CN118421573B - 一种高效去除hcd残留的痘苗病毒纯化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物病毒技术领域，公开了一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，方法步骤包括如下：首先对病毒收获液进行澄清处理；然后用中空纤维柱对澄清液进行浓缩和洗滤；接着对浓缩液进行酶切处理；最后使用复合层析对酶切样品进行精纯，最终样品HCD残留量可降至10ng/剂量以下。该高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，有效减少病毒聚集体的形成，极大地提高了酶切去除HCD的效率，仅通过酶切就可以将HCD降至10ng/剂量以下，避免了使用离子交换层析从而影响产量以及增加无菌风险，适用于痘苗病毒从实验室规模至商业化的生产，直接避免使用离子交换层析，纯化工艺更加简单。
Description
技术领域
本发明涉及生物病毒技术领域，具体为一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺。
背景技术
痘苗病毒是有包膜的双链DNA病毒，已经被广泛地运用到疾病或生物学研究中，目前痘苗病毒下游纯化工艺主要面临的难题是缺乏有效的纯化手段去除样品中的宿主细胞DNA残留（HCD），各国法规均要求对HCD残留量和片段大小进行控制，建议尽量将残留HCD控制在10ng/剂以内，将HCD残留片段大小控制在200bp以下。
目前常见的痘苗病毒纯化工艺一般使用离子交换层析结合酶切来去除HCD，但由于痘苗病毒较大的分子量以及复杂的结构，导致离子交换层析回收率通常只有不到30%，并且离子交换层析需要使用大量的层析缓冲液，给无菌保证也提出了更高的要求，所以离子交换层析并不适用于痘苗病毒规模化生产，此外痘苗病毒具有包膜结构，相对于其它病毒更容易形成高度聚集的复合体，而被包裹的HCD无法通过普通的酶切条件来去除。
为此，需要设计相应的技术方案给予解决。
发明内容
（一）解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，解决了痘苗病毒较大的分子量以及复杂的结构，导致离子交换层析回收率通常只有不到30%，并且离子交换层析需要使用大量的层析缓冲液，给无菌保证液提出了更高的要求，离子交换层析不适用于痘苗病毒规模化生产，相对于其它病毒更容易形成高度聚集的复合体，而被包裹的HCD无法通过普通酶切条件来去除的技术问题。
（二）技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，方法步骤包括如下：
S1、首先对病毒收获液进行澄清处理；
病毒收获液用孔径0.45μm~5μm的过滤器或孔径0.45μm~0.65μm的中空纤维柱进行澄清处理；
S2、然后用中空纤维柱对澄清液进行浓缩和洗滤；
用100KD~0.1μm中空纤维柱或膜包将澄清液浓缩至目标浓度，然后用洗滤液将浓缩液洗滤3~8次，排空中空纤维柱管路，收集浓缩液；
S3、接着对浓缩液进行酶切处理；
向浓缩液中加入终浓度为10~1000mM的NaCl、0.1%~3%的聚山梨酯80或聚山梨酯20和5~250U/mL的核酸酶，酶切反应20min以上；
S4、最后使用复合层析对酶切样品进行精纯，最终样品HCD残留量可降至10ng/剂量以下；
将复合层析填料用NaOH溶液消毒以及缓冲液平衡后将酶切收样品上样和洗脱收集病毒峰。
优选的，步骤S1中，使用孔径0.45μm~5μm的过滤器进行澄清处理的方法步骤包括如下：
S101，准备过滤器：选择孔径在0.45μm至5μm范围内的过滤器；
S102，预处理过滤器：根据过滤器的使用说明，对过滤器进行必要的预处理，包括有湿润和冲洗，用于确保过滤效果；
S103，过滤病毒收获液：将病毒收获液通过准备好的过滤器进行过滤，大颗粒的杂质将被过滤器截留，而病毒则能够顺利通过，用于实现边过滤边收集；
使用孔径0.45μm~0.65μm的中空纤维柱进行澄清处理的方法步骤包括如下：
S201，准备中空纤维柱：选择孔径在0.45μm至0.65μm范围内的中空纤维柱；
S202，组装中空纤维柱：将纤维柱与设备连接，并确保其密封性良好；
S203，预处理纤维柱：在正式使用前，对纤维柱进行必要的预处理，包括消毒、平衡和冲洗，用于确保其过滤效果；
S204，过滤病毒收获液：将病毒收获液泵入中空纤维柱中，大颗粒的杂质将被纤维柱截留，而病毒则能够顺利通过，通过管路进入收集瓶中。
优选的，步骤S2中，使用100KD~0.1μm中空纤维柱或膜包将澄清液浓缩至目标浓度的过程，包括以下步骤：
S301，准备设备：首先，需要确保100KD~0.1μm中空纤维柱或膜包已正确安装并与系统连接，中空纤维柱具有特定的孔径，能够允许小分子和溶剂通过，而病毒被截留，从而实现浓缩效果；
S302，浓缩操作：将澄清液泵入中空纤维柱或膜包中，随着液体的流动，大分子物质将被截留在柱内或膜包中，而小分子和溶剂则通过膜孔流出，此过程会导致目标物质在柱内或膜包内逐渐被浓缩至目标浓度。
优选的，步骤S2中，使用病毒保存液将浓缩液洗滤3~8次的具体方法步骤包括如下：
S401，准备病毒保存液：首先，确保病毒保存液已经准备好，并且其质量和浓度符合实验要求；
S402，进行洗滤：将病毒保存液缓慢地泵入浓缩液中，通过控制流速和和跨膜压力将浓缩液洗滤3~8次，确保浓缩液中的杂质被有效去除；
S403，收集洗滤液：当达到预定的洗滤次数或洗滤液的质量达到预期要求时，停止洗滤，排空中空纤维柱管路并收集浓缩液；
S404，清洗与维护：对中空纤维柱或膜包进行清洗，用于去除残留的物质，并保持其性能。
优选的，步骤S2中，排空中空纤维柱管路并收集浓缩液的具体方法步骤包括如下：
S501，停止洗滤：首先，使用病毒保存液进行洗滤的次数达到预定的3~8次后，停止洗滤过程；
S502，收集样品：打开相应的阀门，将中空纤维柱或膜包中以及管路中的样品排空到收集瓶中；
S503，冲洗管路：用适量洗滤液将管路中残留的样品冲洗到收集瓶中，注意观察收集口样品的颜色和澄清度，用于确认是否已经完全冲洗干净，以保证回收率；
S504，记录与检测：在收集浓缩液的过程中，应记录收集的体积和时间，并对收集的浓缩液进行初步的质量检测，包括测定其浓度、纯度或HCD残留量；
S505，关闭系统与清理：对使用过的中空纤维柱、膜包和管路进行适当的清洗和消毒，关闭整个系统。
优选的，步骤S3中，酶切处理的具体步骤包括如下：
S601，准备酶切反应体系：首先，需要准备酶切反应所需的试剂和溶液，包括NaCl母液、聚山梨酯80或聚山梨酯20溶液，以及核酸酶；
S602，向浓缩液中添加物料：根据样品中HCD的含量，向样品中加入终浓度为10~1000mM的NaCl母液、0.1%~3%的聚山梨酯,5~250U/mL的核酸酶，并混合均匀；
S603，控制酶切反应条件：酶切反应在恒定的温度下进行，用于确保酶切效率和病毒样品的稳定性，控制反应的pH值和离子强度，以维持酶的最佳活性；
S604，进行酶切反应：在添加了物料并设置适当的反应条件后，开始进行酶切反应；
S605，终止酶切反应：当酶切反应达到预定时间或达到预期效果时，终止酶切反应，采用调整反应体系的pH值或添加酶抑制剂来实现；
S606，后续处理：酶切反应结束后，对反应产物进行进一步的处理，包括离心、过滤或浓缩，用于去除多余的酶和其他杂质，得到更纯净的病毒样品。
优选的，步骤S4中，复合层析进行精纯的具体方法步骤包括如下：
S701，选择复合层析填料，包括Capto Core 400或Capto Core 700；
S702，将选定的复合层析填料用NaOH溶液进行消毒处理，用于去除可能存在的微生物污染，使用适当的缓冲液对填料进行平衡，用于确保层析柱内的环境稳定且适合病毒的吸附和洗脱；
S703，将经过酶切处理的样品上样至已准备好的复合层析柱中；
S704，使用缓冲液洗脱病毒，洗脱过程中密切关注洗脱液的紫外吸收情况，收集病毒峰；
S705，对收集到的病毒峰进行分析和检测，用于确保其纯度和HCD残留量达到预期标准，使用凝胶电泳、PCR或质谱方法来检测病毒的纯度和HCD残留量。
（三）有益效果
与现有技术相比，本发明的有益效果：对酶切条件进行优化，酶切体系里加入NaCl和聚山梨酯可有效减少病毒聚集体的形成，极大地提高了酶切去除HCD的效率，仅通过酶切就可以将HCD降至10ng/剂量以下，避免了使用离子交换层析从而影响产量以及增加无菌风险，适用于痘苗病毒从实验室规模至商业化的生产；在酶切体系中加入NaCl或聚山梨酯是为了减少病毒聚集，使被病毒包裹的DNA释放出来，提高酶切效果，可以直接避免使用离子交换层析，纯化工艺更加简单。
附图说明
图1为本发明的整体步骤示意图；
图2为本发明的使用孔径0.45μm~5μm的过滤器进行澄清处理的方法步骤示意图；
图3为本发明的使用孔径0.45μm~0.65μm的中空纤维柱进行澄清处理的方法步骤示意图；
图4为本发明的使用100KD~0.1μm中空纤维柱或膜包将澄清液浓缩至目标浓度过程的步骤示意图；
图5为本发明的使用病毒保存液将浓缩液洗滤3~8次的具体方法步骤示意图；
图6为本发明的排空中空纤维柱管路并收集浓缩液的具体方法步骤示意图；
图7为本发明的酶切处理的具体步骤示意图；
图8为本发明的复合层析进行精纯的具体方法步骤示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-图8，本发明实施例提供一种技术方案：一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，方法步骤包括如下：
S1、首先对病毒收获液进行澄清处理；
病毒收获液用孔径0.45μm~5μm的过滤器或孔径0.45μm~0.65μm的中空纤维柱进行澄清处理；
S2、然后用中空纤维柱对澄清液进行浓缩和洗滤；
用100KD~0.1μm中空纤维柱或膜包将澄清液浓缩至目标浓度，然后用洗滤液将浓缩液洗滤3~8次，排空中空纤维柱管路，收集浓缩液；
S3、接着对浓缩液进行酶切处理；
向浓缩液中加入终浓度为10~1000mM的NaCl、0.1%~3%的聚山梨酯80或聚山梨酯20和5~250U/mL的核酸酶，酶切反应20min以上；
S4、最后使用复合层析对酶切样品进行精纯，最终样品HCD残留量可降至10ng/剂量以下；
将复合层析填料用NaOH溶液消毒以及缓冲液平衡后将酶切收样品上样和洗脱收集病毒峰。
进一步改进地，步骤S1中，使用孔径0.45μm~5μm的过滤器进行澄清处理的方法步骤包括如下：
S101，准备过滤器：选择孔径在0.45μm至5μm范围内的过滤器；
S102，预处理过滤器：根据过滤器的使用说明，对过滤器进行必要的预处理，包括有湿润和冲洗，用于确保过滤效果；
S103，过滤病毒收获液：将病毒收获液通过准备好的过滤器进行过滤，大颗粒的杂质将被过滤器截留，而病毒则能够顺利通过，用于实现边过滤边收集；
使用孔径0.45μm~0.65μm的中空纤维柱进行澄清处理的方法步骤包括如下：
S201，准备中空纤维柱：选择孔径在0.45μm至0.65μm范围内的中空纤维柱；
S202，组装中空纤维柱：将纤维柱与设备连接，并确保其密封性良好；
S203，预处理纤维柱：在正式使用前，对纤维柱进行必要的预处理，包括消毒、平衡和冲洗，用于确保其过滤效果；
S204，过滤病毒收获液：将病毒收获液泵入中空纤维柱中，大颗粒的杂质将被纤维柱截留，而病毒则能够顺利通过，通过管路进入收集瓶中。
确保操作的正确性和安全性，操作过程中需要无菌操作，避免引入新的污染源。
进一步改进地，步骤S2中，使用100KD~0.1μm中空纤维柱或膜包将澄清液浓缩至目标浓度的过程，包括以下步骤：
S301，准备设备：首先，需要确保100KD~0.1μm中空纤维柱或膜包已正确安装并与系统连接，中空纤维柱具有特定的孔径，能够允许小分子和溶剂通过，而病毒被截留，从而实现浓缩效果；
S302，浓缩操作：将澄清液泵入中空纤维柱或膜包中，随着液体的流动，大分子物质将被截留在柱内或膜包中，而小分子和溶剂则通过膜孔流出，此过程会导致目标物质在柱内或膜包内逐渐被浓缩至目标浓度。
进一步改进地，步骤S2中，使用病毒保存液将浓缩液洗滤3~8次的具体方法步骤包括如下：
S401，准备病毒保存液：首先，确保病毒保存液已经准备好，并且其质量和浓度符合实验要求；
S402，进行洗滤：将病毒保存液缓慢地泵入浓缩液中，通过控制流速和和跨膜压力将浓缩液洗滤3~8次，确保浓缩液中的杂质被有效去除；
S403，收集洗滤液：当达到预定的洗滤次数或洗滤液的质量达到预期要求时，停止洗滤，排空中空纤维柱管路并收集浓缩液；
S404，清洗与维护：对中空纤维柱或膜包进行清洗，用于去除残留的物质，并保持其性能。
病毒保存液的质量和浓度与病毒的存活率、稳定性以及后续实验的需求有关，因此，“实验要求”包括病毒保存液的pH值、离子浓度、渗透压、无菌性、无毒性等多个方面，这些要求都是为了确保病毒在保存液中的稳定性和实验结果的准确性；
pH值范围在7.2至7.4之间，与人体血液的pH值相近，对于许多病毒来说是最稳定的；
离子浓度模拟生理条件，与人体血液中的浓度相似；
渗透压与病毒来源组织或细胞的渗透压相近，以避免病毒因渗透压差异而受损，保存液的渗透压在280至320 mOsm/kg之间；
保存液必须是无菌的，以防止微生物污染，在制备和使用过程中必须采取严格的无菌操作措施，包括使用无菌技术、无菌容器和无菌水等；
保存液必须是无毒的，以避免对病毒或后续实验造成负面影响，所有添加剂和成分都必须经过仔细选择和测试，以确保它们对病毒没有毒性或抑制作用。
进一步改进地，步骤S2中，排空中空纤维柱管路并收集浓缩液的具体方法步骤包括如下：
S501，停止洗滤：首先，使用病毒保存液进行洗滤的次数达到预定的3~8次后，停止洗滤过程；
S502，收集样品：打开相应的阀门，将中空纤维柱或膜包中以及管路中的样品排空到收集瓶中；
S503，冲洗管路：用适量洗滤液将管路中残留的样品冲洗到收集瓶中，注意观察收集口样品的颜色和澄清度，用于确认是否已经完全冲洗干净，以保证回收率；
S504，记录与检测：在收集浓缩液的过程中，应记录收集的体积和时间，并对收集的浓缩液进行初步的质量检测，包括测定其浓度、纯度或HCD残留量；
S505，关闭系统与清理：对使用过的中空纤维柱、膜包和管路进行适当的清洗和消毒，关闭整个系统。
进一步改进地，步骤S3中，酶切处理的具体步骤包括如下：
S601，准备酶切反应体系：首先，需要准备酶切反应所需的试剂和溶液，包括NaCl母液、聚山梨酯80或聚山梨酯20溶液，以及核酸酶；
S602，向浓缩液中添加物料：根据样品中HCD的含量，向样品中加入终浓度为10~1000mM的NaCl母液、0.1%~3%的聚山梨酯,5~250U/mL的核酸酶，并混合均匀；
S603，控制酶切反应条件：酶切反应在恒定的温度下进行，用于确保酶切效率和病毒样品的稳定性，控制反应的pH值和离子强度，以维持酶的最佳活性；
S604，进行酶切反应：在添加了物料并设置适当的反应条件后，开始进行酶切反应；
S605，终止酶切反应：当酶切反应达到预定时间或达到预期效果时，终止酶切反应，采用调整反应体系的pH值或添加酶抑制剂来实现；
S606，后续处理：酶切反应结束后，对反应产物进行进一步的处理，包括离心、过滤或浓缩，用于去除多余的酶和其他杂质，得到更纯净的病毒样品。
具体改进地，步骤S4中，复合层析进行精纯的具体方法步骤包括如下：
S701，选择复合层析填料，包括Capto Core 400或Capto Core 700；
S702，将选定的复合层析填料用NaOH溶液进行消毒处理，用于去除可能存在的微生物污染，使用适当的缓冲液对填料进行平衡，用于确保层析柱内的环境稳定且适合病毒的吸附和洗脱；
S703，将经过酶切处理的样品上样至已准备好的复合层析柱中，在上样过程中，控制上样体积，将上样体积控制在30%CV以下，用于避免过载导致的分离效果不佳；
S704，使用缓冲液洗脱病毒，洗脱过程中密切关注洗脱液的紫外吸收情况，收集病毒峰；
S705，对收集到的病毒峰进行分析和检测，用于确保其纯度和HCD残留量达到预期标准，使用凝胶电泳、PCR或质谱方法来检测病毒的纯度和HCD残留量。
表1：纯化过程病毒感染滴度回收率
实施案例一：酶切条件：核酸酶浓度50U/mL，MgCl2浓度2mM，NaCl浓度150mM，聚山梨酯80浓度1%，37℃酶切30min，酶切对HCD去除率为99.19%；
纯化过程HCD去除情况：
实施案例二：酶切条件：核酸酶浓度50U/mL，MgCl2浓度2mM，NaCl浓度300mM，聚山梨酯80浓度0.5%，37℃酶切30min，酶切对HCD去除率为99.80%；
纯化过程HCD去除情况：
实施案例三：酶切条件：核酸酶浓度50U/mL，MgCl2浓度2mM，37℃酶切30min，酶切对HCD去除率为20.73%；
纯化过程HCD去除情况：
实施案例四：酶切条件：核酸酶浓度100U/mL，MgCl2浓度2mM，37℃酶切60min，酶切对HCD去除率为18.57%；
纯化过程HCD去除情况：
综述：对酶切条件进行优化，酶切体系里加入NaCl和聚山梨酯可有效减少病毒聚集体的形成，极大地提高了酶切去除HCD的效率，仅通过酶切就可以将HCD降至10ng/剂量以下，避免了使用离子交换层析从而影响产量以及增加无菌风险，适用于痘苗病毒从实验室规模至商业化的生产；在酶切体系中加入NaCl或聚山梨酯是为了减少病毒聚集，使被病毒包裹的DNA释放出来，提高酶切效果，可以直接避免使用离子交换层析，纯化工艺更加简单。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (5)
1.一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，其特征在于，方法步骤包括如下：
S1、首先对病毒收获液进行澄清处理：
病毒收获液用孔径0.45μm~5μm的过滤器或孔径0.45μm~0.65μm的中空纤维柱进行澄清处理；
S2、然后用中空纤维柱对澄清液进行浓缩和洗滤：
用100KD~0.1μm中空纤维柱或膜包将澄清液浓缩至目标浓度，然后用洗滤液将浓缩液洗滤3~8次，排空中空纤维柱管路，收集浓缩液；
S3、接着对浓缩液进行酶切处理：
向浓缩液中加入终浓度为10~1000mM的NaCl、0.1%~3%的聚山梨酯80或聚山梨酯20和5~250U/mL的核酸酶，酶切反应20min以上；
S4、最后使用复合层析对酶切样品进行精纯，最终样品HCD残留量可降至10ng/剂量以下：
将复合层析填料用NaOH溶液消毒以及缓冲液平衡后将酶切收样品上样和洗脱收集病毒峰；
其中，步骤S3中，酶切处理的具体步骤包括如下：
S601，准备酶切反应体系：首先，需要准备酶切反应所需的试剂和溶液，包括NaCl母液、聚山梨酯80或聚山梨酯20溶液，以及核酸酶；
S602，向浓缩液中添加物料：根据样品中HCD的含量，向样品中加入终浓度为10~1000mM的NaCl母液、0.1%~3%的聚山梨酯,5~250U/mL的核酸酶，并混合均匀；
S603，控制酶切反应条件：酶切反应在恒定的温度下进行，用于确保酶切效率和病毒样品的稳定性，控制反应的pH值和离子强度，以维持酶的最佳活性；
S604，进行酶切反应：在添加了物料并设置适当的反应条件后，开始进行酶切反应；
S605，终止酶切反应：当酶切反应达到预定时间或达到预期效果时，终止酶切反应，采用调整反应体系的pH值或添加酶抑制剂来实现；
S606，后续处理：酶切反应结束后，对反应产物进行进一步的处理，包括离心、过滤或浓缩，用于去除多余的酶和其他杂质，得到更纯净的病毒样品；
步骤S4中，复合层析进行精纯的具体方法步骤包括如下：
S701，选择复合层析填料，包括Capto Core 400或Capto Core 700；
S702，将选定的复合层析填料用NaOH溶液进行消毒处理，用于去除可能存在的微生物污染，使用适当的缓冲液对填料进行平衡，用于确保层析柱内的环境稳定且适合病毒的吸附和洗脱；
S703，将经过酶切处理的样品上样至已准备好的复合层析柱中，在上样过程中，控制上样体积，将上样体积控制在30%CV以下；
S704，使用缓冲液洗脱病毒，洗脱过程中密切关注洗脱液的紫外吸收情况，收集病毒峰；
S705，对收集到的病毒峰进行分析和检测，用于确保其纯度和HCD残留量达到预期标准，使用凝胶电泳、PCR或质谱方法来检测病毒的纯度和HCD残留量。
2.根据权利要求1所述的一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，其特征在于：步骤S1中，使用孔径0.45μm~5μm的过滤器进行澄清处理的方法步骤包括如下：
S101，准备过滤器：选择孔径在0.45μm至5μm范围内的过滤器；
S102，预处理过滤器：根据过滤器的使用说明，对过滤器进行必要的预处理，包括有湿润和冲洗；
S103，过滤病毒收获液：将病毒收获液通过准备好的过滤器进行过滤，大颗粒的杂质将被过滤器截留，而病毒则能够顺利通过；
使用孔径0.45μm~0.65μm的中空纤维柱进行澄清处理的方法步骤包括如下：
S201，准备中空纤维柱：选择孔径在0.45μm至0.65μm范围内的中空纤维柱；
S202，组装中空纤维柱：将纤维柱与设备连接，并确保其密封性良好；
S203，预处理纤维柱：在正式使用前，对纤维柱进行必要的预处理，包括消毒、平衡和冲洗；
S204，过滤病毒收获液：将病毒收获液泵入中空纤维柱中，大颗粒的杂质将被纤维柱截留，而病毒则能够顺利通过，通过管路进入收集瓶中。
3.根据权利要求1所述的一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，其特征在于：步骤S2中，使用100KD~0.1μm中空纤维柱或膜包将澄清液浓缩至目标浓度的过程，包括以下步骤：
S301，准备设备：首先，需要确保100KD~0.1μm中空纤维柱或膜包已正确安装并与系统连接，从而实现浓缩效果；
S302，浓缩操作：将澄清液泵入中空纤维柱或膜包中，随着液体的流动，大分子物质将被截留在柱内或膜包中，而小分子和溶剂则通过膜孔流出，此过程会导致目标物质在柱内或膜包内逐渐被浓缩至目标浓度。
4.根据权利要求3所述的一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，其特征在于：步骤S2中，使用病毒保存液将浓缩液洗滤3~8次的具体方法步骤包括如下：
S401，准备病毒保存液：首先，确保病毒保存液已经准备好，并且其质量和浓度符合实验要求；
S402，进行洗滤：将病毒保存液缓慢地泵入浓缩液中，通过控制流速和跨膜压力将浓缩液洗滤3~8次；
S403，收集洗滤液：当达到预定的洗滤次数或洗滤液的质量达到预期要求时，停止洗滤，排空中空纤维柱管路并收集浓缩液；
S404，清洗与维护：对中空纤维柱或膜包进行清洗，用于去除残留的物质，并保持其性能。
5.根据权利要求4所述的一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，其特征在于：步骤S2中，排空中空纤维柱管路并收集浓缩液的具体方法步骤包括如下：
S501，停止洗滤：首先，使用病毒保存液进行洗滤的次数达到预定的3~8次后，停止洗滤过程；
S502，收集样品：打开相应的阀门，将中空纤维柱或膜包中以及管路中的样品排空到收集瓶中；
S503，冲洗管路：用适量洗滤液将管路中残留的样品冲洗到收集瓶中，注意观察收集口样品的颜色和澄清度，用于确认是否已经完全冲洗干净；
S504，记录与检测：在收集浓缩液的过程中，应记录收集的体积和时间，并对收集的浓缩液进行初步的质量检测，包括测定其浓度、纯度或HCD残留量；
S505，关闭系统与清理：对使用过的中空纤维柱、膜包和管路进行适当的清洗和消毒，关闭整个系统。
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