NO:2的CDR-H2序列及SEQ IDNO:3的CDR-H3序列；及该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:5的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列，或

-其中该VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、SEQ ID NO:15的CDR-H2序列及SEQ IDNO:3的CDR-H3序列；及该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:5的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列，

-其中该VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、SEQ ID NO:15的CDR-H2序列及SEQ IDNO:3的CDR-H3序列；及该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:18的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列，或

-其中该VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、SEQ ID NO:2的CDR-H2序列及SEQ IDNO:3的CDR-H3序列；及该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:18的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列。

-重链可变区，其包含与SEQ ID NO:20、22或24的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列；和/或

在又另一实施方案中，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其包含：

其中：

-该VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、SEQ ID NO:2的CDR-H2序列及SEQ ID NO:3的CDR-H3序列；及该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:5的CDR-L2序列及SEQID NO:6的CDR-L3序列。

其中：

a.可变重链，其包含以下，优选由以下组成：SEQ ID NO:20的氨基酸序列；及可变轻链，其包含以下，优选由以下组成：SEQ ID NO:21的氨基酸序列，该抗体称为“克隆系I”，

b.可变重链，其包含以下，优选由以下组成：SEQ ID NO:22的氨基酸序列；及可变轻链，其包含以下，优选由以下组成：SEQ ID NO:23的氨基酸序列，该抗体称为“克隆系II”；

c.可变重链，其包含以下，优选由以下组成：SEQ ID NO:24的氨基酸序列；及可变轻链，其包含以下，优选由以下组成：SEQ ID NO:25的氨基酸序列，该抗体称为“克隆系III”。

下表描述了根据不同的众所周知的命名法的根据本发明的抗体的CDR，诸如根据Kabat；根据CCG(Chemical Computing Group，如Almagro等人,Proteins 2011；79:3050-3066及Maier等人,Proteins 2014；82:1599-1610中所说明)；根据Chothia；和/或根据Aho。

表2进一步总结了根据本发明的抗体的CDR的氨基酸序列。

表2：

因此，在一具体方面，本发明涉及抗C3抗体或其抗原结合片段，其包含可变重链(VH)及可变轻链(VL)，

-其中该VH包含选自由SEQ ID NO:1、7、8及10组成的组的CDR-H1、选自由SEQ IDNO:2、9、11、15、16及17组成的组的CDR-H2序列、选自由SEQ ID NO:3及12组成的组的CDR-H3序列；及

-其中该VL包含选自由SEQ ID NO:4及13组成的组的CDR-L1序列、选自由SEQ IDNO:5、14、18及19组成的组的CDR-L2序列、及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列。

在一特定方面，本发明涉及抗C3抗体或其抗原结合片段，其包含可变重链(VH)及可变轻链(VL)，

-其中该VH包含SEQ ID NO:7的CDR-H1序列、SEQ ID NO:2的CDR-H2序列及SEQ IDNO:3的CDR-H3序列；及该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:5的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列，或

-其中该VH包含SEQ ID NO:8的CDR-H1序列、SEQ ID NO:9的CDR-H2序列及SEQ IDNO:3的CDR-H3序列；及该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:5的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列，或

-其中该VH包含SEQ ID NO:10的CDR-H1序列、SEQ ID NO:11的CDR-H2序列及SEQID NO:12的CDR-H3序列；及该VL包含SEQ ID NO:13的CDR-L1序列、SEQ ID NO:14的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列，或

-其中该VH包含SEQ ID NO:7的CDR-H1序列、SEQ ID NO:15的CDR-H2序列及SEQ IDNO:3的CDR-H3序列；及该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:5的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列，或

-其中该VH包含SEQ ID NO:8的CDR-H1序列、SEQ ID NO:16的CDR-H2序列及SEQ IDNO:3的CDR-H3序列；及该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:5的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列，或

-其中该VH包含SEQ ID NO:10的CDR-H1序列、SEQ ID NO:17的CDR-H2序列及SEQID NO:12的CDR-H3序列；及该VL包含SEQ ID NO:13的CDR-L1序列、SEQ ID NO:14的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列，或

-其中该VH包含SEQ ID NO:7的CDR-H1序列、SEQ ID NO:15的CDR-H2序列及SEQ IDNO:3的CDR-H3序列；及该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:18的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列，或

-其中该VH包含SEQ ID NO:8的CDR-H1序列、SEQ ID NO:16的CDR-H2序列及SEQ IDNO:3的CDR-H3序列；及该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:18的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列，或

-其中该VH包含SEQ ID NO:10的CDR-H1序列、SEQ ID NO:17的CDR-H2序列及SEQID NO:12的CDR-H3序列；及该VL包含SEQ ID NO:13的CDR-L1序列、SEQ ID NO:19的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列。

根据本发明的示例性可变重链及可变轻链的序列描述于表3中。

表3：

本发明的示例性scFv的序列描述于表4中。

表4

在一个实施方案中，本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段为选自由以下组成的组：单链可变片段(scFv)、Fab片段、Fab'片段、Fv片段、双功能抗体、小抗体仿真物。在一替代实施方案中，抗C3抗体或其抗原结合片段为选自由以下组成的组：单域抗体，诸如sdAb、sdFv、纳米抗体、V-Nar及VHH。在此特定实施方案中，该抗C3抗体或其抗原结合片段包含可变重链。在另一实施方案中，该可变重链包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、选自由SEQ IDNO:2及15组成的组的CDR-H2序列、SEQ ID NO:3的CDR-H3序列。在一具体实施方案中，该可变重链包含SEQ ID NO:20、22或24的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的抗体为单链片段，其包含接头，优选包含SEQ ID NO:46(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)中所示的接头。

在一个实施方案中，本发明的抗体为单链片段，其包含一个选自由SEQ ID NO:26、27、28、29、30及31组成的组的序列。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段能够抑制补体活化途径，包括经典途径(CP)、凝集素途径(LP)及替代途径(AP)。

在一个实施方案中，相较于对C3及C3b的结合亲和力，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段对C3a、iC3b、C4、C4b、C5和/或C5b的结合亲和力更弱。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段对C3a、iC3b、C4、C4b、C5和/或C5b不具有结合亲和力。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段能够抑制C3转化酶放大环路。

本发明的抗C3抗体或根据本发明的其抗原结合片段以高亲和力与人类C3结合。在与此方面相关的一个实施方案中，本发明的抗C3抗体与人类C3结合的K_D<50nM，优选K_D<15nM，优选K_D<10nM，优选K_D<7nM，优选K_D<1nM，优选K_D<0.5nM，优选K_D<0.2nM，优选K_D<0.15nM，优选K_D<0.10nM，优选K_D<0.05nM，优选K_D<0.04nM，更优选K_D<0.03nM，例如，以通过SPR所测定。在一个实施方案中，本发明的抗C3抗体与人类C3结合的K_D包含在0.16至0.023nM之间，如实施例8中所例示。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段与人类C3b结合的K_D<50nM，优选K_D<15nM，优选K_D<10nM，优选K_D<7nM，优选K_D<1nM，优选K_D<0.5nM，优选K_D<0.2nM，优选K_D<0.15nM，优选K_D<0.10nM，更优选K_D<0.05nM，例如，以通过SPR所测定。在另一实施方案中，本发明的抗C3抗体与人类C3结合的K_D包含在0.15nM至0.05nM之间，如实施例8中所例示。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段对C3及C3b具有约10^-8M至约10^-14M的结合亲和力。在某些实施方案中，根据本发明的抗体对C3及C3b具有约10^-10M至约10^-12M的结合亲和力。在某些实施方案中，本发明的抗C3抗体对C3及C3b具有至少(强于)约10^-8M、至少(强于)约10^-9M、至少(强于)约10^-10M、至少(强于)约10^-11M或至少(强于)约10^-12M的结合亲和力。在一个实施方案中，根据本发明的抗体对C3及C3b具有大致相等的结合亲和力。举例而言，但绝不限制，根据本发明的抗体可以对C3具有约10^-10M的结合亲和力及对C3b具有约10^-10M的结合亲和力。在一特定实施方案中，根据本发明的抗体对C3具有约10^-11M的结合亲和力及对C3b具有约10^-11M的结合亲和力。在另一实施方案中，根据本发明的抗体对C3具有约10^-12M的结合亲和力及对C3b具有约10^-12M的结合亲和力。

在一个替代实施方案中，对C3的结合亲和力在对C3b的结合亲和力的10倍以内。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段显示出与食蟹猕猴C3的交叉反应性。发明人已在实施例8中显示本发明的抗体亦结合食蟹猕猴C3。食蟹猕猴(Macaca fascicularis)C3与人类C3有95.1％之一致性，且交叉反应性允许在相关动物模型中对本发明的抗C3抗体进行临床前及毒理学测试。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段对C3疾病相关单核苷酸多型性(SNP)具有结合亲和力，更确切地说为C3 SNP P314L及C3 SNP R102G。发明人亦在实施例8中表明，本发明的抗体结合人类C3的疾病相关SNP，确保本发明的抗体可以治疗范围广泛的患有眼或眼部疾病的患者。

根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段的高结合亲和力有助于延长玻璃体内注射后C3的中和时间并进一步允许降低的注射频率。更高的结合亲和力进一步允许施用更低的剂量，从而限制潜在的副作用。有利的结合亲和力及降低的注射频率显著改善了有需要的患者的治疗功效。

由于其高结合亲和力、其有利的半衰期及其高度浓缩的能力，本发明的抗C3抗体允许增加给药之间之间隔时间。其亦为患者提供了宝贵的益处，尤其为改善了药物的遵从性及依从性。

根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段可以具有长于1个月的治疗有效持续时间，此与其他治疗剂相比可以为更长的持续时间。增加的治疗有效持续时间可能为由于本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段的摩尔浓度，其可高达7mM。

与其他治疗剂相比，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段可以更容易地注射至眼中。在一个实施方案中，本发明的抗C3抗体不含PEG，从而降低了其黏度，如实施例13所说明。因此，本发明的抗C3抗体的黏度预计会低于其他治疗剂的黏度。由于背压降低，黏度降低的溶液(诸如小于或等于20厘泊(cP)的溶液)更容易注射至眼睛中。

发明人已经表明根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段呈现出优异的药学特征，如改进的稳定性所说明的。发明人确实在实施例11中表明，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段显示出改进的热稳定性。这些结果说明本发明的抗体在生理温度下保持其原生及活性构象。值得注意的是，较高的热转变中点(T_m)反映了蛋白质在较低温度下稳定性的提高。发明人因此已经表明，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段显示改善的热稳定性质，有助于改善治疗功效，同时允许减少对患者的注射剂量及频率。此外，T_m表示延长的架储期及改善的治疗产品的时间稳定性。

在另一方面，如实施例4及12所述，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段被证明具有低免疫原性风险。这些结果证实本发明的抗体对于治疗眼或眼部疾病为高度合适及有前途的，因为其显示出低免疫原性风险和/或产生抗药物抗体(ADA)的低风险。

补体系统为先天免疫系统的重要组成部分，参与许多发炎及自体免疫性疾病的组织损伤。补体系统包括超过30种细胞相关蛋白及循环蛋白(例如，C1、C1q、C1r、C1s、C2、C3、C3a、C3b、C4、因子B、因子D、因子H、因子I)。

存在活化补体的三种主要途径，亦即经典途径(CP)、凝集素途径(LP)及替代途径(AP)。三种补体途径由不同的因素启动，各因素均会导致补体组分C3的切割。

经典途径通常由抗原与正确同型或亚类的特异性抗体相互作用触发；免疫球蛋白M(IgM)、IgG3及IgG1为经典途径最有效的活化因子。此会诱导C1复合物的构象变化，使其能够切割C4及C2以生成C4bC2b复合物。C4bC2b作为经典途径的C3转化酶。

凝集素补体途径由C型凝集素、甘露聚糖结合凝集素(MBL；也称为甘露糖结合凝集素)或称为纤维胶凝蛋白(ficolin)(L-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白及M-纤维胶凝蛋白)的相关系列的蛋白质与见于微生物表面上的糖蛋白或包膜多糖上表达的末端糖的结合触发。

替代途径由循环C3的缓慢水解引发，此暴露了内部硫酯基团，此种现象称为『C3逐渐停滞(C3 tickover)』。替代途径特异性蛋白质因子B、因子D及备解素(properdin)与水解的C3或与补体切割片段C3b的结合导致C3的进一步活化。呈C3b形式的经切割C3接着可以与微生物或内毒素(细菌脂多糖)表面的多糖或蛋白质相互作用，以启动替代途径活化并产生MAC，如在经典途径活化期间发生的那样。

在某些实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段根据其抑制一种或多种补体途径，亦即经典途径、替代途径及凝集素途径的能力进行选择。在某些实施方案中，根据其抑制所有三种补体途径，亦即经典途径、替代途径及凝集素途径的能力来选择本发明的抗C3抗体。在某些实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段能够抑制眼睛中的所有三种补体途径。

通常，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段在抑制经典途径、替代途径及凝集素途径中的功能效力可以通过补体抑制分析或溶血分析来确定，如实施例7中所述。效力可以用IC50(半数最大抑制浓度)表示。因此，在一个实施方案中，根据本发明的抗体或其片段

-抑制经典途径(CP)，效力在70及80nM之间，以通过补体抑制分析法所测量

-抑制凝集素途径(LP)，效力在340及360nM之间，以通过补体抑制分析法所测量，及

-抑制替代途径(AP)，效力在60至70nM之间，以通过补体抑制分析法所测量。

根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段抑制所有三种补体途径的能力进一步提高了其在治疗眼或眼部疾病中的治疗潜力。在一个实施方案中，本发明的抗体抑制所有三种补体途径的能力进一步提高了其在治疗眼或眼部疾病，特别为AMD或GA中的治疗潜力。不希望受理论的束缚，抑制所有三种补体途径可以通过防止一种活性途径的疾病促进作用补偿其他不活化途径来提高本发明的抗C3抗体的治疗潜力。

因此，在一特定实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段能够抑制眼睛脉络膜区域中的所有三种补体途径。脉络膜区域为在眼睛背部排列的含有血管的层且位于视网膜与巩膜之间。脉络膜区域分为四个层，亦即哈勒氏层(Haller's layer)、萨特勒氏层(Sattler's layer)、脉络膜毛细管层及布鲁赫膜。布鲁赫膜，也称为玻璃体层，为脉络膜的最内层且与视网膜色素上皮(RPE)相邻。在某些实施方案中，本发明的抗C3抗体能够渗透或扩散穿过布鲁赫膜并进入脉络膜的其他层，诸如但不限于脉络膜毛细血管层。

视网膜有大量的物理障壁，可能会阻止大分子(诸如全长免疫球蛋白)渗透至更深层，此可能会导致治疗效果降低(Jackson等人Invest Ophthalmol Vis Sci.2003；44(5):2141-6)。相比之下，较小的抗体衍生物可更深地渗透至视网膜中。具有约60kDa或更低的分子量的示例性抗体衍生物为抗体片段，包括(但不限于)Fab、Fab'片段、scFab、scFv、Fv片段、纳米抗体、VHH、dAb、V-Nar、sdAb、sdFv以及双特异性及二价抗体，诸如单链双功能抗体(scDb)，或DART。在某些实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段具有约60kDa或更低的分子量，例如约55kDa、约50kDa、约45kDa、约40kDa、约35kDa、约30kDa、约25kDa、约20kDa、约15kDa或更低。

在一个实施方案中，scFv格式能够实现3个月的施用频率。与需要更频繁施用的治疗眼或眼部疾病的现有治疗方法相比，此代表了显著的改进。因此，本发明的scFv显著提高了患者的依从性。

发明人已在实施例10中表明，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段(克隆系I)显示出较高的扩散穿过布鲁赫膜的能力，特别为与如实施例2中所述的比较化合物A2及比较化合物A3相比时。因此，在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段能够部分地由于其低至足以促进渗透的大小而穿透或扩散穿过布鲁赫膜。在某些实施方案中，本发明抗体的大小通过分子量测量。在某些实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段具有小于约60kDa的分子量。在某些实施方案中，本发明的抗C3抗体为约20kDa至约30kDa或约10kDa至约20kDa。在某些实施方案中，本发明的抗C3抗体为约25kDa。在某些实施方案中，本发明的抗C3抗体约为15kDa。在某些实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段的大小通过其流体动力学半径测量。在某些实施方案中，本发明的抗C3抗体具有小于或等于约3.0nm的流体动力学半径。在某些实施方案中，本发明的抗C3抗体具有小于或等于约2.5nm的流体动力学半径。在某些实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段具有小于或等于约2.0nm的流体动力学半径。

人源化及氨基酸序列变体

可以基于在SEQ ID NO:1至6、15及18中描述的序列下鉴定之一组CDR来工程改造其他变体抗C3抗体及抗体片段。应当理解，在一些实施方案中，在抗C3抗体及抗体片段的该变体中，CDR的氨基酸序列保持不变，但可以对周围区域(例如FR区域)进行工程改造。抗C3抗体或其片段的氨基酸序列变体可以通过向抗C3抗体DNA中引入适当的核苷酸改变，或通过肽合成来制备。此类变体包括例如本文实施例的抗C3抗体或其片段的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入及取代的任何组合以获得最终构建物，其限制条件为该最终构建物拥有所需特征。氨基酸变化亦可以改变人源化或变体抗C3抗体或其抗原结合片段的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。

抗体的另一类型氨基酸变体涉及改变抗体的原始糖基化模式。在此上下文中，术语“改变”意谓缺失一个或多个见于抗体中的碳水化合物部分，和/或添加一个或多个先前不存在于抗体中的糖基化位点。

在一些方面，本发明包括编码本文所描述的抗C3抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列变体的核酸分子。编码抗C3抗体或其片段的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于自天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)或通过寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变及盒式诱变先前制备的抗C3抗体或其抗原结合片段的变体或非变体形式进行制备。

在某些实施方案中，本发明的抗C3抗体为抗体片段。存在已开发用于产生抗体片段的技术。片段可经由完整抗体的蛋白分解消化衍生(参见例如Morimoto等人,1992,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117；及Brennan等人,1985,Science 229:81)。替代地，片段可在重组宿主细胞中直接产生。举例而言，Fab'-SH片段可直接自大肠杆菌(E.coli)中回收并化学偶联形成F(ab')₂片段(参见例如，Carter等人,1992,Bio/Technology10:163-167)。通过另一种方法，可以自重组宿主细胞培养物中直接分离F(ab')₂片段。用于产生抗体片段的其他技术对于本领域技术人员而言为显而易见的。

抗C3抗体及其抗原结合片段可以包括修饰。本文中所提供的抗体的变体可由在构架和/或CDR中引入缺失、取代、添加和/或修饰而产生。接着，可使用本文中所描述的方法测试抗体变体的所需功能。可对抗原结合蛋白或其片段进行缺失、取代、添加、修饰及插入的任何组合，其限制条件为所产生的变体具有可使用适当方法筛检的所需特征。

如本文中所使用，“保守性取代”是指保持亲本抗体的功能性质的修饰。举例而言，保守性氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有类似性质的氨基酸残基置换的取代。举例而言，将丙氨酸(A)取代为缬氨酸(V)；用赖氨酸(K)取代精氨酸(R)；用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺酸(N)；用谷氨酸(E)取代天冬氨酸(D)；用丝氨酸(S)取代半胱氨酸(C)；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)；用丙氨酸(A)取代甘氨酸(G)；用精氨酸(R)或赖氨酸(K)取代组氨酸(H)；用亮氨酸(L)取代异亮氨酸(I)；用亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)；用酪氨酸(Y)取代苯丙氨酸(F)；用苏氨酸(T)取代丝氨酸(S)；用酪氨酸(Y)取代色氨酸(W)；用色氨酸(W)取代苯丙氨酸(F)；和/或用亮氨酸(L)取代缬氨酸(V)，反之亦然。

在某些实施方案中，可能需要使用抗C3抗体片段而不为完整抗体。可能需要修饰抗体片段以增加其血清半衰期。此可例如通过将救助受体结合抗原决定基并入抗体片段中来达成。在一种方法中，抗体片段的适当区域可经改变(例如，经突变)，或可将抗原决定基并入至肽卷标中，该肽卷标接着例如通过DNA或肽合成在任一末端或在中间融合至抗体片段。参见例如，WO 96/32478。

在其他实施方案中，本发明包括抗C3抗体或抗原结合片段的共价修饰。共价修饰包括半胱氨酰基残基、组氨酰基残基、赖氨酰基及氨基端残基、精氨酰基残基、酪氨酰基残基、羧基侧基(天冬氨酰基或麸氨酰基)、谷氨酰胺酰基及天冬酰胺酰基残基、或丝氨酰基、或苏氨酰基残基的修饰。另一类型的共价修饰涉及以化学方式或以酶方式将糖苷偶合至抗体。若适用，此类修饰可通过化学合成或通过抗体或其片段的酶或化学切割来进行。通过使抗体或其片段的目标氨基酸残基与能够与选定的侧链或氨基末端或羧基末端残基反应的有机衍生剂反应，可以将抗体的其他类型的共价修饰引入分子中。

抗体或其片段上存在的任何碳水化合物部分的去除可以化学方式或以酶方式完成。化学去糖基化由Hakimuddin等人,1987,Arch.Biochem.Biophys.259:52及Edge等人,1981,Anal.Biochem.,118:131描述。可以通过使用如Thotakura等人,1987,Meth.Enzymol138:350所描述的多种内切及外切糖苷酶达成抗体上碳水化合物部分的酶切割。

另一种类型的有用的共价修饰包含以美国专利第4,640,835号、美国专利第4,496,689号、美国专利第4,301,144号、美国专利第4,670,417号、美国专利第4,791,192号及美国专利第4,179,337号中之一或多者中所述的方式将抗体连接至多种非蛋白质聚合物中之一种，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧亚烷基。

本文所描述的抗体或其抗原结合片段的变体，诸如包含与本文公开的序列具有一定一致性百分比水平的序列的变体，优选保留上述抗体或其抗原结合片段的功能能力，例如，特异性C3抗原决定基结合，能够抑制补体活化途径，包括经典途径(CP)、凝集素途径(LP)及替代途径(AP)，能够结合补体C3及C3b，能够阻止C3转化酶的形成和/或能够穿透布鲁赫膜。

抗原决定基结合

在一个方面，本发明提供识别特定“C3抗原决定基”的抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“C3抗原决定基”是指能够结合抗C3抗体或其抗原结合片段的分子(例如，肽)或分子片段。这些术语进一步包括，例如，被本发明的任何抗体或抗原结合片段识别的C3抗原决定位。

C3抗原的抗原决定基可以包括在蛋白质、蛋白质片段、肽或其类似物中。抗原决定基最常见的为蛋白质、短寡肽、寡肽模拟物(亦即模拟C3抗原的抗体结合性质的有机化合物)或其组合。

在抗原决定基结合的上下文中，词组“在氨基酸区X-Y内结合…”是指根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段结合序列中指定氨基酸区内的至少一个氨基酸残基。

本发明的抗体或抗原结合片段结合如SEQ ID NO:47中所示的人类补体C3的抗原决定基。在一个实施方案中，本发明的抗体结合如SEQ ID NO:48中所示的人类补体C3c的链D的抗原决定基。SEQ ID NO:48可以参考PDB:2A74_D在线获得。

本发明的抗体或抗原结合片段结合如SEQ ID NO:47中所示的人类补体C3的抗原决定基。在另一实施方案中，本发明的抗体结合如SEQ ID NO:48中所示的人类补体C3c的链D的抗原决定基。SEQ ID NO:48可以参考PDB:2A74_D在线获得。

已经发现根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段结合人类补体C3的独特抗原决定基。在一个实施方案中，本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段结合如SEQ ID NO:47中所示的人类补体C3的氨基酸366至氨基酸478的残基内的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，本发明提供了抗C3抗体或其抗原结合片段，其结合如SEQ IDNO:47中所示的人类补体C3的残基366、392-396、413-421、425、427、442、453及478中的所有残基。在一个实施方案中，本发明涉及抗C3抗体或其抗原结合片段，其结合如SEQ ID NO:48中所示的人类补体C3c的链D的氨基酸344至氨基酸456的残基内的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，本发明涉及抗C3抗体或其抗原结合片段，其结合如SEQ IDNO:48中所示的人类补体C3c的链D的选自由残基344、370-374、391-399、403、405、420、431及456组成的组的至少一个残基。

在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段结合如SEQ ID NO:48中所示的人类补体C3c的链D的残基344、370-374、391-399、403、405、420、431及456中的所有残基。

在一个实施方案中，本发明涉及抗C3抗体或其抗原结合片段，其结合如SEQ IDNO:48中所示的人类补体C3c的D链的氨基酸369至氨基酸418的残基内的至少一个氨基酸残基。

在另一实施方案中，本发明涉及抗C3抗体或其抗原结合片段，其结合如SEQ IDNO:48中所示的人类补体C3c的链D的选自由残基369至379、389、391至401、403及418组成的组的至少一个残基。

在另一实施方案中，本发明的抗体结合如SEQ ID NO:48所示的人类补体C3c的链D的残基369至379、389、391至401、403及418中的所有残基。

下表5描述了序列SEQ ID NO:47及48。

表5：

很可能特定的C3抗原决定基结合导致本发明的抗体或其抗原结合片段的意想不到的功能性质，例如，对C3及C3b两者的高结合亲和力，以及对包括经典途径(CP)、凝集素途径(LP)及替代途径(AP)在内的所有三种补体活化途径的强力抑制。

治疗用途

在一个方面，本发明涉及用作药物的抗C3抗体或其抗原结合片段。

如前所述，发明人现在已经表明，视网膜中C3的中和将阻断所有补体途径的放大环路，且由此减少细胞毒性膜攻击复合物的产生及促发炎补体组分(C3a、C3b、iC3b、C5a)的产生，改善地理萎缩患者的临床结果。

因此，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其用于治疗或预防视网膜或眼疾病。

在一个方面，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其用于治疗或预防眼或眼部疾病。在一个方面，本发明提供抗C3抗体或其抗原结合片段，其用于治疗或预防选自由以下组成的组的疾病：视网膜病变、增生性视网膜病变(PR)，诸如早产儿视网膜病变、缺血性视网膜病变；糖尿病性视网膜病变(DR)，包括增生性糖尿病性视网膜病变(PDR)及非增生性糖尿病性视网膜病变；糖尿病性黄斑水肿(DME)、糖尿病性黄斑缺血(DMI)；年龄相关的黄斑部变性(AMD)，包括干性AMD及湿性AMD；地理萎缩(GA)、色素性视网膜炎、遗传性视网膜营养不良、近视性变性、网膜静脉阻塞、网膜动脉阻塞、眼内炎、眼色素层炎、囊样黄斑水肿、继发于任何视网膜疾病的脉络膜新生血管膜、视神经病变、青光眼、视网膜脱落、中毒性视网膜病变、放射性视网膜病变、外伤性视网膜病变、药物诱发的视网膜血管病变、视网膜新生血管形成、息肉状脉络膜血管病变、视网膜血管炎、视网膜微动脉瘤、晶状体后纤维组织增生、脉络膜视网膜炎、福斯氏营养不良、黄斑毛细血管扩张、尤塞氏综合征、阵发性夜间血红素尿症(PNH)及斯特格病。

在一优选实施方案中，本发明提供一种抗C3 scFv，其用于治疗地理萎缩，其中该抗C3scFv包含可变重链(VH)及可变轻链(VL)，其中该VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、选自由SEQ ID NO:2及15组成的组的CDR-H2序列、SEQ ID NO:3的CDR-H3序列；及其中该VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5及18组成的组的CDR-L2序列及SEQ IDNO:6的CDR-L3序列。在一特定实施方案中，该抗C3 scFv包含有分别包含SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21的氨基酸序列的可变重链及可变轻链。在另一特定实施方案中，该抗C3 scFv包含有分别包含SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:23的氨基酸序列的可变重链及可变轻链。在另一特定实施方案中，该抗C3 scFv包含有分别包含SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25的氨基酸序列的可变重链及可变轻链。

发明人已经说明，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段显示出比背景技术中提到的及实施例5中描述的靶向C3的其他“比较化合物”更有利的性质。

根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段不同于基于APL2、NGM621及的治疗方法。

APL-2或派赛可潘(Pegcetacoplan)为环状十肽坎普他汀(compstatin)(补体组分C3的抑制剂)的聚乙二醇化衍生物。APL-2的活性组分为APL-1。如实施例5A所示，发明人开发了替代化合物(比较化合物A1及比较化合物A2)用于比较目的。

APL-2具有350kDa的大分子量当量及约7.8nm的流体动力学半径，因此难以深入至视网膜中。可能归因于3.5mM的低浓度，APL-2仅具有1个月的有效期。APL-2亦为聚乙二醇化分子，由此增加其黏度且可能使其难以注射至眼睛中。因此，需要更有效地减少GA进展。

NGM621为一种人源化IgG1单克隆系抗体，可有效结合补体C3(C3)并抑制补体活化。如实施例5B所示，发明人开发了此化合物用于比较目的。NGM621被描述为能够抑制经典及替代途径。

(或阿瓦卡塔德聚乙二醇(avacincaptad pegol))旨在抑制补体因子C5切割为C5a及C5b。不与C3结合。

发明人在实施例6B中已经说明，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段的格式提高了每次玻璃体内注射在眼睛中递送的药物分子的量。事实上，与其他化合物相比，scFv格式可以在每次IVT注射中递送更多的药物。此证实了scFv格式可以实现更大的补体抑制，从而增强治疗效果。此外，发明人已经表明，与Fab或IgG相比，scFv格式在IVT注射后允许更好的视网膜渗透。

发明人比较了根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段与尤其坎普他汀衍生物(诸如比较化合物A1)及针对C3的IgG(诸如比较化合物A3)的效力，如在实施例7中所说明。发明人已经表明，与比较化合物A1及比较化合物A3相比，本发明的抗体更有效地抑制经典途径、替代途径及凝集素途径。发明人进一步评估了与比较化合物A1相比，本发明的示例性抗体或其片段在抑制CP及LP方面更有效。发明人还表明，与比较化合物A1相比，在溶血分析中抑制AP的效力有所提高。

发明人亦在实施例8中例示了根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段与现有化合物坎普他汀衍生物(诸如比较化合物A1)及针对C3的IgG(诸如比较化合物A3)相比的结合亲和力。示例性抗体的较高结合亲和力有助于延长玻璃体内注射后C3的中和时间并进一步允许降低的注射频率。改进的结合亲和力及降低的注射频率显著改善了对患者的治疗功效。其亦为患者提供了宝贵的益处，尤其为改善了药物的遵从性及依从性。

此外，本发明人已表明，与坎普他汀衍生物(诸如比较化合物A1)及针对C3的IgG(诸如比较化合物A3)相比，本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段以更高的亲和力结合人类C3及C3b，从而能够更有效地抑制C3。与比较化合物A3相比，本发明的抗体以更高的亲和力结合C3b，且因此将阻断C3放大环路中C3b的产生以及已经沉积的C3b及由替代活化途径产生的C3b的活性。

发明人亦在实施例8中表明，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段结合人类C3的疾病相关单核苷酸多型性(SNP)，确保本发明的抗体可以治疗广泛的范围患有眼或眼部疾病的患者。发明人进一步表明，与比较化合物A1对人类C3的该SNP的结合亲和力相比，该结合亲和力得到改善。

发明人已在实施例10中说明，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段允许改善穿过布鲁赫膜的渗透，而比较化合物A2及显示没有渗透，而比较化合物A3仅显示降低的渗透。由于大部分补体活性位于RPE/布鲁赫膜/CC区域，因此极好的穿过布鲁赫膜的渗透及扩散对于抑制C3途径的治疗方法至关重要。

最后，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段以高亲和力及效力抑制所有补体效应子，如实施例7所说明。此导致抑制所有途径中的C3放大环路以及已经形成的C3b及由C3“逐渐停滞”活化产生的C3b的活性。结果为完全抑制所有补体活化途径及所有补体效应功能。

总之发明人因此开发了用于治疗患有GA的患者的非常有前景的治疗策略，并且已经显示根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段优于比较化合物A2及比较化合物A3。发明人确实已经表明，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段：

●允许改善每次玻璃体内注射的药物递送(实施例6B)并且尤其由于其格式而在等摩尔玻璃体内注射后表达出更好的视网膜渗透；

●尤其由于其格式而具有改进的治疗有效持续时间，确保改进的给药频率及增强的患者遵从性；

●对目标组织有更好的渗透力(实施例10)，具有渗透RPE及布鲁赫膜的能力，由此提高其在眼或眼部疾病治疗中的治疗潜力；

●具有改进的效力及更有效的补体阻断，证实根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段抑制所有补体效应功能，具有高亲和力及效力(实施例7及8)；

●对C3具有提高的结合亲和力，有助于延长玻璃体内注射后C3的中和时间，并进一步降低注射频率(实施例8)；

●对C3b具有提高的结合亲和力，特别为根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段以相似的亲和力结合C3及C3b，由此确保抑制C3放大环路中C3b的产生(实施例8))；及

●对人类C3的疾病相关SNP具有改善的结合亲和力，确保本发明的抗体可以治疗广泛的患有眼或眼部疾病的患者(实施例8)；

●表达出改善的稳定性(实施例11及13)；及

●具有低免疫原性风险(实施例4及12)。

此外，在本发明的一个具体实施方案中，抗C3抗体或其抗原结合片段未被聚乙二醇化。在此实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段显示出诱导新血管形成的风险降低，如在关于比较化合物(诸如或APL-2)公开的临床试验中所观察到的。

总的来说，本发明的抗体被证明为一种非常有效的治疗，具有最长的作用持续时间、改善患者最佳可能的遵从的药物摩尔，以及在湿性AMD尤其GA中的视网膜功效最佳。

抗C3抗体或其抗原结合片段通过任何合适的方式施用，包括玻璃体内、口服、非经肠、皮下、腹膜内、肺内及鼻内。非经肠输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。此外，抗C3抗体适合通过脉冲输注施用，特别为抗体剂量递减。在一个方面中，部分视施用的短期或长期性而定，可通过注射，最佳地静脉内或皮下注射来提供给药。在一个实施方案中，抗C3抗体经由玻璃体内注射至眼睛中施用。

为了预防或治疗疾病，抗体的适当剂量将取决于多种因素，诸如待治疗疾病的类型(如上所定义)、疾病的严重程度及病程、抗体是否用于预防或治疗目的、既往疗法、患者的临床病史及对抗体的反应，以及主治医师的判断。一次性或在一系列治疗中适当地向患者施用抗体。

在一些实施方案中，每次注射适用的本发明抗体的剂量范围通常为1mg/眼至20mg/眼，或在5mg/眼至20mg/眼之间，或在10mg/眼至15mg/眼之间或约15mg/眼。

术语“抑制”在本文中在与“改善”及“缓解”相同的情形下使用，意谓减轻或减少疾病的一个或多个特征。

抗体组合物将以与良好医学实践一致的方式调配、给药及施用。在此情形下，考虑因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个别患者的临床病况、病症的病因、药剂递送部位、施用方法、施用时程及医学从业者已知的其他因素。待施用的抗体的“治疗有效量”将由此类考虑因素决定，并且为预防、改善或治疗本发明的抗体所针对的眼或眼部疾病所需的最小量。

抗体不需要但任选与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起调配。此类其他药剂的有效量取决于调配物中存在的抗C3抗体的量、病症或治疗的类型以及上述其他因素。这些通常以与上文所用相同的剂量及施用途径使用，或者为前文所用剂量的约1％至99％。

在一特定方面，本发明亦提供了药物组合物，其包含抗C3抗体或其抗原结合片段及药学上可接受的载体以及至少一种另外的治疗剂。

治疗方法

在另一方面，本发明亦涵盖用于治疗或预防有需要的患者的眼或眼部疾病的任何方法，该方法包含施用本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，本发明涉及一种用于治疗或预防眼或眼部疾病的方法，其包含向有需要的患者施用药学上有效量的根据本发明的抗体或其片段。在一个实施方案中，该疾病为选自由以下组成的组：视网膜病变、增生性视网膜病变(PR)，诸如早产儿视网膜病变、缺血性视网膜病变；糖尿病性视网膜病变(DR)，包括增生性糖尿病性视网膜病变(PDR)及非增生性糖尿病性视网膜病变；糖尿病性黄斑水肿(DME)、糖尿病性黄斑缺血(DMI)；年龄相关的黄斑部变性(AMD)，包括干性AMD及湿性AMD；地理萎缩(GA)、色素性视网膜炎、遗传性视网膜营养不良、近视性变性、网膜静脉阻塞、网膜动脉阻塞、眼内炎、眼色素层炎、囊样黄斑水肿、继发于任何视网膜疾病的脉络膜新生血管膜、视神经病变、青光眼、视网膜脱落、中毒性视网膜病变、放射性视网膜病变、外伤性视网膜病变、药物诱发的视网膜血管病变、视网膜新生血管形成、息肉状脉络膜血管病变、视网膜血管炎、视网膜微动脉瘤、晶状体后纤维组织增生、脉络膜视网膜炎、福斯氏营养不良、黄斑毛细血管扩张、尤塞氏综合征、阵发性夜间血红素尿症(PNH)及斯特格病。

本文中所述的所有所公开的技术特征适用于该治疗方法。

药物组合物及其施用

可以将包含抗C3抗体或其抗原结合片段的组合物施用患有眼或眼部疾病或处于患眼或眼部疾病风险中的个体。本发明进一步提供了抗C3抗体或其抗原结合片段在制造预防或治疗C3相关疾病的药物中的用途。如本文所用，术语“个体”是指可以向其施用抗C3抗体或其抗原结合片段的任何哺乳动物患者，包括例如人类及非人类哺乳动物，诸如灵长类动物、啮齿动物及狗。特定预期使用本文所描述的方法治疗的个体包括人类。抗C3抗体或其抗原结合片段可以单独施用或与其他组合物组合施用。

多种递送系统为已知的并且可用于施用抗C3抗体或其抗原结合片段。引入方法包括但不限于玻璃体内、滴眼剂、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外及经口途径。抗C3抗体或其抗原结合片段可以例如通过输注、推注或注射施用，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以为全身的或局部的。在优选实施方案中，通过玻璃体内注射施用。用于此类注射的调配物可在例如预填充注射器中制备。

在某些实施方案中，眼内施用根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段。向眼睛的不同结构(诸如视网膜)递送治疗化合物为具有挑战性的。挑战包括但不限于几种限制性眼障壁、泪液机制，包括眨眼及冲洗掉递送的化合物、有限的局部注射体积、有限的局部生物可用度以及对杂质及污染物的低耐受性(参见例如，Patel等人World JPharmacol.2013；2(2):47-64；Morrison等人Ther.Deliv.2014；5(12):1297-1315)。本发明的抗体可以克服这些挑战。本发明的抗体优选具有约60kDa或更小的分子量，优选约25kDa。约60kDa或更小的抗原结合蛋白的实施例包括但不限于scFv、VHH及Fab片段。约25kDa或更小的抗原结合蛋白的实施例包括但不限于scFv及VHH。scFv的较小尺寸使得每次注射能够递送更多的治疗化合物。此允许高浓度的抗体进入眼睛。本发明的抗体，特别为scFv的较小尺寸亦可以提高其对疾病相关组织(亦即眼睛的脉络膜区域)的渗透。本发明的抗体能够穿透脉络膜区域之一或多层，包括哈勒氏层、萨特勒氏层、脉络膜毛细血管层及布鲁赫膜，由此靶向脉络膜区域的那些层内的补体C3及C3b。

在某些实施方案中，眼内施用为用药物递送装置达成的，诸如脉络膜上药物递送装置或视网膜下药物递送装置。脉络膜上施用程序涉及将药物施用至眼睛的脉络膜上腔，且通常使用脉络膜上药物递送装置来进行，诸如具有微针的微小注射器(参见例如Hariprasad,2016,Retinal Physician 13:20-23；Goldstein,2014,Retina Today 9(5):82-87；其中的各者以全文引用的方式并入本文中)。

在某些实施方案中，经由玻璃体内途径达成眼内给药。通常通过注射器及27号规格(gauge)至30号规格针进行玻璃体内给药(参见例如Jiang等人,见上文)。

虽然所有这些施用形式均被明确地考虑在本发明的范畴内，但是施用形式可以为注射溶液，特别为用于玻璃体内注射的溶液。通常，适用于注射的药物组合物可包含缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)、任选选用的稳定剂(例如，人类白蛋白)等。然而，在与本文的教示内容兼容的其他方法中，可以将本发明的抗体直接递送至不利细胞群的部位，由此增加患病组织对治疗剂的暴露。

在替代实施方案中，药物组合物可以根据常规程序调配为适于静脉内或皮下施用人类的药物组合物。通常，通过注射施用的组合物为于无菌等张水性缓冲液中的溶液。必要时，药物物亦可包括助溶剂及诸如利多卡因(lignocaine)的局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。一般而言，所述成分为单独提供或以单位剂型混合在一起，例如呈于指示活性剂量的气密密封容器(诸如安瓿或药囊)中的干燥冻干粉末或无水浓缩物形式。当通过输注施用药物物时，其可用含有无菌药物级水或盐水的输注瓶来配药。当通过注射施用药物物时，可提供注射用无菌水或盐水的安瓿，以使得所述成分可在施用前混合。

此外，药物组合物可以作为药物试剂盒提供，该药物试剂盒包含(a)容纳冻干形式的根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段的容器及(b)容纳用于注射的药学上可接受的稀释剂(例如，无菌水)的第二容器。药学上可接受的稀释剂可用于复原或稀释冻干的抗C3抗体或其抗原结合片段。视需要与该(等)容器相关联的可为由管理药物物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的注意事项，该注意事项反映了制造、使用或销售机构批准用于人类给药。

可通过标准临床技术确定有效治疗或预防眼或眼部疾病的根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段的量。另外，体外分析可任选用于帮助鉴别最佳剂量范围。调配物中所用的精确剂量亦将取决于施用途径及病症的阶段，并且应根据医师的判断及各患者的情况来决定。可自来源于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线外推出有效剂量。

例如，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段的毒性及治疗功效可以在细胞培养物或实验动物中通过用于确定ED50(在50％群体中有效的治疗剂量)的标准药学程序来确定。展现出较大治疗指数的抗C3抗体或其抗原结合片段为优选的。

自细胞培养物分析及动物研究获得的资料可用于调配用于人类的剂量范围。抗C3抗体或其抗原结合片段的剂量通常在包括ED50在内的循环浓度范围内，毒性很小或没有毒性。剂量可视所采用剂型及所用施用途径而在此范围内变化。对于此方法中使用的任何抗C3抗体或其抗原结合片段，治疗有效剂量最初可自细胞培养分析中估计。可在动物模型中调配剂量以达成包括以在细胞培养物中所测定的IC50(亦即，达成症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更准确地测定人类中的适用剂量。可例如通过高效液相色谱、ELISA及其类似方法测量血浆中的含量。

对于根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段的玻璃体内注射，通常较长的治疗间隔为优选的。由于其改进的效力，本发明的抗C3抗体可以以更长之间隔施用。

在一个实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段每6周，优选每7周，优选每8周，优选每9周，优选每10周，优选每11周，且更优选每12周施用。在又一优选的实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段每3个月施用一次。

由于可以施用眼睛的体积受到严格限制，所以根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段可以调配成高浓度为非常重要的。此外，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段的效力非常重要，因是有效的抗体可以在甚至更低的剂量下发挥其作用，且由此延长活性及治疗间隔。

本发明的抗体可以调配成非常高的剂量，包括但不限于20mg/ml，30mg/ml，40mg/ml，50mg/ml，60mg/ml，70mg/ml，80mg/ml，90mg/ml，100mg/ml，110mg/ml，120mg/ml，130mg/m，140mg/ml，150mg/ml，160mg/ml，170mg/ml，180mg/ml，190mg/ml，200mg/ml。优选地，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段可以调配成液体调配物，其浓度包含90mg/ml至180mg/ml，更优选130mg/ml至160mg/ml。优选地，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段可以调配成约150mg/ml的液体调配物。

可施用患者的典型剂量为约2.5mg/眼至20mg/眼，或7.5mg/眼至15mg/眼。在一具体实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段可以以每只眼睛7.5mg的浓度施用患者。在另一具体实施方案中，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段可以每只眼睛15mg的浓度施用患者。可用于此类调配物的典型缓冲组分包含例如乙酸钠、PS20及二水合海藻糖。

在一些实施方案中，包含抗C3抗体或其抗原结合片段的药物组合物可以进一步包含与结合剂结合或未结合的治疗剂。

关于组合施用的治疗方案，在一特定实施方案中，抗C3抗体或其抗原结合片段与治疗剂同时施用。在另一特定实施方案中，治疗剂在施用抗C3抗体或其抗原结合片段之前或之后相隔至少一小时及长达几个月施用，例如在施用抗C3抗体或其抗原结合片段之前或之后至少一小时、五小时、12小时、一天、一周、一个月或三个月。

聚核苷酸、载体、宿主细胞及重组方法

在一个方面，本发明涵盖包含编码根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段的序列的经分离聚核苷酸、包含所述聚核苷酸的载体及宿主细胞，以及用于产生该抗体的重组技术。经分离聚核苷酸可以编码任何所需形式的抗C3抗体或其抗原结合片段，包括例如全长单克隆系抗体、Fab、Fab'、F(ab')₂及Fv片段、双功能抗体、线性抗体、单链抗体分子及由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本领域已知的，包含编码根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段的序列的聚核苷酸可以融合至一个或多个调节或控制序列，并且可以包含在合适的本领域已知的表达载体或宿主细胞中。编码重链或轻链可变域的聚核苷酸分子中的各者可以独立地融合至编码恒定域(诸如人类恒定域)的聚核苷酸序列，从而能够产生完整的抗体。或者，可以将聚核苷酸或其部分融合在一起，从而提供用于产生单链抗体的模板。

对于重组生产，将编码抗体或其抗原结合片段的聚核苷酸插入可复制载体中用于克隆系(DNA扩增)或表达。许多适合表达重组抗体的载体为可用的。载体组分通常包括但不限于以下的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、强化子组件、启动子及转录终止序列。

根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段亦可以作为融合多肽产生，其中该抗体或其片段与异源多肽融合，诸如信号序列或在成熟蛋白质或多肽的氨基末端具有特异性切割位点的其他多肽。所选择的异源信号序列通常为被宿主细胞识别及加工(亦即，被信号肽酶切割)的序列。对于不会识别及加工抗C3抗体信号序列的原核宿主细胞，可以用原核信号序列替代该信号序列。信号序列可以为例如碱性磷酸酶、青霉素酶、脂蛋白、热稳定肠毒素II前导子及其类似物。对于酵母分泌，可以用例如自酵母转化酶α-因子(包括酵母菌及克鲁维酵母α-因子前导子)、酸性磷酸酶、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶获得之前导序列或在WO90/13646中描述的信号替代原生信号序列。在哺乳动物细胞中，可以使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导子，例如单纯疱疹病毒gD信号。此类前驱体区域的DNA在读框中连接至编码人源化抗C3抗体或其抗原结合片段的DNA。

表达载体及克隆系载体含有使得载体能够在一个或多个选定的宿主细胞中复制的核酸序列。一般而言，在克隆系载体中，此序列为使得载体能够独立于宿主染色体DNA而复制的序列，且包括复制起点或自主复制序列。此类序列对于各种细菌、酵母及病毒而言为熟知的。质体pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性菌，2-υ.质体来源适用于酵母，且各种病毒来源(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV及BPV)可用于在哺乳动物细胞中克隆系载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(通常可仅使用SV40起点，因为其含有早期启动子)。

表达载体及克隆系载体可含有编码可选标记的基因，以便于识别表达。典型可选标记基因编码如下蛋白质：其赋予对抗生素或其他毒素，例如胺苄青霉素(ampicillin)、新霉素(neomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)或四环素(tetracycline)的抗性，或替代地为补充营养缺陷型缺乏，或在其他替代方案中提供不存在于复杂培养基中的特定营养素，例如编码用于杆菌(Bacilli)的D-丙氨酸消旋酶的基因。

选择方案的的一个实施例利用药物来阻滞宿主细胞生长。这些经异源基因成功转形的细胞产生赋予耐药性的蛋白质且因此在选择疗法中存活。此种优势选择的实施例使用药物新霉素、霉酚酸及潮霉素。哺乳动物细胞的常见选择标记为那些能够鉴定能够摄取编码人源化抗C3抗体的核酸的细胞的标记，诸如DHFR(二氢叶酸还原酶)、胸苷激酶、金属硫蛋白-I及-II(诸如灵长类动物金属硫蛋白基因)、腺苷脱胺酶、鸟氨酸脱羧酶及其类似物。通过在含有DHFR竞争性拮抗剂胺甲喋呤(Mtx)的培养基中培养所有转形体，首先鉴定用DHFR选择基因转形的细胞。当使用野生型DHFR时，合适的宿主细胞系DHFR活性缺乏的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株(例如DG44)。

或者，宿主细胞(特别为含有内源性DHFR的野生型宿主)用编码抗C3抗体、野生型DHFR蛋白及另一种选择标记(诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转形或共转形，可以通过在含有选择标记的选择剂(诸如氨基糖苷类抗生素，例如康霉素(kanamycin)、新霉素或G418)的培养基中进行细胞生长来选择。参见例如，美国专利第4,965,199号。

在酵母细胞作为宿主细胞执行重组生产的情况下，存在于酵母质体YRp7中的TRP1基因(Stinchcomb等人,1979,Nature 282:39)可用作选择标记。TRP1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变菌株提供选择标记，例如ATCC编号44076或PEP4-1(Jones,1977,Genetics 85:12)。酵母宿主细胞基因组中存在trp1损伤接着提供通过在不存在色氨酸下生长检测转形的有效环境。类似地，诸如ATCC 20,622及38,626的Leu2p缺乏酵母菌株由带有LEU2基因的已知质体来补充。

另外，衍生自1.6μm环形质体pKD1的载体可用于克鲁维酵母的转形。或者，针对乳酸克鲁维酵母报导了一种用于大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统(Van den Berg,1990,Bio/Technology 8:135)。亦已公开用于通过工业克鲁维酵母菌株分泌成熟重组人类血清白蛋白的稳定多复本表达载体(Fleer等人,1991,Bio/Technology 9:968-975)。

表达载体及克隆系载体通常含有被宿主生物体识别并可操作地连接至编码抗C3抗体或其多肽链的核酸分子的启动子。适合于与原核宿主一起使用的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶及乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统及杂合启动子，诸如tac启动子。其他已知细菌启动子亦为适合的。用于细菌系统的启动子亦将含有Shine-Dalgamo(S.D.)序列，该序列可操作地连接至编码人源化抗C3抗体的DNA。

已知许多真核启动子序列。几乎所有的真核基因均具有富AT区，其位于转录起始位点上游约25至30个碱基处。在许多基因转录起点上游70至80个碱基处发现的另一序列为CNCAAT区，其中N可为任何核苷酸。大多数真核基因的3'端为AATAAA序列，其可能为将polyA尾添加至编码序列3'端的信号。所有这些序列适合插入至真核表达载体中。

适合与酵母宿主一起使用的启动序列的实施例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖分解酶的启动子，所述糖分解酶诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸去羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶以及葡糖激酶。

诱导性启动子具有通过生长条件控制的额外转录优势。这些启动子包括用于醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的衍生酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及负责麦芽糖及半乳糖利用的酶的酵母启动子区。酵母强化子亦宜与酵母启动子一起使用。

根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段自哺乳动物宿主细胞中的载体的转录受到例如以下各者的控制：获自病毒基因组的启动子，所述病毒诸如为多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳突瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40(SV40)；来自异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子；或来自热休克启动子，其限制条件为启动子与宿主细胞系统兼容。

SV40病毒的早期及晚期启动子宜以亦含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段形式获得。人类巨细胞病毒的即刻早期启动子适宜以HindIII E限制性片段形式获得。在哺乳动物宿主中使用牛乳头状瘤病毒作为载体表达DNA的系统公开于美国专利第4,419,446号。此系统的修改描述于美国专利第4,601,978号。亦参见Reyes等人,1982,Nature 297:598-601，其公开在来自单纯性疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下，人类p-干扰素cDNA于小鼠细胞中的表达。或者，可使用劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)长末端重复序列作为启动子。

可用于重组表达载体的另一有用组件为强化子序列，其用于增加高等真核生物对编码根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段的DNA的转录。许多强化子序列现在已知来自哺乳动物基因(例如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白及胰岛素)。然而，通常使用来自真核细胞病毒的强化子。实施例包括复制起点后侧(bp 100-270)上的SV40强化子、细胞巨大病毒早期启动子强化子、复制起点后侧上的多瘤病毒强化子以及腺病毒强化子。关于增强真核启动子活化的组件的描述亦参见Yaniv,1982,Nature 297:17-18。强化子可以剪接至载体中抗C3抗体编码序列的5'或3'位置，但优选位于启动子的5'位点。

真核宿主细胞(酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞、人类细胞或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体亦可含有终止转录及稳定mRNA所需的序列。此类序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA的5'及偶尔3'非翻译区获得。这些区域包含在编码根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段的mRNA的非翻译部分中转录为聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一种有用的转录终止组分为牛生长激素聚腺苷酸化区域。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。在一些实施方案中，可以使用CHEF系统表达抗C3抗体。(参见例如，美国专利第5,888,809号)。

本文中用于在载体中克隆系或表达DNA的适合宿主细胞系上文所描述的原核生物、酵母或高级真核生物细胞。为此目的合适的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如大肠杆菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(E.coli))、肠杆菌属(Enterobacter)、伊文氏杆菌属(Erwinia)、克留氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门杆菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、锯杆菌属(Serratia)(例如黏质锯杆菌)及志贺杆菌属(Shigella)，以及杆菌(Bacilli)(诸如枯草杆菌(B.subtilis)及地衣杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中公开的地衣杆菌41P))、假单胞菌属(Pseudomonas)(诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))及链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆系宿主为大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其他菌株，诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)及大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)亦为合适的。这些实施例为说明性的而并非限制性的。

除原核生物外，真核微生物，诸如丝状真菌或酵母亦为编码抗C3抗体的载体的合适克隆系或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母为低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、种及菌株在本文中为普遍可用及有用的，诸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、瓦尔特克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)及马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastors)(EP 183,070)；假丝酵母菌属(Candida)；里氏木霉属(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；红面包霉(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；及丝状真菌，诸如红霉属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)及曲菌属(Aspergillus)宿主，诸如构巢曲霉(A.nidulans)及黑曲霉(A.niger)。

用于表达糖基化抗C3抗体或其抗原结合片段的合适宿主细胞来源于多细胞生物体。无脊椎细胞的实施例包括植物及昆虫细胞，包括例如许多杆状病毒株及变体以及来自诸如以下宿主的对应容许昆虫宿主细胞：草地黏虫(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及斑蚊(Aedes aegypti)(蚊虫)、白纹斑蚊(Aedes albopictus)(蚊虫)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)及家蚕(Bombyx mori)(桑蚕(silk worm))。用于转染的各种病毒株可公开获得，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体及家蚕NPV的Bm-5株，且此类病毒可尤其用于转染草地黏虫细胞。

棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、西红柿及烟草的植物细胞培养物亦可用作宿主。

本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段亦可以掺入病毒载体中，亦即将编码抗C3抗体或其抗原结合片段的聚核苷酸引入病毒载体中，接着感染病毒后在患者体内表达。

在另一方面，根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段的表达在脊椎动物细胞中进行。脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已成为常规程序，且技术广泛可用。有用的哺乳动物宿主细胞株的实施例为SV40转形的猴肾CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)、人类胚肾株(293或293细胞次克隆系用于悬浮培养生长(Graham等人,1977,J.Gen Virol.36:59)、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR1(CHO，Urlaub等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216；例如，DG44)、小鼠塞特利氏细胞(sertoli cell)(TM4，Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251)、猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人类宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人类肺细胞(W138，ATCC CCL75)、人类肝细胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)、TR1细胞(Mather等人,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68)、MRC 5细胞、FS4细胞及人类肝肿瘤细胞株(Hep G2)。

宿主细胞用上述用于抗C3抗体或其抗原结合片段生产的表达或克隆系载体进行转形，并在经适当改良以诱导启动子、选择转形体或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。

可以在多种培养基中培养用于产生根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段的宿主细胞。市售培养基，诸如Ham's F10(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,Mo.)、最低必需培养基((MEM),(Sigma-Aldrich Co.))、RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.)及杜尔贝寇改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM),Sigma-Aldrich Co.))适用于培养宿主细胞。此外，Ham等人,1979,Meth.Enz.58:44、Barnes等人,1980,Anal.Biochem.102:255、美国专利第4,767,704号、美国专利第4,657,866号、美国专利第4,927,762号、美国专利第4,560,655号、美国专利第5,122,469号、WO 90/103430及WO 87/00195中之一或多者描述的任何培养基均可用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任一者可视需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙盐、镁盐及磷酸盐)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷及胸苷)、抗生素(诸如健他霉素(gentamicin))、痕量元素(定义为通常以微摩尔浓度范围内的最终浓度存在的无机化合物)及葡萄糖或等效能量来源。亦可以本领域技术人员已知的适当浓度包括其他补充剂。培养条件(诸如温度、pH值及其类似条件)为先前用于经选择用于表达的宿主细胞的培养条件，且对于一般本领域技术人员而言将显而易见。

当使用重组技术时，抗体或其片段可以在细胞内、在周质间隙中产生，或直接分泌至培养基中。若抗体于细胞内产生，则第一步可将细胞破坏以释放蛋白质。可例如通过离心或超滤移除微粒碎片，亦即宿主细胞或溶解片段。Carter等人,1992,Bio/Technology10:163-167描述用于分离被分泌至大肠杆菌的周质间隙的抗体的程序。简言之，在乙酸钠(pH3.5)、EDTA及苯基甲基磺酰基氟(PMSF)存在下历时约30分钟解冻细胞浆料。可通过离心来移除细胞碎片。在抗体分泌至培养基中的情况下，通常首先使用市售蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩此类表达系统的上清液。在任何先前步骤中可包括诸如PMSF的蛋白酶抑制剂以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外来污染物生长。可使用多种方法自宿主细胞分离抗体。

由细胞制备的抗体组合物可使用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析及亲和力色谱加以纯化，其中亲和力色谱为典型纯化技术。蛋白质A作为亲和配位体的适合性视抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的物种及同型而定。蛋白质A可用于纯化基于人类γ1、γ2或γ4重链的抗体(参见例如，Lindmark等人,1983J.Immunol.Meth.62:1-13)。针对所有小鼠同型及人类γ3，推荐蛋白质G(参见例如Guss等人,1986EMBO J.5:1567-1575)。连接亲和配位体的基质最常为琼脂糖，但其他基质为可用的。与琼脂糖可达成的相比，机械上稳定的基质(诸如孔受控的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允许较快流动速率及较短处理时间。当抗体包含CH3域时，Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。取决于欲回收的抗体，亦可以使用其他蛋白质纯化的技术，诸如离子交换柱分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅色谱、肝素SEPHAROSE^TM色谱、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE及硫酸铵沉淀。

在任何初步纯化步骤之后，包含感兴趣的抗体或其片段及污染物的混合物可以使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液进行低pH疏水相互作用色谱，通常在低盐浓度下进行(例如，约0-0.25M盐)。

亦包括在如本文所定义的低、中和高严格条件下与由经分离聚核苷酸序列代表的核苷酸序列的全部或部分(例如，编码可变区的部分)杂交的核酸，该(等)聚核苷酸序列编码根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段。杂交核酸的杂交部分的长度通常为至少15(例如20、25、30或50)个核苷酸。杂交核酸的杂交部分与编码抗C3多肽(例如，重链或轻链可变区)或其补体的部分或全部核酸的序列至少80％，例如至少90％，至少95％，或至少98％一致。可使用本文所描述的类型的杂交核酸例如作为克隆系探针、引物，例如PCR引物或诊断探针。

在一个实施方案中，本发明涉及一种或多种经分离聚核苷酸，其包含编码SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24中所示的重链可变区的序列，及编码SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和/或SEQ ID NO:25中所示的轻链可变区的序列。

应当理解，在该抗C3抗体及抗体片段中，编码CDR的核酸序列保持不变(相对于其编码的氨基酸不变，由于密码子的简并性，DNA序列的等价物为可能的)，但可以工程改造周围区域，例如FR区域。

制造的制品

在另一方面中，包括含有适用于治疗上文所述病症的材料的制品。制品包含容器及标签。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器及试管。容器可由各种材料形成，诸如玻璃或塑料。容器容纳有效治疗病况的组合物且可具有无菌接取口。举例而言，容器可为具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。组合物中的活性剂为根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段。容器上或与容器相关联的卷标指示该组合物用于治疗所选病况。制品可以进一步包含第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)及葡萄糖溶液。其可进一步包括自商业及使用者的观点来看合乎需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器及带有使用说明书的药品说明书。

本发明在以下实施例中进一步加以描述，其不意欲限制本发明的范畴。

实施例

实施例1：地理萎缩的C3机制及病因学

在GA患者中，补体系统的增加及不受控制的活化会导致脉络膜毛细血管的破坏、RPE细胞的损伤以及最终感光体的丧失。

补体活化与疾病病理生理学的相关性基于以下几点：

A.AMD患者视网膜中补体蛋白的表达及补体系统的活化

补体级联的所有蛋白质被发现在视网膜的不同细胞类型中局部表达。在患者中，隐结及GA病变中几种补体因子(例如C3、CFB及C5)的蛋白质含量升高。此外，发现AMD患者的眼房液及血浆中补体活化产物C3a、C4a、C3d、CBb含量升高。膜攻击复合物(MAC)的免疫组织化学染色显示患者GA病灶附近的布鲁赫膜、RPE层及脉络膜毛细血管沉积增加。

B.AMD遗传学

GWAS研究确定补体因子H(CFH)中的Y402H多型性为发生AMD的主要风险因素。在此突变的纯合子个体中发现风险增加高达7倍。CFH为补体系统的主要负调节因子。其增强了C3转化酶C3bBb的衰变并调节已经沉积的C3b的蛋白水解降解。Y402多型性导致CFH与其他蛋白质的结合减少，并且在纯合子患者中发现补体活化产物含量增加以及MAC沉积增加。此外，其他补体基因(例如CFB、C3、C7、C9)的多型性与AMD的发展有关。

C.补体抑制剂的临床研究现有的治疗策略，包括用C3抑制剂(APL-2)及C5抑制剂治疗，在2期临床试验中减少了GA病灶的生长。抑制C3将抑制C3放大环路，且因此抑制补体系统的替代途径、经典途径及凝集素途径。

实施例2：抗C3抗体库的生成及表征

为了产生抗C3抗体，用原生人类C3蛋白免疫3只新西兰白兔。各只动物在不同时间点接受4次C3蛋白注射，使用完全或不完全弗氏佐剂(Freund's adjuvant)。用ELISA测试各只动物的免疫反应，且血清中的特异性抗体滴度表明极好的免疫反应。

scFv抗体cDNA库为经由PCR扩增自分离的兔PBMC及脾淋巴球中提取的RNA构筑的。可变轻域及重域的编码序列分别扩增，并经由一系列重叠PCR步骤连接，得到最终的scFv产物。

使用适当的限制酶消化编码来自兔的scFv的扩增DNA序列，并接合至噬菌粒载体中。噬菌粒载体被转形至非常适合抗体噬菌体展示库生成的大肠杆菌TG1电胜任细胞中。

实施例3：抑制所有三种补体途径的抗C3抗体的筛选

为了筛选具有高亲和力的抗C3抗体，将展示在噬菌体上的scFv提交给针对原生人类C3的几轮生物淘选(选择)。通过降低生物淘选中使用的C3蛋白的浓度或增加洗涤的严格性，各轮均会增加选择的严格性。选择大约380种单克隆系噬菌体并筛选其在ELISA分析中结合C3的能力。

基于噬菌体ELISA数据及DNA指纹，展示的scFv的选择被重组产生为Fab格式的抗体蛋白。评估所得蛋白质结合人类C3及C3b的能力。

为了鉴定阻断所有3种补体途径的抗体，使用酶免疫分析法筛选抗体，使用补体系统筛选(Svar Life Science AB,Sweden)定性测定人类血清中功能性经典途径、凝集素及替代补体途径。克隆系IV(SEQ ID NO:32)被鉴定为能够抑制所有三种补体途径，如表6所示。

表6.单剂量2μM的克隆系IV对CP依赖性、LP依赖性及AP依赖性MAC形成的补体途径抑制.

克隆系IV序列概述于下表7中。

表7：

实施例4：重新格式化、人源化及优化实验(campaign)

重新格式化及人源化：为了抗体人源化及重新格式化为scFv抗体片段格式，将源自兔的克隆系IV CDR序列移植至人类生殖系序列的可变轻链(VL)及可变重链(VH)中。为了VH的人源化，CDR被移植至IMGT_hVH_3_30构架中。为了VL的人源化，CDR被移植至IMGT_hVL_4-69构架中。可变域使用(GGGGS)₄接头(SEQ ID NO:46)以VL-接头-VH方式连接。对于构架4，使用了IGLJ2*01连接(J)基因序列。

重新格式化及人源化的变体克隆系V(SEQ ID NO:33)保留了其抑制经典及替代补体途径的能力，但显示出与亲本分子克隆系IV相比较低的对C3及C3b的结合亲和力。

通过用生殖系序列代替额外的源自兔的氨基酸进一步修饰变体，从而产生克隆系VI(SEQ ID NO:34)。其对人类C3及C3b的亲和力与亲本分子相当，且构建物的热稳定性提高了11.7℃。

克隆系V及克隆系VI序列概述于下表8中。

表8：

亲和力成熟

库构筑：为了提高分子的亲和力，使用克隆系VI(SEQ ID NO:34)作为模板构筑位点饱和库。对CDR L1、L2、L3及H3进行随机化。

生物淘选：将包含轻链随机化的库合并成一个库。同样，将包含重链随机化的库合并成另一库。对轻链及重链库进行针对人类C3的生物淘选。在第二轮、第三轮及第四轮生物淘选(ROP2-4)中，引入了与50μg/mL克隆系IV的竞争，以提高选择严格性并允许鉴定比亲本分子具有更高亲和力的结合物。对通过ROP2-4中的噬菌体ELISA鉴定的命中进行定序。ROP4中最有前景的候选物以scFv格式表达及纯化。

命中表征：ROP4中鉴定的所有命中均包含CDR L3或CDR H3中的氨基酸取代。

所有命中均已成功表达及纯化。对于克隆系VII(SEQ ID NO:35)、克隆系VIII(SEQID NO:36)及克隆系IX(SEQ ID NO:37)观察到对人类C3及C3b的最佳结合亲和力，C3亲和力分别为1.1nM、184pM及1.3nM。

克隆系VII及克隆系IX显示出与亲本分子克隆系IV相当的结合亲和力及补体抑制活性。与克隆系IV相比，克隆系VIII显示对C3及C3b的结合亲和力增加了大约10倍，并且在补体抑制分析中表达出优异的效能。

克隆系VII、VIII及IX的序列概述于下表9中。

表9：

scFv的稳定性

通过引入二硫键(VL 43C、VH 105C)进行scFv的稳定化。天然抗体在恒定轻链及恒定重链CH1域之间有保守的链间二硫键，可强烈稳定轻链及重链之间的相互作用。scFv中不存在此链间二硫键可能导致可变域不稳定及形成二聚体、三聚体及更高级的寡聚物物种，尤其为在以高浓度调配时。二硫键的存在因此可以稳定scFv的VH/VL界面。

克隆系VI的重链构架的稳定性通过引入构架取代进行了探索，从而特别创建了克隆系X(SEQ ID NO:38)。克隆系X及其二硫键稳定的变体克隆系XI(SEQ ID NO:39)在37℃及>100mg/mL蛋白质浓度下的稳定性研究中进行了比较。克隆系XI在37℃下培育两周仅导致3.3％的单体纯度损失，而亲本分子克隆系X损失了60.4％的单体含量(表10)。

表10：二硫键稳定的scFv克隆系XI及亲本分子克隆系X在37℃下的浓度依赖性单体稳定性.

克隆系X及XI的序列概述于下表11中。

表11：

最终优化

在克隆系XII(SEQ ID NO:40)、克隆系XIII(SEQ ID NO:41)及克隆系XIV(SEQ IDNO:42)中组合了最有前景的亲和力成熟取代及二硫键稳定化。

热稳定性及对人类C3及C3b的亲和力由DSF及SPR分析确定。克隆系XII、克隆系XIII及克隆系XIV的解链温度分别为70.4℃、67.7℃及67.2℃。分别地，克隆系XII对人类C3及C3b的结合亲和力为4.7nM及4.8nM，克隆系XIII为116pM及110pM，且克隆系XIV为129pM及116pM。

亦在补体抑制分析中测试了克隆系XII、克隆系XIII及克隆系XIV的活性。克隆系XII、克隆系XIII及克隆系XIV在经典途径中抑制补体的IC50值分别为0.098μM、0.06μM及0.05μM，而亲本克隆系IV的IC50展示为0.08μM。克隆系XII、克隆系XIII及克隆系XIV在替代途径中抑制补体的IC50值分别为0.21μM、0.26μM及0.25μM，而克隆系IV的IC50展示为0.28μM。总的来说，克隆系XIII及克隆系XIV显示出比克隆系IV更优越的功能性质。此外，在浓度依赖性稳定性研究中比较了克隆系XIII及克隆系XIV。克隆系XIII可浓缩至150mg/mL，单体含量无损失，且在37℃下培育2周后仅损失2.2％，而克隆系XIV在浓缩至50mg/mL时已损失1.6％的单体含量，且在37℃下培育2周后再损失2.3％。

克隆系XII、克隆系XIII及克隆系XIV的序列概述于下表12中。

表12：

最终人源化：经由EpiVax进行的免疫原性风险预测公开了克隆系X(克隆系XIII的亲代构建物)的中等风险。VH及VL的EpiVax评分分别为-39.36及14.86。此外，克隆系XI显示VH的人类生殖系序列一致性为77％，VL之一致性为87％。

克隆系IX向克隆系XIII的演化仅包含CDR环修饰，因此克隆系XI的FR中确定的责任在克隆系XIII中保持不变。因此，在构架区进行了额外的生殖系化。

此外，计算机仿真分析允许识别在人类抗体库中很少出现的残基，且因此具有增加的免疫原性风险。因此，为了进一步降低免疫原性的风险，以下突变VH S61D、W62S、A63V及Y30S以及VL T56S被纳入候选物。

在最终人源化及优化实验中，发明人创建了克隆系III，其没有关键的翻译后修饰(PTM)基序，进一步经人源化(VL及VH的人类序列一致性分别为86％及89％)且经亲和力成熟。

此外，研究了CDR L2上的异构化基序(DG)，因为其对再折叠良率及亲和力有很大影响。因此，通过引入突变E50D对克隆系III进行了修饰，从而产生了克隆系II。克隆系II显示VL及VH的人类序列一致性分别为87％及89％。

克隆系II的另一变体为通过将整个CDR H2交换为完全人类生殖系序列(在VH中将人类序列与人类生殖系之一致性再增加7％)而产生的，从而产生克隆系I。

发明人因此确保本发明的抗C3不含有可能引起异构化、脱酰胺及氧化的不利条件。发明人进一步验证了根据本发明的抗C3抗体或其抗原结合片段具有可接受的黏度，强储存稳定性，对C3、C3b的高亲和力，在经典途径、替代途径及凝集素途径中表达出相似的效力，表达出扩散穿过猪布鲁赫膜，且没有显示出明显的T细胞活化。

本发明的示例性抗体包括：

-克隆系I：包含SEQ ID NO:20的可变重链及SEQ ID NO:21的可变轻链；

-克隆系II：包含SEQ ID NO:22的可变重链及SEQ ID NO:23的可变轻链；及

-克隆系III：包含SEQ ID NO:24的可变重链及SEQ ID NO:25的可变轻链。

免疫原性

发明人进一步评估了本发明的scFv的免疫原性。发明人已经评估了根据本发明的示例性抗体，亦即克隆系I、克隆系II及克隆系III的预测免疫原性。

为此目的，本发明人已使用计算机仿真工具来预测此类T细胞抗原决定基(由EpiVax研发的EpiMatrix)。

通过筛选多个人类抗体分离物的序列，EpiVax已识别出咸信具有调节潜力的若干高度保守性HLA配位体。实验证据表明这些肽中的多者在大部分个体中具有积极的耐受性。这些高度保守的、调节性的及混杂的T细胞抗原决定基被称为T调节细胞抗原决定基(Tregitope)(De Groot等人Blood.2008年10月15日；112(8):3303-11)。可在大量调控T调节细胞抗原决定基存在下有效地控制人源化抗体中所含有的新抗原决定基的免疫原性潜力。

出于抗体免疫原性分析的目的，EpiVax包括经T调节细胞抗原决定基调整的EpiMatrix分数及抗治疗性抗体反应的对应预测。为了计算经T调节细胞抗原决定基调整的EpiMatrix分数，自EpiMatrix蛋白质分数扣除T调节细胞抗原决定基的分数。经T调节细胞抗原决定基调整的分数已显示与观察到之一组23种商业抗体的临床免疫反应密切相关(DeGroot等人.Clin Immunol.2009年5月；131(2):189-201)。

EpiMatrix量表的结果总结在下表13中。

表13：

本发明抗体的序列在EpiMatrix量表的低端得分，表明本发明的scFv具有非常有限的免疫原性潜力。该EpiMatrix量表为本领域技术人员所熟知，且尤其可以在出版物Mufarrege等人Clin Immunol.,2017年3月；176:31-41的图2中找到。

实施例5：比较化合物的产生

A.APL-1替代物及APL-2替代物

为了比较的目的，发明人开发了坎普他汀的几种衍生物，如下：

●APL-1替代物：聚乙二醇化单坎普他汀衍生物(以下称为“比较化合物A1”或“化合物A1”)

●APL-2替代物：聚乙二醇化二聚坎普他汀衍生物(以下称为“比较化合物A2”或“化合物A2”)。

这些化合物在专利申请案US20200282012A1中作为APL-1及APL-2公开。其进一步公开于：

●Ricklin D,Lambris JD.Compstatin:a complement inhibitor on its wayto clinical application.Adv Exp Med Biol.2008；632:273-292.doi:10.1007/978-0-387-78952-1_20及

●Mastellos DC,Ricklin D,Lambris JD.Clinical promise of next-generation complement therapeutics.Nat Rev Drug Discov.2019；18(9):707-729.doi:10.1038/s41573-019-0031-6。

化合物A1为衍生自坎普他汀的抗C3环肽。化合物A2在化合物A1的基础上进一步开发，延长其循环半衰期，且提高其在血清中的溶解度。化合物A2包含两个经由线性40kDaPEG接头连接的肽部分。

化合物A1及化合物A2的序列总结在下表14中。

表14：

关于化合物A1及化合物A2的结构及序列的其他数据可在Adv Exp MedBiol.2008；632:273-292中获得。

B.NGM621替代物

为了进行比较，发明人开发了一种NGM化合物，如WO2019195136A1中所公开。此NGM化合物优选作为NGM621替代物，在下文中称为“比较化合物A3”或“化合物A3”。该化合物A3为抗C3 IgG，具有以下特征。

相关序列如下概述于下表15中。

表15：

基于上述序列，发明人进一步开发了Fab格式的NGM621替代物。该化合物称为“化合物A3 Fab”。

实施例6：比较数据

A.不同作用机制

本发明的示例性抗体及比较化合物具有独特的作用机制及独特的特征，总结如下：

-本发明的抗体抑制C3及C3b，

-APL-2抑制C3及C3b，

-NGM621抑制C3，以及

-抑制C5。

发明人已经表明，与NGM621相反，本发明的示例性抗体克隆系I以相似的亲和力结合C3及C3b，如下表16所说明。

表16：

	本发明的示例性抗体(克隆系I)	NGM621*
			C3(Kd,nM)	0.16	0.34
C3b(Kd,nM)	0.14	>34

*已发布的数据Alexander Loktev等人。“NGM621 is a potent inhibitoryanti-complement C3 antibody in development for treatment of geographicatrophy”ARVO 2020Meeting,Poster B0267。

B.ScFv格式可以在每次IVT注射中递送更多的药物分子

发明人建立了根据本发明的示例性抗体及比较化合物A2、比较化合物A3及的质量重量、注射体积及可能的剂量(数据可自文献中获得)，如下表17所说明。

表17：

本发明的抗体证明了每次IVT施用眼睛时可提供更高的药物量，有助于在眼睛中达成更大的补体抑制。

C.与Fab或IgG相比，ScFv格式在等摩尔玻璃体内注射后可以更好地渗透视网膜。

发明人比较了scFv(溴珠单抗)及Fab(兰尼单抗)在食蟹猕猴中等摩尔玻璃体内注射后的视网膜渗透。数据表明，与Fab或IgG相比，scFv格式可改善视网膜渗透。因此，与Fab相比，scFv格式的本发明抗体在玻璃体内施用时有望达到优异的视网膜暴露水平(图1A及图1B)。

实施例7：本发明的scFv的效力及体外活性以及与比较化合物A1及比较化合物A3的比较

为了确定功能效力及比较本发明的示例性scFv，进行以下分析：测量膜攻击复合物的产生的补体抑制分析及溶血分析。

A.材料及方法

a.补体抑制分析

为了监测人类血清中补体系统的抑制，使用酶免疫分析法测试本发明的scFv或比较分子，以使用补体系统筛选(Svar Life Science AB,Sweden)，遵循供货商的说明，对人类血清中功能性经典、凝集素及替代补体途径进行定性测定。产生的C5b-C9新抗原的量与补体途径的功能活性成正比。本发明的scFv及比较分子在浓度反应曲线中进行测试，且抑制的IC50使用GraphPadPrism软件及非线性的4参数曲线回归计算。

b.溶血分析

评估了抗C3抗体片段抑制人类血清中经典途径(CP)或替代途径(AP)活化介导的抗体致敏绵羊红血球溶血的能力。为此，绵羊红血球表面涂有溶血素(兔抗绵羊抗体)以活化人类血清中的补体系统，导致C3活化并随后形成膜攻击复合物(MAC)。MAC聚集在绵羊红血球的膜上，导致细胞溶解。自溶解的红血球释放的血红蛋白含量在OD 414nm处测量，并与血清样品中存在的补体活性成正比。为确定抗C3分子抑制CP活性的能力，将人类血清稀释在GVB++缓冲液(补体技术)中以最佳活化经典途径(需要钙及镁离子)。自此溶液制备抗C3测试样品的系列稀释液，各数据点的终浓度为1％人类血清(在加入红血球之前)。样品与抗体致敏的绵羊红血球在37℃下培育1小时，并在离心步骤后测量上清液中释放的血红蛋白。

人类血清样品中的替代途径(AP)由兔红血球自发活化。由于AP活化需要更高浓度的血清，因此需要用MgEGTA阻断经典途径以螯合Ca2+离子(AP仅需要Mg2+离子)。AP活化导致C3活化并随后形成膜攻击复合物(MAC)。MAC聚集在兔红血球膜上，导致细胞溶解。自溶解的红血球释放的血红蛋白含量在OD 414nm处测量，并与血清样品中存在的补体活性成正比。

B.结果

结果总结于下表18中。

表18：

本发明的示例性抗体(克隆系I、克隆系II及克隆系III)比化合物A1(化合物A2的活性组分)更有效。重要的是，发明人已经表明与化合物A1相比，本发明的示例性抗体更有效地抑制经典途径及凝集素途径。

克隆系I显示出与化合物A1类似的替代途径活性。

与化合物A1相比，克隆系I显示出对经典途径更有效的抑制。

与化合物A1相比，克隆系I显示出对凝集素途径更有效的抑制。

克隆系I：发明人已经表明，本发明的示例性抗体(克隆系I)抑制所有补体效应功能，具有高亲和力及效力。

化合物A1：本发明人已经说明，与本发明的抗体相比，比较化合物A1抑制所有补体效应功能，具有较低的亲和力及效力。

NGM621：本发明人已表明，NGM621替代物、比较化合物A3未显示出C3b抑制作用。

化合物仅靶向C5。

实施例8：对人类C3及C3b的结合亲和力以及本发明抗体、比较化合物A1及比较化合物A3的结合亲和力的比较

发明人已经评估了本发明的示例性scFv对人类C3的结合亲和力以及化合物A1及化合物A3对人类C3及C3b的结合亲和力。

A.材料及方法

使用表面等离子共振(SPR)及Biacore T100装置确定候选物的动力学参数。使用EDC/sulfo-NHC连接化学将C3及其不同变体(表19)固定为HC30M SPR传感器芯片(XanTecbionanalytics,Germany)上的配位体。使用单循环动力学(SCK)模式连续注入各分子(分析物)的五个递增浓度以确定动力学参数。候选物之间的再生为用10mM甘氨酸*HCl、2M NaCl、pH 3.5完成的。数据拟合1:1朗谬结合模型(Langmuir binding model)，并确定了结合速率(ka)、解离速率(kd)及亲和力(K_D)的动力学参数。

已在整个人群中观察到C3中的单核苷酸多型性(SNP)，并且在全基因组关联研究(GWAS)中确定某些SNP与患AMD的风险增加相关。常见的SNP变体包括P314L，其出现在大约23.3％的人群中，以及R102G，据报导，其出现在大约26-29％的人群中。在不到2.5％的人群中出现的非常罕见的变体包括K155Q、R735W、S1619W、K65Q及R161W。

因此，发明人测量了本发明的scFv与最常见的C3形式(亦即R102G及P314L)的结合亲和力。使用ExpiFectamine CHO表达试剂盒(Thermo Fisher Scientific)在CHO细胞株中表达野生型人类C3、人类C3 P314L及人类C3 R102G。蛋白质表达成具有N端6×His标签，并使用HisTrap Excel HP柱(GE Healthcare)纯化，接着进行尺寸排阻色谱步骤(20010/300GL；GE Healthcare)。

B.结果

本发明的scFv、化合物A1(化合物A2的活性组分)及化合物A3分别与人类C3及C3b结合的动力学及亲和力数据列于下表19中。

表19：

化合物A3以对完整人类C3的高亲和力(KD＝0.34nM)结合C3，但对C3切割片段C3b显示出显著较低的亲和力(>100倍)。

相反，本发明的示例性抗体以比化合物A3更高的亲和力结合C3。此外，本发明的示例性抗体对C3及C3b具有大致相等的结合亲和力。

值得注意的是，与化合物A1及化合物A3相比，本发明的抗体以更高的亲和力结合人类C3及C3b，从而能够更有效地抑制C3。与化合物A3相比，本发明的抗体以更高的亲和力结合C3b，且因此将阻断C3放大环路中C3b的产生以及已经沉积的C3b及通过替代活化途径产生的C3b的活性。

其他结果总结在下表20中。

表20：

因此，发明人证实，包括克隆系I、克隆系II及克隆系III在内的本发明的抗体对C3及C3b具有更高的亲和力，并且比化合物A1更有效地抑制2/3补体活化。

示例性抗体的高结合亲和力有助于延长玻璃体内注射后C3的中和时间，并进一步降低注射频率。改进的结合亲和力及降低的注射频率显著改善了对患者的治疗功效。其亦为患者提供了宝贵的益处，尤其为改善了药物的遵从性及依从性。

进一步值得注意的是，本发明的scFv以比化合物A1更高的亲和力结合野生型C3以及疾病相关的SNP C3P314L。

实施例9：鉴定人类补体C3上的结合抗体的抗原决定基

蛋白质制备：补体组分C3c为C3被C3转化酶及因子I切割产生的主要片段。自人类血浆中分离的C3c购自Athens Research&Technology(产品编号16-16-030303)，用PNGaseF去糖基化并通过尺寸排阻色谱在200柱上纯化。汇集峰值洗脱份，以50kDa截止值使用Amicon过滤装置浓缩，并储存在-80℃。

scFv的晶体：通过将0.1μl蛋白质与0.1μL含有0.1M乙酸铵、0.1M氯化锌、0.1MBIS-TRIS pH 6.0及15％w/v PEG Smear High的储库溶液混合，使用悬滴蒸汽扩散法获得晶体。一天的内出现片状晶体。晶体通过补充有30％v/v甘油的储库溶液进行低温保护，并在液氮中急骤冷冻。

数据收集及结构确定：数据为在Villigen,Switzerland的SLS的光束线X10SA处以100K收集的。在EIGER X 16M检测器上收集了3600讯框，每讯框0.1°。使用autoPROC处理数据。使用先前确定的类似scFv的X射线结构作为模板，使用PHENIX软件套中的SCULPTOR创建分子置换模型。使用以SCULPTOR制备的scFv模型作为模板，使用PHASER进行分子置换。使用Buster对结构进行细化，使用COOT进行模型构建及最小平方拟合分析。

Cryo-EM样品制备及数据收集：C3c与ScFv以1:1.2的比率混合，在277K下培育16小时，并使用200增量柱进行纯化。峰值洗脱份浓缩至36μM并应用于EM网格(Quantifoil-1.2/1.3Au 300)。使用Leica GP(Leica Microsystems)准备低温EM网格。网格在4℃及85％湿度下印渍2秒，接着浸入液氮冷却的液态乙烷中。在带有Falcon III检测器的200kV电压下操作的Glacios显微镜上筛选冷冻网格，并将良好质量的网格转移至在300kV下操作的Titan Krios显微镜。使用Falcon IV检测器(Thermo Fisher Scientific)以超分辨率模式收集影像，该检测器安装在能量过滤器后，校准像素大小为每像素显微照片以的总剂量曝光，并使用CryoSPARC v3.1.1进行处理。堆栈经过运动校正及双重并像，导致每像素的像素大小为

Cryo-EM影像分析：使用CryoSPARC模板选取器自3622张显微照片中选取了总共1,914,120个粒子。选取的粒子以348像素的框大小提取，并在CryoSPARC中合并为174像素。接着，提取的粒子在cryoSPARC-3.1.1中进行3轮2D分类以去除冰、污染物及聚集体，产生421,628个粒子。具有明确定义的C3c-scFv密度的类别用于cryoSPARC-3.1.0中的重头起算重建。基于0.9的2D类别临限值选择245,993个粒子，并进行一轮均匀及非均匀细化。使用348像素的框大小重新提取粒子，并进行两轮进一步的均匀及非均匀细化。此导致傅立叶(fourier)壳层分辨率为

模型构建：C3c(pdb 5FOB)及scFv的X射线结构在CHIMERA的帮助下构建至EM密度中，用PHENIX细化实空间并用COOT检查。界面分析为用PYMOL完成的。

克隆系I的结构由X射线晶体学确定，分辨率为结构的每个不对称单元含有两个分子。除了链A及B中的两个N端残基、链A中的接头残基115-132及链B中的114-133以及链B中的C端残基253之外，所有残基均在电子密度图中得到了很好的定义。

由于复杂分子在EM网格上的优先取向，分辨率在C3c与scFv之间的界面处限制为此仍然允许将X射线衍生模型放入EM图中。将scFv附近内的残基确定为结合位点残基，其对应于人类补体C3(SEQ ID NO:47)上的氨基酸366、392-396、413-421、425、427、442、453、478。结果表明，克隆系I结合了与坎普他汀结合位点部分重叠的抗原决定基，但不限于此。与坎普他汀衍生物相比，本发明的分子表达出的对C3增强的结合亲和力可能为由于此扩展的结合界面。这些结果表明，与背景技术的C3抑制剂相比，本发明的分子以不同的模式与C3结合，此可能有助于其抑制所有三种补体途径的独特能力，包括经典途径(CP)、凝集素途径(LP)及替代途径(AP)。

实施例10：体外BrM渗透分析及BrM渗透性

布鲁赫膜形成脉络膜的最内层，且结构变化被认为会触发GA患者的补体活化。由于补体驱动的脉络膜毛细血管破坏在GA的病理生理学中起着重要作用，因此极好的扩散穿过布鲁赫膜为治疗此疾病的补体抑制剂的一个重要特征。

因此，发明人评估了本发明的scFv在体外扩散穿过布鲁赫膜的能力，并将其与化合物A2及化合物A3进行了比较。

A.材料及方法

猪布鲁赫膜样品用于此测量。猪眼在动物处死后不超过6小时自屠宰场收集，并在4℃下储存直至使用(当天)。

富集的布鲁赫膜(BrM)的制备：将眼睛放入一次性培养皿中，并去除眼球周围的任何残留组织。用解剖刀在虹膜旁边切开眼球，自眼杯中取出眼睛之前部以及晶状体、玻璃体及视网膜组织。将包括上覆的RPE单层的富集的布鲁赫膜自眼杯的整个内表面轻轻取出，放入装有PBS的培养皿中，并小心地在液体中弄平。之后，将布鲁赫膜转移到尤斯室，关闭尤斯室并在一个隔室内填充1ml PBS进行泄漏测试。若5分钟后在第二个隔室中没有观察到明显的液体积聚，则认为膜为完整的。各尤斯室使用来自4只不同眼睛的布鲁赫膜制备物。

用测试样品培育富集的布鲁赫膜：制备APL-2替代物(诸如化合物A2)及抗C3 scFv或APL-2替代物(诸如化合物A2)及NGM621替代物(诸如化合物A3)在PBS(+0.02％ NaN3+蛋白酶抑制剂混合物(完整片剂，微型不含EDTA，EASYpack；Roche))中的主混和液，其足以用于4个尤斯室(每个尤斯室1ml)，各种化合物的最终浓度为0.1mg/ml。将1ml主混和液添加至每个尤斯室的一个隔室(指定的样品室)中。将1ml PBS(+0.02％ NaN3+蛋白酶抑制剂)添加至每个尤斯室的第二个隔室(指定的扩散质室)。尤斯室用石蜡膜密封并在室温下培育，轻轻摇动以促进扩散。

取样及膜完整性分析：对于在不同时间点(4小时、24小时、48小时及72小时)取样，通过小心地上下移液将单个隔室中的溶液混合，并自各样品及扩散质室分别转移90μl至收集管中。在培育期结束时，使用Sphero羧基聚苯乙烯蓝色粒子(Sphero CarboxylPolystyrene Blue Particles)进行膜完整性测试：将悬浮液在PBS中按1:10稀释，并将200μl添加至每个尤斯室的一个隔室(指定的样品室)中并培育30分钟。观察第二个隔室中蓝色粒子的积聚，并记录照相机相片以控制整体膜完整性。

样品分析：将来自样品室及扩散质室的15μl各溶液与作为加载对照的类似量的储存的主混和液一起有效地加载至2块预制聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE Bis-Tris凝胶)上。第一块凝胶通过标准SDS-PAGE及基于考马斯的染色方法进行蛋白质检测(抗C3 scFv)分析。第二块凝胶通过SDS-PAGE及碘化钡染色进行PEG检测(化合物A2)分析。

评估：使用ImageJ2软件(Fiji)分析SDS凝胶的相片。条带被量化并表示为各别室中的测试化合物百分比，其中100％是指同一尤斯装置中样品及扩散质室的条带强度总和。

B.结果

比较了本发明的scFv及坎普他汀衍生物(诸如化合物A2)穿过猪BrM的能力，其同时在来自四只不同猪眼的BrM制备物上培育。与APL-2替代物相比，在所有四种膜制备物中，有显著更高量的scFv穿过BrM。类似地，比较了NGM621替代物(化合物A3)及APL-2替代物(化合物A2)穿过猪BrM的能力，其同时在来自四只不同猪眼的BrM制备物上培育。

与化合物A2及化合物A3相比(图3及图4)，本发明的示例性抗体(克隆系I)显示出优异的扩散穿过布鲁赫膜的能力。

化合物A2：无渗透

化合物A3：与吾人的根据本发明的示例性抗体相比渗透减少。

该分子未经测试。因为其含有与APL-2相同的较大的40kDa PEG部分，因此预计会有类似的现象。

实施例11：本发明的scFv的蛋白质热稳定性

A.材料及方法

使用的技术：DSF

差示扫描荧光法(DSF)通过监测荧光随温度的变化来测量蛋白质解折叠。

蛋白质解折叠的温度(T_m)与抗体稳定性相关联，具体言之与治疗性产物的储存期间的聚集及长期稳定性相关联。单克隆系抗体CH2及CH3域的热量转变对同型内的不同抗体通常为不变的，且CH2域在CH3域之前解折叠。

B.结果

结果总结于下表21中。

表21：

化合物	克隆系I	克隆系II	克隆系III
				TM解折叠℃(DSF)	72.0/71.8	69.5/69.4	69.0/68.5

高T_m值意味着在给定温度下较少的分子填充未折叠状态。因此，高T_m值有利于治疗性蛋白质药物，因为高T_m值可维持生理温度下的活性构象。

这些结果证实了本发明示例性抗体的极好药物性质。特别是，改进的热稳定性质有助于提高治疗功效，同时允许减少对患者的注射剂量及频率。此外，结果表明治疗产品具有更长的架储期及改进的时间稳定性。改进的稳定性及延长的活性有助于使本发明的抗体高度适合于玻璃体内施用。

实施例12：免疫原性风险：筛选预先存在的ADA

发明人使用桥接ELISA筛选健康人类供体的血清中预先存在的针对克隆系I的ADA。来自健康人类供体的血清中存在的预先存在的ADA被固定化的抗C3 scFv结合。在下一步中，ADA与生物素标记的相同抗C3 scFv结合，并利用HRP偶联的链霉抗生物素蛋白检测。

A.材料及方法

按照供货商的说明，使用“生物素结合试剂盒(快速，A型)-Lightning-Link”-试剂盒(Expedeon/Abcam)对scFv进行生物素标记。未标记的scFv用PBS稀释至0.5μg/ml，以每孔50μl转移至96孔盘中，且4℃培育隔夜。第二天，用洗涤缓冲液(3×320μl，0.05％ Tween 20于PBS pH 7.4中)洗涤96孔盘，并在室温下用300μl/孔封闭缓冲液(SuperBlock BlockingBuffer；ThermoFisher scientifi)封闭非特异性结合位点30分钟。接着用洗涤缓冲液(3×320μl/孔)洗涤孔。

来自健康志愿者的人类血清在PBS中稀释至10％，将50μl/孔添加至96孔盘中，并将盘在室温下培育1小时。接着用洗涤缓冲液(3×320μl/孔)洗涤盘，每孔加入50μl/孔的生物素化scFv(0.05μg/ml于PBS中)并在室温下培育1小时。

洗涤盘(3×320μl/孔洗涤缓冲液)，添加50μl/孔链霉抗生物素蛋白-PolyHRP40(SDT试剂；1:5000于PBS中)并在室温下培育30分钟。

洗涤盘(3×320μl/孔洗涤缓冲液)，添加50μl/孔TMB底物(Invitrogen)并在室温下培育5分钟。接着通过添加50μl/孔1N H2SO4终止反应。在450nm处测量吸收。预先存在的ADA会导致吸收增加。

B.结果

对于克隆系I，在50个血清样品中的9个中发现了预先存在的ADA，表明免疫原性的总体风险较低。这些结果证实，本发明的抗体非常适合并有希望用于治疗眼或眼部疾病，且免疫原性风险较低。

实施例13：本发明抗体在高浓度调配物中的生物物理学特征

储存稳定性

测试克隆系I、克隆系II及克隆系III的储存稳定性。将样品浓缩至150mg/ml(Vivaspin20离心装置，5kDa MWCO，3800×g)并在25℃及40℃下储存长达4周。分析样品的低聚反应(SE-HPLC)及化学降解(IEX-HPLC)。表22中报导了与起始值相比单体含量的相应降低。各克隆系的起始单体纯度由SE-HPLC确定为99.96％。对于克隆系I、II及III，通过IEX-HPLC测定的起始装料纯度分别为98.07％、97.16％及96.76％。

克隆系I、克隆系II及克隆系III在25℃及40℃的4周培育期内表达出极好的单体及电荷稳定性。

在高浓度下的黏度

经由标准玻璃体内针头递送药物所需的注射力取决于产品的黏度，并且需要足够低以使医生能够安全注射产品。因此，需要经完全调配的产品的低黏度，在20℃时通常低于15mPa*s。

使用为储存稳定性研究准备的样品进行黏度测量。除了经完全调配的样品(10mMHis pH 5.5、275mM蔗糖、0.02％w/v聚山梨醇酯20)外，亦在最低限度的调配物(10mM组氨酸pH 5.5)中测量各候选物的黏度。执行此操作为为了评估候选物的药物物质可加工性(例如，过滤、泵送、透滤等)，直至150mg/ml的最终药物产品浓度的125％。

使用锥板流变仪在20℃及1000s^-1的剪切速率下测量黏度。简而言之，将剪切速率逐步增加至1,000s^-1以收集100个数据点，接着将剪切速率进一步增加至2000s^-1，再收集10个数据点。最后，将剪切速率逐步降低至起始速率。获得的黏度数据呈现于表22中。已观察到所有候选物均具有良好的填充及可注射性药物产品处理性质。

表22总结了以>150mg/mL调配的克隆系I、II及III的黏度及稳定性性质。

表22

发明人已经表明，本发明的示例性抗体在高浓度调配物中表达出非凡的稳定性。

Claims

1.一种抗C3抗体或其抗原结合片段，其包含可变重链(VH)及可变轻链(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、选自由SEQ ID NO:2及15组成的组的CDR-H2序列、SEQID NO:3的CDR-H3序列；及

其中所述VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、选自由SEQ ID NO:5及18组成的组的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列。

2.根据权利要求1所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，

其中所述VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、SEQ ID NO:2的CDR-H2序列及SEQ ID NO:3的CDR-H3序列；及所述VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:5的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列，或

其中所述VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、SEQ ID NO:15的CDR-H2序列及SEQ IDNO:3的CDR-H3序列；及所述VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:5的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列，或

其中所述VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、SEQ ID NO:15的CDR-H2序列及SEQ IDNO:3的CDR-H3序列；及所述VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:18的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列，或

其中所述VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、SEQ ID NO:2的CDR-H2序列及SEQ ID NO:3的CDR-H3序列；及所述VL包含SEQ ID NO:4的CDR-L1序列、SEQ ID NO:18的CDR-L2序列及SEQ ID NO:6的CDR-L3序列。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变区，其包含与SEQ ID NO:20、22或24的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列；及

轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:21、23或25的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列。

4.根据权利要求1至2中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其包含：

轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:21、23或25的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列；

其中：

其中所述VH包含SEQ ID NO:1的CDR-H1序列、选自由SEQ ID NO:2及15组成的组的CDR-H2序列、SEQ ID NO:3的CDR-H3序列；及

5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:20、22或24的氨基酸序列的重链可变区；及

包含SEQ ID NO:21、23或25的氨基酸序列的轻链可变区。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：

7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为选自由以下组成的组：单链可变片段(scFv)、Fab片段、Fab'片段、Fv片段、双功能抗体及小抗体仿真物。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为单链可变片段(scFv)。

9.根据权利要求8所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为单链片段，所述单链片段包含选自由SEQ ID NO:26、27、28、29、30及31组成的组的氨基酸序列。

10.一种抗C3抗体或其抗原结合片段，其结合根据SEQ ID NO:47中所示的人类补体C3的选自由残基366、392-396、413-421、425、427、442、453及478组成的组的至少一个氨基酸残基。

11.一种抗C3抗体或其抗原结合片段，其结合根据SEQ ID NO:47中所示的人类补体C3的氨基酸残基366、392-396、413-421、425、427、442、453及478中的所有残基。

12.根据权利要求10或11所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗C3抗体或其抗原结合片段为根据权利要求1至9中任一项的抗C3抗体或抗原结合片段。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗C3抗体或其抗原结合片段能够抑制补体活化途径，包括经典途径(CP)、凝集素途径(LP)及替代途径(AP)。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗C3抗体或其抗原结合片段能够结合补体C3及C3b。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗C3抗体或其抗原结合片段能够阻止C3转化酶的形成。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗C3抗体或其抗原结合片段能够穿透布鲁赫膜(Bruch’s membrane)。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗C3抗体或其抗原结合片段与人类C3结合的K_D<50nM，优选K_D<15nM，优选K_D<10nM，优选K_D<7nM，优选K_D<1nM，优选K_D<0.5nM，优选K_D<0.2nM，优选K_D<0.15nM，优选K_D<0.10nM，优选K_D<0.05nM，优选K_D<0.04nM，或更优选K_D<0.03nM。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗C3抗体或其抗原结合片段与人类C3b结合的K_D<50nM，优选K_D<15nM，优选K_D<10nM，优选K_D<7nM，优选K_D<1nM，优选K_D<0.5nM，优选K_D<0.2nM，优选K_D<0.15nM，优选K_D<0.10nM，或更优选K_D<0.05nM。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其对C3及C3b具有大致相等的结合亲和力。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其对C3a、iC3b、C4、C4b、C5和/或C5b的结合亲和力为约10^-4M或更弱。

21.根据权利要求1至19中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，相较于对C3及C3b的结合亲和力，其对C3a、iC3b、C4、C4b、C5和/或C5b的结合亲和力更弱。

22.根据权利要求1至19中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其对C3a、iC3b、C4、C4b、C5和/或C5b不具有结合亲和力。

23.根据权利要求1至19中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其能够抑制C3转化酶放大环路。

24.根据权利要求1至19中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段，其能够抑制脉络膜C3活性。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的抗体或抗原结合片段供作为药物使用。

26.根据权利要求1至24中任一项所述的抗体或抗原结合片段供在制造药物中使用。

27.根据权利要求1至24中任一项所述的抗体或抗原结合片段供用于治疗或预防眼或眼部疾病使用。

28.根据权利要求1至24中任一项所述的抗体或抗原结合片段供用于制备治疗或预防眼或眼部疾病的药物使用。

29.根据权利要求27或28所述的供使用的抗体或抗原结合片段，其中所述疾病为选自由以下组成的组：视网膜病变、增生性视网膜病变(PR)，诸如早产儿视网膜病变、缺血性视网膜病变；糖尿病性视网膜病变(DR)，包括增生性糖尿病性视网膜病变(PDR)及非增生性糖尿病性视网膜病变；糖尿病性黄斑水肿(DME)、糖尿病性黄斑缺血(DMI)；年龄相关的黄斑部变性(AMD)，包括干性AMD及湿性AMD；地理萎缩(GA)、色素性视网膜炎、遗传性视网膜营养不良、近视性变性、网膜静脉阻塞、网膜动脉阻塞、眼内炎、眼色素层炎、囊样黄斑水肿、继发于任何视网膜疾病的脉络膜新生血管膜、视神经病变、青光眼、视网膜脱落、中毒性视网膜病变、放射性视网膜病变、外伤性视网膜病变、药物诱发的视网膜血管病变、视网膜新生血管形成、息肉状脉络膜血管病变、视网膜血管炎、视网膜微动脉瘤、晶状体后纤维组织增生、脉络膜视网膜炎、福斯氏营养不良(Fuch'sdystrophy)、黄斑毛细血管扩张、尤塞氏综合征(usher syndrome)、阵发性夜间血红素尿症(PNH)及斯特格病(Stargardt disease)。

30.根据权利要求27至29中任一项所述的供使用的抗体或抗原结合片段，其中所述眼或眼部疾病为选自由以下组成的组：年龄相关的黄斑部变性、地理萎缩、新生血管性青光眼及糖尿病性视网膜病变。

31.根据权利要求27至30中任一项所述的供使用的抗体或抗原结合片段，其中所述眼或眼部疾病为地理萎缩。

32.根据权利要求27至31中任一项所述的供使用的抗体或抗原结合片段，其用于通过抑制补体经典途径(CP)、凝集素途径(LP)及替代途径(AP)的活性或通过抑制定位于脉络膜的补体C3的活性来治疗眼或眼部疾病。

33.一种使用根据权利要求1至24中任一项所述的抗C3抗体或其抗原结合片段诊断与生物样品中的补体C3相关的病症的方法。

34.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至24中任一项所述的抗体或抗原结合片段及药学上可接受的载体。

35.一种药物组合物，其包含编码根据权利要求1至24中任一项所述的抗体或抗原结合片段的一种或多种聚核苷酸及药学上可接受的载体。

36.根据权利要求1至24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段用于通过非经肠途径、静脉内途径、玻璃体内途径或皮下途径施用。

37.根据权利要求1至24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段通过玻璃体内途径施用。

38.一种经分离的聚核苷酸或多种经分离的聚核苷酸，其编码根据权利要求1至24中任一项所述的抗体或抗原结合片段。

39.根据权利要求38所述的一种经分离的聚核苷酸或多种经分离的聚核苷酸，其包含：

编码SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24中所示的重链可变区的序列，及编码SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25中所示的轻链可变区的序列。

40.一种表达载体，其包含根据权利要求38或39所述的一种经分离的聚核苷酸或多种经分离的聚核苷酸。

41.一种宿主细胞，其包含根据权利要求38或39所述的一种经分离的聚核苷酸或多种经分离的聚核苷酸或根据权利要求40所述的表达载体。

42.一种用于产生抗C3抗体或其抗原结合片段的方法，其包含：

a.获得根据权利要求41所述的宿主细胞，及

b.培养所述宿主细胞。

43.根据权利要求42所述的方法，其进一步包含回收及纯化所述抗体或其抗原结合片段。