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CN118403149A - 疫苗注射剂及其制备方法 - Google Patents

疫苗注射剂及其制备方法 Download PDF

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CN118403149A CN202410069182.1A CN202410069182A CN118403149A CN 118403149 A CN118403149 A CN 118403149A CN 202410069182 A CN202410069182 A CN 202410069182A CN 118403149 A CN118403149 A CN 118403149A
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Abstract

本发明涉及疫苗注射剂及其制备方法，其中制备方法包括如下步骤：提供呈胶体状且铝离子含量在0.3～1.5mg/ml的铝胶佐剂分散液、灭活菌液和免疫增强剂，混合后，分离胶质沉淀；将所述胶质沉淀与注射溶剂混合，得到所述疫苗注射剂。制得的疫苗注射剂能够使得抗原和免疫增强剂时间和空间上保持较佳的浓度比，从而提高免疫效果。

Description

疫苗注射剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，特别是涉及疫苗注射剂及其制备方法。
背景技术
铝胶佐剂是一种乳白色的凝胶半固体，包括氢氧化铝凝胶等，其通过吸附蛋白质抗原形成抗原集合体，在体内缓慢的释放出抗原，从而可以延长抗原的作用时间，被广泛应用于各类疫苗中。免疫增强剂是一类可以提高机体免疫应答的物质，将疫苗与免疫增强剂联合使用可以进一步提高疫苗的效果。然而，疫苗和免疫增强剂在人体内的运输和代谢过程存在差异，导致疫苗与免疫增强剂在体内不同区域和不同时间不能维持较合适的浓度比例，使得免疫效果无法进一步得到提高。
通过对疫苗注射剂制备方法的改进，有助于进一步提高疫苗对人体的免疫作用。
发明内容
基于此，有必要提供一种疫苗注射剂及其制备方法。
一种疫苗注射剂的制备方法，包括如下步骤：
提供呈胶体状且铝离子含量在0.3～1.5mg/ml的铝胶佐剂分散液、灭活菌液和免疫增强剂，混合后，分离胶质沉淀；
将所述胶质沉淀与注射溶剂混合，得到所述疫苗注射剂。
本方案通过铝胶佐剂将灭火菌液和免疫增强剂一同吸附形成胶质沉淀，并且将胶质沉淀分离后与注射溶剂混合，形成疫苗注射剂，从而保证疫苗注射剂中没有游离的灭活菌液(即抗原)和免疫增强剂，待疫苗注射剂注入体内后，由铝胶佐剂的缓释作用持续释放抗原和免疫增强剂，使得抗原和免疫增强剂的浓度由0开始逐渐增加到趋近于平衡，抗原和免疫增强剂随着铝胶佐剂的运输而在体内各区域缓释，如此可以保证抗原和免疫增强剂时间和空间上保持较佳的浓度比，从而提高免疫效果。
具体地，所述注射溶剂包括水、生理盐水或磷酸盐缓冲液中的至少一种。这些液体能够作为胶质沉淀的稀释剂，使得胶质沉淀富有流动性，且适配于受体体内状况。
在其中一个实施例中，所述呈胶体状且铝离子含量在0.3～1.5mg/ml的铝胶佐剂分散液的制备方法包括：取铝盐溶液，在搅拌过程中逐渐加入水溶性碱，分离铝胶佐剂并加入去离子水，以制得呈胶体状且铝离子含量在0.3～1.5mg/ml的铝胶佐剂分散液。通过该步骤能够制得呈胶体状的铝胶佐剂分散液，且呈胶状的铝胶佐剂能够很好地吸收灭活菌液和免疫增强剂，从而将灭活菌液和免疫增强剂固定在铝胶佐剂的颗粒中，起到同步缓释的作用，并提升受体的免疫能力。
在其中一个实施例中，所述水溶性碱为氢氧化钠和氨水中的一种，该两种水溶性碱较常用于制备铝胶佐剂，从而制得纯度较高且更安全的铝胶佐剂。
在其中一个实施例中，将灭活菌液和免疫增强剂加入至所述铝胶佐剂分散液中的步骤之前还包括：
菌液制备步骤：将冻干菌株在CLBA血平板中培养复苏后，挑选单个菌落细菌接种于第一LB培养基，振荡培养，纯度检验合格后得到第一代菌种；挑取所述第一代菌种中的单个菌落接种到第一CLBA培养基继续培养，纯度检验合格后得到第二代菌种；挑取所述第二代菌种中的单个菌落，在第二LB培养基中培养，纯度检验合格后，按1％接种至新的第三LB培养皿中，振荡培养，纯度检验合格后进行下一步；具体地，将冻干菌株在CLBA血平板中培养复苏后，挑选单个菌落细菌接种于第一LB培养基，于35～40℃振荡培养16～24h，纯度检验合格后得到第一代菌种；挑取所述第一代菌种中的单个菌落接种到第一CLBA培养基继续培养，纯度检验合格后得到第二代菌种；挑取所述第二代菌种中的单个菌落，在第二LB培养基中培养，纯度检验合格后，按1％接种至第三LB培养皿中，于35～40℃振荡培养18～24h，纯度检验合格后进行下一步；
灭活步骤：加入甲醛溶液后密闭处理，取样接种第二CLBA培养基进行无菌检验，检验合格后进行下一步；具体地，加入甲醛溶液至终浓度为0.1～0.3％，在35～40℃温度下密闭处理16～32h，隔4～6h振摇一次，取样接种第二CLBA培养基进行无菌检验，检验合格后进行下一步；
菌液浓缩步骤：将菌液置于离心机离心，得到的菌泥洗涤至少三次后悬浮为菌液，调整所述菌液的浓度至1×109～3×109CFU/ml，得到灭活菌液；具体地，将菌液置于2000～4000rpm的离心机离心10～30min，得到的菌泥洗涤至少三次后悬浮为菌液，调整所述菌液的浓度至1×109～3×109CFU/ml，得到灭活菌液。
通过上述的制备步骤能够制得灭活菌液的纯度较高，适用于注射至受体体内，起到免疫作用。
在其中一个实施例中，所述铝胶佐剂包括氢氧化铝和磷酸铝中的至少一种，上述的氢氧化铝和磷酸铝均能很好地起到吸附灭活菌液和免疫增强剂的作用，且相对无毒，能够增加受体的免疫能力。具体地，所述氢氧化铝的粒径为2～20nm，磷酸铝的粒径为50～100nm。这个粒径范围能够较好地制得胶状的铝胶佐剂。
一种疫苗注射剂，采用如上述任一实施例中所述的疫苗注射剂制备方法制备得到。
具体实施方式
为了便于理解本申请，下面将参照相关实施例对本申请进行更全面的描述。实施例中给出了本申请的较佳实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在申请的描述中，“多种”的含义是至少两种，例如两种，三种等，除非另有明确具体的限定。在本申请的描述中，“若干”的含义是至少一个，例如一个，两个等，除非另有明确具体的限定。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本申请中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本申请中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
本申请中所提及的“颗粒”，或限定了粒径分布的物质，其形状不一定是球形的，也有可能是无规则的，可以为一次颗粒，也可以为二次颗粒。无规则的颗粒粒径以其最大直径和最小直径的平均值计。
在其中一个实施例中，提供一种疫苗注射剂的制备方法，包括如下步骤：
S1：取铝盐溶液，在搅拌过程中逐渐加入水溶性碱，以制得呈胶体状且铝离子含量在0.3～1.5mg/ml的铝胶佐剂分散液。
S2：提供呈胶体状且铝离子含量在0.3～1.5mg/ml的铝胶佐剂分散液、菌液浓度在1×109～3×109CFU/ml的鸭疫里默氏杆菌的灭活菌液及浓度范围在1～3mg/ml的鱼腥草素钠。
S3：将鱼腥草素钠和鸭疫里默氏杆菌的灭活菌液加入至铝胶佐剂分散液中，其中，鱼腥草素钠、鸭疫里默氏杆菌的灭活菌液和铝佐剂分散液的体积份配比为1：(1～10)：(1～20)，混合后，分离胶质沉淀。
S4：将胶质沉淀与注射溶剂混合，得到疫苗注射剂。
本申请的疫苗注射剂的制备方法，制得的疫苗注射剂能够接种到受体体内，其中，铝胶佐剂能够通过静电吸附作用吸附鸭疫里默氏杆菌的灭活菌液的抗原及鱼腥草素钠，使得抗原及鱼腥草素钠与铝胶佐剂发生作用形成复合体，这样，抗原及鱼腥草素钠会稳定地结合到铝胶佐剂。当分离出胶质沉淀后混合注射溶剂并注入受体体内后，铝胶佐剂能够同步缓慢地释放出灭活菌液及鱼腥草素钠，充分延长了灭活菌液及鱼腥草素钠的作用时间，并且能够在受体体内于不同的时空间下持续维持灭活菌液及鱼腥草素钠两者较佳的浓度配比，持续发挥高效的免疫作用同时又不会导致受体溶血。同时，在释放灭活菌液及鱼腥草素钠的过程中，铝胶佐剂起到了免疫增强作用，增加了受体的免疫能力。即，铝胶佐剂能够一方面起到缓释作用，避免灭活菌液过早消耗，且使得灭活菌液与鱼腥草素钠维持在合适的浓度配比，另一方面还起到免疫增强作用，进一步提升受体的免疫能力。进一步地，由于在铝胶佐剂吸附鱼腥草素钠和灭活菌液后，将胶质沉淀进行了分离再混合注射溶剂，这样，在分离阶段去除了游离的鱼腥草素钠和灭活菌液，避免受体发生溶血。
为避免试验对人造成伤害，下面以协助花边鸭免疫鸭疫里默氏杆菌病为例。鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(RA，Riemerella anatipestifer)引起的一种接触性传染性疾病，又称为鸭传染性浆膜炎、新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合症和鸭疫巴氏杆菌病等。在自然条件下，本病一年四季都有发生，是危害养鸭业最为严重疫病之一。以鸭疫里默氏杆菌疫苗注射剂对花边鸭进行免疫保护，并进行攻毒试验，得到下面的具体的实施例和对比例。
实施例1：
该实施例的鸭疫里默氏杆菌疫苗注射剂制备方法包括如下步骤：
S1：制备铝胶佐剂分散液，包括：
取三氯化铝以去离子水溶解，配置成铝离子含量在0.3mg/ml铝离子溶液。
取浓度为0.5mol/L的氢氧化钠在搅拌过程中逐渐加入至铝离子溶液中，其中，三氯化铝和氢氧化钠的重量份配比为3：1。在持续20min的搅拌过程中按需滴加氢氧化钠溶液并使得混合液的PH维持在7。
静置并分离上清液，得到铝胶佐剂，加入足量去离子水清洗铝胶佐剂。
取铝胶佐剂加入去离子水，搅拌后得到呈胶体状的铝胶佐剂分散液，其中，制得所述铝胶佐剂分散液的铝离子含量为0.3mg/ml。
S2：制备RA灭活菌液，包括：
菌液制备步骤：将RA冻干菌株在CLBA血平板中培养复苏后，挑选单个菌落细菌接种于第一LB培养基，于37℃振荡培养20h，纯度检验合格后得到第一代菌种；挑取所述第一代菌种中的单个菌落接种到第一CLBA培养基继续培养，纯度检验合格后得到第二代菌种；挑取所述第二代菌种中的单个菌落，在5ml的第二LB培养基中培养，纯度检验合格后，按1％接种至100ml的第三LB培养皿中，于37℃振荡培养20h，纯度检验合格后进行下一步；
灭活步骤：加入甲醛溶液至终浓度为0.2％，在37℃温度下密闭处理24h，隔5h振摇一次，取样接种第二CLBA培养基进行无菌检验，检验合格后进行下一步；
菌液浓缩步骤：将菌液置于3000rpm的离心机离心20min，得到的菌泥洗涤至少三次后悬浮为菌液，调整所述菌液的浓度至1.5×109CFU/ml，得到RA灭活菌液。
S3：鱼腥草素钠选用广东永康药业有限公司生产销售的新鱼腥草素钠注射液，其中该新鱼腥草素钠注射液的浓度规格为2mg/ml。
S4：将所述鱼腥草素钠和所述RA灭活菌液加入至所述铝胶佐剂分散液中，其中，所述鱼腥草素钠、所述RA灭活菌液和所述铝佐剂分散液的体积份配比为1：4：8，混合后，分离胶质沉淀；
S5：以0.75％浓度的生理盐水为注射溶剂，其中生理盐水的溶质为氯化钠，将所述胶质沉淀与注射溶剂混合，得到鸭疫里默氏杆菌疫苗注射剂，并配置成0.83ml剂量的鸭疫里默氏杆菌疫苗注射剂。
实施例2：与实施例1的区别在于，所述铝胶佐剂的铝离子含量为1.5mg/ml，所述鱼腥草素钠、RA灭活菌液和所述铝胶佐剂分散液的重量份配比为1：4：8。
实施例3：与实施例1的区别在于，所述铝胶佐剂的铝离子含量为0.8mg/ml，所述鱼腥草素钠、RA灭活菌液和所述铝胶佐剂分散液的重量份配比为1：4：8。
实施例4：与实施例1的区别在于，所述铝胶佐剂的铝离子含量为0.8mg/ml，所述RA灭活菌液的浓度为1×109CFU/ml，所述鱼腥草素钠、RA灭活菌液和所述铝胶佐剂分散液的重量份配比为1：10：1。
实施例5：与实施例1的区别在于，所述铝胶佐剂的铝离子含量为0.8mg/ml，所述RA灭活菌液的浓度为3×109CFU/ml，所述鱼腥草素钠、RA灭活菌液和所述铝胶佐剂分散液的重量份配比为1：1：20。
对比例1：注射0.83ml浓度为0.75％的生理盐水。
对比例2：不注射任何注射剂。
对比例3：参照《张思旺.亚微乳制剂减低鱼腥草素钠溶血副作用的研究[D].西南大学；张思旺，2010,10-11.》论文的方法，将与实施例1同等剂量的鱼腥草素钠制备为亚微乳剂，且与实施例同等剂量的RA灭活菌液直接混合作为注射剂。
对比例4：将浓度为2mg/ml的鱼腥草素钠、菌液浓度为1.5×109CFU/ml的RA灭活菌液和铝离子浓度为0.8mg/ml的铝胶佐剂分散液三者以体积份配比1：4：8的比例混合后，分离出0.83ml剂量的注射剂并直接注射至受体体内。
收集一日龄健康花边鸭，采取分组笼养，笼具采取消毒液喷洒、冲洗、晾晒等方式消毒。每天清洗料槽和饮水器，清除粪便并冲洗地板。并保持舍内通风良好。在花边鸭的1～6日龄阶段，当室舍温度低于10℃时，红外线照射增温。饲养方式为自由采食。
将90只11日龄健康未免疫鸭随机平分为九组，每一组对应一实施例或一对比例，于免疫后10天在花边鸭的腿部肌肉进行攻毒接种。其中攻毒参照文献《张毅,朱柱振,张凤仙.鸭疫里默氏杆菌病的疫苗及防治研究进展[A].中国家禽,1998,20(4):32-34.》的方法，以4.8×108CFU/0.2mL·只剂量腿部肌肉途径进行接种。
凡表现为精神沉郁、嗜睡懒动、腿软无力、站立、走路摇晃、出现甩头、呼吸困难、头颈歪斜等症状及死亡都判为发病，统计各组动物发病数和死亡数。
实验组 发病数(只) 死亡(只)
实施例1 5 3
实施例2 4 2
实施例3 3 1
实施例4 5 3
实施例5 4 3
对比例1 10 9
对比例2 10 10
对比例3 6 4
对比例4 7 6
从对比例1、对比例2和各实施例的对比可知，对比例1和对比例2的花边鸭在攻毒后均出现发病症状，且死亡的只数较多，而各实施例相较于对比例1和2，花边鸭发病数和死亡数均有所下降，这是由于鱼腥草素钠和RA灭活菌液混合至铝胶佐剂后，能够使得花边鸭对鸭疫里默氏杆菌产生免疫，从而降低发病数和死亡率。
从各实施例和对比例3的对比可知，各实施例的花边鸭死亡率低于对比例3，这是因为对比例3仅实现了鱼腥草素钠的缓释，而RA灭活菌液被过早消耗，导致免疫效果下降。各实施例的铝胶佐剂能够同步缓慢地释放出RA灭活菌液及鱼腥草素钠，充分延长了RA灭活菌液及鱼腥草素钠的作用时间，并且能够在受体体内于不同的时空间下持续维持RA灭活菌液及鱼腥草素钠两者较佳的浓度配比，持续发挥高效的免疫作用同时又不会导致受体溶血。并且，一方面铝胶佐剂增加了RA灭活菌液的释放时长，另一方面铝胶佐剂本身具备增加免疫效果的作用，有利于持续且更好地促进花边鸭的免疫系统工作，降低了花边鸭的发病率。
从实施例1至实施例5的对比可知，实施例3的花边鸭的发病数和死亡数都较低，可见该实施例的鸭疫里默氏杆菌疫苗注射剂具有较佳的免疫效果。与实施例3对比，实施例1的铝胶佐剂分散液的铝离子浓度过低，铝胶佐剂在混合的阶段无法很好地接触并吸附鱼腥草素钠和RA灭活菌液，从而导致铝胶佐剂内部的鱼腥草素钠和RA灭活菌液含量过少，从而无法释放足够的鱼腥草素钠和RA灭活菌液来增加免疫作用。实施例2的铝胶佐剂分散液的铝离子浓度过高，导致鱼腥草素钠和RA灭活菌液在混合时被过快吸附，从而导致两者在铝胶佐剂的分布不均匀，进而导致在缓释过程中鱼腥草素钠和RA灭活菌液的浓度不稳定，降低了花边鸭对鸭疫里默氏杆菌的免疫效果。
从实施例3至实施例5可见，RA灭活菌液的菌液浓度在1×109～3×109CFU/ml均能获得免疫作用，其中实施例4的铝胶佐剂分散液的体积配比相较于实施例3更低，无法充分吸附鱼腥草素钠和RA灭活菌液，导致注射剂最终鱼腥草素钠和RA灭活菌液含量过低。而实施例5的铝胶佐剂分散液的体积配比相较于实施例3更高，导致混合阶段鱼腥草素钠、RA灭活菌液与无法很好地与铝胶佐剂接触，使得吸附不充分，且导致铝胶佐剂内部的鱼腥草素钠和RA灭活菌液分布不均，进而也会导致在缓释过程中鱼腥草素钠和RA灭活菌液的浓度不稳定，降低了花边鸭对鸭疫里默氏杆菌的免疫效果。
对比例4中，虽然采用了与实施例3配方相同的浓度为2mg/ml的鱼腥草素钠、菌液浓度为1.5×109CFU/ml的RA灭活菌液和铝离子浓度为0.8mg/ml的铝胶佐剂分散液三者以体积份配比1：4：8的比例混合制得注射剂，但仍然导致花边鸭具有较高的发病率和死亡率，这是由于三者混合后相较于实施例3少了分离胶质沉淀的步骤，这样，注射剂中还混合有未被铝胶佐剂充分吸附的鱼腥草素钠，这些游离的鱼腥草素钠会导致花边鸭发生溶血，从而导致花边鸭发病和死亡。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种疫苗注射剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供呈胶体状且铝离子含量在0.3～1.5mg/ml的铝胶佐剂分散液、灭活菌液和免疫增强剂，混合后，分离胶质沉淀；
将所述胶质沉淀与注射溶剂混合，得到所述疫苗注射剂。
2.根据权利要求1所述的疫苗注射剂的制备方法，其特征在于，所述呈胶体状且铝离子含量在0.3～1.5mg/ml的铝胶佐剂分散液的制备方法包括：取铝盐溶液，在搅拌过程中逐渐加入水溶性碱，分离铝胶佐剂并加入去离子水，以制得呈胶体状且铝离子含量在0.3～1.5mg/ml的铝胶佐剂分散液。
3.根据权利要求1所述的疫苗注射剂的制备方法，其特征在于，所述注射溶剂包括水、生理盐水或磷酸盐缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的疫苗注射剂的制备方法，其特征在于，所述灭活菌液来源于人病原菌或兽病原菌。
5.根据权利要求4所述的疫苗注射剂的制备方法，其特征在于，所述人病原菌包含肺炎链球菌、结核杆菌。
6.根据权利要求1所述的疫苗注射剂的制备方法，其特征在于，所述灭活菌液的制备步骤包括：
菌液制备步骤：将冻干菌株在CLBA血平板中培养复苏后，挑选单个菌落细菌接种于第一LB培养基，振荡培养，纯度检验合格后得到第一代菌种；挑取所述第一代菌种中的单个菌落接种到第一CLBA培养基继续培养，纯度检验合格后得到第二代菌种；挑取所述第二代菌种中的单个菌落，在第二LB培养基中培养，纯度检验合格后，按1％接种至新的第三LB培养皿中，振荡培养，纯度检验合格后进行下一步；
灭活步骤：加入甲醛溶液后密闭处理，取样接种第二CLBA培养基进行无菌检验，检验合格后进行下一步；
菌液浓缩步骤：将菌液置于离心机离心，得到的菌泥洗涤至少三次后悬浮为菌液，调整所述菌液的浓度至1×109～3×109CFU/ml，得到灭活菌液。
7.根据权利要求6所述的疫苗注射剂的制备方法，其特征在于，所述菌液制备步骤包括：将冻干菌株在CLBA血平板中培养复苏后，挑选单个菌落细菌接种于第一LB培养基，于35～40℃振荡培养16～24h，纯度检验合格后得到第一代菌种；挑取所述第一代菌种中的单个菌落接种到第一CLBA培养基继续培养，纯度检验合格后得到第二代菌种；挑取所述第二代菌种中的单个菌落，在第二LB培养基中培养，纯度检验合格后，按1％接种至第三LB培养皿中，于35～40℃振荡培养18～24h，纯度检验合格后进行下一步。
8.根据权利要求6所述的疫苗注射剂的制备方法，其特征在于，所述灭活步骤包括：在35～40℃温度下密闭处理16～32h，隔4～6h振摇一次，取样接种第二CLBA培养基进行无菌检验，检验合格后进行下一步。
9.根据权利要求6所述的疫苗注射剂的制备方法，其特征在于，所述菌液浓缩步骤包括：将菌液置于2000～4000rpm的离心机离心10～30min，得到的菌泥洗涤至少三次后悬浮为菌液，调整所述菌液的浓度至1×109～3×109CFU/ml。
10.一种疫苗注射剂，其特征在于，采用如权利要求1-9中任一项所述的疫苗注射剂的制备方法制备得到。
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