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CN118434454A - 一种抗衰老相关疾病的前药及其使用方法 - Google Patents

一种抗衰老相关疾病的前药及其使用方法 Download PDF

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CN118434454A
CN118434454A CN202380014687.1A CN202380014687A CN118434454A CN 118434454 A CN118434454 A CN 118434454A CN 202380014687 A CN202380014687 A CN 202380014687A CN 118434454 A CN118434454 A CN 118434454A
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邓宏魁
董杰斌
郦宏刚
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Beijing Sanxiu Biomedical Technology Co ltd
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Abstract

提供了抗衰老和抗炎前药，其由细胞毒性剂设计，通过化学修饰细胞毒性剂以在体内递送前药后掺入可被SA‑β‑gal切割的位点，以释放活性母体药物。前药包括优选可被修饰的半乳糖基部分、苄氧基羧基和细胞毒性剂部分。通过向受试者施用治疗有效量的抗衰老前药，抗衰老前药用于在有需要的受试者中选择性杀死一种或多种衰老细胞和/或减少急性或慢性炎症反应。所公开的组合物可用于减轻受试者中与衰老相关疾病或病症或炎性病症例如特发性肺纤维化和老年相关眼部病变等。

Description

一种抗衰老相关疾病的前药及其使用方法 技术领域
本发明涉及能够选择性杀死衰老细胞而不是非衰老细胞的化合物，即抗衰老化合物，及其使用方法。
 背景技术
衰老是生理退化、慢性病发病率增加和年龄相关性死亡率的主要危险因素(Lopez-Otin,等人,Cell 153,1194-1217(2013))。在衰老过程中，衰老细胞在多个组织中积累并引起组织功能障碍(van Deursen,等人,Nature 509,439-446(2014)；McHugh,等人,J Cell Biol 217,65-77(2018))。衰老细胞还会分泌多种促炎因子，称为衰老相关分泌表型(SASP)，这导致与年龄相关的身体衰退(Coppe,等人,PLoS Biol 6,2853-2868(2008)；Coppe,等人,Annu Rev Pathol 5,99-118(2010))。细胞衰老还会损害组织再生的能力并导致慢性低度炎症，从而加剧老化过程。清除衰老细胞已成为改善年龄相关疾病和改善健康的有吸引力的潜在方法(Xu等人,Nat Med 24,1246-1256(2018)；Baker等人,Nature 479,232-236(2011)；Baker等人,Nature 530,184-189(2016))。仍然需要开发一种新策略，其允许选择性删除广谱细胞类型或组织中的衰老细胞，用于抗衰老干预。
然而，由于衰老细胞的复杂性和异质性，特异并有效地清除多种类型的衰老细胞仍然具有挑战性(Kirkland,等人J Am Geriatr Soc 65,2297-2301(2017)；Lozano-Torres等人,Nature Reviews Chemistry 3,426-441(2019))。选择性杀死衰老细胞的化合物，称为‘抗衰老药物(senolytics)’，已经引起了相当大的兴趣，并揭示了抗凋亡途径(Zhu等人,Aging Cell 14,644-658(2015),Chang等人,Nat Med 22,78-83(2016))，BCL-2家族抑制剂(Zhu等人,Aging Cell 15,428-435(2016))，HSP90抑制剂(Fuhrmann-Stroissnigg等人,Nat Commun 8,422(2017))和FOXO4-p53复合体(Baar等人,Cell 169,132-147e116(2017))等可以有针对性地实现这一目标。BCL-2家族特别是BCL-XL基因在多种衰老细胞中特异性高表达(He等人,Nat Commun 11,1996(2020))，并通过控制细胞内促凋亡和抗凋亡信号在调节程序性细胞死亡中发挥核心作用(Czabotar,P.E等人,Nat Rev Mol Cell Biol 15,49-63(2014))。尽管对‘抗衰老药物(senolytics)’进行了成功的临床前概念验证，但其潜在的药物转化性受到其相关毒性的限制，譬如BCL-2家族抑制剂的抗衰老作用已在多种临床前模型中得到验证，然而它也有显著的靶内血液毒性，包括血小板减少症(Cang等人,Journal of Hematology&Oncology 8,129(2015))。因此需要开发更精细和新颖的策略，以提高其对衰老细胞的功效和特异性，并降低毒性。
另一种靶向衰老的策略是利用衰老细胞与正常细胞之间的区别。衰老细胞的一个保守和明确的特征是溶酶体和溶酶体蛋白在它们中富集，包括被广泛用作衰老标记物的与衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)(Hernandez-Segura等人,Trends in Cell Biology 28,436-453(2018))。药物和大分子制剂在经过β-半乳糖苷酶的切割后可以在衰老细胞内的优先释放(Ana Guerrero等人,Aging Cell 19:e13133(2020))。半乳糖偶联已经是一种通用的治疗和检测策略，通过使用各种现有配方，包括模块化系统、纳米载体、可激活的前药、探针和小分子，促进优先靶向衰老细胞。因此可以利用半乳糖偶联策略来设计更特异和创新的抗衰老药物。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于选择性靶向衰老细胞的组合物。
本发明的另一个目的是提供用于减轻有需要的受试者中的炎症的组合物。
本发明的另一个目的是提供在有需要的受试者中选择性杀死一种或多种衰老细胞的方法。
本发明的又一个目的是提供在有需要的受试者中改善与衰老相关病症相关的一种或多种症状的方法。
本发明的另一个目的是提供用于改善与病毒诱导的炎症相关的一种或多种症状的方法。
提供了具有抗衰老作用和抗炎作用的前药。前药由细胞毒性剂(母体细胞毒性剂)设计，通过化学修饰细胞毒性剂以掺入可被SA-β-gal切割的位点(以释放活性母体细胞毒药物)，然后在体内递送前药，以便优先杀死衰老细胞。前药包括优选通过乙酰化修饰的半乳糖基部分(本文中，修饰的半乳糖部分)、苄氧羰基和细胞毒性部分(由母体细胞毒性剂提供)。在优选的实施方案中，用于制备前药的细胞毒性母体细胞毒性药物是
在实施方案中，前药可以是晶体形式。
优选的乙酰化半乳糖部分是D-半乳糖四乙酸酯部分，如下所示。
在另一个实施方案中，可以从半乳糖基部分去除一个或多个(例如，两个、三个或四个)乙酰基(Ac)基团。
特别优选的苄氧羰基如下所示。
3-硝基-4-氧-苄基羧基
在另一个实施方案中，可以从上述苄氧羰基中去除NO2。
还公开了在有需要的受试者中选择性杀死一种或多种衰老细胞的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的一种或多种所公开的抗衰老前药。在一些实施方案中，活性剂选择性地杀死经历癌基因诱导的衰老的细胞；经历药物诱导的衰老的细胞；经历年龄诱导的衰老的细胞；疾病相关衰老的细胞(cells disease-associated senescence)和/或经历放射诱导的衰老的细胞。
还提供了在有需要的受试者中减轻炎症的方法。所公开的组合物可用于改善与促炎相关的症状，例如过度激活的巨噬细胞积累(和相关细胞因子的减少)。在特别优选的实施方案中，所公开的组合物可以施用于有需要的受试者，以减少与病毒感染，例如冠状病毒(CoV)感染，更具体地，SARS-CoV或SARS-CoV2感染相关的炎症反应。在该实施方案中，以有效量施用组合物以减少受试者中的一种或多种巨噬细胞，优选SA-β-gal阳性巨噬细胞。
所公开的组合物可用于减少受试者中与衰老相关疾病或病症相关的一种或多种症状和/或受试者中一种或多种炎症相关病症，其包含一长串其他病理学，包括神经病学(例如脑动脉瘤、阿尔茨海默氏病和帕金森病)、肺(例如特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病和囊性纤维化)、眼科(例如白内障、青光眼、黄斑变性)、肌肉骨骼(例如少肌症、椎间盘退变)、心血管(例如动脉粥样硬化、心脏纤维化、主动脉瘤)、肾(例如移植并发症)、和其他疾病，如粘膜炎、高血压、肝纤维化和骨髓纤维化(OMF)。
具体而言，通过以下实施方案解决了本领域的技术问题。
1.用于选择性杀死一种或多种衰老细胞或缓解与炎性病症相关的一种或多种症状的活性剂，所述活性剂包含：
(i)如式I所示的β-gal部分
(ii)如式II所示的细胞毒性部分，
其中位置*处N原子上的氢、位置**处C原子上的羧基和W上的氢中的一者或多者被接头X取代，从而通过接头X与所述β-gal部分连接，或是位置*处、位置***处N原子直接与所述β-gal部分连接；
(iii)如式(a)-(j)中任一者所示的接头X：
其中接头X在连接位置处与所述β-gal部分连接，并且在连接位置处与所述细胞毒性部分连接，
其中在式(e)和(f)的接头X中，连接在两个连接位置处的细胞毒性部分是相同或不同的；
其中
R1、R2、R3和R4独立地选自H、-C(O)R5、-C(O)OR6、-C(O)NR7R8和-PO3R9，其中R5、R6、R7、R8和R9独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环状基团以及取代或未取代的杂环基；
每个R4’、R5’和R6’独立地选自氢、硝基、氰基、异氰基、氨基、羟基、硫醇基、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、取代或未取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸基、磷酰基和膦酰基；
n是0、1、2、3或4；
mAb为单克隆抗体，并且连接基团Z为用于抗体偶联的连接基团；
其中
连接基团L选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环状基团以及取代或未取代的杂环基；
连接基团L优选选自以下结构：
其中在环氮原子处与W基团连接；和
m是0、1、2或3；
连接基团L最优选选自以下结构：
W选自取代或未取代的环状基团、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的桥环烷基、取代或未取代的杂桥环烷基、取代或未取代的螺环烷基、取代或未取代的杂螺环烷基、取代或未取代的稠环芳基以及取代或未取代的杂稠环芳基；
条件是当W上的氢被接头X取代时，W具有氨基、仲氨基、环仲胺基或羟基并且氨基、仲氨基、环仲胺基或羟基中的N原子或O原子上的氢被接头X取代。
2.根据项目1所述的活性剂，其中R4’独立地选自氢、硝基、氰基、异氰基、氨基、羟基、硫醇基和卤素。
3.根据项目2所述的活性剂，其中R4’独立地为氢或硝基。
4.根据项目1所述的活性剂，其中R5’和R6’独立地是氢。
[根据细则26改正 17.04.2023] 5.根据项目1所述的活性剂，其中R5’和R6’独立地是如下所示的溶酶体导向单元：
其中R7’、R8’和R9’独立地为不存在、亚烷基、亚烷氧基、亚烷基氨基或亚烷基羰基；
其中R10’、R11’和R12’独立地选自氢、硝基、氰基、异氰基、氨基、羟基、硫醇基、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、取代或未取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸基、磷酰基、膦酰基和膦酰基；
n1是0、1、2、3或4。
[根据细则26改正 17.04.2023] 6.根据项目5所述的活性剂，其中R5’和R6’独立地选自以下结构：
[根据细则26改正 17.04.2023] 其中R3’为取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷基氨基或者取代或未取代的烷氧基。
[根据细则26改正 17.04.2023] 7.根据项目1-6中任一项所述的活性剂，其中所述接头X独立地选自以下结构：
8.根据项目7所述的活性剂，其中所述接头X独立地选自以下结构：
9.根据项目1所述的活性剂，其中Z基团选自：
10.根据项目1所述的活性剂，其中R1、R2、R3和R4独立地为H或-C(O)R5。
11.根据项目10所述的活性剂，其中R5独立地为取代或未取代的烷基。
12.根据项目1所述的活性剂，其中所述β-gal部分独立地选自以下结构：
13.根据项目1所述的活性剂，其中W选自以下基团：
其中R13’为氢、氘、卤素、氨基、羟基、硝基、硫醇基、氰基、异氰基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、取代或未取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸基、磷酰基和膦酰基；其中R14’为氢、氘、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环状基团以及取代或未取代的杂环基；其中p是0、1、2、3或4。
[根据细则26改正 17.04.2023] 14.项目1所述的活性剂，其中所述活性剂具有如下结构：
[根据细则26改正 17.04.2023] 其中Y为W并且具有氨基、仲氨基、环仲胺基或羟基，并且
[根据细则26改正 17.04.2023] 其中所述氨基、仲氨基、环仲胺基或羟基中的N原子或O原子上的氢被接头X取代。
[根据细则26改正 17.04.2023] 15.根据项目1所述的活性剂，所述活性剂具有以下结构：
16.根据项目14所述的活性剂，其中Y选自以下结构：
[根据细则26改正 17.04.2023] 17.根据项目1所述的活性剂，其中所述活性剂选自：
18.根据项目1所述的活性剂，其中当W含有被氨基或羟基取代的苯基时，所述氨基或羟基中的N原子或O原子上的氢被所述β-gal部分取代，使得所述细胞毒性部分不经由接头X直接与所述β-gal部分连接。
[根据细则26改正 17.04.2023] 19.根据项目18所述的活性剂，其中所述活性剂为：
20.组合物，其包含杀死一种或多种衰老细胞或缓解与炎性病症相关的一种或多种症状的有效量的项目1-19中任一项的活性剂。
21.项目20所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
22.在受试者中选择性杀死一种或多种衰老细胞或缓解与炎性病症相关的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的项目20或21的组合物。
23.项目22所述的方法，其中所述受试者患有衰老相关疾病或病症或炎症疾病或病症。
24.项目22或23所述的方法，其中所述衰老相关疾病或病症是代谢疾病、炎性疾病或病症、肺部疾病或病症、神经疾病或病症、增殖性病症、肾病症或疾病、眼部疾病或病症，或皮肤病学病症或疾病。
25.项目22-24中任一项所述的方法，其中所述衰老相关疾病或病症选自：
(i)选自口腔粘膜炎、炎性肠病、脊柱后凸和椎间盘突出症的炎症或自身免疫性疾病或病症；
(ii)选自阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、痴呆、轻度认知障碍、黄斑变性和运动神经元功能障碍的神经疾病或病症；
(iii)选自糖尿病性溃疡、代谢综合征和肥胖症的代谢疾病；
(iv)选自肺纤维化、慢性阻塞性肺病、哮喘、囊性纤维化、肺气肿、支气管扩张和与年龄相关的肺功能丧失的肺部疾病；
(v)选自黄斑变性、青光眼、白内障、老花眼和视力丧失的眼部疾病或病症；
(vi)选自肾衰竭、虚弱、听力损失、肌肉疲劳、皮肤状况、皮肤伤口愈合、肝纤维化、胰腺纤维化、口腔粘膜下纤维化和少肌症的年龄相关病症；和
(vii)选自湿疹、银屑病、色素沉着过多、痣、皮疹、特应性皮炎、荨麻疹、与光敏性或光老化相关的疾病和病症、皱纹、瘙痒、感觉迟钝、湿疹性皮疹、嗜酸性皮肤病、反应性中性粒细胞皮肤病、天疱疮、类天疱疮、免疫大疱性皮肤病、皮肤纤维组织细胞增生、皮肤淋巴瘤和皮肤狼疮的皮肤疾病或病症。
26.项目25所述的方法，其中所述受试者被诊断患有癌症并且任选地正在经历选自化学治疗和放射治疗的癌症治疗。
27.项目26所述的方法，其中所述活性剂
(i)减少已被推向衰老的细胞或癌细胞；
(ii)减少衰老细胞产生的一种或多种副作用，其中所述副作用包括炎症、促进癌生长和促进转移；
(iii)减少化学治疗的一种或多种副作用；或
(iv)减少放射治疗的一种或多种副作用。
28.项目22-27中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性部分在体内递送后被切割。
29.项目22-28中任一项所述的方法，其中所述组合物在体内施用后以杀死一种或多种衰老细胞的有效量获得结构：
其中连接基团L选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环状基团以及取代或未取代的杂环基；
连接基团L优选选自以下结构：
其中在环氮原子处与W基团连接；和
m是0、1、2、3；
连接基团L最优选选自以下结构：
W选自取代或未取代的环状基团、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的桥环烷基、取代或未取代的杂桥环烷基、取代或未取代的螺环烷基、取代或未取代的杂螺环烷基、取代或未取代的稠环芳基以及取代或未取代的杂稠环芳基；
30.项目22或23所述的方法，其中所述受试者具有病毒感染，任选地，其中所述病毒感染导致所述受试者中激活的巨噬细胞的过度产生。
31.项目30所述的方法，其中所述病毒感染是选自冠状病毒、严重急性呼吸系统综合症(SARS)冠状病毒(CoV)、SARS-CoV-2(其引起COVID-19(冠状病毒病)2019))和中东呼吸综合征(MERS)-CoV的冠状病毒感染。
32.项目31所述的方法，其中所述受试者患有SARS-CoV-2感染并且已被诊断患有冠状病毒病2019。
 附图说明
图1.筛选得到A1331852作为最具潜力β-gal修饰母药
A.体外化合物库筛选中，所选部分化合物在诱导衰老A549细胞模型上的杀伤结果。其中，MZ-1、dBET6、ARV-825、I-BET726、I-BET151、INCB057643均为BET抑制剂；A1331852、A1155463为新型Bcl-xL抑制剂；达沙替尼(Dasatinib)、槲皮素(Quercetin)、漆树黄酮(Fisetin)、姜黄色素(Curcumin)为熟知有活性的药物或天然产物。
B.在诱导衰老A549细胞模型上三种Bcl-xL抑制剂的杀伤效果比较。A549，为正常未诱导细胞A549细胞组；A549-CDDP，为体外加顺铂(Cisplatin,CDDP)诱导衰老A549细胞组。
C.在诱导衰老HEF细胞模型上三种Bcl-xL抑制剂的杀伤效果比较。HEF，为分离的早代未诱导细胞HEF细胞组；HEF-ETO，为体外加依托泊苷(Etoposide,ETO)诱导衰老HEF细胞组。
图2.合成与测试A1331852经β-gal后前药A13bGa1
A.基于母药A1331852的β-gal修饰后前药的合成路线。每一步合成反应按图中箭头所示原料及当量配比在所述条件下进行，eq.原料添加配比，rt，室温反应。所有反应均在氮气环境下用干燥溶剂在无水条件下进行。化合物5即为母药A1331852，简写为A13，终产物7a为A13经β-gal修饰后前体药物，命名为A13bGa1。
B.前药A13bGa1经β-gal酶切后释放母药A13示意图。
C.高效液相色谱图显示前药在β-gal酶切前及酶切后峰图变化。A13代表母药A1331852，A13bGa1代表A13经β-gal修饰后前药，A13bGa1+β-gal代表A13前药体外经β-gal酶水解处理后。
图3.体外杀伤确认β-gal前药A13bGa1效果
A.不同细胞体外诱导衰老后SA-β-gal染色检测结果。HUVEC细胞，HEF细胞及HELF细胞使用依托泊苷诱导衰老，A549细胞使用顺铂诱导衰老，BJ细胞及MRC5细胞使用博来霉素诱导衰老。
B-G).前药A13bGa1及其前药A13对人HEF细胞(B)、HELF(C)、BJ细胞(D)、A549细胞(E)、HUVEC细胞(F)、MRC5细胞(G)的体外杀伤比较。
图4.体内测试β-gal前药A13bGa1的血小板毒性
A.单次腹腔注射不同剂量的给定药物后，注射后的第1天、第3天、第5天、第8天、第10天外周血中血小板计数结果。图中每个点代表1只小鼠在该时间点检测得到的血小板数目(n＝4只小鼠)，A13，母药A1331852给药组，A13bGa1，A13经β-gal修饰后前药。mpk为每公斤体重的毫克药量，A13及A13bGa1给药均设2、5、20mg/kg三个不同剂量组。图中虚线指示对照单溶媒对照给药组小鼠血小板数目平均值。
B.小鼠多次给药及后续血常规检测示意图。每周连续3天给药，接着停药4天，连续给药3周。腹腔注射给药，给药时间点分别在第0，1，2，7，8，9，14，15，16天下午，采血检测时间点分别在第1，3，5，8，10，12，15，17，19上午。
C.多次腹腔注射不同剂量的给定药物后，注射后的第1天、第3天、第5天、第8天、第10天、第12天、第15天、第17天、第19天外周血中血小板计数结果。图中每个点代表1只小鼠在该时间点检测得到的血小板数目(n＝4只小鼠)，mpk为每公斤体重的毫克药量，A13为母药A1331852，A13bGa1为A13经β-gal修饰后前药。图中虚线指示对照单溶媒对照给药组小鼠血小板数目平均值。
D.连续3轮给药后A13组观察到小鼠脱毛状态不佳。日常观察发现A13给药组在5mg/kg及20mg/kg连续给药3轮后小鼠脱毛、萎靡状态不佳，其中A13-5mg/kg剂量组4只中2只(2/4)，A13-20mg/kg组4只中2只(2/4)。
图5.体内博来霉素小鼠模型证明前药A13bGa1治疗效果
A.小鼠博来霉素诱导肺纤维化模型造模及治疗示意图。小鼠在第0天用博来霉素经气管滴注给药造模，第4天开始进行腹腔注射药物治疗，每周连续给药3天，停药4天，连续4周。
B.给药治疗过程中小鼠体重监测。A13，A1331852给药治疗，给药剂量2mg/kg，动物只数n＝6；A13bGa1，前药治疗组，给药剂量5mg/kg；VEH，溶媒给药对照(vehicle)治疗组，n＝6；NC，生理盐水气管滴注造模对照组，n＝5。
C.不同组小鼠计算肺比重指数进行比较。小鼠按给药方案完成给药后，处死取肺脏称重，计算肺比重指数，肺指数＝肺重(g)/体重(g)X 100％。A13，A1331852给药治疗，给药剂量2mg/kg；A13bGa1前药治疗组，给药剂量5mg/kg；VEH,溶媒给药对照治疗组；NC，生理盐水气管滴注造模对照组。图中每个点代表1只小鼠的肺比重指数结果，生理盐水造模对照组n＝5，其它组n＝6。统计分析使用非配对t检验，ns表示无统计学差异；*p<0.05；**p<0.01。
D.不同组小鼠处死后肺脏病理取材切片的HE及马松染色代表性结果。Normal，生理盐水气管滴注造模对照组；Vehicle,溶媒给药对照组；A13bGa1，前药治疗组；A13，A1331852给药治疗。标尺：500微米。
图6.小鼠氧诱导视网膜病变模型上前药A13bGa1发挥治疗效果
A.小鼠氧诱导视网膜病变模型造模及治疗示意图。C57BL6/J小鼠在出生后第7天开始连续5天置于75％高氧环境下培养，在出生后第12天进行单次经玻璃体内给药治疗，然后转移至正常空气条件下至第17天进行视网膜取材分析。图中P0，P7，P12，P17分别表示小鼠出生后第0天，第7天，第12天，第17天。
B.玻璃体内注射A13bGa1治疗后小鼠视网膜病理性无血管区域减少代表图。小鼠视网膜微血管经IB4染色标记后进行中心缺血管区域分析，绿色荧光为IB4标记的微血管区域，缺血管区域图中用白色标记圈出。左边图为VEH对照组(单溶媒给药对照)；中间图为A13bGa1单次50ng剂量给药组；右边图为A13bGa1单次100ng剂量给药组。
C.不同组小鼠给药治疗后视网膜病理性无血管区域统计结果。VEH，单溶媒给药对照组，动物只数n＝7；50ng，A13bGa1给药治疗组，剂量为50ng；100ng，A13bGa1给药治疗组，剂量为100ng。图中统计为各样本视网膜缺血区域面积相较于VEH对照组区域面积均值后的定量结果，误差条为标准差。统计分析使用非配对t检验，***p<0.001；****p<0.0001。
D.玻璃体内注射A13bGa1治疗后小鼠视网膜病理性异常新生血管区域减少代表图。小鼠视网膜微血管经IB4染色标记后进行异常新生血管分析，绿色荧光为IB4标记的微血管区域，异常新生血管区域图中用白色标记圈出。左边图为VEH对照组(单溶媒给药对照)；右边图为A13bGa1单次100ng剂量给药组。
E.不同组小鼠给药治疗后视网膜病理性异常新生血管区域统计结果。VEH，单溶媒给药对照组，动物只数n＝7；50ng，A13bGa1给药治疗组，剂量为50ng；100ng，A13bGa1给药治疗组，剂量为100ng。图中统计为各样本视网膜异常新生血管区域面积相较于VEH对照组区域面积均值后的定量结果，误差条为标准差。统计分析使用非配对t检验，*p<0.05；***p<0.001。
图7.体外测试β-gal前药对衰老细胞的选择性杀伤效果
A-B).β-gal前药A13bGa1-lyso(即实施例4中d-12)对A549细胞、顺铂诱导衰老的A549细胞(图7A)，以及对人HEF细胞、依托泊苷诱导衰老的人HEF细胞(图7B)的杀伤作用。
C-D).β-gal前药A13bGa2-lyso(即实施例4中d-11)对A549细胞、顺铂诱导衰老的A549细胞(图7C)，以及对人HEF细胞、依托泊苷诱导衰老的人HEF细胞(图7D)的杀伤作用。
E-F).β-gal前药A13bGb1(即实施例3中b-4)对A549细胞、顺铂诱导衰老的A549细胞(图7E)，以及对人HEF细胞、依托泊苷诱导衰老的人HEF细胞(图7F)的杀伤作用。
A549，为正常未诱导细胞A549细胞组；A549-CDDP，为体外加顺铂(Cisplatin,CDDP)诱导衰老A549细胞组。HEF，为分离的早代未诱导细胞HEF细胞组；HEF-ETO，为体外加依托泊苷(Etoposide,ETO)诱导衰老HEF细胞组。统计分析使用非配对t检验，ns表示无统计学差异；*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001；****p<0.0001。
 具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
SA-β-gal是衰老的主要特征和广泛使用的衰老标志物(Dimri,等人,PNAS,92:9363-9367(1995)；Lee等人,Aging Cell 5,187-195(2006))，本文利用其活性来选择性代谢衰老细胞中的小分子(Lozano-Torres等人,J Am Chem Soc 139,8808-8811(2017))。本文公开的组合物和方法基于基于SA-β-gal的前药策略的开发，以释放活性母体药物以优先杀死衰老细胞。所公开的组合物可用于改善与促炎相关的症状，例如，响应于感染，例如病毒感染的活化巨噬细胞的过度积累。
在肺纤维化领域，特发性肺纤维化(IPF)是最常见、最严重的形式，它被定义为一种特殊形式的慢性、进行性、纤维化的不明原因的间质性肺炎(Raghu G等人,Am J Respir Crit Care Med 183,788-824(2011))。IPF多发于中老年人群，是一种致命的肺病，病人健康组织被改变的细胞外基质取代，肺泡结构被破坏，导致肺顺应性下降，气体交换中断，最终呼吸衰竭和死亡(Wolters PJ等人,Annu Rev Pathol 9，157-179(2014))。虽然IPF病程多变且有些不可预测，但诊断后生存率较低，中位生存时间仅为2-4年，被认为是一种比癌症更凶险的“类肿瘤疾病”(Ley B等人,Am J Respir Crit Care Med 183,431-440(2011)；Hutchinson JP等人,Annals of the American Thoracic Society 11(8),1176-1185(2014))。IPF目前无治愈性药物，市面上的两款药物Pirfenidone(吡非尼酮)及Nintedanib(尼达尼布)仅起到延缓疾病进展的作用，无法根治，且毒性较大，花费较高(Richeldi L等人,N Engl J Med 370,2071-2082(2014)；King TE等人,N Engl J Med 370,2083-2092(2014)；Noble PW等人,Lancet 377,1760-1769(2011))。因此，治愈IPF是一个在人类健康中重大的未满足的医疗需求，需要更好的机制理解发病机理，以开发新的疾病修饰疗法。
越来越多的证据表明，衰老(包括细胞衰老)在IPF发病机制中起了关键的加速作用(Faner R等人,Am J Respir Crit Care Med 186,306-313(2012)；Marissa J等人,Nat Commun 8,14532(2017))。已建立的衰老生物标志物，包括p16、p21和与衰老相关的β-半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)，已在IPF病人肺组织的成纤维细胞和上皮细胞中观察到(Kuwano K等人,Am J Respir Crit Care Med 154,477-483(1996)；Lomas N.J等人,Int.J.Clin.Exp.Pathol.5,58-71(2012))，并且人IPF细胞在体外表现出明显衰老的倾向(Yanai H等人,Aging(Albany NY)7,664-672(2015))。因此，用抗衰老药物(senolytics)来治疗IPF成为一种非常合理且吸引人的选择,，并在近年来快速发展(Jin Pan等人,Int J Radiat Oncol Biol Phys 99(2),353-361(2017)；Jamie N等人,EBioMedicine 40,554-563(2019))。
开发IPF的有效治疗方法的主要困难是这种疾病的发病机制非常不明确。因此，纤维化疾病的建模已经成为一个成熟的研究领域。过去20年里使用的一种常见模型是博莱霉素(BLM)模型，这是一种直接将BLM注入啮齿动物肺部的实验技术。在啮齿动物中，BLM的给药途径有很多种，包括静脉(IV)、皮下(SC)、鼻内(IN)和气管内(IT)，但IT BLM给药是迄今为止最流行的给药方式。在小鼠中，气管内灌注化疗药物博莱霉素可导致可溶性肺纤维化，此模型概括了人类IPF的关键特征(Izbicki G等人,Int.J.Exp.Pathol 83,111-119(2002))。
与许多器官一样，眼睛的功能受损也是随着年龄增长而出现的，并且随着人口的老龄化而越来越普遍。当视力下降和视野丧失变得显著时，它们开始影响患者的日常生活活动能力，如阅读、写作、驾驶和行走。比弗达姆眼科研究表明，视力差、对比敏感度差、双眼视力差异是衰老和虚弱的生物标志物，与跌倒风险呈正相关(Knudtson,Klein等人,Arch Ophthalmol 124(2):243-249(2009))。更令人震惊的是，同一研究将视力损害确定为死亡的独立危险因素(Knudtson,Klein等人,Arch Gerontol Geriatr 49(1):22-26(2006))。目前，已有多种眼部相关疾病的发病被证实与年龄相关，包括老年性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)，糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,PDR)，糖尿病黄斑水肿(diabetic macular edema,DME)以及青光眼(Glaucoma)等等。目前针对年龄相关眼部疾病的主要治疗方法是视网膜的血管护理，其有一定治疗效果但同时也有很大的风险。激光光凝固术治疗消融缺血性视网膜组织，这些组织在疾病中心产生血管生成和炎症因子，但当它们燃烧并破坏神经视网膜时，会引发暗点(Little等人,Ophthalmology 92,279–283(1985))。抗血管内皮生长因子(VEGF)治疗需要定期直接注射到眼睛的玻璃体中，并使患者暴露于潜在的感染和眼内炎(Fintak等人，Retina 28,1395–1399(2008))。此外，在某些患者中，VEGF中和可加速光感受器的萎缩(Grunwald等人，Ophthalmology 121,150–161(2014))。除了抗血管生成疗法，目前正在临床试验中的治疗年龄相关眼部疾病的药物主要针对补体调节或炎症。然而，这些尝试大部分都失败了(Holz FG等人，JAMA Ophthalmol.136(6):666–77(2018))，这并不奇怪，因为这类疾病是由多种因素引起的，这些因素目前还不完全了解。
虽然年龄相关眼部疾病的确切机制还不完全清楚，但与其他成人组织一样，随着时间的推移，眼睛的衰老程序可能是由各种外源性和内源性因素引起的，如氧化应激、代谢紊乱、营养和生长因子信号、炎症和免疫系统紊乱、端粒功能障碍和DNA损伤等等(Marazita MC等人,Redox Biol.7:78–87(2016)；Sreekumar PG等人,Investigative Ophthalmology&Visual Science.57(3):1238–53(2016)；Supanji等人,Exp Eye Res.112:79-92(2013))。衰老的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium(RPE)cells)、视网膜血管内皮细胞(retinal vascular endothelial cells)以及视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells)已经在多种年龄相关眼部疾病(如AMD,DR,DME,Glaucoma)中被发现，同时用相关senolytics药物清除这部分衰老细胞可以明显在相关动物模型中改善疾病症状(Chae JB等人,Geroscience.43(6):2809-2833(2021)；Crespo-Garcia S等人,Cell Metab.33,818–832(2021)；Rocha LR等人,Aging Cell.19(2):e13089.(2020))。因此，开发新的更广谱和特异性地清除眼部衰老细胞的药物是一种能从根本上针对年龄相关眼部疾病的复杂发病机制并有效治疗的办法。
氧诱导视网膜病变(oxygen induced retinopathy(OIR))模型是年龄相关眼部疾病病理学研究的金标准临床前模型，是眼科和血管生物学研究中被广泛引用的疾病模型之一(Smith,LE等人，Invest Ophthalmol Vis Sci 35,101–111(1994)；Connor,KM等人，Nat Protoc 4,1565–1573(2009))。它以早产儿视网膜病变为模型，现在也被广泛用于了解几种以缺氧或炎症驱动的血管生成为特征的视网膜疾病，如新生血管年龄相关性黄斑变性和增殖性糖尿病视网膜病变(Grisanti,S等人，Prog Retin Eye Res 27,372–390(2008)；Simo,R等人，Curr Diabetes Rev 2,71–98(2006))，而正是这些疾病共同构成了失明的主要原因(Stahl,A等人，Invest Ophthalmol Vis Sci 51,2813–2826(2010))。在OIR模型中，最初可在视网膜神经节神经元中观察到的细胞衰老，随后传播到视网膜的其他细胞群(小胶质细胞、血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞)，进一步促进了视网膜病变(Oubaha M等人，Sci Transl Med.8(362):362ra144(2016))。根据以上特征，本实验中采用的氧诱导视网膜病变(OIR)模型，非常适合用于年龄相关眼部疾病的抗衰老药物开发。
I.定义
如本文所用，“细胞毒性部分”是指由母体细胞毒性剂提供的抗衰老前药的部分。
如本文所用，“细胞毒性剂”是指用于杀死细胞的化学品或药物。
如本文所用，“肠胃外施用”表示通过消化道或非侵入性局部或区域途径以外的任何方法施用。
如本文所用，待处理的“患者”或“受试者”是指人或非人动物。
如本文所用，“肠胃外施用”是指通过除通过消化道或非侵入性局部或区域途径以外的任何方法施用。
如本文所用，待处理的“患者”或“受试者”是指人或非人动物。
如本文所用，“抗衰老药物”相比于非衰老细胞选择性地杀死一种或多种衰老细胞。
如本文所用，“治疗有效的”或“有效量”表示所用组合物的量是足以改善疾病或病症的一种或多种原因或症状的量。这种改善只需要减少或改变，而不一定是消除。如本文所用，术语“治疗有效量”、“治疗量”和“药物有效量”是同义词。本领域技术人员可以容易地确定合适的治疗量。
如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转疾病或病症的进展，基本上改善疾病或病症的临床症状或基本上预防疾病或病症的临床症状的出现。
如本文所用，“取代的”是指本文所述的化合物或官能团的所有允许的取代基。在最广泛的意义上，允许的取代基包括有机化合物的无环和环状、支链和非支链、碳环和杂环、芳族和非芳族取代基。示例性的取代基包括但不限于卤素、羟基或含有任何数量碳原子，优选1-14个碳原子的任何其他有机基团，并且任选地包括线性、支链或环状结构形式的一个或多个杂原子，例如氧、硫或氮基团。代表性的取代基包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环状基团、取代的C3-C20环状基团、杂环、取代的杂环、氨基酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、肽和多肽组。这样的烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环状基团、取代的C3-C20环状基团、杂环、取代的杂环、氨基酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、肽和多肽基团可以进一步被取代。
杂原子例如氮可具有氢取代基和/或满足杂原子化合价的本文所述的有机化合物的任何允许的取代基。应理解，“取代”或“取代的”包括这样的隐含条件，即此类取代符合被取代原子和取代基的允许价数，并且该取代产生稳定的化合物，即不会自发经历转化如通过重排、环化、消除等转化的化合物。
除非另有专门和明确规定，术语“取代的”是指结构，例如化合物或更大的化合物上的部分，而不管该结构是如何形成的。该结构不限于通过任何特定方法制成的结构。
如本文所用，“芳基”是指C5-C26元芳族、稠合芳族、稠合杂环或双芳族环系统。如本文所用，广义定义的“芳基”包括5-、6-、7-、8-、9-、10-、14-、18-和24-元单环芳族基团，其可包括从零到四个杂原子，例如苯(benzene)、萘(naphthalene)、蒽(anthracene)、菲(phenanthrene)、chrysene、芘(pyrene)、心环烯(corannulene)、晕苯(coronene)等。
“芳基”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳是两个相邻环(即“稠合环”)共有的，其中至少一个环是芳族的，例如其他环状环或多个环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环。
术语“取代芳基”是指芳基，其中一个或多个芳环上的一个或多个氢原子被一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、羰基(例如酮、醛、羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、亚氨基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基(例如CF3、-CH2-CF3、-CCl3)、-CN、芳基、杂芳基及其组合。
“杂环”、“杂环”和“杂环基”可互换使用，并且是指通过含有3-10个环原子，优选5-6个环原子的单环或双环的环碳或氮原子连接的环状基团，由碳和一到四个杂原子组成，每个杂原子选自非过氧化物氧、硫和N(Y)，其中Y不存在或为H、O、C1-C10烷基、苯基或苄基，并且任选地含有1-3个双键并且任选地被一个或多个取代基取代。根据定义，杂环基不同于杂芳基。杂环的实例包括但不限于哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、二氢呋喃[2,3-b]四氢呋喃、吗啉基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、吡喃基、2H-吡咯基、4H-喹啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、6H-1,2,5-噻二嗪基。杂环基团可以任选地被如上对烷基和芳基定义的一个或多个取代基取代。
术语“杂芳基”是指C5-C26元芳族、稠合芳族、双芳族环系统或其组合，其中一个或多个芳环结构上的一个或多个碳原子已被杂原子取代。合适的杂原子包括但不限于氧、硫和氮。如本文所用，广义定义的“杂芳基”包括5-、6-、7-、8-、9-、10-、14-、18-和24-元单环芳族基团，其可以包括一至四个杂原子，例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、四唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。杂芳基团也可称为“芳基杂环”或“杂芳族化合物”。“杂芳基”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳是两个相邻环(即“稠合环”)共有的，其中至少一个环是杂芳族的，例如其他环或多个环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或其组合。杂芳环的实例包括但不限于苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH-咔唑基、咔啉基、苯并二氢吡喃基、苯并吡喃基、肉啉基(cinnolinyl)、十氢喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、呋喃基、呋咱基(furazanyl)、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、吲哚烯基(indolenyl)、二氢吲哚基、吲哚啉嗪基(indolizinyl)、吲哚基(indolyl)、3H-吲哚基、isatinoyl、异苯并呋喃基、isochromanyl、异吲唑基、异二氢吲哚基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、亚甲二氧基苯基、萘啶基、八氢异喹啉基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、酚黄素基(phenoxathinyl)、吩噁嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基(pyridinyl)、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、苯硫基和呫吨基。一个或多个环可以被取代，如下文对“取代的杂芳基”所定义。
术语“取代的杂芳基”是指其中一个或多个杂芳基环上的一个或多个氢原子被一个或多个取代基取代的杂芳基，所述取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、羰基(例如酮、醛、羧基、烷氧羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、亚氨基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基(例如CF3、-CH2-CF3、-CCl3)、-CN、芳基、杂芳基及其组合。
如本文所用，“烷基”是指饱和脂肪族基团的基团，包括直链烷基、支链烷基、环烷基(脂环族)、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。在优选的实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有30个或更少的碳原子(例如，C1-C30用于直链，C3-C30用于支链)，优选20个或更少，更优选15个或更少，最优选10个或更少。同样，优选的环烷基在其环结构中具有3-10个碳原子，并且更优选在环结构中具有5、6或7个碳原子。在整个说明书、实施例和权利要求中使用的术语“烷基”(或“低级烷基”)旨在包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，后者是指具有一个或多个取代基的烷基部分替换烃主链的一个或多个碳上的氢。此类取代基包括但不限于卤素、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳族或杂芳族部分。
除非另外指定碳原子数，否则本文所用的“低级烷基”是指如上定义的烷基，但在其主链结构中具有1至10个碳原子，更优选1至6个碳原子。同样，“低级烯基”和“低级炔基”具有相似的链长。在整个申请中，优选的烷基是低级烷基。在优选的实施方案中，本文指定为烷基的取代基是低级烷基。
“烷基”包括在烃基以及杂烷基的一个或多个碳原子处的一个或多个取代。合适的取代基包括但不限于卤素，例如氟、氯、溴或碘；羟基；-NRR’，其中R和R’独立地为氢、烷基或芳基，并且其中氮原子任选地被季铵化；-SR，其中R是氢、烷基或芳基；-CN；-NO2；-COOH；羧酸盐；-COR、-COOR或CON(R)2，其中R是氢、烷基或芳基；叠氮化物、芳烷基、烷氧基、亚氨基、膦酸酯、次膦酸酯、甲硅烷基、醚、磺酰基、磺酰氨基、杂环基、芳族或杂芳族部分、卤代烷基(例如-CF3、-CH2-CF3、-CCl3)；CN；-NCOCOCH2CH2；NCOCOCH；-NCS；及其组合。
本领域技术人员将理解，如果合适，烃链上被取代的部分本身可以被取代。例如，取代烷基的取代基可包括卤素、羟基、硝基、硫醇、氨基、叠氮基、亚氨基、酰氨基、磷酰基(包括膦酸酯和次膦酸酯)、磺酰基(包括硫酸酯、磺酰氨基、氨磺酰基、亚砜和磺酸酯)，和甲硅烷基，以及醚、烷硫基、羰基(包括酮、醛、羧酸盐和酯)、卤代烷基、-CN等。环烷基可以以相同方式被取代。
术语“烯基”和“炔基”是指长度和可能的取代与上述烷基相似但分别含有至少一个双键或三键的不饱和脂族基团。
术语“取代的烯基”是指具有取代烃主链的一个或多个碳上的一个或多个氢原子的一个或多个取代基的烯基部分。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。
术语“取代的炔基”是指具有替换烃主链的一个或多个碳上的一个或多个氢原子的一个或多个取代基的炔基部分。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。
如本文所用，“氨基”和“胺”是本领域公认的并且指取代和未取代的胺，例如，可以由以下通式表示的部分：
其中，R、R’和R”各自独立地代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的羰基、-(CH2)m-R”’或R和R’连同它们所连接的N原子一起构成在环结构中具有3至14个原子的杂环；R”’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；m为0或1至8的整数。在优选的实施方案中，R和R’中仅一个可以是羰基，例如，R和R’一起与氮不形成二酰亚胺。在优选的实施方案中，R和R’(和任选的R”)各自独立地代表氢原子、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基或-(CH2)m-R”’。因此，本文使用的术语“烷基胺”是指具有连接其上的取代或未取代的烷基的如上定义的胺基团(即R、R’或R”中的至少一个是烷基)。
如本文所用，“羰基”是本领域公认的并且包括可由以下通式表示的部分：
其中X是键，或代表氧或硫，R代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-(CH2)m-R”或药学上可接受的盐，R’代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代的或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基或(CH2)m-R”；R”代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；m为0或1至8的整数。其中X为氧且R如上定义，该部分也称为羧基。当X为氧且R为氢时，该式代表“羧酸”。其中X为氧且R’为氢时，该式代表“甲酸”。其中X为氧且R或R’不是氢时，该式代表“酯”。通常，其中上式的氧原子被硫原子替换时，该式代表‘硫代羰基’基团。其中X是硫且R或R’不是氢时，该式代表‘硫酯’。其中X是硫且R是氢，该式代表‘硫代羧酸’。其中X是硫且R’是氢时，该式代表‘硫代甲酸酯’。其中X是键且R不是氢时，上式代表‘酮’。其中X是键且R是氢时，上式代表‘醛’。
术语“取代的羰基”是指如上所定义的羰基，其中R、R’或部分
与其连接的基团中的一个或多个氢原子被独立取代。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。
术语“羧基”如上对下式所定义
并且更具体地由式-RivCOOH定义，其中Riv是烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、烷芳基、芳烷基、芳基或杂芳基。在优选的实施方案中，直链或支链烷基、烯基和炔基在其主链中具有30个或更少的碳原子(例如，C1-C30用于直链烷基，C3-C30用于支链烷基，C2-C30用于直链烯基和炔基，C3-C30用于支链烯基和炔基)，优选20或更少，更优选15或更少，最优选10或更少。同样，优选的环烷基、杂环基、芳基和杂芳基在其环结构中具有3-10个碳原子，并且更优选在环结构中具有5、6或7个碳原子。
术语“取代的羧基”是指如上所定义的羧基，其中Riv中的一个或多个氢原子被取代。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。
如本文所用，“杂烷基”是指含有至少一个杂原子的直链或支链、或环状含碳基团、或其组合。合适的杂原子包括但不限于O、N、Si、P和S，其中氮、磷和硫原子任选地被氧化，并且氮杂原子任选地被季铵化。
饱和烃基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基以及其同系物和异构体，例如，正戊基、正己基、正庚基、正辛基。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基和3-丁炔基。
术语“烷氧基(alkoxyl)”或“烷氧基(alkoxy)”、“芳氧基(aroxy)”或“芳氧基(aryloxy)”一般描述由式-ORv代表的化合物，其中Rv包括但不限于取代或未取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、环烯基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂烷基、烷芳基、烷基杂芳基。
如本文所用，术语“烷氧基”或“烷氧基”是指其上连接有氧基的如上定义的烷基。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。“醚”是由氧共价连接的两种烃。因此，使烷基成为醚的烷基的取代基是或类似于烷氧基，例如可以由-O-烷基、-O-烯基和-O-炔基之一代表。如果化合价允许，术语烷氧基还包括环烷基、杂环基、环烯基、杂环烯基和芳烷基，其具有连接到至少一个碳原子上的氧基。
术语“取代的烷氧基”是指具有替换烷氧基主链的一个或多个碳上的一个或多个氢原子的一个或多个取代基的烷氧基。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。
术语“烷硫基”是指连接有硫基的如上定义的烷基。“烷硫基”部分由-S-烷基代表。代表性的烷硫基包括甲硫基、乙硫基等。术语“烷硫基”还包括其上连接有硫基团的环烷基。
术语“取代的烷硫基”是指具有替换烷硫基主链的一个或多个碳原子上的一个或多个氢原子的一个或多个取代基的烷硫基。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。
“芳硫基”是指-S-芳基或-S-杂芳基，其中芳基和杂芳基如本文所定义。
术语“取代的芳硫基”代表-S-芳基或-S-杂芳基，其具有替换本文定义的芳基和杂芳基环的一个或多个环原子上的氢原子的一个或多个取代基。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。
如本文所用，“芳烷基”是指被取代或未取代的芳基或杂芳基取代的烷基。
如本文所用，“烷芳基”是指被取代或未取代的烷基取代的芳基(例如，芳族或杂芳族基团)。
术语“酰胺”或“酰氨基”可互换使用，指“未取代的酰氨基”和“取代的酰氨基”并由通式代表：
其中，E不存在，或E为取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环基，其中独立于E，R和R’各自独立地代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的羰基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷芳基、取代的或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-(CH2)m-R”’或R和R’连同它们所连接的N原子一起构成在环结构中具有3至14个原子的杂环；R”’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；并且m是0或1至8的整数。在优选的实施方案中，R和R’中只有一个可以是羰基，例如，R和R’与氮一起不形成二酰亚胺。在优选的实施方案中，R和R’各自独立地代表氢原子、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基或-(CH2)m-R”’。当E为氧时，形成氨基甲酸酯。如本领域普通技术人员所理解的，氨基甲酸酯不能与另一种化学物质连接，例如形成氧-氧键或其他不稳定键。
术语“磺酰基”由下式代表
其中E不存在，或E为烷基、烯基、炔基、芳烷基、烷芳基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基，其中独立于E，R代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的胺、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-(CH2)m-R”’，或E和R与它们所连接的S原子一起构成在环结构中具有3至14个原子的杂环；R”’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；并且m为0或1至8的整数。在优选的实施方案中，E和R中仅一个可以是取代或未取代的胺，以形成“磺酰胺(sulfonamide)”或“磺酰氨基”。取代或未取代的胺如上所定义。
术语“取代的磺酰基”代表其中E和R独立地被取代的磺酰基。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。
术语“磺酸基”是指如上定义的磺酰基，其中R为羟基，且E不存在，或E为取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基，或取代或未取代的杂芳基。
术语“硫酸酯”是指如上定义的磺酰基，其中E为不存在，氧、烷氧基、芳氧基、取代的烷氧基或取代的芳氧基，如上定义，并且R独立地为羟基、烷氧基、芳氧基、取代的烷氧基或取代的芳氧基，如上定义。如本领域普通技术人员所理解的，当E是氧时，硫酸酯不能与另一种化学种类连接，例如形成氧-氧键或其他不稳定键。
术语“磺酸酯”是指如上定义的磺酰基，其中E为如上定义的氧、烷氧基、芳氧基、取代的烷氧基或取代的芳氧基，并且R独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代的或未取代的炔基、取代或未取代的胺、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-(CH2)m-R”’，R”’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；m为0或1至8的整数。如本领域普通技术人员所理解的，当E为氧时，磺酸酯不能与另一种化学种类连接，例如形成氧-氧键或其他不稳定键。
术语“氨磺酰基”是指磺酰胺或由下式代表的磺酰胺
其中E不存在，或E是取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂环基，其中E、R和R’各自独立地代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的羰基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-(CH2)m-R”’，或R和R’与它们所连接的N原子一起构成在环结构中具有3到14个原子的杂环；R”’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；并且m是0或1至8的整数。在优选的实施方案中，R和R’中只有一个可以是羰基，例如，R和R’与氮一起不形成二酰亚胺。
术语“亚砜”由下式表示
其中E不存在，或E为烷基、烯基、炔基、芳烷基、烷芳基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基，其中独立于E，R代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的胺、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-(CH2)m-R”’，或E和R与它们所连接的S原子一起构成在环结构中具有3至14个原子的杂环；R”’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；并且m为0或1至8的整数。
术语“膦酰基”由下式表示
其中E不存在，或E是取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂环基，其中，独立于E，Rvi和Rvii独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的羰基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-(CH2)m-R”’，或R和R’连同它们所连接的P原子构成在环结构中具有3至14个原子的杂环；R”’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；并且m为0或1至8的整数。
术语“取代的膦酰基”代表其中E、Rvi和Rvii独立地被取代的膦酰基。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。
术语“磷酰基”定义这样的磷酰基，其中E不存在，是如上所定义的氧、烷氧基、芳氧基、取代的烷氧基或取代的芳氧基，并且独立于E，Rvi和Rvii独立地为羟基、烷氧基、芳氧基、取代的烷氧基或取代的芳氧基，如上定义。当E是氧时，磷酰基不能连接另一种化学种类，例如形成氧-氧键或其他不稳定键，如本领域普通技术人员所理解的。当E、Rvi和Rvii被取代时，取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。
术语“C3-C20环状基团”是指在几何限制允许的情况下，具有3至20个碳原子的取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环烯基、取代或未取代的环炔基、取代或未取代的杂环基。环状结构由单环或稠环系统形成。取代的环烷基、环烯基、环炔基和杂环基分别如上文对烷基、烯基、炔基和杂环基所定义进行取代。
本文所述的“溶酶体导向单元”是指本发明活性剂中含有的溶酶体导向单元(如本文中所述的R5’或R6’)，其通常带有含胺弱碱性基团，如吗啉环、二甲基乙二胺。含有溶酶体导向单元的本发明活性剂容易进入溶酶体中。
本文所述的接头Z选自CL2A,MCC,VC,MC-VC-PAB,MC-GGFG,SPDB,MHH，这些接头是本领域中公知和常用的接头，其结构如下：
II.组合物
A.抗衰老前药化合物
本文公开的抗衰老前药基于细胞毒性剂的选择性设计，以在体内递送前药后引入可由SA-β-gal切割的位点，以释放活性母体细胞毒性剂用于优先杀死衰老细胞。
在优选的实施方案中，细胞毒性剂是A1331852。
细胞毒性剂也可以是A1331852的衍生物。例如，A1331852的金刚烷基被基团取代。例如,细胞毒性部分是
A1331852衍生物，
其中连接基团L选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环状基团以及取代或未取代的杂环基。
连接L优选选自以下结构：
其中在环氮原子处与W基团连接；和
m是0、1、2、3；
连接基团L最优选选自以下结构：
其中W为取代或未取代的环状基团、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的桥环烷基、取代或未取代的杂桥环烷基、取代或未取代的螺环烷基、取代或未取代的杂螺环烷基、取代或未取代的稠环芳基、取代或未取代的杂稠环芳基。
在一些实施方案中，其中W为取代的C3-C10环基、未取代的C3-C10环基或取代的C3-C10杂环基、未取代的C3-C10杂环基、取代的C6-C10芳基、未取代的C6-C10芳基、取代的C6-C10杂芳基、未取代的C6-C10杂芳基、未取代的C6-C12桥环基、取代的C6-C12桥环基、未取代的C6-C12杂桥环基、取代的C6-C12杂桥环基、未取代的C6-C12并环基、取代的C6-C12并环基、未取代的C6-C12杂并环基、取代的C6-C12杂并环基、未取代的C6-C12稠环芳基、取代的C6-C12稠环芳基、未取代的C6-C12杂稠环芳基、取代的C6-C12杂稠环芳基。
在优选的实施方案中，W选自以下基团：
其中R13’为氢、氘、卤素、氨基、羟基、硝基、硫醇基、氰基、异氰基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、取代或未取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸基、磷酰基和膦酰基；其中R14’为氢、氘、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环状基团以及取代或未取代的杂环基；其中p是0、1、2、3或4。
在一些实施方案中，细胞毒性剂是：
因此，其中公开的前药化合物包括细胞毒性剂，在本文中以经修饰以被SA-β-gal切割的A1331852为例。细胞毒性剂被修饰以包括优选被乙酰化的基于半乳糖的部分，和苄氧羰基。因此，在优选的实施方案中，前药在基于半乳糖的部分上不包括游离羟基(-OH)。在一些实施方案中，前药可包括修饰(例如，去除苄氧羰基部分的芳基或杂芳基(例如，苯基)上的硝基(例如-NO2)或在其上添加其他官能团)以降低其潜在的免疫原性。在一些实施方案中，前药可包括在苄氧羰基部分的芳基或杂芳基(例如，苯基)上的硝基(例如-NO2)，其可例如影响前药在β-半乳糖苷酶激活后产生细胞毒性剂的效率。在一些实施方案中，前药可以包括进一步的修饰(例如，从基于半乳糖的部分去除一个或多个保护基团(例如乙酰基(Ac)基团))以增加其水溶性，这可以，例如，促进稳定结晶形式的形成，简化体内代谢途径，和/或获得更好的类药物特性。
在一些形式中，苄氧羰基部分具有如下所示的结构：
其中：
J是芳基或杂芳基，优选C6芳基，例如苯基，
V是O、S或NR1’，其中R1’为氢、取代的C1-C5烷基、未取代的C1-C5烷基、取代的C6-C10芳基，或未取代的C6-C10芳基，其中优选地，V为O，
Q是取代的C1-C5亚烷基或未取代的C1-C5亚烷基，例如未取代的C1亚烷基、取代的C1亚烷基、未取代的C2亚烷基、取代的C2亚烷基、未取代的C3亚烷基、取代的C3亚烷基、未取代的C4亚烷基、取代的C4亚烷基、未取代的C1亚烷基、取代的C5亚烷基，其中优选地，Q是亚甲基，
M是O、S或NR2’，其中R2’为氢、取代的C1-C5烷基、未取代的C1-C5烷基、取代的C6-C10芳基或未取代的C6-C10芳基，其中优选地，M是O，
T是O、S或NR3’，其中R3’为氢、取代的C1-C5烷基、未取代的C1-C5烷基、取代的C6-C10芳基或未取代的C6-C10芳基，其中优选地，T是O，
每个U独立地是硝基(例如-NO2)、氰基(例如-CN)、氨基(例如-NH2)、羟基(-OH)、硫醇(-SH)、卤素(例如F、Cl、I、Br)、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、取代的烷氧基、羧基、羰基、取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸、磷酰基、膦酰基、膦酰基、氢、烷基、取代的烷基，其中优选地，U是-NO2或氢，和
r是0和10之间的整数，包括例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，如果化合价允许的话。
在式1的一些形式中，J是C6芳基。在一些形式中，U是-NO2。在一些形式中，U是氢。在一些形式中，V是O。在式1的一些形式中，T是O。在一些形式中，Q是取代的C1亚烷基。在式1的一些形式中，Q是取代的C1亚烷基。在一些形式中，M是O。
在式1的一些形式中，J是C6芳基，Q是取代的C1亚烷基或取代的C1亚烷基。在式1的一些形式中，J是C6芳基，Q是取代的C1亚烷基或取代的C1亚烷基，V和T是O。
在式1的一些形式中，J是C6芳基，Q是取代的C1亚烷基或取代的C1亚烷基，V、M和T是O。
[根据细则26改正 17.04.2023] 在式1的一些形式中，苄氧羰基是如式II中(a)-(j)任一个所示的接头X：
其中每个R4’、R5’和R6’独立地选自氢、硝基(例如-NO2)、氰基(例如-CN)、异氰基、氨基(例如-NH2)、羟基(-OH)、硫醇基(-SH)、卤素(例如F、Cl、I、Br)、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、烷氨基、二烷氨基、羧基、取代或未取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸基、磷酰基和膦酰基，
mAb为单克隆抗体，并且连接基团Z为用于抗体偶联的连接基团，
n是0到4之间的整数，包括0和4，
其中接头X在连接位置处与所述β-gal部分连接，并且在连接位置处与所述细胞毒性部分连接，
其中在式(e)和(f)的接头X中，连接在两个连接位置处的细胞毒性部分是相同或不同的。
在一些实施方案中，至少一个R4’是氢、硝基(例如-NO2)、氰基(例如-CN)、氨基(例如-NH2)、羟基(-OH)、硫醇基(-SH)、卤素(例如F、Cl、I、Br)、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、烷氨基、二烷氨基、羧基、取代或未取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸基、磷酰基或膦酰基。
在一些实施方案中，至少一个R4’是氢、硝基(例如-NO2)、氰基(例如-CN)、异氰基(例如)、氨基(例如-NH2)、羟基(-OH)、硫醇基(-SH)或卤素(例如F、Cl、I、Br)。
在一些实施方案中，至少一个R4’是氢或硝基。
在一些实施方案中，至少一个R4’是硝基，其可以例如提高效率以在活化后产生细胞毒性剂。
在一些实施方案中，至少一个R4’是氢(而不是硝基(例如-NO2))，其可以例如降低潜在的免疫原性。
在一些实施方案中，R5’是氢、烷基或取代的烷基。
在一些实施方案中，R5’是氢。
在一些实施方案中，R6’是氢。
在一些实施方案中，连接基团Z选自CL2A,MCC,VC,MC-VC-PAB,MC-GGFG,SPDB,MHH，其结构如下：
[根据细则26改正 17.04.2023] 在一些实施方案中，R5’和R6’独立地是如下所示的溶酶体导向单元：
其中R7’、R8’和R9’独立地为不存在、亚烷基、亚烷氧基、亚烷基氨基或亚烷基羰基；
其中R10’、R11’和R12’独立地选自氢、硝基、氰基、异氰基、氨基、羟基、硫醇基、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、取代或未取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸基、磷酰基、膦酰基和膦酰基；
n1是0、1、2、3或4。
[根据细则26改正 17.04.2023] R5’和R6’独立地选自以下结构：
[根据细则26改正 17.04.2023] 其中R3’为取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷基氨基或者取代或未取代的烷氧基。
[根据细则26改正 17.04.2023] 在一些实施方案中，接头X独立地选自以下结构：
在一些实施方案中，接头X独立地选自以下结构：
本发明的化合物包括以下所示结构的基于半乳糖的部分(β-gal部分)。
R1、R2、R3和R4可以各自/独立地是H或可以在细胞内水解的任何取代基。
在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4各自是氢或取代基，使得-OR1、-OR2、-OR3和/或-OR4可以在细胞内水解。
在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4独立地为H、-C(O)R5、-C(O)OR6、-C(O)NR7R8和-PO3R9，使得-ORx独立地分别为酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或磷酸二酯基团，其中x为1、2、3或4。
在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4独立地为-C(O)R5、-C(O)OR6和-C(O)NR7R8。在这些形式中，R5、R6、R7、R8和R9独立地为氢、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的C3-C10环基、未取代的C3-C10环基、取代的C3-C10杂环基，未取代的C3-C10杂环基。在这些形式中，R5、R6、R7、R8和R9独立地为氢、取代的C1-C5烷基、未取代的C1-C5烷基、取代的C6-C10芳基、未取代的C6-C10芳基、取代的C6-C10杂芳基、未取代的C6-C10杂芳基、取代的C3-C10环基、未取代的C3-C10环基或取代的C3-C10杂环基、未取代的C3-C10杂环基。在这些形式中，R5、R6、R7、R8和R9独立地为氢、取代的C1-C3烷基、未取代的C1-C3烷基、取代的C6芳基、未取代的C6芳基、取代的C6杂芳基、未取代的C6杂芳基、取代的C6环基、未取代的C6环基，或取代的C6杂环基，未取代的C6杂环基。
在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4中的一个或多个(或全部)可以是H，其可以例如增加水溶性、促进稳定结晶形式的形成、简化体内代谢途径，和/或获得更好的类药物特性。
在一些实施方案中，当前药为晶体形式时，R1、R2、R3和R4中的一个或多个(或全部)是H。
在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4是-C(O)R5。在这些形式中，R5独立地是取代的C1-C3烷基或未取代的C1-C3烷基。在这些形式中，R5优选地是甲基。
优选的基于半乳糖的部分是D-半乳糖四乙酸酯部分，如下所示。
在一些形式中，可以从基于半乳糖的部分去除一个或多个(例如，两个、三个或四个)保护基团(例如乙酰基(Ac)基团)。在一些实施方案中，去除一个或多个(例如，两个、三个或四个)保护基团可以增加水溶性、促进稳定结晶形式的形成、简化体内代谢途径和/或获得更好的类药物特性。在一些实施方案中，前药可以是晶体形式，其可以例如不包含保护基团(例如乙酰基(Ac)基团)或在基于半乳糖的部分上包含减少数量的保护基团(例如乙酰基(Ac)基团)。在一些形式中，例如，当前药为晶体形式时，R1、R2、R3和R4中的一个或多个(或全部)是H。
在一些实施方案中，β-gal部分具有以下结构：
在一些形式中，活性剂由
式IV代表；
其中R1、R2、R3、R4、R4’和R5’如上文所述，
D包括细胞毒性剂。
在一些形式中，可以从基于半乳糖的部分去除一个或多个(例如，两个、三个或四个)保护基团(例如乙酰基(Ac)基团)。在一些形式中，例如，当前药为晶体形式时，R1、R2、R3和R4中的一个或多个(或全部)是H。在一些形式中，R4’可以是硝基-(例如-NO2)。在一些形式中，R4’可以是氢(而不是例如硝基(例如-NO2))。优选的细胞毒性剂是本领域已知的化学治疗剂/药物。化学治疗剂的实例包括但不限于A1331852。
[根据细则26改正 17.04.2023] 在一些实施方案中，活性剂具有如下结构：
[根据细则26改正 17.04.2023] 其中Y为W并且具有氨基、仲氨基、环仲胺基或羟基，并且
[根据细则26改正 17.04.2023] 其中所述氨基、环仲胺基或羟基中的N原子或O原子上的氢被接头X取代。
[根据细则26改正 17.04.2023] 在优选的实施方案中，Y选自以下结构：
[根据细则26改正 17.04.2023] 在一些实施方案中，活性剂具有以下结构：
其中X为本文定义的接头，R1,R2,R3和R4如本文定义。
在一些形式中，可以从基于半乳糖的部分去除一个或多个(例如，两个、三个或四个)保护基团(例如乙酰基(Ac)基团)。
在一些形式中，NO2可以被去除。在一些形式中，NO2和一个或多个(例如，两个、三个或四个)保护基团(例如乙酰基(Ac)基团)都可以被去除。
[根据细则26改正 17.04.2023] 在优选的实施方案中，活性剂可以选自以下结构：
B.制剂
可以配制本文所述的化合物用于肠内、肠胃外、局部或肺部施用。化合物可以与一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂组合，所述载体和/或赋形剂被认为是安全和有效的并且可以施用于个体而不会引起不希望的生物学副作用或不想要的相互作用。载体是药物制剂中除一种或多种活性成分以外的所有组分。
化合物以治疗有效量包含在制剂中。可以从细胞培养测定中初步估计治疗有效量。例如，可以在动物模型中配制剂量以达到循环浓度范围，其包括在细胞培养中确定的IC50或IC100。此类信息可用于更准确地确定人体的有用剂量。也可以从体内数据估计初始剂量。使用这些初始指南，本领域普通技术人员可以确定人体的有效剂量。
1.肠胃外制剂
可以配制本文所述的化合物用于肠胃外施用。
例如，肠胃外施用可以包括通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、玻璃体内、瘤内、肌内、皮下、结膜下、囊内、心包内、脐内注射和输注向患者施用。
可以使用本领域已知的技术将肠胃外制剂制备为水性组合物。通常，此类组合物可制备为可注射制剂，例如溶液或悬浮液；适合在注射前加入重构介质后用于制备溶液或悬浮液的固体形式；乳剂，例如油包水(w/o)乳剂、水包油(o/w)乳剂及其微乳剂、脂质体或乳剂。
载体可以是包含例如水、乙醇、一种或多种多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、油，例如植物油(例如花生油、玉米油、芝麻油等)及其组合的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用涂层如卵磷脂、在分散的情况下通过维持所需的颗粒大小和/或通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。
可以在水或另一种溶剂或与一种或多种药学上可接受的赋形剂适当混合的分散介质中制备活性化合物作为游离酸或碱或其药学上可接受的盐的溶液和分散体，所述赋形剂包括但不限于表面活性剂、分散剂、乳化剂、pH调节剂、粘度调节剂及其组合。
合适的表面活性剂可以是阴离子、阳离子、两性或非离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于含有羧酸根、磺酸根和硫酸根离子的那些。阴离子表面活性剂的实例包括长链烷基磺酸的钠、钾、铵盐和烷基芳基磺酸盐，例如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，如双-(2-乙基硫氧基)-磺基琥珀酸钠；和烷基硫酸盐如十二烷基硫酸钠。阳离子表面活性剂包括但不限于季铵化合物，例如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵、聚氧乙烯和椰油胺。非离子表面活性剂的实例包括乙二醇单硬脂酸酯、丙二醇肉豆蔻酸酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、聚甘油-4-油酸酯、脱水山梨糖醇酰化物、蔗糖酰化物、PEG-150月桂酸酯、PEG-400单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚山梨醇酯、聚氧乙烯辛基苯基醚(polyoxyethylene octylphenylether)、PEG-1000十六烷基醚、聚氧乙烯十三烷基醚、聚丙二醇丁醚、硬脂酰单异丙醇酰胺和聚氧乙烯氢化牛脂酰胺。两性表面活性剂的实例包括N-十二烷基-β-丙氨酸钠、N-月桂基-β-亚氨基二丙酸钠、肉豆蔻两性乙酸盐(myristoamphoacetate)、月桂基甜菜碱和月桂基磺基甜菜碱。
制剂可含有防腐剂以防止微生物的生长。合适的防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。制剂还可含有抗氧化剂以防止活性剂的降解。
制剂通常被缓冲至3-8的pH值，用于重构后的肠胃外施用。合适的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。
水溶性聚合物通常用于肠胃外施用的制剂中。合适的水溶性聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、羧甲基纤维素和聚乙二醇。
可以通过将所需量的活性化合物与上面列出的一种或多种赋形剂(根据需要)掺入到合适的溶剂或分散介质中，然后过滤除菌来制备无菌可注射溶液。通常，分散剂是通过将多种已灭菌的活性成分掺入到含有基本分散介质和来自上面列出的那些所需的其他成分的无菌运载体中来制备的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何额外的所需成分的粉剂。可以以颗粒本质上是多孔的这样的方式制备粉剂，其可以增加颗粒的溶解。制备多孔颗粒的方法是本领域公知的。
(a).控制释放的制剂
可将本文所述的肠胃外制剂配制用于控制释放，包括立即释放、延迟释放、延长释放、脉冲释放及其组合。
1.纳米和微颗粒
对于肠胃外施用，可将一种或多种化合物和任选的一种或多种额外活性剂掺入提供化合物和/或一种或多种额外活性剂的控制释放的微颗粒、纳米颗粒或其组合中。在其中制剂含有两种或多种药物的实施方案中，可以将药物配制用于相同类型的控制释放(例如，延迟、延长、立即或脉冲式)，或者可以将药物独立地配制用于不同类型的释放(例如，立即和延迟、立即和延长、延迟和延长、延迟和脉冲等)。
例如，可以将化合物和/或一种或多种额外的活性剂掺入聚合物微颗粒中，其提供药物的控制释放。通过药物从微颗粒中的扩散和/或聚合物颗粒通过水解和/或酶促降解的降解来控制药物的释放。合适的聚合物包括乙基纤维素和其他天然或合成纤维素衍生物。
在水性环境中缓慢溶解并形成凝胶的聚合物，例如羟丙基甲基纤维素或聚环氧乙烷，也可适合作为含药物微颗粒的材料。其他聚合物包括但不限于聚酐、聚(酯酐)、多羟基酸，例如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚-3-羟基丁酸酯(PHB)及其共聚物，聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)及其共聚物，聚己内酯及其共聚物，以及它们的组合。
或者，可将药物掺入由在水溶液中不溶或水溶液中缓慢溶解但能够在胃肠道内通过包括酶促降解、胆汁酸的表面活性作用和/或机械侵蚀而被降解的材料制备的微颗粒中。如本文所用，术语“水溶液中缓慢溶解的”是指在30分钟内不溶于水的材料。优选的实例包括脂肪、脂肪物质、蜡、蜡状材料及其混合物。合适的脂肪和脂肪物质包括脂肪醇(例如月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇、鲸蜡醇或鲸蜡硬脂醇)、脂肪酸和衍生物，包括但不限于脂肪酸酯、脂肪酸甘油酯(甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)和氢化脂肪。具体实例包括但不限于氢化植物油、氢化棉籽油、氢化蓖麻油、以商品名可获得的氢化油、硬脂酸、可可脂和硬脂醇。合适的蜡和蜡状材料包括天然或合成蜡、烃和普通蜡。蜡的具体实例包括蜂蜡、糖蜡、蓖麻蜡、巴西棕榈蜡、石蜡和小烛树蜡。如本文所用，蜡状材料被定义为在室温下通常为固体并且具有约30至300℃的熔点的任何材料。
在一些情况下，可能需要改变水渗透到微颗粒中的速度。为此，可以将速率控制(芯吸)剂与上面列出的脂肪或蜡一起配制。速率控制材料的实例包括某些淀粉衍生物(例如，蜡质麦芽糊精和滚筒干燥的玉米淀粉)、纤维素衍生物(例如，羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和羧甲基纤维素)、藻酸、乳糖和滑石粉。此外，可加入药学上可接受的表面活性剂(例如卵磷脂)以促进此类微颗粒的降解。
水不溶的蛋白质，例如玉米醇溶蛋白，也可用作用于形成含药物微颗粒的材料。此外，水溶性的蛋白质、多糖及其组合可以与药物一起配制成微颗粒，然后交联形成不溶性网络。例如，环糊精可以与单个药物分子络合并随后交联。
2.制备纳米和微颗粒的方法
将药物封装或掺入载体材料中以产生含药物的微颗粒可通过已知的药物制剂技术来实现。在脂肪、蜡或蜡状材料配制的情况下，通常将载体材料加热至其熔化温度以上，并且加入药物以形成混合物，其包含悬浮在载体材料中的药物颗粒、溶解在载体材料中的药物、或其混合物。随后可以通过几种方法配制微颗粒，包括但不限于凝结、挤出、喷雾冷却或水分散的方法。在优选的方法中，将蜡加热至高于其熔化温度，加入药物，并且随着混合物冷却，在持续搅拌下使熔化的蜡-药物混合物凝结。或者，可将熔化的蜡-药物混合物挤出并滚圆以形成丸剂或珠剂。这些方法是本领域已知的。
对于一些载体材料，可能需要使用溶剂蒸发技术来生产含药物的微颗粒。在这种情况下，药物和载体材料共溶解在互溶剂中，随后可以通过几种技术产生微颗粒，包括但不限于在水或其他合适的介质中形成乳液、喷雾干燥或通过从本体溶液中蒸发掉溶剂和研磨所得材料。
在一些实施方案中，颗粒形式的药物均匀地分散在水不溶性或缓慢水溶的材料中。为了将组合物中药物颗粒的大小最小化，可以在配制之前研磨药物粉末本身以产生细颗粒。制药领域已知的喷射研磨方法可用于该目的。在一些实施方案中，通过将蜡或蜡状物质加热至其熔点以上并在搅拌混合物的同时加入药物颗粒，将颗粒形式的药物均匀分散在蜡或蜡样物质中。在这种情况下，可将药学上可接受的表面活性剂加入混合物中以促进药物颗粒的分散。
颗粒也可以包衣有一种或多种释放涂层。被脂肪酶水解的固体脂肪酸酯可以喷涂到微颗粒或药物颗粒上。玉米醇溶蛋白是天然水不溶性蛋白质的实例。它可以通过喷涂或湿法制粒技术包衣到含药物的微颗粒或药物颗粒上。除了天然的水不溶性材料外，可以利用交联程序处理消化酶的一些底物，导致不溶性网络的形成。已经报道了通过化学和物理方式起始的许多蛋白质交联方法。获得交联的最常见方法之一是使用化学交联剂。化学交联剂的实例包括醛类(戊二醛和甲醛)、环氧化合物、碳二亚胺和京尼平(genipin)。除了这些交联剂外，氧化糖和天然糖也已用于交联明胶。也可以使用酶促方法完成交联；例如，转谷氨酰胺酶已被批准为用于交联海产品的GRAS物质。最后，可以通过物理方法，例如热处理、紫外线放射和伽马放射起始交联。
为了产生包围含有药物的微颗粒或药物颗粒的交联蛋白的涂层，可以将水溶性蛋白质喷涂到微颗粒上，然后通过上述方法之一进行交联。或者，可以通过凝聚相分离(例如，通过添加盐)将含有药物的微颗粒在蛋白质内微囊化，然后交联。用于此目的的一些合适的蛋白质包括明胶、白蛋白、酪蛋白和谷蛋白。
也可以交联多糖以形成水不溶性网络。对于许多多糖，这可以通过与钙盐或多价阳离子反应来实现，这些阳离子使聚合物主链交联。果胶、藻酸盐、葡聚糖、直链淀粉和瓜尔胶在多价阳离子存在下进行交联。也可以形成带相反电荷的多糖之间的复合体；例如，果胶和壳聚糖可以通过静电相互作用复合。
(b).可注射/可植入制剂
可将本文所述的化合物掺入可注射/可植入的固体或半固体植入物，例如聚合物植入物。在一个实施方案中，将化合物掺入聚合物中，所述聚合物在室温下为液体或糊剂，但在与水性介质例如生理流体接触时，表现出粘度增加以形成半固体或固体材料。示例性聚合物包括但不限于衍生自与羟基链烷酸共聚的至少一种不饱和羟基脂肪酸的共聚反应的羟基链烷酸聚酯。聚合物可以熔化、与活性物质混合并浇铸或注塑到装置中。这种熔体制造需要聚合物具有这样的熔点，其低于物质待递送和聚合物降解或变得有反应性的温度。也可以通过溶剂浇铸来制备所述装置，其中聚合物溶解在溶剂中，药物溶解或分散在聚合物溶液中，然后蒸发溶剂。溶剂法要求聚合物可溶于有机溶剂。另一种方法是将聚合物和载有活性剂的药物或聚合物颗粒的混合粉末压缩成型。
或者，可将化合物掺入聚合物基质中并模塑、压缩或挤进在室温下为固体的装置中。例如，可将化合物掺入可生物降解的聚合物中，例如聚酐、聚羟基链烷酸(PHA)、PLA、PGA、PLGA、聚己内酯、聚酯、聚酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、蛋白质和多糖，例如胶原蛋白、透明质酸、白蛋白和明胶，以及它们的组合并压缩成固体装置，例如盘，或挤进装置，例如棒。
可以通过聚合物的选择、聚合物的分子量和/或聚合物的修饰来改变一种或多种化合物从植入物的释放以增加降解，例如孔的形成和/或可水解键的掺入。用于修饰可生物降解聚合物的性质以改变化合物从植入物中的释放曲线的方法是本领域公知的。
2.肠内制剂
合适的口服剂型包括片剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂和锭剂。可以使用本领域公知的压缩或模塑技术制备片剂。明胶或非明胶胶囊可制备为硬或软胶囊壳，其可使用本领域公知的技术包封液体、固体和半固体填充材料。
可以使用药学上可接受的载体制备制剂。如本文中通常使用的，“载体”包括但不限于稀释剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、溶胀剂、填充剂、稳定剂及其组合。
载体还包括包衣组合物的所有组分，其可包括增塑剂、色素、着色剂、稳定剂和助流剂。
合适的包衣材料的实例包括但不限于纤维素聚合物，例如邻苯二甲酸醋酸纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素；聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、丙烯酸聚合物和共聚物，以及以商品名(Roth Pharma,Westerstadt,Germany)商购的甲基丙烯酸树脂、玉米醇溶蛋白、虫胶和多糖。
此外，包衣材料可包含常规载体，例如增塑剂、色素、着色剂、助流剂、稳定剂、成孔剂和表面活性剂。
“稀释剂”，也称为“填充剂”，通常是增加固体剂型体积所必需的，以便为片剂的压缩或珠子和颗粒的形成提供实际大小。合适的稀释剂包括但不限于磷酸二钙二水合物、硫酸钙、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素、微晶纤维素、高岭土、氯化钠、干淀粉、水解淀粉、预胶化淀粉、二氧化硅、氧化钛、硅酸铝镁和糖粉。
“粘合剂”用于赋予固体剂型内聚特性，从而确保片剂或珠子或颗粒在剂型形成后保持完整。合适的粘合剂材料包括但不限于淀粉、预胶化淀粉、明胶、糖(包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖和山梨糖醇)、聚乙二醇、蜡、天然和合成树胶，例如阿拉伯胶、黄蓍胶、海藻酸钠、纤维素，包括羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素和硅酸铝镁，以及合成聚合物，例如丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚丙烯酸/聚甲基丙烯酸和聚乙烯吡咯烷酮。
“润滑剂”用于促进片剂制造。合适的润滑剂的实例包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、山嵛酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉和矿物油。
“崩解剂”用于在施用后促进剂型崩解或“破碎”，通常包括但不限于淀粉、羟基乙酸淀粉钠、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、预胶化淀粉、粘土、纤维素、海藻素、树胶或交联聚合物，例如交联PVP(来自GAF Chemical Corp的XL)。
“稳定剂”用于抑制或延缓药物分解反应，例如其包括氧化反应。合适的稳定剂包括但不限于抗氧化剂、丁基化羟基甲苯(BHT)；抗坏血酸、其盐类和酯类；维生素E、生育酚及其盐类；亚硫酸盐例如焦亚硫酸钠；半胱氨酸及其衍生物；柠檬酸；没食子酸丙酯和丁基化羟基苯甲醚(BHA)。
(a)控制释放的肠内制剂
口服剂型，例如胶囊剂、片剂、溶液剂和悬浮剂，可以配制用于控制释放。例如，可将一种或多种化合物和任选的一种或多种额外活性剂配制成纳米颗粒、微颗粒及其组合，并封装在软或硬明胶或非明胶胶囊中或分散在分散介质中以形成口服悬浮剂或糖浆剂。颗粒剂可由药物和控制释放聚合物或基质形成。或者，药物颗粒可以在掺入最终剂型之前用一种或多种控制释放涂层包衣。
在另一个实施方案中，将一种或多种化合物和任选的一种或多种额外的活性剂分散在基质材料中，所述基质材料在与水性介质，例如生理流体接触后凝胶化或乳化。在凝胶的情况下，基质溶胀，夹带活性剂，所述活性剂随着时间通过基质材料的扩散和/或降解缓慢释放。此类基质可配制成片剂或硬胶囊和软胶囊的填充材料。
在又一个实施方案中，将一种或多种化合物和任选的一种或多种额外的活性剂配制成出售的口服剂型，例如片剂或胶囊剂，并且固体剂型用一种或多种控制释放涂层包衣，例如延迟释放涂层或延长释放涂层。一个或多个涂层还可以含有化合物和/或额外的活性剂。
(i)延长释放剂型
通常将延长释放制剂制备为本领域已知的扩散或渗透系统。扩散系统通常由两种类型的装置组成，即储存器和基质，并且为本领域所公知和描述。通常通过将药物与缓慢溶解的聚合物载体一起压缩成片剂形式来制备基质装置。用于制备基质装置的三种主要类型的材料是不溶性塑料、亲水性聚合物和脂肪化合物。塑料基质包括但不限于丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯和聚乙烯。亲水性聚合物包括但不限于纤维素聚合物例如甲基和乙基纤维素、羟烷基纤维素例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚环氧乙烷及其混合物。脂肪化合物包括但不限于多种蜡，例如巴西棕榈蜡和三硬脂酸甘油酯以及蜡类物质，包括氢化蓖麻油或氢化植物油，或其混合物。
在某些优选实施方案中，塑料材料是药学上可接受的丙烯酸聚合物，包括但不限于丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸)(酐)、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸酐)和甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物。
在某些优选实施方案中，丙烯酸类聚合物包含一种或多种甲基丙烯酸铵共聚物。甲基丙烯酸铵共聚物为本领域众所公知，并且在NF XVII中被描述为具有低季铵基团含量的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的完全聚合的共聚物。
在一个优选的实施方案中，丙烯酸类聚合物是丙烯酸类树脂漆，例如可从Rohm Pharma以商品名商购的那些。在进一步优选的实施方案中，丙烯酸类聚合物包含可分别以商品名RL30D和RS30D从Rohm Pharma商购的两种丙烯酸类树脂漆的混合物。RL30D和RS30D是具有低含量季铵基团的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的共聚物，在RL30D中铵基团与其余中性(甲基)丙烯酸酯的摩尔比为1:20，在RS30D中为1:40。平均分子量约为150,000。还优选S-100和L-100。代码名称RL(高渗透性)和RS(低渗透性)是指这些活性剂的渗透性特性。RL/RS混合物在水和消化液中不溶。然而，形成以包含它们的多颗粒系统在水溶液和消化液中是可溶胀和可渗透的。
上述聚合物，例如RL/RS可以以任何期望的比例混合在一起，以最终获得具有期望溶解曲线的持续释放制剂。可从例如100％RL、50％RL和50％RS，和10％RL和90％RS获得期望的持续释放多颗粒系统。本领域技术人员会认识到也可以使用其他丙烯酸聚合物，例如L。
或者，可以使用渗透系统或通过对剂型应用半透性涂层来制备延长释放制剂。在后一种情况下，可以通过以合适的比例组合低渗透性和高渗透性包衣材料来实现期望的药物释放曲线。
可以在包含单个或多个单元的最终剂型中组合具有上述不同药物释放机制的装置。多个单元的实例包括但不限于多层片剂和包含片剂、珠子或颗粒的胶囊。可以通过使用涂层或压缩过程或在多单元系统例如含有延长和立即释放珠子的胶囊中将立即释放层应用到延长释放核心的顶部来将立即释放部分添加到延长释放系统中。
通过本领域公知的技术，例如直接压缩、湿法制粒或干法制粒制备含有亲水性聚合物的延长释放片剂。它们的制剂通常掺入聚合物、稀释剂、粘合剂和润滑剂以及活性药物成分。通常的稀释剂包括惰性粉状物质例如淀粉、粉状纤维素，尤其是结晶和微晶纤维素，糖类例如果糖、甘露醇和蔗糖、谷物粉和类似的可食用粉剂。典型的稀释剂包括例如多种类型的淀粉、乳糖、甘露醇、高岭土、磷酸钙或硫酸钙、无机盐例如氯化钠和糖粉。粉状纤维素衍生物也是重要的。典型的片剂粘合剂包括物质例如淀粉、明胶和糖类例如乳糖、果糖和葡萄糖：也可以使用天然和合成树胶，包括阿拉伯树胶、藻酸盐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。聚乙二醇、亲水聚合物、乙基纤维素和蜡也可用作粘合剂。片剂制剂中需要润滑剂以防止片剂和冲头粘在模具中。润滑剂选自此类光滑固体，如滑石、硬脂酸镁和硬脂酸钙、硬脂酸和氢化植物油。
通常使用本领域已知的方法，例如直接混合法、凝固法和水分散法制备含蜡材料的延长释放片剂。在凝固法中，药物与蜡材料混合并喷雾凝固或凝固并筛选和加工。
(ii)延迟释放剂型
可以通过用聚合物薄膜包衣固体剂型来产生延迟释放制剂，所述薄膜在胃的酸性环境中不溶，而在小肠的中性环境中可溶。
可以例如通过用选定的包衣材料包衣药物或含药物的组合物来制备延迟释放剂量单位。含药组合物可以是例如用于掺入胶囊的片剂、用作“包衣芯”剂型中的内核的片剂，或用于掺入片剂或胶囊中的多个含药物珠子、颗粒(particle)或颗粒(granule)。优选的包衣材料包括可生物侵蚀的、逐渐水解的、逐渐水溶性的和/或酶促降解的聚合物，并且可以是常规的“肠道”聚合物。如本领域技术人员所理解的，肠道聚合物在下胃肠道的较高pH环境中变得可溶或随着剂型通过胃肠道而缓慢侵蚀，而酶促降解聚合物被存在于下胃肠道，尤其是结肠中的细菌酶降解。用于实现延迟释放的合适包衣材料包括但不限于纤维素聚合物，例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、醋酸纤维素偏苯三甲酸酯和羧甲基纤维素钠；丙烯酸聚合物和共聚物，优选由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或甲基丙烯酸乙酯，以及以商品名(Rohm Pharma；Westerstadt,Germany)商购的其他甲基丙烯酸树脂，包括L30D-55和L100-55(在pH 5.5及以上可溶)、L-100(在pH 6.0及以上可溶)、S(在pH 7.0及以上可溶，由于更高程度的酯化)，和NE、RL和RS(具有不同程度渗透性和可膨胀性的水不溶性聚合物)；乙烯聚合物和共聚物，例如聚乙烯吡咯烷酮、醋酸乙烯酯、邻苯二甲酸乙酸乙烯酯、醋酸乙烯巴豆酸共聚物，和乙烯-醋酸乙烯酯共聚物；可酶促降解的聚合物，例如偶氮聚合物、果胶、壳聚糖、直链淀粉和瓜尔胶；玉米蛋白和虫胶。也可以使用不同包衣材料的组合。也可以应用使用不同聚合物的多层包衣。
可由本领域技术人员通过评估用不同量的多种包衣材料制备的片剂、珠子和颗粒的单独释放曲线而容易地确定特定包衣材料的优选包衣重量。产生所期望的释放特性的材料、方法和应用形式的组合，其只能从临床研究中确定。
包衣组合物可包括常规添加剂，例如增塑剂、色素、着色剂、稳定剂、助流剂等。增塑剂通常存在以降低包衣的脆性，并且相对于聚合物的干重通常占约10wt.％至50wt.％。典型的增塑剂的实例包括聚乙二醇、丙二醇、三醋精、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、蓖麻油和乙酰化甘油单酯。优选使用稳定剂来稳定分散液中的颗粒。典型的稳定剂是非离子乳化剂，例如山梨醇酯、聚山梨醇酯和聚乙烯吡咯烷酮。推荐助流剂以减少成膜和干燥过程中的粘附效应，并且通常占包衣溶液中聚合物重量的约25wt.％至100wt.％。一种有效的助流剂是滑石。也可以使用其他助流剂，例如硬脂酸镁和单硬脂酸甘油酯。也可以使用色素例如二氧化钛。少量的消泡剂，例如硅酮(例如，二甲基硅油)，也可以添加到包衣组合物中。
3.局部制剂
用于局部施用的合适剂型包括乳膏、软膏、油膏、喷雾剂、凝胶剂、洗剂、乳剂和透皮贴剂。可以配制所述制剂用于经粘膜、经上皮、经内皮或经皮施用。也可以配制化合物用于鼻内递送、肺部递送或吸入。组合物可进一步包含一种或多种化学渗透增强剂、膜渗透剂、膜转运剂、润肤剂、表面活性剂、稳定剂、缓冲剂及其组合。
在某些实施方案中，可能期望向有需要的患者提供一种或多种化合物的连续递送。对于局部应用，可以进行重复应用，或者可以使用贴剂在延长时间内提供化合物的连续施用
“缓冲剂”用于控制组合物的pH值。优选地，缓冲剂将组合物从约4的pH缓冲至约7.5的pH，更优选地从约4的pH缓冲至约7的pH，最优选地从约5的pH缓冲至约7的pH。在优选的实施方案中，缓冲剂是三乙醇胺。
“润肤剂”是软化或舒缓皮肤的外用剂，并且一般为本领域所知并列在药典中，例如“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第4版，Pharmaceutical Press，2003。这些包括但不限于，杏仁油、蓖麻油、长角豆提取物、鲸蜡硬脂醇(cetostearoyl alcohol)、鲸蜡醇、鲸蜡酯蜡、胆固醇、棉籽油、环甲硅油、乙二醇棕榈硬脂酸酯、甘油、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、羊毛脂、卵磷脂、轻矿物油、中链甘油三酯、矿物油和羊毛脂醇、凡士林油、凡士林油和羊毛脂醇、大豆油、淀粉、硬脂醇、葵花油、木糖醇及其组合。在一个实施方案中，润肤剂是硬脂酸乙基己酯和棕榈酸乙基己酯。
“乳化剂”是表面活性物质，其促进一种液体在另一种液体中的悬浮并促进油和水的稳定混合物或乳液的形成。常见的乳化剂是：金属皂、某些动植物油和多种极性化合物。合适的乳化剂包括阿拉伯胶、阴离子乳化蜡、硬脂酸钙、卡波姆、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、胆固醇、二乙醇胺、乙二醇棕榈硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、羊毛脂、水合、羊毛脂醇、卵磷脂、中链甘油三酯、甲基纤维素、矿物油和羊毛脂醇、磷酸二氢钠、单乙醇胺、非离子乳化蜡、油酸、泊洛沙姆、泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、丙二醇海藻酸酯、自乳化单硬脂酸甘油酯、脱水柠檬酸钠、十二烷基硫酸钠、脱水山梨糖醇酯、硬脂酸、葵花籽油、黄蓍胶、三乙醇胺、黄原胶及其组合。在一个实施方案中，乳化剂是硬脂酸甘油酯。
“渗透促进剂”是本领域已知的并且包括但不限于脂肪醇、脂肪酸酯、脂肪酸、脂肪醇醚、氨基酸、磷脂、卵磷脂、胆酸盐、酶、胺和酰胺、络合剂(脂质体、环糊精、改性纤维素和二酰亚胺)、大环化合物，例如大环内酯、酮和酸酐和环脲、表面活性剂、N-甲基吡咯烷酮及其衍生物、DMSO和相关化合物、离子化合物、氮酮(azone)和相关化合物，和溶剂，例如醇、酮、酰胺、多元醇(例如二醇)。这些类别的实例是本领域已知的。
“防腐剂”可用于防止真菌和微生物的生长。合适的抗真菌剂和抗微生物剂包括但不限于苯甲酸、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠、丙酸钠、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙醇，和硫柳汞。
“表面活性剂”是表面活性剂，其降低表面张力，从而增加产品的乳化、发泡、分散、铺展和润湿性能。合适的非离子表面活性剂包括乳化蜡、单油酸甘油酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、环糊精、单硬脂酸甘油酯、泊洛沙姆、聚维酮及其组合。在一个实施方案中，非离子表面活性剂是硬脂醇。
(a)乳剂
乳剂是一种液体的制剂，所述液体以小球状分布在整个第二种液体的主体中。在特定的实施方案中，乳剂的不可混溶组分包括亲脂组分和水性组分。分散液为不连续相，而分散介质为连续相。当油是分散液，水溶液是连续相时，它被称为水包油乳剂，而当水或水溶液为分散相，油或油性物质为连续相时，它被称为油包水乳剂。油相和水相中的一者或两者可含有一种或多种表面活性剂、乳化剂、乳液稳定剂、缓冲液和其他赋形剂。优选的赋形剂包括表面活性剂，尤其是非离子表面活性剂；乳化剂，尤其是乳化蜡；和液体非挥发性非水材料，特别是二醇，例如丙二醇。油相可包含其他油性药学上批准的赋形剂。例如，可以在油相中使用诸如羟基化蓖麻油或芝麻油之类的材料作为表面活性剂或乳化剂。
油相可至少部分由推进剂，例如HFA推进剂组成。油相和水相中的一者或两者可含有一种或多种表面活性剂、乳化剂、乳液稳定剂、缓冲剂和其他赋形剂。优选的赋形剂包括表面活性剂，尤其是非离子表面活性剂；乳化剂，尤其是乳化蜡；和液体非挥发性非水材料，特别是二醇，例如丙二醇。油相可包含其他油性药学上批准的赋形剂。例如，可以在油相中使用诸如羟化蓖麻油或芝麻油之类的材料作为表面活性剂或乳化剂。
乳液的一个子集是自乳化系统。这些药物递送系统通常是胶囊(硬壳或软壳)，由分散或溶解在表面活性剂和亲脂性液体(例如油或其他与水不混溶的液体)的混合物中的药物组成。当胶囊暴露在水性环境中并且外层明胶壳溶解时，水性介质与胶囊内容物之间的接触会立即产生非常小的乳液液滴。这些通常在胶束或纳米颗粒的大小范围内。不需要混合力来产生乳液，这是乳液配制过程中的典型情况。
(b).洗剂
通过使用悬浮剂和分散剂，洗剂可以包含在分散介质中不溶的细粉状物质。或者，洗剂可以具有作为分散相的液体物质，所述液体物质与运载体不混溶并且通常通过乳化剂或其他合适的稳定剂分散。在一个实施方案中，洗剂是粘度在100到1000厘沲之间的乳液形式。洗剂的流动性允许在广泛的表面积上快速均匀应用。洗剂通常旨在在皮肤上干燥，在皮肤表面留下一层薄薄的其药物组分。
(c).乳膏
乳膏可能含有乳化剂和/或其他稳定剂。在一个实施方案中，制剂是具有大于1000厘沲，通常在20,000-50,000厘沲的范围内的粘度的乳膏形式。乳膏经常比软膏更优选，因为它们通常更容易涂抹和去除。
乳膏和洗剂之间的区别在于粘度，这取决于多种油的量/用途以及用于制备制剂的水的百分比。乳膏通常比洗剂更稠，可能有多种用途，并且通常一种使用更多不同的油/黄油，这取决于对皮肤的期望效果。在乳膏制剂中，水基百分比约为总体的约60-75％，油基百分比约为20-30％，其他百分比为乳化剂、防腐剂和添加剂，合计为100％。
(d).软膏
合适的软膏基质的实例包括烃基质(例如凡士林、白凡士林、黄色软膏和矿物油)；吸收基质(亲水性凡士林、无水羊毛脂、羊毛脂和冷霜)；水溶性基质(例如亲水性软膏)和水溶性基质(例如聚乙二醇软膏)。糊剂通常与软膏不同，因为它们含有较大百分比的固体。与使用相同组分制备的软膏相比，糊剂通常更具吸收性且更不油腻。
(e).凝胶剂
凝胶剂是含有小分子或大分子在液体运载体中的分散体的半固体系统，通过增稠剂或溶解或悬浮在液体运载体中的聚合物材料的作用使所述液体运载体变成半固体。液体可包括亲脂性组分、水性组分或两者。一些乳液可以是凝胶剂或以其他方式包括凝胶剂组分。然而，一些凝胶剂不是乳剂，因为它们不包含不混溶组分的均质混合物。合适的胶凝剂包括但不限于改性纤维素，例如羟丙基纤维素和羟乙基纤维素；Carbopol均聚物和共聚物；及其组合。液体运载体中合适的溶剂包括，但不限于，二甘醇单乙醚；亚烷基二醇，例如丙二醇；二甲基异山梨醇；醇类，例如异丙醇和乙醇。通常根据其溶解药物的能力来选择溶剂。也可以掺入改善制剂的皮肤感觉和/或润肤性的其他添加剂。此类添加剂的实例包括但不限于肉豆蔻酸异丙酯、乙酸乙酯、苯甲酸C12-C15烷基酯、矿物油、角鲨烷、环甲基硅油、癸酸/辛酸甘油三酯及其组合。
(f).泡沫剂
泡沫剂由乳液和气态推进剂组合组成。气态推进剂主要由氢氟烷烃(HFA)组成。合适的推进剂包括HFA，例如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134a)和1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227)。推进剂优选不是烃类推进剂气体，其在喷雾过程中会产生易燃或易爆的蒸气。此外，该组合物优选不含挥发性醇，其在使用过程中会产生易燃或易爆的蒸气。
II.制备和使用方法
因此，所公开的组合物可用于在有需要的受试者中治疗衰老相关病症和与异常炎症相关的病症。优选地，受试者是哺乳动物，更优选地是人。如本文所用，衰老相关病症或疾病包括与细胞衰老相关或由细胞衰老引起的病症或疾病，包括年龄相关疾病和病症。衰老相关疾病或病症也可称为衰老细胞相关疾病或病症。
衰老是细胞反应，其特征是稳定的生长停滞和其他表型改变，包括促炎分泌组。衰老在正常发育、维持组织稳态和限制肿瘤发展中发挥作用。然而，衰老也被表明是导致年龄相关疾病的主要原因。衰老细胞随着年龄的增长而积累，并与许多疾病有关，包括癌症、纤维化和许多与年龄相关的病理。最近的证据表明，衰老细胞在多种病理中是有害的，它们的消除具有许多优势，改善多种病理并延长健康跨度和寿命。
衰老细胞存在于许多肿瘤前病变、纤维化组织(例如肝、肾、心脏、胰腺)和旧组织中。
虽然SA-β-gal被广泛用作细胞衰老的标志物(Childs等人,Nat Med,21(12),1424-1435(2015)；Hernandez-Segura等人,Trends Cell Biol,28(6),436-453(2018)；Sharpless&Sherr,Nat Rev Cancer,15(7),397-408(2015))，在一些非衰老细胞中发现其活性升高，例如活化的巨噬细胞(Bursuker,Rhodes,&Goldman,J Cell Physiol 112,385-390(1982)；Frescas等人,Cell Cycle 16,1526-1533(2017))。这些SA-β-gal阳性巨噬细胞可能是有害的，并且已被发现会在受伤和年老的组织中积聚，导致慢性炎症(Hall等人,Aging(Albany NY)8,1294-1315(2016)；Oishi&Manabe,NPJ Aging Mech Dis 2,16018(2016))。
病毒性病症
所公开的组合物可用于缓解由病毒诱导的炎症引起的与异常细胞因子产生相关的症状。在此期间受试者可以受益于有效量的本文公开的制剂的施用的示例性病毒感染包括冠状病毒，例如冠状病毒，例如严重急性呼吸系统综合症(SARS)冠状病毒(CoV)、SARS-CoV-2(其导致COVID-19(冠状病毒病2019))和中东呼吸综合征(MERS)-CoV。SARS-CoV-2病毒是β冠状病毒，与MERS-CoV和SARS-CoV一样。这些高致病性人类呼吸道冠状病毒引起以炎症反应和肺损伤为特征的急性致死性疾病。伴随着延迟的I型干扰素(IFN-I)信号传导的SARS-CoV的稳健复制可协调炎症反应和肺免疫病理学，存活率降低。在病毒滴度达到峰值之前，IFN-I仍可检测到，但早期IFN-I施用缓解免疫病理学。这种延迟的IFN-I信号传导促进了致病性炎性单核细胞-巨噬细胞(IMM)的积累，导致肺细胞因子/趋化因子水平升高、血管渗漏和病毒特异性T细胞反应受损。越来越多的证据表明，患有严重的冠状病毒病2019(COVID-19)的患者的一个亚组可能患有细胞因子风暴综合征(Mehta等人，DOI：https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30628-0)。
组合物以有效量施用以降低受试者体内一种或多种巨噬细胞的水平。在特别优选的实施方案中，将公开的组合物施用于感染冠状病毒的受试者，优选地，SARS-CoV或SARS冠状病毒2(Sars-CoV-2)。
癌症和癌症治疗应用
研究已经显示通过SASP(衰老相关分泌表型)，年老组织为癌症提供了支持性微环境。衰老细胞可以通过增强癌细胞的增殖潜力或促进上皮向间充质转化来促进肿瘤发展。因此，随着年龄的增长，年老组织中衰老细胞数量的增加可能导致癌症发病率的增加。支持这一点，当衰老细胞被消除时，观察到肿瘤形成的延迟发作。抗衰老药物治疗还降低了转移的发生率，转移是癌症相关死亡的主要原因。(概述于McHugh等人，J.Cell Biol.,217(1):65-77(2018)中。
在一些实施方案中，本文公开的组合物可与癌症治疗剂组合使用。因此，在一些优选的实施方案中，接受治疗的受试者已被诊断患有癌症。可根据本发明的该方面治疗的癌症的非限制性实例包括：腺癌、肾上腺肿瘤、成釉细胞瘤、间变性、甲状腺间变性癌、血管纤维瘤、血管瘤、血管肉瘤、脓肿、银质瘤、肾母细胞瘤、腹水肿瘤细胞、腹水瘤、星形母细胞瘤、星形细胞瘤、共济失调毛细血管扩张症、心房粘液瘤、基底细胞癌细胞、骨癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、樱桃血管瘤、胆管癌、胆管瘤、软骨母细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、绒毛膜母细胞瘤、绒毛膜癌、结肠癌、常见急性淋巴细胞白血病、颅咽管瘤、囊性癌、囊性纤维瘤、囊瘤、导管原位癌、导管乳头状瘤、无性细胞瘤、脑瘤、子宫内膜癌、内皮瘤、室管膜瘤、上皮瘤、红白血病、尤因氏肉瘤、结外淋巴瘤、猫肉瘤、纤维腺瘤、纤维肉瘤、甲状腺滤泡癌、神经节神经胶质瘤、胃泌素瘤细胞(gastrinoma cell)、多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、性腺母细胞瘤、血管母细胞瘤、成血管内皮细胞瘤、血管内皮瘤、血管外皮细胞瘤、成血细胞瘤、血细胞瘤、毛细胞白血病、错构瘤、肝癌、肝细胞癌、肝细胞瘤、组织瘤、何杰金氏病、肾上腺瘤、浸润性癌、浸润性导管细胞癌、胰岛瘤、青少年型血管瘤(angioforoma)、卡波西肉瘤、肾肿瘤、大细胞淋巴瘤、白血病、白血病、急性白血病、脂肪瘤、肝癌、肝转移、吕克癌、淋巴腺瘤、淋巴管瘤、淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、淋巴细胞瘤、淋巴水肿、淋巴瘤、肺癌、恶性间皮瘤、恶性畸胎瘤、肥大细胞瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、间皮瘤、莫顿神经瘤、多发性骨髓瘤、成髓细胞瘤、骨髓性白血病、髓脂肪瘤、骨髓瘤、成肌细胞瘤、粘液瘤、鼻咽癌、肿瘤、肾胚细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、神经纤维瘤病、神经胶质瘤、神经瘤、非霍奇金淋巴瘤、少突胶质细胞瘤、视神经胶质瘤、骨软骨瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳头佩吉特氏病、肺上沟瘤、胰腺癌、亲铬细胞瘤(phaeochromocytoma)、嗜铬细胞瘤(pheoehromocytoma)、浆细胞瘤、原发性脑肿瘤、前驱瘤(progonoma)、泌乳素瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、横纹肌肉瘤(rhabdo sarcoma)、实体瘤、肉瘤、继发性肿瘤、精原细胞瘤、皮肤癌、小细胞癌、鳞状细胞癌、草莓状血管瘤、T细胞淋巴瘤、畸胎瘤、睾丸癌、胸腺瘤、滋养细胞肿瘤、威尔姆氏瘤。
在一个优选的实施方案中，所公开的抗衰老前药与诱导衰老的其他癌症的治疗方法，例如放射治疗或化学治疗(例如，使用帕博西尼(Palbociclib)、ribociclib或abemaciclib或其他化学治疗剂的治疗)组合使用。因此，通过同时处理或在其他处理之后进行处理，所述活性剂可以：(a)消除已被推至衰老的癌细胞；和/或消除或减少衰老细胞产生的某些副作用，例如炎症、促进癌症生长、促进转移和化学治疗或放射治疗的其他副作用；和/或(b)减少或消除癌前病变；和/或(c)通过用CDK4/6抑制剂处理消除或减少经历衰老的细胞。所公开的活性剂可以减少或消除癌前(或癌前)病变。衰老细胞存在于癌前肿瘤中。在这方面，应理解，癌前肿瘤中的大量细胞经历了癌基因诱导的衰老。因此，所公开的活性剂可用于减少或消除癌前(或肿瘤前)病变。
在另一个优选的实施方案中，例如在用化学治疗剂治疗之前、期间或之后，施用公开的抗衰老前药以消除或减少化学治疗诱导的衰老。因此，在一个优选的实施方案中，所述治疗剂可以用于与化学治疗剂组合治疗，其中该治疗剂与化学治疗剂分开、相继或同时施用。示例性化学治疗剂包括但不限于蒽环类、多柔比星、依托泊苷、柔红霉素、紫杉醇(taxol)、紫杉醇(paclitaxel)、吉西他滨、泊麦度胺和来那度胺。所公开的抗衰老前药可以消除或减少由CDK抑制剂，例如CDK4或CDK6抑制剂治疗诱导的衰老。因此，在一个优选的实施方案中，所公开的抗衰老前药可以用于与CDK4或CDK6抑制剂组合治疗，其中所述治疗剂与CDK4或CDK6抑制剂分开、相继或同时施用。所公开的抗衰老前药可以消除或减少帕博西尼诱导的衰老。在消除或减少帕博西尼诱导的衰老的背景下，当细胞重新进入细胞周期时，施用所述治疗剂可能会潜在地阻止癌症缓解。在另一个优选的实施方案中，所述治疗剂可以消除已被推向衰老的癌细胞。在一个优选的实施方案中，该治疗剂延迟肿瘤发生。
在另一个优选的实施方案中，所公开的抗衰老前药可以减少衰老细胞产生的某些副作用，例如炎症、促进癌症生长、促进转移以及化学治疗或放射治疗的其他副作用。
化学治疗诱发的副作用或放射治疗诱发的副作用包括但不限于体重减轻、内分泌变化、激素失衡、激素信号传导变化、心脏毒性变化、身体组成、身体活动能力降低、胃肠道毒性、恶心、呕吐、便秘、厌食、腹泻、周围神经病变、疲劳、不适、体力活动不足、血液学毒性、贫血、肝毒性、脱发、疼痛、感染、粘膜炎、体液潴留、皮肤病学毒性、皮疹、皮炎、色素沉着过多、荨麻疹、光敏性、指甲变化、口腔、牙龈或喉咙问题，以及化学治疗或放射治疗引起的任何毒副作用。因此，在一个优选的实施方案中，所述治疗剂可以用于与化学治疗剂的组合治疗，其中该治疗剂与化学治疗剂分开、相继或同时施用。同样，所述治疗剂可以用于与放射治疗的组合治疗，其中该治疗剂在放射治疗之前、期间或之后施用。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的治疗剂，其用于减少或减轻一种或多种化学治疗诱发或放射治疗诱发的副作用。
在一些实施方案中，提供了用于处理或降低转移可能性的方法，其包括在非化学治疗或非放射治疗时间间隔期间或在化学治疗或放射治疗处理方案已经完成之后施用本文所述的治疗剂。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的治疗剂，其用于处理转移或降低转移可能性。
在一个优选的实施方案中，所公开的抗衰老前药可用于处理慢性或长期化学治疗诱发或放射治疗诱发的副作用。某些毒性作用可能会在处理后很长时间内出现，并且可能是由于治疗对器官或系统造成的损害。在儿童时期接受癌症治疗的受试者中可以观察到器官功能障碍，例如神经、肺、心血管和内分泌功能障碍。在接受化学治疗或放射治疗的受试者中发生的慢性或晚期毒副作用包括，例如，心肌病、充血性心脏病、炎症、更年期提前、不孕症、认知功能受损、周围神经病变、继发性癌症、白内障和其他视力问题、听力损失、慢性疲劳、肺容量减退和肺部疾病。
非癌症/癌症治疗应用
在其他优选的实施方案中，受试者没有被诊断出患有癌症并且没有接受癌症治疗。在这些实施方案中，所公开的组合物被施用以减少有需要的受试者中的衰老细胞群。
衰老细胞与一长串其他病理相关，包括神经系统(例如脑动脉瘤、阿尔茨海默氏症和帕金森病)、肺部(例如特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病和囊性纤维化)、眼科(例如白内障、青光眼、黄斑变性)、肌肉骨骼(例如少肌症、椎间盘退变)、心血管(例如动脉粥样硬化、心脏纤维化、主动脉瘤)、肾(例如移植并发症)、和其他例如粘膜炎、高血压、肝纤维化和骨髓纤维化(OMF)。
衰老的一个显著特征是功能逐渐丧失，或发生在分子、细胞、组织和生物体水平上的退化。与年龄相关的退化引起公认的病理，例如少肌症、动脉粥样硬化和心力衰竭、肺功能不全、肾衰竭、神经变性(包括黄斑变性、阿尔茨海默氏病和帕金森病)等等。衰老相关疾病和病症包括但不限于心血管疾病和病症、炎症性疾病和病症、自身免疫性疾病和病症、肺部疾病和病症、眼部疾病和病症、代谢疾病和病症、神经系统疾病和病症(例如，神经退行性疾病和病症)；衰老引起的与年龄有关的疾病和病症；皮肤状况；与年龄有关的疾病；皮肤病和病症；和移植相关的疾病和病症。
与β-半乳糖苷酶活性升高相关的疾病
在另一个实施方案中，所述治疗剂可用于治疗与升高的β-半乳糖苷酶活性相关联或相关的疾病或病症。在优选的实施方案中，升高的β-半乳糖苷酶活性是β-半乳糖苷酶表达升高或β-半乳糖苷酶活性相对于基线水平过度表达的结果，这可以通过标准方法确定。在细胞中可以通过组织化学或免疫组织化学方法检测β-半乳糖苷酶的表达。例如，可以通过已知方法检测衰老标志物SA-β半乳糖苷酶(SAβ-Gal)(Dimri等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：9363-9367(1995))。
在本发明的更优选的实施方案中，所述疾病选自新生儿早衰症的Wiedemann-Rautenstrauch综合征、成人早衰症的Werner综合征、Hutchinson-Gilford综合征、Rothmund Thompson综合征、Mulviii-Smith综合征、Cockayne综合征、先天性角化不良、特发性肺纤维化、再生障碍性贫血、肺气肿、和软骨退化。
Hutchinson-Gilford早衰综合症(“早衰症”或“HGPS”)是一种罕见的致命遗传病，其特征是儿童出现加速衰老。尽管他们出生时看起来很健康，但早衰症儿童在生命的头两年内开始表现出许多加速衰老的特征。早衰迹象包括生长障碍、身体脂肪和头发减少、皮肤老化、关节僵硬、髋关节脱位、全身动脉粥样硬化、心血管(心脏)疾病和中风。其他早衰综合征包括WerneR’s综合征，也称为“成人早衰”，其直到青少年晚期才发病。早衰症无法治愈，但如果孩子的关节僵硬，职业和物理治疗可以帮助他们保持活动。所公开的组合物和方法可以缓解与早衰综合症相关的加速老化症状。下面的实例表明，使用反义寡核苷酸(AON)从HGPS小鼠模型(LAKI)获得的细胞中L1RNA的消除恢复了表观遗传标志物的水平并降低了衰老相关基因的表达，延长了寿命。
心血管疾病
在本发明的一个优选实施方案中，衰老相关疾病或病症是心血管疾病。实例包括但不限于动脉粥样硬化、心绞痛、心律失常、心肌病、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、颈动脉疾病、心内膜炎、冠状动脉血栓形成、心肌梗塞、高血压、主动脉瘤、心脏舒张功能障碍、高胆固醇血症、高血脂、二尖瓣脱垂、外周血管疾病、心脏应激抵抗、心脏纤维化、脑动脉瘤和中风。在一个优选的实施方案中，衰老相关疾病或病症与动脉粥样硬化(即动脉的硬化)有关或由其引起。
动脉粥样硬化的特征是斑片状的内膜斑块(粥样斑块)，其侵入中型和大动脉的管腔上。施用根据本发明的治疗剂可以降低受试者血管中动脉粥样硬化斑块的脂质含量和/或增加纤维帽厚度。
炎症和自身免疫性疾病和病症
在本发明的一个优选实施方案中，衰老相关疾病或病症是炎性或自身免疫性疾病或病症。自身免疫疾病的非限制性实例包括银屑病、口腔粘膜炎、类风湿性关节炎、炎性肠病、湿疹、脊柱后凸(脊柱弯曲)、椎间盘突出和肺部疾病、COPD和特发性肺纤维化。在一个优选的实施方案中，衰老相关疾病或病症是慢性炎症。
因此，在一些实施方案中，衰老相关疾病或病症可以是类风湿性关节炎。类风湿性关节炎是慢性炎症性病症，其通常会影响手和脚的关节。
神经系统疾病或病症
在本发明的一个优选实施方案中，衰老相关疾病或病症是选自阿尔茨海默氏病(和其他痴呆)、帕金森病、亨廷顿病、痴呆、轻度认知障碍(MCI)、黄斑变性和运动神经元功能障碍(MND)的神经系统疾病或病症，以及眼睛的疾病和病症，例如与年龄相关的黄斑变性。
帕金森病(PD)是以运动缓慢(运动迟缓)、颤抖、僵硬、姿势不稳定和失去平衡为特征的大脑致残病状。许多这些症状是由于大脑中某些神经的丧失，其导致多巴胺缺乏。产生多巴胺的神经元的衰老被认为是通过产生活性氧导致观察到的PD中细胞死亡。
阿尔茨海默氏病(AD)是神经退行性疾病，其表现为缓慢进行性的智力衰退，伴有记忆力减退、定向障碍和意识模糊，导致严重的痴呆症。随着疾病的发展，会出现判断力受损、意识模糊、行为改变、定向障碍以及行走和吞咽困难。年龄是发生AD的单一最大诱发风险因素，其是年老人痴呆的主要原因(Hebert等人，Arch.Neurol.60:1 19-1122(2003))。早期临床症状显示与轻度认知障碍显著的相似性。
轻度认知障碍(MCI)是脑功能综合征，其涉及认知障碍的发生和发展，超出基于个人年龄和教育的预期，但不足以干扰个人的日常活动。MCI是认知老化的一个方面，其被认为是正常老化与其可能转化为痴呆之间的过渡状态(Pepeu，Dialogues in Clinical Neuroscience,6:369-377,2004)。主要影响记忆的MCI被称为“遗忘型MCI”，通常被视为阿尔茨海默氏病的前驱期。影响除记忆以外的思维技能的MCI被称为“非遗忘型MCI”。
MND是一组进行性神经系统病症，其破坏运动神经元，所述运动神经元是控制自主肌肉活动，例如说话、行走、呼吸和吞咽的细胞。MND的实例包括肌萎缩侧索硬化(ALS)，也称为Lou Gehrig病、进行性延髓麻痹、假性延髓麻痹、原发性侧索硬化、进行性肌萎缩、下运动神经元疾病和脊髓性肌萎缩(SMA)(例如，SMA1(也称为Werdnig-Hoffmann病)、Kugelberg-Welander综合征和肯尼迪病、脊髓灰质炎后综合征和遗传性痉挛性截瘫。
眼科疾病和病症
在本发明的一个优选实施方案中，衰老相关疾病或病症是眼部疾病、病症或病状。实例包括但不限于老花眼、黄斑变性、白内障和青光眼。黄斑变性是神经退行性疾病，其引起视网膜中央部分(称为黄斑)的感光细胞丢失。
代谢疾病
在本发明的一个优选实施方案中，衰老相关疾病或病症是选自糖尿病性溃疡、代谢综合征和肥胖症的代谢疾病。
衰老细胞被理解为在代谢疾病中发挥作用，例如肥胖症。研究已经显示，肥胖小鼠的脂肪组织显示衰老标志物SA-p-Gal、p53和p21的诱导(Tchkonia等人，Aging Cell 9：667-684(2010)；Minamino等人，Nat.Med.15:1082-087(2009))。本文所述的治疗剂在处理或预防肥胖症和代谢综合征方面具有潜在的应用。
肺部疾病或病症
在本发明的一个优选实施方案中，衰老相关疾病或病症是肺病。实例包括但不限于肺纤维化、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、囊性纤维化、肺气肿、支气管扩张和与年龄相关的肺功能丧失。
COPD是肺部疾病，其定义为由肺组织破裂(肺气肿)和小气道功能障碍(阻塞性细支气管炎)导致的持续不良气流。肺纤维化是慢性进行性肺部疾病，其特征是肺硬化和瘢痕形成，可能导致呼吸衰竭、肺癌和心力衰竭。本发明的治疗剂还可用于治疗老化且肺功能丧失(或退化)(即，与年轻受试者相比肺功能下降或受损)和/或肺组织退化的受试者。
其他与年龄有关的病症
在一些实施方案中，所治疗的衰老相关疾病或病症是选自肾衰竭、虚弱、听力损失、肌肉疲劳、皮肤状况、皮肤伤口愈合、肝纤维化、胰腺纤维化、口腔粘膜下纤维化和少肌症的年龄相关病症。
皮肤科疾病或病症
在本发明的一个优选实施方案中，衰老相关疾病或病症是皮肤病学疾病或病症，实例包括但不限于湿疹、银屑病、色素沉着过多、痣、皮疹、特应性皮炎(湿疹和炎症相关的一种形式)、荨麻疹、与光敏性或光老化有关的疾病和病症、皱纹(因老化而产生的皱纹)；瘙痒症(与老化有关)；感觉迟钝(与多发性硬化症相关的化学治疗副作用)；湿疹性药物疹(经常在年老患者中观察到，并与某些药物的副作用有关)；嗜酸性皮肤病(与某些类型的血液学癌症有关)；反应性中性粒细胞皮肤病(与诸如炎症性肠综合征等的潜在疾病相关)；天疱疮；类天疱疮；免疫大疱性皮肤病(皮肤自身免疫性水疱)；皮肤纤维组织细胞增生；皮肤淋巴瘤；和皮肤狼疮。迟发性狼疮可能与老化相关的T细胞和B细胞以及细胞因子(免疫衰老)的功能降低(即减少)有关联。
寿命和与年龄有关的疾病或病症
在一个优选的实施方案中，本文所述的治疗剂可用于通过选择性杀死衰老细胞而不是非衰老细胞来延长受试者的寿命。在一些实施方案中，延长受试者的寿命包括延迟与年龄相关的疾病或病症的发作或发展。在一些实施方案中，与年龄相关的疾病或病症选自动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症、关节炎、痴呆、白内障、高血压、与年龄相关的脂肪减少、和脂肪营养不良。在一些实施方案中，年龄相关疾病或病症是年老焦虑症。在一些实施方案中，与年龄相关的疾病或病症是与年龄相关的不活动性。在一些实施方案中，与年龄相关的疾病或病症是自发活动的减少。在一些实施方案中，与年龄相关的疾病或病症是探索行为的减少。
实施例
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
除非另有说明，所有化学反应均在氮气环境下用干燥溶剂在无水条件下进行。除非另有说明，否则试剂均以最高商业质量购买，无需进一步纯化。产率通过色谱法测量。
通过薄层色谱在Yantai Chemicals(China)提供的平板(GF254)上，使用UV光作为显色剂，磷钼酸和硫酸铈的乙醇溶液和热作为显影剂来监测反应。除非另有说明，快速柱色谱均使用Tsingtao Haiyang Chemicals(China)提供的硅胶(200-300目)。
除非另有说明，在Brüker Advance 600(13C 150MHz,19F 565MHz)和Brüker Advance 400(1H 400MHz)光谱仪上记录NMR光谱，所述光谱仪使用残留的未氘化溶剂(在3.31ppm 1H NMR处的CD3OD，49.0ppm 13C NMR)校准。以下缩写用于解释多重性：s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，dd＝双峰的双峰，m＝多重峰。使用Brüker Apex IV FTMS使用ESI(电喷雾电离)获得质谱数据。
实施例1
合成A13经β-gal修饰前药A13bGa1
1.合成化合物a-3
室温条件下在搅拌的[(2R,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-三(乙酰基氧基)-6-溴四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(5.0g,12.160mmol,1eq)和MeCN(100mL)溶液中加入4-甲酰基-2-硝基苯酚(2.24g,13.376mmol,1.1eq)和Ag2O(9.30g,40.128mmol,3.3eq)。得到的混合物在室温下搅拌12小时，采用薄层色谱法(TLC)和液相色谱法(LCMS)检测反应。所得到的混合物在减压下浓缩，残留物经硅胶柱层析纯化，PE/EA(1/1)洗脱得到化合物a-3(5.1g,84％)为白色固体。
LCMS15-化合物a-3:(ESI,m/z):[M+NH4]+＝515.2.
H-NMR16-化合物a-3:1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ9.98(s,1H),8.30(d,J＝2.1Hz,1H),8.07(dd,J＝8.7,2.1Hz,1H),7.48(d,J＝8.6Hz,1H),5.59(dd,J＝10.4,7.9Hz,1H),5.49(d,J＝3.4Hz,1H),5.21(d,J＝7.9Hz,1H),5.13(dd,J＝10.4,3.4Hz,1H),4.32–4.05(m,3H),2.19(s,3H),2.13(s,3H),2.08(s,3H),2.02(s,3H).
2.合成化合物a-4
室温条件下在搅拌的氯仿(100mL)、丙-2-醇(20mL)和[(2R,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰氧基)-6-(4-甲酰基-2-硝基苯氧基)四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(5.1g,10.253mmol,1eq)溶液中加入NaBH4(0.47g,12.304mmol,1.2eq)。得到的混合物在室温下搅拌12小时，采用薄层色谱法(TLC)和液相色谱法(LCMS)检测反应。所得到的混合物在减压下浓缩，残留物经硅胶柱层析纯化，PE/EA(1:2)洗脱得到化合物a-4(4.8g,93％)为白色固体。
LCMS15-化合物a-4:(ESI,m/z):[M+NH4]+＝517.2.
I-NMR30-化合物a-4:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.79(d,J＝2.1Hz,1H),7.62(dd,J＝8.6,2.1Hz,1H),7.37(d,J＝8.6Hz,1H),5.54(d,J＝7.5Hz,1H),5.41(d,J＝5.7Hz,1H),5.36(dd,J＝3.3,1.1Hz,1H),5.29–5.18(m,2H),4.51(d,J＝5.7Hz,2H),4.47(m,1H),4.13(t,J＝6.1Hz,2H),2.15(s,3H),2.03(d,J＝0.8Hz,6H),1.94(s,3H).
3.合成化合物a-6
室温条件下在搅拌的3-[1-(金刚烷-1-基甲基)-5-甲基吡唑-4-基]-6-{8-[(1,3-苯并噻唑-2-基)氨基甲酰基]-3,4-二氢-1H-异喹啉-2-基}吡啶-2-羧酸(200mg,0.304mmol,1eq)、化合物4a(181.93mg,0.365mmol,1.2eq)和DMF(50mL)溶液中加入EDC.HCl(69.83mg,0.365mmol,1.2eq)。得到的混合物在50℃下搅拌16小时，采用液相色谱法(LCMS)监测反应。所得到的混合物在真空下浓缩，残留物在以下条件下经反向快速色谱(reverse flash chromatography)纯化得到产物，条件为:色谱柱:C18,330g；流动相A:水/0.05％FA,流动相B:ACN；流速:100mL/min；梯度:3分钟内5％B到10％B；0分钟内从10％B到25％B；35分钟内25％B到80％B；5分钟内80％B到95％B；检测,254/220nm。平行反应24批次，最终得到化合物a-6(4.5g,52％)为淡黄色固体。
LCMS24-化合物a-6:(ESI,m/z):[M+H]+＝1140.1.
H-NMR10-化合物a-6:1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.86(s,1H),8.04–7.97(m,1H),7.76(d,J＝8.2Hz,1H),7.68–7.52(m,3H),7.51–7.41(m,3H),7.40–7.29(m,3H),7.22(s,1H),7.01(d,J＝8.9Hz,1H),5.54(d,J＝7.3Hz,1H),5.37(dd,J＝3.1,1.1Hz,1H),5.28–5.19(m,2H),5.08(s,2H),4.97(s,2H),4.57–4.45(m,1H),4.12(d,J＝6.2Hz,2H),3.87(d,J＝5.9Hz,2H),3.62(s,2H),3.02(d,J＝5.9Hz,2H),2.14(s,3H),2.07(s,1H),2.02(d,J＝2.2Hz,8H),1.95(s,3H),1.86(s,3H),1.58(s,3H),1.46(s,9H).
4.合成化合物a-7(A13bGa1)
室温条件下在搅拌的化合物a-6(100mg,0.088mmol,1eq)、MeCN(1mL)和EtOH(1mL)溶液中加入碳酸钾(36.36mg,0.264mmol,3eq)。得到的混合物在室温下搅拌24小时，采用液相色谱法(LCMS)监测反应。所得到的混合物在减压下浓缩，残留物在以下条件下经反向快速色谱纯化得到产物，条件为:色谱柱:C18,120g；流动相A:水/0.05％FA,流动相B:ACN；流速:100mL/min；梯度:3分钟内5％B到10％B；0分钟内从10％B到25％B；35分钟内25％B到80％B；5分钟内80％B到95％B；检测,254/220nm。平行反应44批次，最终得到化合物a-7(1.68g,45％)为淡黄色固体。
LCMS24-化合物a-7:(ESI,m/z):[M+H]+＝972.20.
H-NMR30-化合物a-7:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.33(t,J＝4.9Hz,1H),7.98(d,J＝7.9Hz,1H),7.74(d,J＝8.1Hz,1H),7.65–7.59(m,2H),7.54(d,J＝8.7Hz,1H),7.48–7.27(m,6H),7.22(s,1H),6.99(d,J＝8.8Hz,1H),5.06–4.99(m,3H),4.98(s,2H),3.87(m,3H),3.71(d,J＝3.1Hz,1H),3.65(m,4H),3.60–3.45(m,4H),3.40(m,1H),3.01(t,J＝6.1Hz,3H),2.03(s,3H),1.89(s,3H),1.61(d,J＝12.2Hz,3H),1.54–1.41(m,9H).
实施例2
a.合成A13衍生物A13-c1作为β-gal前药的母药
将化合物c1-1溶液(300mg,1.08mmol,1.00eq，溶于DMF溶剂)加入化合物c1-2溶液(145mg,700umol,0.65eq)，再加入KI(44.7mg,269umol,0.25eq)和Cs2CO3(446mg,1.37mmol,1.27eq)，混合物在70℃搅拌反应24小时。LC-MS检测c1-2峰在0.366分钟，c1-3峰在0.553分钟，生成的c1-3反应回收率约为62％。通过20℃加水(20ml)终止反应，使用EA(10.0ml)稀释，用EA(10mL*3)进行萃取，所得有机层用盐水(20.0mL*1)洗涤，干燥[Na2SO4]，在低压条件下过滤及浓缩得到残留产物，进一步使用pre-TLC色谱柱(SiO2,PE:EA＝0:1,Rf[P1]＝0.79)进行纯化，得到化合物c1-3，呈无色油状。
2.合成化合物c1-4
将化合物m2(330mg,583umol,1.00eq)和化合物c1-3(591mg,1.46mmol,2.50eq)混合，加入Pd2(dba)3(53.4mg,58.3umol,0.10eq)，97739-46-3(68.2mg,233umol,0.40eq)和K3PO4(433mg,2.04mmol,3.50eq)，加二噁烷(0.50ml)和水(0.50ml)作为反应溶剂，在N2条件下，90℃搅拌反应2小时。LC-MS检测显示71.6％终产物获得(RT＝0.651min,m/z＝765.0[M+H]+)。反应终止后产物经过滤，甲醇(20.0mL)洗涤，减压浓缩，进一步使用pre-HPLC进行纯化(色谱柱:DAICEL CHIRALPAK IC(250mm*30mm,10um)；流动相:[ACN/IPA(0.1％NH3H2O)]；B％:40％-40％,A3.5；35min)，得到化合物c1-4(70.0mg,89.0umol,15.2％产率,97.2％纯度)。
化合物c1-4LCMS:RT＝0.651min,M+H+＝765.0.HNMR:(400MHz,CHLOROFORM-d)δ＝7.82(d,J＝7.9Hz,1H),7.52(d,J＝7.6Hz,1H),7.39-7.33(m,2H),7.24-7.18(m,1H),7.18-7.09(m,2H),6.83(d,J＝8.8Hz,1H),5.02(s,2H),4.11(br d,J＝4.1Hz,1H),4.07-3.97(m,4H),3.91(d,J＝7.1Hz,2H),3.03(br t,J＝5.7Hz,2H),2.66(br t,J＝11.7Hz,2H),2.11(s,3H),1.60(br d,J＝11.8Hz,2H),1.45(s,9H),1.34(s,9H),1.26(br s,2H),0.91-0.80(m,1H).
3.合成化合物c1(A13-c1)
化合物c1-4(70.0mg,91.6umol,1.00eq)溶于DCM(5.00ml)，在0℃下加入TFA(1.00ml)，混合物在25℃下搅拌反应3小时。LC-MS检测到化合物c1-4充分反应，95.1％产物c1生成(RT＝0.389min,m/z＝608.5[M+H]+)。产物经减压浓缩，使用prep-HPLC进行纯化(TFA条件色谱柱:Welch Xtimate C18 150*25mm*5um；流动性:[water(NH4HCO3)-ACN]；B％:15％-45％,2min)，得到产物c1(20.0mg,32.4umol,35.4％产率,98.6％纯度，浅黄色固体)。
化合物c1LCMS:RT＝0.389min,M+H+＝608.5.HNMR:(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.01(d,J＝7.8Hz,1H),7.77(d,J＝7.9Hz,1H),7.60(d,J＝6.6Hz,1H),7.49-7.38(m,3H),7.36-7.31(m,3H),6.67(d,J＝8.6Hz,1H),4.90(s,2H),3.89-3.83(m,4H),2.98(br d,J＝5.5Hz,4H),2.16(s,3H),2.00(br d,J＝7.9Hz,2H),1.49(br d,J＝11.9Hz,2H),1.30(br d,J＝9.9Hz,2H),0.85(br t,J＝6.8Hz,1H).
b.合成A13衍生物A13-c2作为β-gal前药的母药
化合物c2-1(800mg,3.49mmol,1.00eq)溶于DCM(8.00mL)，在0℃条件加入MsCl(599mg,5.23mmol,405uL,1.50eq)和TEA(564mg,5.58mmol,776uL,1.60eq)，混合物在25℃搅拌反应16小时。TLC(PE:EA＝0:1,Rf[c2-1]＝0.38,Rf[c2-2]＝0.81)方法检测化合物c2-1充分反应，产物生成。将反应混合物分布于5.00％碳酸氢钠溶液(15.0ml)，使用二氯甲烷45ml进行萃取(15.0mL*3)，获取有机相，使用盐水(25.0ml)洗涤，进行干燥[Na2SO4]，过滤浓缩得到产物c2-2(1.5g，粗品)，直接用于下步反应。
2.合成化合物c2-3
将化合物c2-2(1.00g,3.25mmol,1.00eq)和化合物c1-2(812mg,3.90mmol,1.20eq)混合，加入KI(135mg,813umol,0.25eq)，Cs2CO3(2.65g,8.13mmol,2.50eq)，溶于DMF(10.0mL)，混合物在N2条件下，70℃搅拌反应12小时。LCMS检测c2-2充分反应，34.2％产物c2-3生成(RT＝0.647min,m/z＝420.9[M+H]+)。反应混合物用水(20.0mL)稀释，乙酸乙酯进行萃取(20.0mL*3)，获取有机层，盐水洗涤(20mL*1)，进行干燥[Na2SO4]，过滤浓缩，进行反向HPLC(0.1％FA条件)纯化得到产物c2-3(300mg,370umol,11.3％产率,51.8％纯度)。
3.合成化合物c2-4
将化合物c2-3(278mg,663umol,2.50eq)和化合物m2(150mg,265umol,1.00eq)溶于二噁烷(5.00ml)和水(5.00ml)，加97739-46-3(31.0mg,106umol,0.40eq)，Pd2(dba)3(24.2mg,26.5umol,0.10eq)和K3PO4(225mg,1.06mmol,4.00eq)，所得混合物在90℃搅拌反应2小时。LCMS检测到化合物m2充分反应，48.9％产物c2-4生成(RT＝0.588min,m/z＝778.5[M+H]+)。反应混合物过滤，甲醇洗涤(20.0ml)，减压浓缩，使用反向HPLC进行纯化(0.1％FA条件)，得到黄色固体产物c2-4(130mg,165umol,62.3％产率,99.0％纯度)。
4.合成化合物c2(A13-c2)
化合物c2-4(130mg,167umol,1.00eq)溶于DCM(5.00ml)，在0℃加入TFA(1.00ml)，混合物在25℃条件下反应10小时。LCMS检测化合物c2-4充分反应，约96.7％产物c2生成(RT＝0.389min,m/z＝622.4[M+H]+)。产物经减压浓缩，SFC方法纯化(条件:色谱柱:DAICEL CHIRALCEL OX(250mm*30mm,10um)；流动相:[ACN/MeOH(0.1％NH3H2O)]；B％:65％-65％,A5；50min)，得到产物c2(24.0mg,35.4umol,21.2％产率,91.8％纯度)，呈黄绿色固体形态。
化合物c2LCMS:RT＝0.389min,M+H+＝622.4；SFC:EC7305-41-P1A2,RT＝1.950min；HNMR:(400MHz,METHANOL-d4)δ＝7.91(d,J＝7.9Hz,1H),7.77(d,J＝7.9Hz,1H),7.60(d,J＝7.4Hz,1H),7.52(d,J＝8.8Hz,1H),7.44(d,J＝8.0Hz,2H),7.40-7.32(m,3H),7.05(d,J＝8.9Hz,1H),5.06(s,2H),4.00-3.93(m,4H),3.09(s,1H),3.16-3.01(m,1H),3.02(s,1H),3.14-2.98(m,1H),2.21(s,1H),2.13(s,3H),2.05(d,J＝11.1Hz,2H),1.75(d,J＝11.6Hz,2H),1.25-1.10(m,3H),0.94-0.83(m,2H)
c.合成化合物m1作为β-gal修饰中间体化合物
1.合成化合物m1-3
将化合物m1-1(20.0g,48.6mmol)和Ag2O(57.4g,248mmol)溶于ACN(171mL)，往其中加入溶于ACN(162mL)的化合物m1-2(8.13g,48.6mmol)，混合物在25℃条件下搅拌反应4小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1/1,化合物m1-3Rf＝0.20)检测化合物m1-1(Rf＝0.80)完全消耗，化合物m1-3生成。反应混合物经过滤浓缩得到粗品，经柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝1000/1至1/1)纯化得到化合物m1-3(16.0g,63.9％产率,96.3％纯度)，呈现白色固体。
化合物m1-3 1H NMR:(400MHz,CDCl3)δ9.96(s,1H),8.29-8.07(m,1H),8.06-8.05(m,1H),7.49-7.47(m,1H),5.57-5.47(m,2H),5.22-5.11(m,2H),4.24-4.14(m,3H),2.18-1.98(m,12H)
2.合成化合物m1-4
往化合物m1-3(11.0g,22.1mmol)溶于CHCl3(77.0mL)和i-PrOH(25.6mL)的溶液中，在0℃下加入NaBH4(750mg,19.8mmol)，混合物在0℃条件下搅拌反应2小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1/1,化合物m1-4Rf＝0.10)检测到化合物m1-3完全消耗，化合物m1-4生成。反应通过在0℃条件下加饱和的NHCl4溶液(30.0mL)终止。有机相使用饱和盐水(30.0ml)洗涤，使用乙酸乙酯溶液(90.0mL)进行萃取，Na2SO4干燥，过滤浓缩得到粗品。粗品经柱层析(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝1000/1至1/1)纯化得到化合物m1-4(7.00g,54.3％产率,85.3％纯度)，呈现为白色固体。
化合物m1-4 1H NMR:(400MHz,CDCl3)δ7.79-7.52(m,1H),7.51-7.50(m,1H),7.49-4.32(m,1H),5.52-5.50(m,2H),5.46-5.08(m,2H),5.07-4.71(m,2H),4.24-4.00(m,3H),2.18-2.00(m,12H)
3.合成中间体化合物m1
往化合物m1-4(4.00g,8.01mmol)溶于DCM(144mL)的溶液中加入化合物m1-5(3.55g,17.6mmol)和Py(1.58g,20.0mmol,1.62mL)，混合物在25℃条件下搅拌反应2小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1/1,化合物m1Rf＝0.20)检测到化合物m1-4(Rf＝0.30)完全消耗，化合物m1生成。反应通过加入H2O(20.0ml)进行终止。所得有机相使用饱和盐水(20.0ml)洗涤，使用DCM(90.0ml)萃取，Na2SO4干燥，过滤浓缩得到粗品，经柱层析(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝1000/1至1/1)纯化得到化合物m1(3.68g,55.7％产率,80.6％纯度)，呈白色固体。
化合物m1 1H NMR:(400MHz,CDCl3)δ8.28-8.26(m,2H),7.89-7.61(m,1H),7.59-7.58(m,1H),7.40-7.36(m,3H),5.54-5.52(m,2H),5.47-5.09(m,2H),4.25-4.13(m,3H),2.18-2.00(m,12H)
实施例3
[根据细则26改正 17.04.2023] 合成A13经β-gal修饰前药A13bG-b1
1.合成化合物b-1
往化合物A-1331852(50mg，75.8μmol)，Py(90.0mg,1.14mmol)溶于DCM(0.35ml)和BuOH(213mg,2.88mmol)的溶液中于0℃下加入TosCl(95.0mg,498μmol)。混合物在0℃下搅拌30分钟，接着在25℃下搅拌2小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝1/1，化合物b-1，Rf＝0.60)检测显示化合物A-1331852(Rf＝0.20)充分反应，有新化合物生成。反应混合物通过在0℃下加入饱和的NaHCO3(5.00mL)终止反应。所得有机层用饱和盐水(5.00mL)洗涤，使用乙酸乙酯(15.0ml)萃取，Na2SO4干燥，在低压条件下过滤及浓缩得到残留产物，进一步使用pre-TLC色谱柱(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝1：1)进行纯化，得到化合物b-1(6.00mg,9.33％产量,84.4％纯度)，呈黄色油状。
[根据细则26改正 17.04.2023] 2.合成化合物b-3
往化合物b-2(17.2mg,41.9μmol)，b-1(6.00mg,8.39μmol)溶于DMF(0.144ml)和MeCN(0.036mL)的溶液中加入1,1,3,3-四甲基胍(966μg,8.39μmol,1.06μL)，Rac-BINOL(240μg,0.839μmol)和CuI(79.9μg,0.420μmol)。混合物于25℃在450nm蓝-LED灯照射环境下反应6个小时。LCMS显示约11.4％化合物b-2残留，多个新峰产生，监测到约7.0％化合物b-3生成。以上反应6个平行进行，反应完后合一起进行后续分离纯化。通过硅胶过滤反应后悬液，使用乙酸乙酯(10.0ml，3次)洗涤。残留物使用prep-HPLC(色谱柱:Welch Ultimate XB CN 10u100x 30mm；流动相:[Heptane-EtOH]；梯度洗脱:5％-95％B，10分钟)纯化得到化合物b-3(1.00mg,5.00％产率)，呈白色固体。
1H NMR:ET67304-79-P1A1(400MHz,CDCl3)δ8.27-8.25(m,1H),7.99(d,J＝8.4Hz,1H),7.68(d,J＝8.0Hz,1H),7.44-7.40(m,1H),7.38-7.36(m,1H),6.93-6.89(m,2H),5.97-5.92(m,1H),5.66(d,J＝3.2Hz,1H),5.43-5.39(m,1H),5.26-5.10(m,1H),4.32-4.30(m,2H),4.21-4.17(m,1H),4.13-4.10(m,2H),3.73(s,2H),3.09-3.05(m,2H),2.35(s,3H),2.14(s,3H),2.05(s,3H),2.03(s,3H),1.77(s,3H),1.72-1.69(m,4H),1.63-1.57(m,12H),1.40(s,9H).
3.合成化合物b-4(即为A13bG-b1)
将化合物b-3(800μg,0.765μmol)加入1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(0.800mL)，80℃下反应6个小时。LCMS(产物RT＝0.772分钟)显示反应完全。反应产物进行真空下浓缩得到化合物b-4(约1.00mg)，呈黄色固体。
1H NMR:ET55368-152-P1A1(400MHz,CDCl3)δ8.27-8.25(m,1H),7.99(d,J＝8.4Hz,1H),7.68(d,J＝8.0Hz,1H),7.44-7.40(m,1H),7.38-7.36(m,1H),6.93-6.89(m,2H),5.97-5.92(m,1H),5.66(d,J＝3.2Hz,1H),5.43-5.39(m,1H),5.26-5.10(m,1H),4.32-4.30(m,2H),4.21-4.17(m,1H),4.13-4.10(m,2H),3.73(s,2H),3.09-3.05(m,2H),2.35(s,3H),2.14(s,3H),2.05(s,3H),2.03(s,3H),1.77(s,3H),1.72-1.69(m,4H),1.63-1.57(m,12H).
实施例4
[根据细则26改正 17.04.2023] 合成A13经β-gal修饰前药A13bG-c1和A13bG-c2
[根据细则26改正 17.04.2023] 1.合成化合物b-5
将化合物b-1(200mg,279μmol,1.00eq)，b-2(460mg,1.12mmol,4.00eq)和Cs2CO3(319mg,979μmol,3.50eq)在DMF(4.00mL)中混合，于50℃下搅拌反应16个小时。LCMS(EC10054-196-p1,p1,RT＝2.182min)检测显示约95.9％目标产物生成。反应后混合物经减压过滤浓缩得到产物粗品，经快速柱层析纯化，进行TLC检测(石油醚：乙酸乙酯＝1：1,Rf＝0.65)，得到化合物b-5(550mg)，呈黄色胶状。
LCMS:EC10054-196-p1,P1RT＝2.182min,MS(ESI)m/z＝1045.7[M+H]+
[根据细则26改正 17.04.2023] 2.合成化合物b-6，即A13bG-c1
将化合物b-5(380mg,363μmol,1.00eq)加入TFA(4.00mL)中，混合物在50℃下搅拌反应2个小时。LC-MS(EC10054-209-p1,P1,RT＝0.600min)检测显示约87.2％目的产物生成。混合物经减压过滤浓缩得到产物粗品b-6(50.0mg,43.5μmol,11.9％yield,86.0％)，呈白色固体。
LCMS:EC10054-209-p1,P1RT＝0.600min,MS(ESI)m/z＝989.3[M+H]+
[根据细则26改正 17.04.2023] 3.合成化合物b-7，即A13bG-c2
往化合物b-6(50.0mg,43.5μmol,1.00eq)溶于甲醇(3.00mL)的混合液中加入NaOMe(9.39mg,174μmol,4.00eq)，混合物在25℃下搅拌反应0.5个小时。LC-MS(EC10054-215-p1,P1,RT＝0.488min)检测显示约86.3％目标产物生成。反应后混合物经减压过滤浓缩得到产物粗品，进一步用prep-HPLC(中性条件)纯化得到化合物b-7(11.1mg,12.6μmol,28.9％产率,94.0％纯度)，呈黄色固体。
LCMS:EC10054-215-p1,P1RT＝0.488min,MS(ESI)m/z＝821.5[M+H]+
1HNMR:EC10054-215--p1,400MHz,DMSOδppm 8.08-8.22(m,2H),7.93(d,J＝8.0Hz,1H),7.48-7.57(m,2H),.7.41(m,3H),7.30(s,1H),6.95(d,J＝8.4Hz,1H),6.47(d,J＝9.2Hz,1H),5.31-5.39(m,1H),5.17(s,2H),5.12(d,J＝3.2Hz,1H),4.64-4.82(m,1H),4.34(t,J＝8.8Hz,1H),3.91(s,1H),3.86(s,1H),3.70(s,2H),3.59(s,3H),3.00(t,J＝5.6Hz,2H),2.12(s,3H),1.93(s,3H),1.63(s,3H),1.57(s,3H),1.53(s,9H)
实施例5
合成带溶酶体导向单元的β-gal修饰前药A13bGa1-lyso和A13bGa2-lyso
1.合成化合物d-2
往化合物d-1(7.50g,36.0mmol)溶于DMF的溶液中加入NaN3(4.47g,68.7mmol)，混合物于80℃下搅拌反应24个小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝0/1，产物Rf＝0.30)检测显示化合物d-1(Rf＝0.20)反应完全，新产物生成。反应混合物在0℃下加水(100ml)终止反应，使用乙酸乙酯萃取(100ml，3次)，所得有机层用饱和盐水(100ml，3次)洗涤，Na2SO4干燥，减压条件下过滤、浓缩得到残留固体，粗产品经进一步纯化得到化合物d-2(2.50g,40.7％产率)，呈黄色油状。
1H NMR:ET65547-12-P1A1(400MHz,CDCl3)δ3.71-3.69(m,4H),3.36-3.33(m,2H),2.43-2.39(m,6H),1.79-1.72(m,2H).
2.合成化合物d-5
往化合物d-4(55.6g,373mmol)溶于THF溶剂(70.0mL)的溶液中，于0℃下逐滴加入Al(10.0g,373mmol,3.74mL)和HgCl2(162mg,598μmol)，之后混合物在80℃下搅拌13个小时，待冷却至0℃，将化合物d-3(10.0g,59.8mmol)于0℃下逐滴加入到上述混合物中，所得混合物于0℃下搅拌反应5个小时。TLC监测(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)显示化合物d-3反应完全，一个主峰(Rf＝0.5)新产物生成。反应混合物通过0℃下加入1N HCl(50.0ml)终止反应，使用乙酸乙酯萃取(50.0ml，3次)，所得有机层用饱和盐水(50.0ml，3次)洗涤，Na2SO4干燥，减压条件下过滤、浓缩得到残留物。所得粗品经柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝50/1至0/1)纯化得到化合物d-5，呈黑色油状。
3.合成化合物d-7
往化合物d-5溶于ACN(25.0mL)的溶液中加入CO3Ag2(14.8g,53.6mmol)和HMTTA(2.34g,10.1mmol)，然后将化合物d-6(11.9g,28.9mmol)加入到混合物中，于25℃下搅拌反应4个小时。反应混合物通过在0℃加入1N HCl(5.00ml)终止，使用乙酸乙酯萃取(10.0ml，3次)，所得有机层用饱和盐水(10.0ml，3次)洗涤，Na2SO4干燥，真空条件下过滤、浓缩。所得粗品经柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝20/1至1/1)纯化得到化合物d-7(1.10g,14.3％产率)，呈黄色固体。
4.合成化合物d-8
往化合物d-7(500mg,930μmol)溶于DCM(3.50ml)的溶液中于20℃下加入TBSCl(182mg,1.21mmol)和IMIDAZOLE(165mg,2.42mmol)，混合物于20℃下搅拌反应12个小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝3/1，化合物d-8Rf＝0.5)监测显示反应完全，产物使用DCM(20.0ml，3次)萃取，所得有机层使用饱和盐水(10.0ml)洗涤，Na2SO4干燥，真空条件下过滤、浓缩。所得粗品经柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝50/1至2/1)纯化得到化合物d-8(500mg,77.5％产率)，呈黄色油状。
1H NMR:ET67304-34-P1A1(400MHz,CDCl3)δ7.83(dd,J＝15.6,2.0Hz,1H),7.51-7.58(m,1H),7.32(dd,J＝8.4,6.6Hz,1H),5.53-5.58(m,1H),5.48(d,J＝2.8Hz,1H),5.08-5.13(m,2H),4.83(t,J＝6.2Hz,1H),4.23-4.32(m,1H),4.05-4.21(m,3H),2.56-2.65(m,1H),2.41-2.52(m,1H),2.20(s,3H),2.15(s,3H),2.08(d,J＝2.0Hz,3H),2.02(s,3H),m0.90(d,J＝2.0Hz,11H),0.11(d,J＝1.6Hz,3H),-0.03(d,J＝2.4Hz,3H).
5.合成化合物d-9
往化合物d-8(500mg,767μmol)溶于水(5.00mL)和ACN(5.00mL)溶剂的溶液中于20℃下加入化合物d-2(144mg,844μmol)，CuSO4(6.12mg,38.4μmol)，L-抗坏血酸钠(22.8mg,115μmol)，混合物在20℃下搅拌反应12个小时。反应混合物使用乙酸乙酯萃取(20.0ml，3次)，所得有机层用饱和盐水(5.00ml，3次)洗涤，Na2SO4干燥，真空条件下过滤、浓缩。得到的粗品使用柱层析(SiO2,石油醚/乙酸乙酯＝20/1to 0/1,石油醚/乙酸乙酯＝0/1,化合物d-9Rf＝0.20)纯化得到化合物d-9(550mg,65.4％产率,75％纯度)，呈白色固体。
6.合成化合物d-10
往化合物d-9(550mg,669μmol)溶于乙酸乙酯(55.0ml)的溶液中于20℃下加入HCl/EtOAc(4M,11.0ml)，在20℃下搅拌反应2个小时。反应混合物真空下浓缩得到粗品产物，进一步用prep-TLC(SiO2,DCM/MeOH＝10/1,化合物d-10Rf＝0.45)纯化得到化合物d-10(110mg,23.9％产率)，呈黄色油状。
1H NMR:ET67304-60-P1A1(400MHz,CDCl3)δ7.61-7.78(m,1H),7.47-7.53(m,1H),7.23-7.38(m,2H),5.35-5.52(m,2H),4.95-5.12(m,3H),4.30-4.45(m,2H),3.90-4.28(m,5H),3.69(s,4H),3.02-3.12(m,1H),2.89-3.01(m,1H),2.24-2.62(m,6H),2.12(s,3H),2.06(s,4H),2.01(s,3H),1.95(s,3H).
7.合成化合物d-11(即为A13bGa2-lyso)
往化合物d-10(2.79mg,3.95μmol)溶于ACN(0.28ml)的溶液中于20℃下加入A-1331852(2.00mg,3.04μmol)，NMI(872μg,10.6μmol)和TCFH(1.02mg,3.64μmol)，混合物在20℃下反应12个小时。反应混合物使用乙酸乙酯(20.0ml，3次)萃取，有机层用饱和盐水洗涤(5.00ml,3次)，Na2SO4干燥，真空条件下过滤、浓缩。所得粗品使用prep-HPLC(色谱柱:Waters Xbridge BEH C18 100x 30mm x 10μm；流动相:[H2O(10mM NH4HCO3)-ACN]；梯度洗脱:35％-65％B，8.0分钟)纯化得到化合物d-11(2.2mg，52.1％产率，97％纯度)，呈白色固体。
1H NMR:ET67304-65-P1B1(400MHz,CDCl3)δ7.80(s,1H),7.54-7.68(m,3H),7.26-7.46(m,7H),7.15-7.22(m,2H),6.90(d,J＝8.8Hz,1H),5.94-6.11(m,1H),5.41-5.53(m,2H),5.14-5.28(m,1H),4.89-5.10(m,2H),4.53(d,J＝1.2Hz,1H),3.98-4.28(m,5H),3.83-3.97(m,3H),3.54-3.66(m,3H),3.04-3.23(m,4H),2.16(s,3H),2.10(d,J＝3.6Hz,3H),2.04(d,J＝4.4Hz,3H),1.99(s,4H),1.90-1.98(m,8H),1.62-1.70(m,5H),1.42-1.51(m,10H),1.36(s,2H),1.23(s,4H).
8.合成化合物d-12(即为A13bGa1-lyso)
往化合物d-11(20.0mg,14.8μmol)溶于甲醇(0.10ml)的溶液中于20℃下加入NaOMe(4.01mg,74.2μmol)，混合物在20℃下搅拌反应12个小时。反应混合物在真空下浓缩，所得粗品使用prep-HPLC(色谱柱:Waters Xbridge BEH C18 100x 30mm x 10μm；流动相:[H2O(10mM NH4HCO3)-ACN]；梯度洗脱:50％-80％B，8.0分钟)纯化得到化合物d-12(6.20mg，34.3％产率，97％纯度)，呈白色固体。
1H NMR:ET67304-73-P1B1(400MHz,CDCl3)δ7.72-7.82(m,1H),7.55-7.71(m,3H),7.29-7.45(m,5H),7.14-7.24(m,4H),6.91(d,J＝8.8Hz,1H),5.97-6.08(m,1H),5.05-5.40(m,2H),4.74-4.93(m,1H),4.22-4.45(m,2H),3.80-4.16(m,7H),3.59-3.72(m,7H),3.16-3.47(m,4H),2.99-3.13(m,3H),2.31(d,J＝3.6Hz,4H),2.21(t,J＝6.4Hz,2H),1.92-1.98(m,6H),1.63-1.72(m,4H),1.43-1.54(m,8H).
实施例6
合成A13衍生化合物C3，C4
a.合成A13衍生物C3作为β-gal前药的母药
1.合成化合物C3-7-2a
将化合物C3-7-1a(5.00g,21.0mmol,1.00eq)，TBSCl(4.12g,27.3mmol,3.35mL,1.30eq)和IMIDAZOLE(2.86g,42.0mmol,2.00eq)在DMF(30.0ml)中混合，排出空气充入N2，混合物在N2环境下于25℃搅拌反应2个小时。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝1:0,P1:Rf＝0.86,R1:Rf＝0.05)检测显示C3-7-1a反应完全，一个低极性新的主峰生成。反应混合物通过加入300ml水终止反应，使用共300ml DCM(100ml，3次)萃取，所得有机层用饱和盐水300ml洗涤，Na2SO4干燥，减压下过滤、浓缩得到产物粗品，粗品经柱层析(SiO2,石油醚：乙酸乙酯＝1:0)纯化得到化合物C3-7-2a(7.00g,19.9mmol,94.6％产率)，呈无色液体。
HNMR:EC10607-21-P1A,CDCl3,400MHz
1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.16(dd,J＝10.0,2.0Hz,1H),7.07(d,J＝8.4Hz,1H),6.44(t,J＝8.4Hz,1H),0.78(s,10H),0.03(s,6H).
2.合成化合物C3-7-3a
将化合物C3-7-2a(2.00g,5.68mmol,1.00eq)，C3-7-3(1.91g,8.52mmol,1.50eq)，CuI(54.1mg,284μmol,0.05eq)和Pd(PPh3)4(399mg,568μmol,0.10eq)在DMF(30ml)中混合，在N2环境下于75℃搅拌反应2个小时。LCMS(EC10607-30-p1a1,P1:RT＝0.460分钟)检测显示约58.1％目标产物生成。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝3:1,P1:Rf＝0.22,R1:Rf＝0.98)显示化合物C3-7-2a反应完全，一个新极性大的主峰生成。反应混合物通过加入200ml水终止反应，使用200ml DCM(70.0ml，3次)萃取，有机层用200ml饱和盐水洗涤，Na2SO4干燥，减压下过滤、浓缩得到产物粗品，粗品经柱层析(SiO2,石油醚：乙酸乙酯＝3：1，Rf＝0.22)纯化得到化合物C3-7-3a(1.98g,4.41mmol,77.7％产率)，呈黄色油状。
LCMS:EC EC10607-30-p1a1,RT＝0.460min,M/Z(M+H+)＝449.9
3.合成化合物C3-7
往化合物C3-7-3a(1.98g,4.41mmol,1.00eq)溶于THF(20.0ml)的混合物中加入吡啶·氢氟酸(875mg,8.83mmol,795uL,2.00eq)，混合物在N2环境下于25℃搅拌反应2个小时。LCMS(EC10607-35-p1a1,P1:RT＝0.241分钟)检测显示约89.2％目标产物生成。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝2:1,R1:Rf＝0.22,P1:Rf＝0.98)显示化合物C3-7-3a反应完全，一个新极性大的主峰生成。反应混合物通过加入300ml水终止反应，使用300ml DCM(100ml，3次)萃取，有机层用300ml盐水洗涤，Na2SO4干燥，减压下过滤、浓缩得到产物粗品，粗品经柱层析(SiO2,石油醚：乙酸乙酯＝2：1，Rf＝0.15)纯化得到化合物C3-7(1.16g,3.47mmol,78.6％产率)，呈红色固体。
LCMS:EC EC10607-35-p1a1,RT＝0.241min,M/Z(M+H+)＝335.4
HNMR:EC10607-21-P1A,CDCl3,400MHz
1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.01-7.08(m,2H),6.90(t,J＝8.8Hz,1H),3.49-3.57(m,6H),2.62(br t,J＝4.5Hz,4H),1.47(s,9H).
4.合成化合物C3-2
将化合物C1-1(1.50g,2.65mmol,1.00eq)，化合物3a(2.37g,7.96mmol,3.00eq)，Pd2(dba)3(243mg,265μmol,0.10eq),K3PO4(1.97g,9.28mmol,3.50eq)和(1S,3R,5R,7S)-1,3,5,7-四甲基-8-苯基-2,4,6-三氧杂-8-磷三环[3.3.1.13,7]癸烷(310mg,1.06mmol,0.40eq)在1,4-二恶烷(10.0ml)和水(10.0ml)中混合，排出空气冲入N2，混合物在N2环境下于90℃搅拌反应2个小时。LCMS(EC10607-26-p1a2,P1:RT＝0.649分钟)检测显示约67.5％目标产物生成。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝3:1,P1:Rf＝0.29,R1:Rf＝0.25)显示化合物C3-1反应完全，多个新峰生成。反应混合物通过加入300ml水终止反应，使用300ml DCM(100ml，3次)萃取，有机层用300ml盐水洗涤，Na2SO4干燥，减压下过滤、浓缩得到产物粗品，粗品经柱层析(SiO2,石油醚：乙酸乙酯＝3：1，Rf＝0.29)纯化得到化合物C3-2(1.25g,1.90mmol,71.7％产率)，呈黄色油状。
LCMS:EC10607-26-p1a2,RT＝0.650min,M/Z(M+H+)＝657.8
5.合成化合物C3-3
往化合物C3-2(1.20g,1.83mmol,1.00eq)溶于THF(20.0ml)和甲醇(20.0ml)的溶液中加入Pd/C(1.00g,1.83mmol,10％纯度,1.00eq)，反应混合物在50psi H2(1.23mg,609μmol)环境下于25℃搅拌反应24个小时。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝3:1,P1:Rf＝0.36，R1:Rf＝0.31)检测显示化合物C3-2反应完全，一个新峰生成。使用用硅藻土过滤除去Pd/C，并在减压下浓缩得到粗产物，粗品经柱层析(SiO2,石油醚：乙酸乙酯＝3：1，Rf＝0.30)纯化得到化合物C3-3(1.01g,1.53mmol,73.7％产率)，呈黄色固体。
6.合成化合物C3-4
往化合物C3-3(1.00g,1.52mmol,1.00eq)溶于THF(15.0ml)的混合物中加入吡啶·氢氟酸(694mg,4.55mmol,631uL,65％纯度,3.00eq)，混合物在N2环境下于25℃搅拌反应2个小时。LCMS(EC10607-37-p1a1,P1:RT＝0.410分钟)检测显示约46.4％目标产物生成。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝1:1,R1:Rf＝0.60,P1:Rf＝0.16)检测显示C3-3反应完全，一个大极性的新主峰生成。反应混合物通过加入300ml水终止反应，使用300ml DCM(100ml，3次)萃取，有机层用300ml盐水洗涤，Na2SO4干燥，减压下过滤、浓缩得到产物粗品，粗品经prep-TLC(SiO2,石油醚：乙酸乙酯＝1：1，Rf＝0.16)纯化得到化合物C3-4(700mg,1.29mmol,84.7％产率)，呈白色固体。
LCMS:EC EC10607-37-p1a1,RT＝0.410min,M/Z(M+H+)＝545.4
7.合成化合物C3-5
将化合物C3-4(680mg,1.25mmol,1.00eq),TEA(133mg,1.31mmol,182μL,1.05eq),DMAP(1.53mg,12.5μmol,0.01eq)和4-甲基苯磺酰氯(250mg,1.31mmol,1.05eq)在DCM(5.00ml)中混合，排出空气充入N2，混合物在N2环境下于25℃搅拌反应3个小时。LC-MS(EC10607-47-p1a1,P1:RT＝0.548分钟)检测显示约46.7％目标产物生成。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝2:1,P1:Rf＝0.36,R1:Rf＝0.20)检测显示部分C3-4反应完，多个新峰生成。反应混合物通过加入300ml水终止反应，使用300ml DCM(100ml，3次)萃取，有机层用300ml盐水洗涤，Na2SO4干燥，减压下过滤、浓缩得到产物粗品，粗品经柱层析(SiO2,石油醚：乙酸乙酯＝2：1，Rf＝0.36)纯化得到化合物C3-5(400mg,572μmol,45.8％产率)，呈黄色固体。
LCMS:EC(EC10607-47-p1a1,RT＝0.548min,M/Z(M+H+)＝699.1
8.合成化合物C3-6
将化合物C3-5(100mg,143μmol,1.00eq)，C3-7(71.8mg,214μmol,1.50eq)，Cs2CO3(69.9mg,215μmol,1.50eq)在DMA(5.00ml)中混合，排出空气充入N2，混合物在N2环境下于25℃搅拌反应12个小时。LC-MS(EC10607-49-p1a1,P1:RT＝0.493分钟)检测显示约36.9％目标产物生成。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝1:1,P1:Rf＝0.24,R1:Rf＝0.42)检测显示C3-5消耗完全，多个新峰生成。反应混合物通过加入30ml水终止反应，使用30.0ml DCM(10.0ml，3次)萃取，有机层用30.0ml盐水洗涤，Na2SO4干燥，减压下过滤、浓缩得到产物粗品，粗品经prep-TLC(SiO2,石油醚：乙酸乙酯＝1：1，Rf＝0.24)纯化得到化合物C3-6(106mg,123μmol,86.0％产率)，呈黄色固体。
LCMS:EC10607-49-p1a1,RT＝0.493min,M/Z(M+H+)＝861.2
9.合成化合物C3
将化合物C3-6(100mg,116μmol,1.00eq)溶于HCl/二氧己环(5.00ml)，排出空气充入N2，混合物在N2环境下于25℃搅拌反应12个小时。LC-MS(EC10607-51-p1a5,P1:RT＝0.412分钟)检测显示约86.5％目标产物生成。反应混合物在减压下浓缩得到产物粗品，粗品经prep-HPLC(HCl条件下,色谱柱:Welch Xtimate C18 150*25mm*5um；流动相:[water(HCl)-ACN]；B％:26％-46％，10分钟)纯化得到化合物C3(25.0mg,35.5μmol,89.3％产率)，呈黄色固体。LCMS(EC10607-57-p1a1,P1:RT＝0.42分钟)检测显示产物纯度约100％。HPLC(EC10607-57-p1a2,P1:RT＝2.027分钟)检测显示产物C3纯度约96.1％。1HNMR(EC10607-57-P1D,400MHz,DMSO+D2O)显示所得产物与目标化合物一致。
LCMS:EC EC10607-51-p1a5,RT＝0.412,M/Z(M+H+)＝705.2
LCMS:EC10607-57-p1a1,RT＝0.402min,M/Z(M+H+)＝705.2
1H NMR(400MHz,DMSO+D2O)δppm 7.99(d,J＝7.6Hz,1H),7.77(d,J＝8.0Hz,1H),7.57(d,J＝8.8Hz,1H),7.54(d,J＝7.2Hz,1H),7.47(t,J＝7.2Hz,1H),7.39-7.42(m,1H),7.32-7.37(m,3H),7.27(d,J＝8.9Hz,1H),7.06-7.12(m,1H),7.01(d,J＝8.8Hz,1H),4.91(s,2H),4.22(s,2H),4.08(s,2H),3.75-3.81(m,2H),3.33-3.43(m,8H),2.94-2.99(m,2H),2.77-2.83(m,2H),1.88-1.96(m,2H).
[根据细则26改正 17.04.2023] b.合成A13衍生物C4作为β-gal前药的母药
1.合成化合物C4-2
往化合物C4-1(2.00g,17.7mmol,1.0eq)溶于MeCN(20.0mL)和TFA(3.34mL)的溶液中加入NIS(4.38g,19.5mmol,1.1eq)，反应混合物在25℃下搅拌反应12个小时。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝0:1,R1:Rf＝0.4；P1:Rf＝0.8)监测显示C4-1消耗完全，一个新的化合物峰生成。反应混合物经过滤得到粗品产物C4-2(3.00g，粗品)，呈白色固体。
2.合成化合物C4_3
往化合物C4-2(1.00g,4.18mmol,1.0eq)，C3-7-3(1.41g,6.28mmol,1.5eq)溶于DMF(20.0mL)的溶液中加入CuI(39.9mg,209μmol,0.05eq)，TEA(1.27g,12.6mmol,1.75mL,3.0eq)和Pd(dppf)Cl2(306mg,418μmol,0.1eq)，反应混合物在90℃下搅拌反应2个小时。LCMS(EC13784-5-P1A,P1:RT＝0.242分钟)监测显示C4-2反应完全，目的产物主峰生成。反应混合物通过加入20.0mL水和60.0mL乙酸乙酯萃取，所得有机层用饱和盐水(20.0mL，2次)洗涤，Na2SO4干燥，减压下过滤、浓缩得到产物粗品C4-3(500.0mg)，呈棕色固体。
LC-MS:EC13784-5-P1A,产物:RT＝0.242min,m/z＝336.3[M+H]+
3.合成化合物C4-4
往化合物C4-3(90.0mg,268μmol,1.0eq)溶于DMA(3.00mL)的溶液中加入Cs2CO3(175mg,537μmol,2.0eq)和C3-3(188mg,268μmol,1.0eq)，反应混合物在25℃下搅拌反应12个小时。LCMS(EC13784-6-P1A,P1:RT＝0.495min)监测显示化合物C4-3反应完全，有m/z符合预期的目的产物主峰生成。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝1:2,R1:Rf＝0.1；R2:Rf＝0.85；P1:Rf＝0.55)监测显示C4-3消耗完全，两个新化合物峰生成。反应混合物通过加入10.0mL水和10.0mL乙酸乙酯萃取，所得有机层用饱和盐水(10.0mL，2次)洗涤，Na2SO4干燥，减压下过滤、浓缩得到产物粗品，进行TLC(石油醚：乙酸乙酯＝1:2,P1:Rf＝0.55；P2:Rf＝0.30)检测，柱层析(SiO2,石油醚：乙酸乙酯＝1:2)纯化得到化合物C4-4(55.0mg)，呈无色油状。
LC-MS:EC13784-6-P1A,产物:RT＝0.495min,m/z＝862.6[M+H]+
4.合成化合物C4
将化合物C4-4(50.0mg,58.0μmol,1.0eq)溶于HCl-二氧杂环已烷(2.00mL)，混合物在25℃下搅拌反应1个小时。LCMS(EC13784-11-P1A2,P1:RT＝0.418分钟)监测显示化合物C4-4反应完全，有m/z符合预期的目的产物主峰生成。反应混合物减压下过滤浓缩得到粗品，经prep-HPLC(色谱柱:Welch Xtimate C18 150*25mm*5μm；流动相:[water(HCl)-ACN]；梯度洗脱:30％-60％B，10min)柱层析纯化得到化合物C4(11.0mg,24.46％产率,91.03％纯度)，呈无色油状。
LC-MS:EC13784-11-P1A2,产物:RT＝0.418min,m/z＝706.3[M+H]+
HPLC:EC13784-11-P1C；产物:RT＝1.945min
1H NMR:EC13784-11-P1C1(400MHz DMSO)δppm 8.17(d,J＝1.6Hz,1H),8.02(d,J＝7.6Hz,1H),7.90(dd,J＝10.8,1.8Hz,1H),7.78(d,J＝8.0Hz,1H),7.59(t,J＝8.8Hz,2H),7.44-7.50(m,1H),7.40-7.44(m,1H),7.32-7.38(m,2H),7.02(d,J＝8.8Hz,1H),4.92(s,2H),4.37-4.42(m,2H),4.29-4.37(m,2H),3.83(t,J＝6.0Hz,3H),3.57(d,J＝4.0Hz,5H),3.42-3.49(m,4H),2.98(t,J＝5.6Hz,2H),2.81(t,J＝7.6Hz,2H),1.92-2.01(m,2H).
实施例7体外测试β-gal前药的细胞杀伤活性
细胞衰老诱导
为了避免复制诱导的衰老细胞，低代增殖HEF(<10代)和A549细胞用作正常对照。对于化学药物诱导的衰老，HEF细胞用10μM依托泊苷处理36-48小时，A549细胞用15μM顺铂(Selleck,S1166)处理72小时,处理后三天，在进一步分析和使用之前，将细胞以1:3的比例在新鲜培养基中传代培养72小时。
细胞杀伤活性测试
准备细胞铺板：分别取非衰老、诱导衰老的HEF细胞和A549细胞，用胰酶消化，1000rmp离心5分钟，移去上清并用新鲜含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬，进行计数。调整细胞密度使得非衰老细胞密度在4000个/100μL，衰老细胞密度在7000个/100μL，将细胞悬液每孔100μL加入96孔透明细胞培养板。注意96孔板的边缘孔不用于测试孔，单独加300μL PBS减少培养基蒸发。将铺好细胞的96孔板放回37℃培养箱过夜培养至细胞贴壁。
配制药物浓度梯度：待第二天细胞贴壁后，准备加入待测试活性的小分子化合物(d-12,d-11,和d-4)。预先设置一系列小分子浓度梯度，如0.01、0.03、1、3、10、25μM，在含10％胎牛血清的DMEM培养基中配制2倍上述浓度的药物稀释液，按每孔100μL将含梯度浓度药物的上述DMEM培养基加入到提前铺好细胞的96孔板中，使得每孔药物终浓度为预先设置的系列浓度梯度，每个测试药物浓度设置3个平行复孔。将96孔板重新放回37℃培养箱，三天后进行细胞存活检测。
使用CCK-8方法检测药物处理后细胞存活情况：在加入药物三天后取出孔板，弃去上清液，每孔加入100μL预先配制的CCK-8工作液。CCK-8工作液是用无血清DMEM培养基按10倍体积稀释CCK8储存液(C0041，Beyotime)得到。将加入CCK-8工作液的96孔板放回37℃培养箱，温育0.5-2小时，取出孔板测定每孔在450nm波长处吸光度值(OD值)，计算各个实验组中细胞存活率。根据公式：相对细胞存活率(％)＝(空白对照组-实验组)/空白对照组x 100％。
根据细胞存活率计算结果，作出不同药物对于衰老、非衰老细胞的杀伤曲线，如图7所示。从图7可以看出，三个测试的前药分子(d-12,d-11,d-4)在A549诱导衰老及HEF诱导衰老细胞模型上均表现出对衰老细胞的选择性杀伤，三个分子在最高浓度下(25μM)都没有对非衰老细胞造成杀伤，体现出其衰老细胞选择性较好。其中d-12,d-4相对而言，对衰老细胞的杀伤活性更好。根据结果进行分析，d-12和d-4在诱导衰老的A549细胞上IC50分别约为6.9μM和10.4μM。综合以上结果可以看出，所述合成的β-gal前药分子均具有靶向杀伤衰老细胞的高度选择性，较高浓度也不影响非衰老细胞，其中d-12及d-4对衰老细胞杀伤活性更高。
实施例8前药A13bGa1(即实施例1中a-7)的生化和药理学研究
A13bG水解反应的研究
体外酶水解反应使用大肠杆菌来源β-半乳糖苷酶(Sigma)在PBS溶液(0.01M,pH 7.3)中进行，A13及A13bG反应浓度均为10μM,加入β-半乳糖苷酶(10U/μM)后于37℃条件下反应6小时。水解反应通过高效液相色谱(HPLC)进行监测。化合物A13及未加酶反应的前药A13bG在相同条件下进行HPLC上样分析，作为参照。色谱柱型号：Waters Acquity BEH C4，条件：0.04ml/min,(水(0.1％乙酸)):乙腈梯度洗脱:98:2 1min,5:95 13min,5:95 18min,2:98 20min。
细胞培养和处理
人类原代细胞分离
本研究获得北京大学审查委员会研究所(Institute of Review Board in Peking University)(IRB 00001052-15087)的批准，并按照批准的方案进行。根据中日友好医院(China–Japanese Friendship Hospital)的伦理批准程序，从知情同意的捐赠者收集样本。
如前所述(Xie,B.等人.Cell Res.29,696-710(2019))获得人胚胎皮肤成纤维细胞(HEF)和人胎肺成纤维细胞(HELF)。简而言之，在获得患者知情同意的情况下从流产组织中获得的人胚胎皮肤组织和胎肺组织用镊子切碎并在1mg/ml胶原酶IV中在37℃下温育1-2小时。酶处理后，通过离心收集细胞并重悬于含有10％胎牛血清(FBS，Ausbian)、1％GlutaMAX(Gibco)、1％非必需氨基酸(NEAA,Gibco)和1％青霉素/链霉素(Gibco)的HEF培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Gibco)中。将细胞铺在10cm组织培养皿上并在10％FBS DMEM中生长。HUVEC细胞购自Lonza(C2519A)，在Endothelial Cell Medium(sciencell,1001)中培养。根据Lonza公司的方法将其进行传代并冷冻保存。A549细胞,BJ细胞,MRC5细胞购自ATCC，使用含10％胎牛血清(FBS，Ausbian)，1％青霉素/链霉素(Gibco)的DMEM培养基进行培养。
细胞衰老诱导
为了避免复制诱导的衰老细胞，低代增殖HEF/HELF(<10代)和HUVEC(<6代)用作正常对照。
对于化学药物诱导的衰老，HEF/HELF细胞用10μM依托泊苷处理36-48小时，HUVEC细胞用5μM依托泊苷(Etoposide,S1225)处理36-48小时。A549细胞用15μM顺铂(Selleck,S1166)处理72小时,BJ、MRC5细胞用20μM博来霉素(Selleck,S1214)处理48-72小时，处理后三天，在进一步分析之前，将细胞以1:3的比例在新鲜培养基中传代培养72小时。
培养细胞和冰冻切片的β-半乳糖苷酶染色
培养的细胞用PBS洗涤一次，并在β-半乳糖苷酶染色固定液中室温固定15分钟。然后用PBS洗涤细胞3次，并与β-半乳糖苷酶染色溶液(Beyotime Biotechnology)在37℃下温育16-20小时。对于12孔板，向每孔加入1mlβ-半乳糖苷酶染色溶液。平板用Parafilm密封以防止染色介质的蒸发。过夜温育后，用PBS洗涤细胞并在明场显微镜下观察。对于冰冻切片的β-半乳糖苷酶染色，冰冻切片在37℃下干燥20-30分钟，然后在β-半乳糖苷酶染色固定液中室温固定15分钟。冷冻切片用PBS洗涤3次，用β-半乳糖苷酶染色液在37℃温育过夜。β-半乳糖苷酶染色完成后，用曙红染色切片1-2分钟，在流水下冲洗1分钟，在1％酸性醇中分化10-20秒，再次在流水下冲洗1分钟。切片在增加浓度的醇中脱水并在二甲苯中透明化。排出多余的二甲苯并将盖玻片放在切片上。干燥后，在显微镜下观察样品。
细胞活力测试
Cell Counting Kit–8(CCK-8)分析用于评估细胞活力。将衰老和非衰老细胞或软骨细胞接种到96孔板中并培养过夜。然后用对照(0.05％DMSO)或不同浓度的待测药物处理细胞。48小时或72小时后，将CCK-8溶液(C0041，Beyotime)以1:10的比例加入每个孔中，并温育1-2小时。在450nm波长处测量吸光度。
小鼠
所有动物实验均按照Animal Protection Guidelines of Peking University,China进行。C57BL/6(C57)小鼠获自Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co,Ltd.，并饲养在无特定病原体设施(SPF)条件下，12光/12暗循环，自由进食和饮水。年老雄性小鼠单独笼养，雌性小鼠和同窝雄性幼仔每笼不超过五只进行饲养。
体内药物处理
所有药物在85％生理盐水、5％DMSO(Sigma,D8418)和10％Solutol HS 15(Sigma,42966)中混合，并通过腹膜内(i.p.)注射向小鼠施用。为了处理博来霉素损伤的年轻小鼠，每周连续三天给予A13(2mg/kg)、A13bGa1(5mg/kg)或空溶媒对照，持续四周。A1331852(简写A13)购自MCE。
体内血小板毒性试验
使用A13或A13bG单次给药。雌性5-6周龄C57小鼠用单次腹腔注射治疗。A13及A13bG给药均设2、5、20mg/kg三个不同剂量组。在不同时间点对每只小鼠通过内眦取血方法收集大约50μl的血液至EDTA管(RAM Scientific)，并使用血液分析仪进行血常规分析，计数血小板。使用A13或A13bG多次给药。雌性5-6周龄C57小鼠用多次腹腔注射治疗。A13及A13bG给药均设2、5、20mg/kg三个不同剂量组。每周连续3天给药，接着停药4天，连续给药3周。给药时间点分别在第0，1，2，7，8，9，14，15，16天下午，采血检测时间点分别在第1，3，5，8，10，12，15，17，19天上午。
博来霉素诱导的肺纤维化和衰老
博来霉素购自Selleck。为了诱导肺衰老和纤维化，如先前报道的(Bivas-Benita等人，Eur J Pharm Biopharm 61,214-218(2005))，对年轻的雄性C57小鼠(8～10周龄)进行了经气管注射博来霉素(2mg/kg)。造模4天后开始药物治疗，每周连续给药三天，连续四周后处死取材。
血液分析
对于血常规检查，从每只小鼠收集50μl新鲜血液并立即与EDTA混合。通过Celltac Alpha MEK-6400系列血液分析仪(Nihon Kohden，MEK-6400)分析血液样品。数据以每μl血液中不同血细胞或血小板的数量表示。对于血清生化分析，收集血液样品，在室温下凝固2小时或在4℃下凝固过夜，然后离心(1000g，10分钟)以获得血清。将200μl血清等分并通过化学分析仪(Mindray,BS-350E)分析丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、尿酸(UA)和肌酐(CREA)。
组织病理学检查
所有动物(包括发现死亡、濒死安乐死动物)均进行解剖，并保存肺组织。分离肺脏并清除脂肪等组织，滤纸吸干表面液体，称全肺重量(包括发现死亡、濒死安乐死动物)，用于计算肺重指数。右肺及细支气管置于10％中性缓冲福尔马林溶液中固定、石蜡包埋、切片、制片、HE染色进行肺组织病理形态学观察，使用标准术语诊断和分类，按4分级法(轻微，轻度，中度，重度)对肺组织炎症细胞浸润程度等病变进行分级。剪取左肺组织于-60℃以下暂存。
肺重指数(％)＝肺脏重/体重×100％。
Masson染色
使用Masson三色染色试剂盒(Solarbio,G1340)检测肺组织纤维化。用二甲苯对经福尔马林固定、石蜡包埋的肺切片进行脱蜡处理，然后用100％酒精、95％酒精和蒸馏水进行复水。然后根据生产商的说明对切片进行染色。之后切片用95％酒精和100％酒精快速脱水，二甲苯清洁后用盖玻片覆盖。采用明场光学显微镜(10倍目镜)(OLYMPUS,BX43)采集图像，按染色强度(弱阳性，中阳性，中强阳性，极强阳性)对肺组织纤维化程度进行分级。
小鼠氧诱导视网膜病变模型造模
新生C57BL6/J小鼠在出生后第7天至第12天，连同代乳ICR母鼠，一同暴露于75％高氧舱(上海塔望智能科技有限公司，Ox-100HE)饲养，第12天后取出小鼠置于正常空气环境饲养。新生小鼠经高氧条件下饲养再转移至正常氧条件后，视网膜持续发生缺氧诱导的异常血管增生病变。该小鼠病变模型模拟了一些人视觉相关疾病的视网膜病变特征，如增生性糖尿病视网膜病变。
小鼠玻璃体内注射给药
出生后第12天的小鼠进行玻璃体内给药治疗，每只小鼠每只眼睛进行A13bGa1或溶媒对照给药。药物溶媒为5％Solutol HS 15(Sigma,42966)，95％生理盐水，使用单独溶媒注射作为药物对照组(VEH)；A133bGa1药物使用溶媒(5％Solutol HS 15，95％生理盐水)进行溶解，分别配制不同浓度的注射液使用。小鼠玻璃体内注射采用2.5μl微量注射针(Hamilton，7632-01)连接34G斜角注射针头(Hamilton)进行，玻璃体内给药体积为每只眼球1μl，按相应给药剂量预先配制好药物注射液进行注射。
视网膜微血管染色分析
小鼠摘取的眼球先置于4％多聚甲醛室温固定1小时，使用显微眼科剪及显微镊小心分离视网膜，将视网膜置于预先配制的荧光标记植物凝集素IB4(Vector，FL-1201)染色液中，在4摄氏度条件下过夜避光染色。染色完成后制作视网膜切片，使用共聚焦荧光显微镜(Leica，TCS-SP8)进行拍照。视网膜微血管染色切片使用ImageJ(NIH，USA)进行缺血区域和异常新生血管区域分析。
血浆代谢稳定性
将A13bGa1分别与小鼠、大鼠、犬、猴和人血浆共孵育，200μL孵育体系中药物终浓度为10μM，孵育时间为120分钟，在孵育过程中分别在时间点0、60和120分钟进行取样分析。终止反应通过加3倍体积乙腈，16000g离心20分钟完成。取上清进行LC-MS/MS分析。色谱柱：Waters XSelect HSS T3；流速：500μL/min；洗脱液：A,水(0.1％甲酸)；B,乙腈(0.1％甲酸)；梯度洗脱：0-1.5min,5％B,1.5-9min,5％-80％B,9-12min,80％-100％B,12-14min,100％B,14-14.3min,100％-5％B,14.3-15min,5％B。
肝微粒体代谢稳定性
将A13bGa1分别与小鼠、大鼠、犬、猴和人肝细胞及孵育培养基共孵育，孵育体系中药物终浓度为1μM，孵育时间为60分钟。在孵育过程中分别在时间点0、15、30、45和60分钟进行取样分析，加入一定量的含有内标的乙腈溶液，终止反应。用Verapamil和7-OH香豆素作为阳性对照药质控实验孵育体系。测定剩余百分比，半衰期、固有清除率、扩大清除率、肝清除率和肝摄取率。整个试验采用三平行实施。所有的数据计算均通过Microsoft Excel软件进行。通过提取离子图谱检测峰面积。通过对母药消除百分比的自然对数与时间进行线性拟合，检测母药的体外半衰期(t1/2)。
体外半衰期(t1/2)通过斜率计算：in vitro t1/2＝0.693/k
体外固有清除率(单位μL/min/mg蛋白质)用下列公式计算：in vitro CLint＝kV/N
扩大清除率(单位mL/min/kg)用下列公式计算：放大CLint＝kV/N×放大倍数
肝清除率(单位mL/min/kg)用下列公式计算：预测的肝CLH＝(Q×Fu/RB×放大CLint)/(Q+Fu/RB×放大CLint)
V＝每孔孵育体积(0.2mL)；
N＝蛋白总量(mg)
Q＝肝血流量(mL/min/kg)
Fu＝血浆游离率(假设为1)
RB＝全血分配系数(假设为1)
肝摄取率用下列公式计算：
肝摄取率(ER，Extraction Ratio)＝(预测的肝CLH)/Q
统计学分析
对于统计学分析，在Excel或GraphPad Prism 8中使用默认参数通过t检验(仅比较两组时)或单因素方差分析(比较两组以上时)计算P值。所有结果均表示为均值±sem，n表示小鼠数量。P值如下：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
结果和讨论
为找到靶向衰老细胞更加高效且安全的β-gal前体药物，我们进行了β-gal修饰候选母药化合物的筛选优化工作。比较理想的母药化合物应具有如下几个特性：1)化合物具有适合β-gal修饰的结构位点且分子量适宜2)化合物具有一定的安全性基础3)化合物本身对衰老细胞具有较高的杀伤活性且较未衰老细胞最好具有一定选择性。
我们首先在诱导衰老A549细胞(人非小细胞肺癌细胞)模型和诱导衰老HEF细胞(人胚成纤维细胞)模型上进行一系列化合物的体外筛选工作。我们的体外化合物筛选结果发现，BRD4抑制剂和Bcl-xL抑制剂在衰老细胞杀伤活性和选择性上表现最佳。其中一些BRD4抑制剂，如MZ1、dBET6、ARV825，虽然体外杀伤活性较好，图1A，其结构均为PROTAC分子，分子量较大且结构相对复杂不宜用于作为母药分子进行修饰。筛选结果也发现新型Bcl-xL抑制剂分子，如A1331852和A1155463，在体外具有良好的衰老细胞杀伤活性和选择性，图1A。我们通过进一步的实验结果发现，A1331852和A1155462，对于衰老细胞具有选择性杀伤，且其对于衰老细胞的杀伤活性高，优于经典小分子抑制剂ABT-263，图1B,1C。综合体外细胞模型上筛选结果和化合物结构性质分析，我们最终确立以化合物A1331852作为母药化合物进行β-gal修饰改造。
基于化合物A1331852(简写为A13)，我们进行了β-gal前药合成，合成路线如图2A所示。我们先合成带硝基苯接头的乙酰化半乳糖苷中间体(产物4a)，将其与母药A1331852反应，得到带乙酰化形式半乳糖苷修饰的A1331852前药(产物6a)，后经过脱乙酰基得到另一种形式的半乳糖苷修饰A1331852前药(产物7a)，将产物7a命名为A13bGa1，即为其中一种形式的β-gal前药。
接着，我们进行体外酶水解实验来验证A13bGa1在β-gal酶作用下，剪切释放母药化合物A13，示意图如图2B。我们通过高效液相色谱(HPLC)方法来观察母药化合物A13，以及前药A13bGa1在加β-gal酶与不加β-gal酶的峰流出时间。实验结果发现，母药A13峰流出时间在第19.0分钟，前药A13bGa1峰流出时间在第18.1分钟，在加入β-gal酶反应后，前药在第19.0分钟出现峰流出，表明前药A13bGa1在β-gal酶作用下水解释放出母药化合物A13，图2C。
我们接着在多种体外诱导衰老细胞模型上评估和比较了母药A13与修饰后前药A13bGa1的衰老细胞杀伤活性和选择性。诱导衰老细胞模型包括HEF细胞(原代人胚皮肤成纤维细胞)、HELF细胞(原代人胚肺成纤维细胞)、A549细胞(人非小细胞肺癌细胞系)、MRC5细胞(人胚肺成纤维细胞株)、BJ细胞(人皮肤成纤维细胞株)及HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞株)模型。我们检测了各细胞模型诱导衰老前后衰老标志物β-gal的表达情况，诱导衰老的细胞形态变大且β-gal染色阳性，图3A。同时，在以上多种细胞模型上的杀伤实验结果表明，前药A13bGa1对于人皮肤来源成纤维细胞(图3B,3D)、肺来源细胞(图3C,3E,3G)或是血管内皮来源细胞(图3F)均能高效且选择性杀伤衰老细胞。虽然相较于母药A13，前药A13bGa1对于衰老细胞的杀伤活性整体有一定程度下降，图3B-3G，但其对于正常细胞的毒副作用极大下降，尤其是对于一些原代来源对Bcl-xL抑制比较敏感的细胞，图3A,3C,3E。以上杀伤实验结果表明，修饰后的前药A13bGa1在体外能对多种类型来源的衰老细胞高效、选择性杀伤，且具有对正常细胞极大降低毒副作用的潜力。
根据已发表文献，Bcl-xL抑制剂体内使用时有严重的血小板毒性，这一副作用极大限制了其临床应用。考虑到β-gal修饰后增强了母药A13的特异性，我们推测前药A13bGa1相较于母药A13血小板毒性可以得到明显改善。我们分别在小鼠上进行了两种化合物的不同浓度给药，然后监测外周血中血小板数目变化。单次腹腔给药结果表明，A13bGa1对血小板毒性显著低于母药A13，图4A，仅在较高剂量20mg/kg时有较强破坏血小板作用，但整体而言其对于外周血中血小板变化幅度影响明显小于A13。另外，我们按体内清除衰老细胞1周连续3天的给药方案进行了多轮给药测试，图4B。结果发现，母药A13在最低剂量2mg/kg使用时就具有对血小板非常严重的毒副作用，其三个测试剂量用药均对血小板有强烈破坏作用，导致监测过程中外周血血小板数目剧烈波动起伏，图4C。相较而言，该多轮给药方案下，前药A13bGa1对血小板毒副作用显著降低，外周血血小板数目变化比较平稳，图4C。另外，我们密切监测了给药过程中各组小鼠的状态及临床表现，发现连续3周多轮给药后，母药A13给药组小鼠在5mg/kg及20mg/kg剂量时出现脱毛、萎靡不振的异常表现，图4D，提示该剂量连续多轮给药对小鼠正常机体功能有较大的不利影响。综合以上结果，前药A13bGa1能显著降低体内血小板毒副作用，提高体内用药的安全性。
我们接着在小鼠博来霉素诱导肺纤维化模型上测试了前药A13bGa1的体内治疗效果。博来霉素造模及药物治疗方案如图5A所示，小鼠造模后经过连续4周给药治疗，期间监测小鼠体重变化，图5B。治疗完成后，进行肺脏取材计算肺比重指数并进行病理评估。实验结果表明，相较未造模对照组博来霉素造模后小鼠肺指数显著增加，给药A13bGa1治疗后小鼠肺指数恢复至正常水平，相较而言，母药A13给药后未观测到小鼠肺指数改善，图5C。与之对应，肺脏病理切片结果反映出造模后小鼠肺脏呈现散在炎症细胞浸润，肺间隔增厚、实变等病理表现；A13bGa1给药治疗后小鼠肺脏炎症、实变得到明显改善，而A13给药治疗组未观察到改善，图5D和表1。
表1.肺脏HE病理改变结果
同时，马松染色结果进一步证明，A13bGa1给药治疗后小鼠肺纤维化病理表现得到改善，A13给药组未得到改善，见图5D和表2。
表2.肺脏masson染色结果
体内博来霉素诱导肺纤维化模型实验结果表明，前药A13bGa1在体内能发挥良好的抗炎症及纤维化治疗效果。
我们同时在小鼠氧诱导视网膜病变模型上测试了前药A13bGa1的体内治疗效果。氧诱导视网膜病变模型建立及药物治疗方案如图6A所示，小鼠经过75％高氧诱导造模及玻璃体内注射给药后，进行视网膜病变评估。我们使用绿色荧光标记的植物凝集素IB4对视网膜进行微血管病变分析，实验结果表明，模型小鼠经过A13bGa1不同剂量给药治疗后，相较于单溶媒对照给药组，视网膜中心缺血病变区域面积显著减少，图6B，图6C。同时，我们观察比较了各组造模小鼠的视网膜异常新生血管病变情况，发现A13bGa1给药治疗后，造模小鼠视网膜异常血管新生病变得到改善，异常新生血管区域面积显著减小，图6D，图6E。以上实验结果表明，前药A13bGa1治疗能有效改善氧诱导的小鼠视网膜微血管病变，有望在各种视网膜病变相关疾病上发挥良好的治疗效果。
我们同时初步测试评估了前药A13bGa1在体内的稳定性和代谢情况。研究结果表明，A13bGa1在人、猴、犬、大鼠、小鼠多个种属血浆中高度稳定，见表3。
表3.A13bGa1前药在不同种属里血浆代谢稳定性
在肝微粒体代谢稳定性研究中，A13bGa1也呈现出良好适中的代谢稳定性，见表4。
表4.A13bGa1前药在不同种属里肝微粒体代谢稳定性
以上初步药学研究结果提示前药A13bGa1在体内具有一定的稳定性和良好的药学性质。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (32)

  1. [根据细则26改正 17.04.2023] 用于选择性杀死一种或多种衰老细胞或缓解与炎性病症相关的一种或多种症状的活性剂，所述活性剂包含：
    (i)如式I所示的β-gal部分
    (ii)如式II所示的细胞毒性部分，
    其中位置*处N原子上的氢、位置**处C原子上的羧基和W上的氢中的一者或多者被接头X取代，从而通过接头X与所述β-gal部分连接，或是位置*处、位置***处N原子直接与所述β-gal部分连接；
    (iii)如式(a)-(j)中任一者所示的接头X：
    其中接头X在连接位置处与所述β-gal部分连接，并且在连接位置处与所述细胞毒性部分连接，
    其中在式(e)和(f)的接头X中，连接在两个连接位置处的细胞毒性部分是相同或不同的；
    其中
    R1、R2、R3和R4独立地选自H、-C(O)R5、-C(O)OR6、-C(O)NR7R8和-PO3R9，其中R5、R6、R7、R8和R9独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环状基团以及取代或未取代的杂环基；
    每个R4’、R5’和R6’独立地选自氢、硝基、氰基、异氰基、氨基、羟基、硫醇基、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、取代或未取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸基、磷酰基和膦酰基；
    n是0、1、2、3或4；
    mAb为单克隆抗体，并且连接基团Z为用于抗体偶联的连接基团；
    连接基团L选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环状基团以及取代或未取代的杂环基；
    连接基团L优选选自以下结构：
    其中在环氮原子处与W基团连接；和
    其中m是0、1、2、3；
    连接基团L最优选选自以下结构：
    W选自取代或未取代的环状基团、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的桥环烷基、取代或未取代的杂桥环烷基、取代或未取代的螺环烷基、取代或未取代的杂螺环烷基、取代或未取代的稠环芳基以及取代或未取代的杂稠环芳基；
    条件是当W上的氢被接头X取代时，W具有氨基、仲氨基、环仲胺基或羟基并且氨基、仲氨基、环仲胺基或羟基中的N原子或O原子上的氢被接头X取代。
  2. 根据权利要求1所述的活性剂，其中R4’独立地选自氢、硝基、氰基、异氰基、氨基、羟基、硫醇基和卤素。
  3. 根据权利要求2所述的活性剂，其中R4’独立地为氢或硝基。
  4. 根据权利要求1所述的活性剂，其中R5’和R6’独立地是氢。
  5. [根据细则26改正 17.04.2023] 根据权利要求1所述的活性剂，其中R5’和R6’独立地是如下所示的溶酶体导向单元：
    其中R7’、R8’和R9’独立地为不存在、亚烷基、亚烷氧基、亚烷基氨基或亚烷基羰基；
    其中R10’、R11’和R12’独立地选自氢、硝基、氰基、异氰基、氨基、羟基、硫醇基、卤素、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、取代或未取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸基、磷酰基、膦酰基和膦酰基；
    n1是0、1、2、3或4。
  6. [根据细则26改正 17.04.2023] 根据权利要求5所述的活性剂，其中R5’和R6’独立地选自以下结构： 其中R3’为取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷基氨基或者取代或未取代的烷氧基。
  7. [根据细则26改正 17.04.2023] 根据权利要求1-6中任一项所述的活性剂，其中所述接头X独立地选自以下结构：
  8. 根据权利要求7所述的活性剂，其中所述接头X独立地选自以下结构：
  9. 根据权利要求1所述的活性剂，其中Z基团选自：
  10. 根据权利要求1所述的活性剂，其中R1、R2、R3和R4独立地为H或-C(O)R5。
  11. 根据权利要求10所述的活性剂，其中R5独立地为取代或未取代的烷基。
  12. 根据权利要求1所述的活性剂，其中所述β-gal部分独立地选自以下结构：
  13. 根据权利要求1所述的活性剂，其中W选自以下基团：
    其中R13’为氢、氘、卤素、氨基、羟基、硝基、硫醇基、氰基、异氰基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、取代或未取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸基、磷酰基和膦酰基；其中R14’为氢、氘、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环状基团以及取代或未取代的杂环基；其中p是0、1、2、3或4。
  14. [根据细则26改正 17.04.2023] 权利要求1所述的活性剂，其中所述活性剂具有如下结构：
    其中Y为W并且具有氨基、仲氨基、环仲胺基或羟基，并且
    其中所述氨基、仲氨基、环仲胺基或羟基中的N原子或O原子上的氢被接头X取代。
  15. [根据细则26改正 17.04.2023] 根据权利要求1所述的活性剂，所述活性剂具有以下结构：
  16. 根据权利要求14所述的活性剂，其中Y选自以下结构：
  17. [根据细则26改正 17.04.2023] 根据权利要求1所述的活性剂，其中所述活性剂选自：
  18. 根据权利要求1所述的活性剂，其中当W含有被氨基或羟基取代的苯基时，所述氨基或羟基中的N原子或O原子上的氢被所述β-gal部分取代，使得所述细胞毒性部分不经由接头X直接与所述β-gal部分连接。
  19. [根据细则26改正 17.04.2023] 根据权利要求18所述的活性剂，其中所述活性剂为：
  20. 组合物，其包含杀死一种或多种衰老细胞或缓解与炎性病症相关的一种或多种症状的有效量的权利要求1-19中任一项的活性剂。
  21. 权利要求20所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
  22. 在受试者中选择性杀死一种或多种衰老细胞或缓解与炎性病症相关的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求20或21的组合物。
  23. 权利要求22所述的方法，其中所述受试者患有衰老相关疾病或病症或炎症疾病或病症。
  24. 权利要求22或23所述的方法，其中所述衰老相关疾病或病症是代谢疾病、炎性疾病或病症、肺部疾病或病症、神经疾病或病症、增殖性病症、肾病症或疾病、眼部疾病或病症，或皮肤病学病症或疾病。
  25. 权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述衰老相关疾病或病症选自：
    (i)选自口腔粘膜炎、炎性肠病、脊柱后凸和椎间盘突出症的炎症或自身免疫性疾病或病症；
    (ii)选自阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、痴呆、轻度认知障碍、黄斑变性和运动神经元功能障碍的神经疾病或病症；
    (iii)选自糖尿病性溃疡、代谢综合征和肥胖症的代谢疾病；
    (iv)选自肺纤维化、慢性阻塞性肺病、哮喘、囊性纤维化、肺气肿、支气管扩张和与年龄相关的肺功能丧失的肺部疾病；
    (v)选自黄斑变性、青光眼、白内障、老花眼和视力丧失的眼部疾病或病症；
    (vi)选自肾衰竭、虚弱、听力损失、肌肉疲劳、皮肤状况、皮肤伤口愈合、肝纤维化、胰腺纤维化、口腔粘膜下纤维化和少肌症的年龄相关病症；和
    (vii)选自湿疹、银屑病、色素沉着过多、痣、皮疹、特应性皮炎、荨麻疹、与光敏性或光老化相关的疾病和病症、皱纹、瘙痒、感觉迟钝、湿疹性皮疹、嗜酸性皮肤病、反应性中性粒细胞皮肤病、天疱疮、类天疱疮、免疫大疱性皮肤病、皮肤纤维组织细胞增生、皮肤淋巴瘤和皮肤狼疮的皮肤疾病或病症。
  26. 权利要求25所述的方法，其中所述受试者被诊断患有癌症并且任选地正在经历选自化学治疗和放射治疗的癌症治疗。
  27. 权利要求26所述的方法，其中所述活性剂
    (i)减少已被推向衰老的细胞或癌细胞；
    (ii)减少衰老细胞产生的一种或多种副作用，其中所述副作用包括炎症、促进癌生长和促进转移；
    (iii)减少化学治疗的一种或多种副作用；或
    (iv)减少放射治疗的一种或多种副作用。
  28. 权利要求22-27中任一项所述的方法，其中所述细胞毒性部分在体内递送后被切割。
  29. 权利要求22-28中任一项所述的方法，其中所述组合物在体内施用后以杀死一种或多种衰老细胞的有效量获得结构：
    其中连接基团L选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环状基团以及取代或未取代的杂环基；
    连接基团L优选选自以下结构：
    其中在环氮原子处与W基团连接；和
    m是0、1、2、3；
    连接基团L最优选选自以下结构：
    W选自取代或未取代的环状基团、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的桥环烷基、取代或未取代的杂桥环烷基、取代或未取代的螺环烷基、取代或未取代的杂螺环烷基、取代或未取代的稠环芳基以及取代或未取代的杂稠环芳基；
  30. 权利要求22或23所述的方法，其中所述受试者具有病毒感染，任选地，其中所述病毒感染导致所述受试者中激活的巨噬细胞的过度产生。
  31. 权利要求30所述的方法，其中所述病毒感染是选自冠状病毒、严重急性呼吸系统综合症(SARS)冠状病毒(CoV)、SARS-CoV-2(其引起COVID-19(冠状病毒病)2019))和中东呼吸综合征(MERS)-CoV的冠状病毒感染。
  32. 权利要求31所述的方法，其中所述受试者患有SARS-CoV-2感染并且已被诊断患有冠状病毒病2019。
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