CN118382636A - 一种用于检测淀粉样蛋白β42(Aβ42)的新抗体 - Google Patents
一种用于检测淀粉样蛋白β42(Aβ42)的新抗体 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其具有使用免疫测定体外检测Aβ42的有利特征。还提供了编码所述单克隆抗体或其抗原结合片段的多核苷酸或多核苷酸集以及包含所述多核苷酸的载体。进一步提供了包含所述多核苷酸的宿主细胞以及使用这种宿主细胞的相应生产方法。本文还提供了采用本文提供的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的用途和方法。
Description
本发明涉及新的Aβ42特异性抗体，其在体外Aβ42检测测定以及与所述新的Aβ42特异性抗体相关的方面中显示出有利的特征。
淀粉样蛋白β(Aβ)(尤其是易于聚集的小肽Aβ42)在大脑中所谓的斑块中的积累是阿尔茨海默病(AD)的主要标志。这就是为什么早期检测和量化Aβ水平对于AD的诊断和未来潜在的治疗至关重要。目前，Aβ检测的两种主要方法是(1)基于与大脑中Aβ沉积物结合的放射性标记示踪剂的PET扫描，以及(2)测量脑脊液(CSF)中的Aβ水平，例如通过Roche测试进行测量。这两种方法都有缺点，即它们具有一定程度的侵入性，并且对于世界各地的患者来说不容易得到。由于近年来技术的进步，现在也可以使用例如质谱法或超灵敏免疫测定来量化血浆中的Aβ42水平(Hampel等人,Zetterberg等人,Nat RevNeurol,2018.14(11):第639-652页)。然而，仍然需要进一步提高血液中Aβ42量化的稳健性并鉴定测定设置，从而进一步改善临床性能。
可能潜在影响基于血液的测定的稳健性的一个方面是干扰。众所周知，血液含有内源性物质，其可能会干扰用于量化Aβ42的测定中使用的组分(例如，抗体)，例如针对测定组分的异嗜性抗体，诸如抗体(Zetterberg,H.和S.C.Burnham,Blood-based molecularbiomarkers for Alzheimer's disease.Mol Brain,2019.12(1):Art.nr.26)。这些类型的抗体在CSF中的问题要少得多。例如，基于血液的基于抗体的免疫测定中潜在干扰的已知来源是人类风湿因子(Rf)(Tate等人Clin Biochem Rev.2004；25(2):105-120；Ward等人ClinBiochem.2017；50(18):1306-1311)，即自身抗体，最常见的是免疫球蛋白M(IgM)亚型(MGioud-Paquet等人,Ann Rheum Dis.1987Jan；46(1):65–71)，通常在来自患有类风湿性关节炎和诸如狼疮或脓毒症的其他疾病的患者的血液中发现其浓度升高(FrancescaIngegnoli等人,Dis Markers.2013；35(6):727–734)。这可能导致假阳性或假阴性测定结果，并且从而降低此类测定的临床价值(Tate等人；同上，Ward等人，同上)。
因此，还需要例如通过提供改善的抗体来改善用于检测血液样品中的Aβ42的基于抗体的测定的稳健性。特别地，需要检测血液样品中的Aβ42以最大限度地减少干扰(诸如Rf诱导的干扰)和/或提高此类Aβ42测定单独或与其他生物标记物组合(例如，Aβ42/Aβ40比率)的临床性能。
本发明提供了针对上述需求的解决方案。
根据第一方面，本文提供了一种与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，“与Aβ42特异性结合”意指单克隆抗体或抗原片段在抗原-抗体反应中与Aβ42结合，并将Aβ42与其他蛋白质、特别是也与不具有由Aβ42的氨基酸42形成的C末端的其他Aβ肽(例如，Aβ38、Aβ40和/或Aβ43)区分开来。“区分”意指与Aβ42的结合亲和力高于与其他蛋白质或肽的结合亲和力。
抗体或其抗原结合片段的特异性是通过以下事实实现的：Aβ42的C末端包含在抗体识别的表位中。因此，本发明的抗体或抗原结合片段可以与Aβ42的C末端结合。
在实施例中，“与Aβ42特异性结合”可以意指本发明的抗体或抗原结合片段以为其他蛋白质或肽(例如，Aβ38、Aβ40和/或Aβ43)至少5倍、优选10倍、甚至更优选50倍或最优选100倍的亲和力结合Aβ42。换句话说，与Aβ42结合的解离平衡常数KD是其他蛋白质或肽(例如，Aβ38、Aβ40和/或Aβ43)的5倍、优选10倍、甚至更优选50倍或最优选100倍低。
在实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段将Aβ42与(所有)其他Aβ肽(例如，Aβ38、Aβ40和Aβ43)区分开来，因为对Aβ42的结合亲和力是对(所有)其他Aβ肽(例如，Aβ38、Aβ40和Aβ43)的结合亲和力的至少5倍，优选10倍，甚至更优选50倍或最优选100倍。换句话说，与Aβ42结合的解离平衡常数KD是(所有)其他Aβ肽(例如，Aβ38、Aβ40和Aβ43)的5倍、优选10倍、甚至更优选50倍或最优选100倍低。
与Aβ42结合的结合亲和力和/或解离平衡常数KD可以通过本领域已知的方法确定，诸如表面等离子体共振光谱法(例如，使用下文和/或所附实例中描述的设置)。
在实施例中，当测量样品中的Aβ42的预定浓度不受掺入与预定的Aβ42浓度相比2倍、优选10倍并且甚至更优选50倍过量浓度的Aβ38、Aβ40和/或Aβ43的影响时，可以认为抗体与Aβ42特异性结合。“不受影响”意指考虑到相应方法的测量误差(例如，5％或10％)，正确测量了预定浓度。
在实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段的特征还在于2倍、优选10倍并且甚至更优选50倍过量的Aβ38、Aβ40和Aβ43不竞争与Aβ42的结合。
为了确定Aβ38、Aβ40和/或Aβ43与Aβ42对与抗体或抗原结合片段结合的竞争，可以采用使用与Aβ38、Aβ40和/或Aβ43肽或其模拟肽竞争来量化Aβ42的免疫测定(例如，如本文别处和所附实例中所述)。特别地，可以使用基于的Aβ42免疫测定。此类测定的非限制性但优选的示例公开于所附实例中。
为了确定亲和力(或其他动力学参数)或用于本文所述的竞争实验，可以使用Aβ42、Aβ38、Aβ40和/或Aβ43模拟肽。此类模拟肽仅包含部分肽(包括C末端作为游离C末端)，因为已发现此类缩短的模拟肽具有更好的可溶性。示例性的模拟肽在所附实例中描述。对于Aβ38，模拟肽可以包含Aβ38的氨基酸1至12和25至38，但不包含Aβ38的氨基酸13至24(例如，通过接头连接的Aβ38的氨基酸1至12和25至38)。对于Aβ40，模拟肽可以包含Aβ40的氨基酸1至12和25至40，但不包含Aβ40的氨基酸13至24(例如，通过接头连接的Aβ40的氨基酸1至12和25至40)。对于Aβ43，模拟肽可以包含Aβ43的氨基酸1至12和34至43，但不包含Aβ43的氨基酸13至33(例如，通过接头连接的Aβ43的氨基酸1至12和34至43)。对于所有模拟肽，C末端对应于相应的Aβ肽。所描述的模拟肽是本发明的一部分。Aβ42模拟肽在下文描述。在模拟肽中，可以使用本领域中的不同接头。非限制性示例是以下接头：-O2Oc-O2Oc-Lys(Bi)-O2Oc-O2Oc-。
已发现本发明的单克隆抗体或抗原结合片段在用于检测血液样品中的Aβ42的免疫测定中时，尤其是与Aβ42/Aβ40比率组合使用时，令人惊讶地优于先前使用的单克隆Aβ42特异性抗体。具体地，当以基于血液样品的Aβ42/Aβ40比率使用时，使用本发明的新的Aβ42特异性抗体的免疫测定在评定淀粉样蛋白阳性方面显示出比以类似测定格式广泛用于现有技术测定中的Aβ42抗体显著更好的临床性能。
因此，在实施例中，本发明的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的特征在于，当其在用于检测和/或量化血液样品(例如，血清或血浆样品)中的Aβ42的夹心免疫测定中使用时，使用Aβ42/Aβ40比率(或反之亦然)来确定参考群体的样品中的淀粉样蛋白阳性的准确度高于使用现有技术Aβ42抗体21F12和/或H31L21的相同Aβ42夹心免疫测定的准确度。准确度优选地通过ROC分析使用用于检测参考群体(具有已知的淀粉样蛋白状态)的样品中的淀粉样蛋白阳性的AUC(曲线下面积)作为准确度的量度来确定。在实施例中，用于检测参考群体的样品中的淀粉样蛋白阳性的Aβ42/Aβ40比率的AUC可以为至少0.8，优选至少0.85并且最优选至少0.86。
在实施例中，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段，其中当用于针对血液样品(例如，血清或血浆样品)中的Aβ42的夹心免疫测定时，使用Aβ42/Aβ40比率(或反之亦然)来确定具有预定淀粉样蛋白状态的参考群体的样品中的淀粉样蛋白阳性的准确度至少与使用具有SEQ ID NO:9的重链和SEQ ID NO:10的轻链的本发明抗体的相同夹心免疫测定的准确度一样好。准确度优选地通过ROC分析来确定，并且用于检测参考群体(具有已知的淀粉样蛋白状态)的样品中的淀粉样蛋白阳性的AUC(曲线下面积)用作准确度的量度。
参考群体可以例如是如所附实例中所使用的参考群组，例如，可以包含淀粉样蛋白阳性和淀粉样蛋白阴性受试者。淀粉样蛋白阳性受试者可能没有认知障碍、具有轻度认知障碍或者具有认知障碍。
在Rf干扰分析中的任一者中使用的免疫测定可以是夹心免疫测定，例如，如所附实例中所述的免疫测定。免疫测定可以使用作为第二结合剂的与氨基酸1至42中的任一者特异性结合(即，Aβ特异性但非Aβ42特异性)并且不与本发明的抗体或抗原结合片段竞争与Aβ42的结合的Aβ特异性结合剂。此类第二结合剂的示例性但非限制性示例是3D6、6E10(BioLegend目录号803004)和1E8(Nanotools目录号0315-100/bA4N-1E8)。在优选的实施例中，第二结合剂是3D6，如下文所定义。
用于ROC分析的淀粉样蛋白阳性的参考读数可以是(例如，在CSF样品中测量的CSF pTau181/Aβ42比率，例如使用0.024的截止值)或PET扫描分析。在优选的实施例中，用于ROC分析的淀粉样蛋白阳性的参考读数是CSF样品中测量的CSFpTau181/Aβ42比率，优选使用0.024的截止值。
作为有助于使用本发明的抗体改善基于血液的Aβ42免疫测定的临床结果的一个因素，本发明人惊奇地发现，与目前本领域广泛使用的以下大多数Aβ42抗体相比，本发明的抗体对于血液样品中的类风湿因子(Rf)干扰是稳健的：21F12和H31L21(Pannee J等人,Alzheimers Dement(Amst)2021Oct 14；13(1):e12242.doi:10.1002/dad2.12242)。在表征本发明抗体的特征以及与提到的现有技术抗体比较期间，已经鉴定出针对21F12和H31L21而非本发明抗体的先前未描述的Rf干扰。最初在人工掺有来自血浆池的纯化Rf的样品以及Rf水平升高的天然样品中鉴定了干扰。与传统的Rf干扰相反，该干扰不依赖于相应抗体的Fc结构域，而是可以分配给包含这些现有技术抗体的可变结构域(VH和VL)的抗原结合片段(例如，F(ab)2片段)。有充分的证据表明现有技术抗体的VH和VL结构域并且更具体地是其CDR残基有助于Rf干扰(参见实例和图)。发明人可以进一步证明，当使用具有升高的IgM抗体的样品时，Rf IgM抗体与现有技术抗体21F12结合，所述结合在很大程度上与使用21F12的免疫测定中观察到的Rf干扰相关。这一发现表明现有技术Aβ42抗体遭受由抗原结合结构域引起的Rf IgM干扰，其中VH和VL、更具体地是其中包含的CDR起关键作用。
令人惊奇的是，本文鉴定的新的单克隆Aβ42特异性抗体(克隆3.2.52)没有显示出如广泛使用的现有技术Aβ42抗体21F12和H31L21所观察到的Rf干扰。该特征是有助于使用本发明的新单克隆抗体改善免疫测定临床性能的一个因素。通过克服干扰，即基于抗体的Aβ42检测方法(诸如免疫测定(例如，异相免疫测定))中的Rf干扰，可以提高Aβ42检测的稳健性，尤其是血液样品(诸如血浆)中的Aβ42检测的稳健性。如所附实例所证明的，本文提供的新单克隆抗体可以准确地检测样品中的Aβ42，而与来自血浆池的纯化Rf的存在无关，其中Rf活性至少高达1200IU/ml。相比之下，21F12和H31L21在300IU/ml Rf活性下已显示出显著干扰。此外，所附实例证明与抗体21F12相反，本发明的抗体不与具有升高的Rf的天然样品中的IgM结合。所附实例还证明，在许多具有升高的Rf水平的天然样品中，与用新单克隆抗体(克隆3.2.52)检测到的水平相比，现有技术抗体21F12显示出异常低的结果。这证明本文提供的新抗体可以通过避免在具有升高的Rf水平的大部分天然血清/血浆样品中Aβ42的结果异常低来提高血液样品中Aβ42测量的准确度。
因此，在实施例中，当在免疫测定(例如，夹心免疫测定)中用作Aβ42特异性结合剂时，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段不显示出类风湿因子(Rf)干扰，其中血液样品显示出伴随其他Aβ42特异性结合剂(例如，21F12和/或H31L21)的Rf干扰。样品可以具有300IU/ml或更高(优选不高于1200IU/ml)的Rf活性。Aβ42的预定量在相应免疫测定的测量范围内选择。
Rf干扰优选意指未正确测量具有300IU/ml或更高(优选不高于1200IU/ml)的Rf活性的样品中Aβ42的可检测的预定量，即测量得过高或过低(例如，高于或低于预定量至少20％)。在一个优选的实施例中，Rf干扰意指具有300IU/ml或更高(优选不高于1200IU/ml)的Rf活性的样品中Aβ42的预定量的测量过低(例如，低于预定量20％)。
在实施例中，当在免疫测定(例如，夹心免疫测定)中用作Aβ42特异性结合剂时，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段比用于其他方面相同的免疫测定时的其他先前描述的Aβ42抗体更准确地(例如，比21F12和/或H31L21更准确地)检测血液样品中Aβ42的量，该血液样品显示出伴随其他Aβ42特异性结合剂(例如，21F12和/或H31L21)的Rf干扰并且包含可检测的和预定的Aβ42量。优选地，通过使用本发明的抗体的免疫测定检测到的量与预定量的差异不超过20％，优选不超过15％，并且甚至更优选不超过10％。
在Rf干扰分析中的任一者中使用的免疫测定可以是夹心免疫测定，例如，如所附实例中所述的免疫测定。免疫测定可以使用作为第二结合剂的与氨基酸1至42中的任一者特异性结合(即，Aβ特异性但非Aβ42特异性)并且不与本发明的抗体或抗原结合片段竞争与Aβ42的结合的Aβ特异性结合剂。此类第二结合剂的示例性但非限制性示例是3D6、6E10(BioLegend目录号803004)和1E8(Nanotools目录号0315-100/bA4N-1E8)。在优选的实施例中，第二结合剂是3D6，如下文所定义。
在实施例中，具有Rf活性的样品可以是获自患有类风湿性关节炎的受试者的天然样品。在可替代的实施例中，样品可以是掺有纯化的Rf浓缩物至最终Rf活性相当于300IU/ml或更高(优选不高于1200IU/ml)的样品。
“纯化的Rf浓缩物”涉及从血液样品(例如，血浆和/或血清)池中富集的Rf(包含RfIgM)。用于生产包含Rf IgM的“纯化的Rf浓缩物”的方法是本领域已知的并且在所附实例中进行了描述。在优选的方面，纯化的Rf浓缩物获自已获自类风湿性关节炎患者的血浆池。在实施例中，纯化的Rf浓缩物可以富集IgM型Rf。
在优选的实施例中，Rf浓缩物(含有Rf IgM)可以通过Tatum AH(JImmunolMethods.1993年1月14日；158(1):1-4.doi:10.1016/0022-1759(93)90252-3)描述的方法获得。特别地，Rf浓缩物(含有Rf IgM)可以如以下和/或所附实例中所述获得。简而言之，可以对来自RA患者的血浆(例如，经验证Rf活性高于300IU/ml)进行离心以去除聚集的蛋白质。接下来，可以使用2M乙酸将上清液的pH调节至4.75，并在室温孵育60分钟后，使用2MTris碱重新调节至7.5。离心后，可以使用2.5MCaCl2x2H2O(最终浓度20mM)重新钙化上清液。在室温孵育2小时后，可以将混合物离心，并且可以通过每升血浆添加100mL 3.53％硫化葡聚糖、4.47M CaCl2溶液对上清液进行脱脂。在室温孵育30分钟后，可以将混合物离心并保留上清液。为了富集Rf IgM，可以使用聚乙二醇(PEG)沉淀免疫球蛋白，并经由硫酸铵沉淀进一步纯化以消除残留的PEG。然后可以将最终沉淀溶解在50mM磷酸钾、150mM NaCl缓冲液中。最后，可以使用Roche RF-II测定来确定Rf活性。
由于纯化的Rf浓缩物将用作用于确定Rf干扰的工具，因此可以使用现有技术抗体21F12或H31L21作为Aβ42特异性结合剂来测试纯化的Rf浓缩物以在参考Aβ42免疫测定中显示Rf干扰。参考免疫测定可以是本文和所附实例中描述的另外的免疫测定。特别优选的是使用21F12或H31L21作为捕获剂和3D6作为检测剂的夹心免疫测定。
在实施例中，当用作用于量化血液样品中的Aβ42的夹心免疫测定中的结合剂时，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段检测在没有Rf干扰的样品中的Aβ42的预定量，所述样品具有介于300IU/ml与1200IU/ml之间的Rf活性。样品可以是掺有纯化的Rf浓缩物的样品，以及所述掺入样品。样品可以在使用Aβ42抗体21F12或H31L21代替本发明的单克隆抗体或抗原结合片段的其他方面相同的夹心免疫测定中显示出Rf干扰。免疫测定可以如本文别处所定义。例如，Rf干扰分析中的任一者中使用的免疫测定可以是夹心免疫测定，例如，如所附实例中所述的免疫测定。免疫测定可以使用作为第二结合剂的与氨基酸1至42中的任一者特异性结合(即，Aβ特异性但非Aβ42特异性)并且不与本发明的抗体或抗原结合片段竞争与Aβ42的结合的Aβ特异性结合剂。上面提到了此类第二结合剂的示例性但非限制性的示例。
本文用于评定Rf活性的样品(无论是天然的还是掺有纯化的Rf浓缩物)具有300IU/ml或更高的Rf活性。在实施例中，所述样品的Rf活性为1200IU/ml或更低。因此，在优选的实施例中，样品的Rf活性可以为300IU/ml至1200IU/ml。该Rf活性可能天然存在于样品中，或者可能使用纯化的Rf浓缩物掺入。优选使用Roche RF-II测定(目录号05480167190)检测Rf活性。
在另外或可替代的实施例中，当与具有300IU/ml或更高(优选不高于1200IU/ml)的Rf活性的血液样品一起孵育时，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段不与IgM亚型的一种或多种抗体结合，所述血液样品包含与Aβ42特异性抗体21F12的F(ab’)2区和/或与Aβ42特异性抗体H31L21的F(ab’)2区结合的IgM亚型的抗体。在实施例中，当与具有300IU/ml或更高(优选不高于1200IU/ml)的Rf活性的血液样品一起孵育时，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段不与IgM亚型的一种或多种抗体结合，所述血液样品包含与包含Aβ1-42抗体21F12的可变区的F(ab’)2区和/或与包含Aβ1-42抗体H31L21的可变区的F(ab’)2区结合的IgM亚型的抗体。
在本上下文中，“不结合”意指测量的信号低于取决于所使用的精确测定的某个截止值。使用具有参考抗体的相同的血液样品来确定截止水平，已知所述抗体没有Rf干扰。示例性参考抗体是本发明的F(ab’)2片段，其具有SEQ ID NO:9的重链序列和SEQ ID NO:10的轻链序列。另一优选的参考抗体是TU1(Roche Diagnostics；以物料编号10767778103商业可得)。
如所附实例所证明的，特异性结合Aβ42的本发明的抗体或抗原结合片段的特征在于优异的动力学特性，该动力学特性使得其理想地适合用作用于检测和/或量化样品中的Aβ42的免疫测定中的试剂。
在实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段在37℃以20nM或更低、优选10nM或更低并且最优选7nM或更低的解离平衡常数KD结合Aβ42。KD优选通过表面等离子体共振光谱法(例如，Biacore)确定。
在实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段在37℃以1*104M-1s-1或更高、优选1*105M-1s-1或更高、甚至更优选1*106M-1s-1或更高、甚至更优选3*106M-1s-1或更高并且最优选3.8*106M-1s-1或更高的缔合速率常数ka结合Aβ42。高缔合速率常数ka具有实现抗体或抗原结合片段与Aβ42的快速结合的优点。快速结合又允许缩短免疫测定的处理时间，因为可以保持短孵育时间(例如，通常使用的9分钟)。优选通过表面等离子体共振光谱法(例如，Biacore)确定ka。
在实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段在37℃以10-2s-1或更低、优选2*10-2s-1或更低并且最优选2.5 10-2s-1或更低的解离速率常数kd结合Aβ42。低解离速率常数确保与Aβ42的高复合物稳定性。kd优选通过表面等离子体共振光谱法(例如，Biacore)确定。
在实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段与Aβ42结合的抗体/抗原复合物半衰期t/2diss可以为30秒或更长，优选45秒或更长，并且最优选1分钟或更长。t/2diss优选通过表面等离子体共振光谱法(例如，Biacore)确定。
缔合速率常数ka[M-1s-1]、解离速率常数kd[s-1]、解离平衡常数KD[M]和/或抗体/抗原复合物半衰期t/2diss可以用本领域已知的方法测量。在优选的实施例中，可以采用表面等离子体共振光谱法(例如，Biacore)。此类方法的非限制性示例公开于所附实例中。
可以校准表面等离子体共振光谱法，使得抗体3.2.52(SEQ ID NO:23的重链序列；和SEQ ID NO:10的轻链序列)显示出以下测量结果：ka＝3.8±0.1*106M-1s-1，kd＝2.53±0.06*10-2s-1，t/2diss<1分钟，MR(摩尔比)＝0.7,KD＝6.7±0.2nM。
在非限制性示例中，缔合速率常数ka[M-1s-1]、解离速率常数kd[s-1]、解离平衡常数KD[M]和/或抗体/抗原复合物半衰期t/2diss的测量可以使用BIAcoreTM8K+仪器进行。范围为1.2nM至900nM的Aβ42浓度系列可以以30μL/min进样。在37℃，缔合阶段可以监测3分钟，解离阶段可以监测介于5分钟与10分钟之间。可以使用PBS-DT+，pH7.4(10mM磷酸盐缓冲液，2.7mM KCl，137mM NaCl，5％DMSO、0.05％Tween 20)作为运行缓冲液进行测量。动力学速率常数和解离平衡常数KD可以根据Scrubber版本2.0.c使用Langmuir 1:1拟合模型来计算。抗体/抗原复合物半衰期根据公式t/2diss＝ln(2)/(kd*60)以分钟计来计算。
用于确定缔合速率常数ka[M-1s-1]、解离速率常数kd[s-1]、解离平衡常数KD[M]和/或抗体/抗原复合物半衰期t/2diss的测量可以使用Aβ42或模拟Aβ42的肽进行。Aβ42模拟肽可以包含Aβ42的氨基酸1至12和35至42，其中氨基酸42形成C末端(例如，与接头融合的Aβ42的氨基酸1至12和35至42)。示例性但非限制性的Aβ42模拟肽为Aβ(1-12)-O2Oc-O2Oc-Lys(Bi)-O2Oc-O2Oc-Aβ(35-42)(也称为所附实例中的Aβ42肽的氨基酸1至12和35至42(由接头连接))。
在实施例中，本文提供的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域(VH)，其包含(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，以及(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，并且其中轻链可变结构域(VL)包含(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，以及(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体。
在实施例中，本文提供的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域(VH)，其包含(a)CDR-H1，其由SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体组成，(b)CDR-H2，其由SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体组成，以及(c)CDR-H3，其由SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体组成，并且其中轻链可变结构域(VL)包含(d)CDR-L1，其由SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体组成，(e)CDR-L2，其由SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体组成，以及(f)CDR-L3，其由SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体组成。
在实施例中，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3中的一个氨基酸取代是保守氨基酸交换。
因此，在实施例中，本文提供的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域(VH)，其包含(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其具有一个保守氨基酸取代的变体，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其具有一个保守氨基酸取代的变体，以及(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其具有一个保守氨基酸取代的变体，并且其中轻链可变结构域(VL)包含(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其具有一个保守氨基酸取代的变体，(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其具有一个保守氨基酸取代的变体，以及(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其具有一个保守氨基酸取代的变体。
在具体实施例中，本文提供的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域(VH)，其包含(a)CDR-H1，其由SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其具有一个保守氨基酸取代的变体组成，(b)CDR-H2，其由SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其具有一个保守氨基酸取代的变体组成，以及(c)CDR-H3，其由SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其具有一个保守氨基酸取代的变体组成，并且其中轻链可变结构域(VL)包含(d)CDR-L1，其由SEQ IDNO:6的氨基酸序列或其具有一个保守氨基酸取代的变体组成，(e)CDR-L2，其由SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其具有一个保守氨基酸取代的变体组成，以及(f)CDR-L3，其由SEQ IDNO:8的氨基酸序列或其具有一个保守氨基酸取代的变体组成。
在实施例中，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3中的一个氨基酸取代是高度保守的氨基酸交换。
因此，在实施例中，本文提供的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域(VH)，其包含(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其具有一个高度保守氨基酸取代的变体，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其具有一个高度保守氨基酸取代的变体，以及(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其具有一个高度保守氨基酸取代的变体，并且其中轻链可变结构域(VL)包含(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其具有一个高度保守氨基酸取代的变体，(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其具有一个高度保守氨基酸取代的变体，以及(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其具有一个高度保守氨基酸取代的变体。
在具体实施例中，本文提供的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域(VH)，其包含(a)CDR-H1，其由SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其具有一个高度保守氨基酸取代的变体组成，(b)CDR-H2，其由SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其具有一个高度保守氨基酸取代的变体组成，以及(c)CDR-H3，其由SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其具有一个高度保守氨基酸取代的变体组成，并且其中轻链可变结构域(VL)包含(d)CDR-L1，其由SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其具有一个高度保守氨基酸取代的变体组成，(e)CDR-L2，其由SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其具有一个高度保守氨基酸取代的变体组成，以及(f)CDR-L3，其由SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其具有一个高度保守氨基酸取代的变体组成。
如所附实例中所解释的，有强有力的证据表明用现有技术抗体21F12观察到的Rf干扰是由其VH和VL结构域引起的，更具体地可能是由其CDR残基引起的。21F12和3.2.52(本发明的示例性抗体)的VH和VL区在框架区中仅显示出最小的差异，如从图7和8所示的序列比对中明显看出的。3.2.52和21F12的VH框架区(即Kabat定义的CDR的外部)中的序列差异仅在对应于SEQ ID NO:1的位置12、19、20、23、24、29、37、72、77、79、82、95、97、113、114和118的氨基酸中发现。根据Kabat命名法，这些位置对应于位置12、19、20、23、24、29、37、71、76、78、81、91、93、108、109和113。3.2.52和21F12的VL框架区(即Kabat定义的CDR的外部)中的序列差异仅在对应于SEQ ID NO:2的位置10、12、14、15、17、18、19、41、42、44、51、74、92、105、110、111和112的氨基酸中发现。根据Kabat命名法，这些位置对应于位置10、12、14、15、17、18、19、36、37、39、46、69、87、100、105、106和107。
因此，在实施例中，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段的VH包含如上文实施例中任一者中定义的CDR，并且进一步包含在SEQ ID NO:1的位置12、19、20、23、24、29、37、72、77、79、82、95、97、113、114和118处(在与其相对应的位置处)的氨基酸。
在实施例中，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段的VH包含如上文实施例中任一者中定义的CDR，并且进一步包含在SEQ ID NO:1的位置12、19、20、23、24、29、37、72、77、79、82、95、97、113、114和118处(分别在根据Kabat命名法的位置12、19、20、23、24、29、37、71、76、78、81、91、93、108、109和113处)的氨基酸。
在实施例中，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段的VH包含如上文实施例中任一者中定义的CDR，并且进一步包含SEQ ID NO:1的对应于根据Kabat命名法的位置12、19、20、23、24、29、37、71、76、78、81、91、93、108、109和113的氨基酸。
在实施例中，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段的VL包含如上文实施例中任一者中定义的CDR，并且进一步包含在SEQ ID NO:2的位置10、12、14、15、17、18、19、41、42、44、51、74、92、105、110、111和112处(在与其相对应的位置处)的氨基酸。
在实施例中，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段的VL包含如上文实施例中任一者中定义的CDR，并且进一步包含在SEQ ID NO:2的位置10、12、14、15、17、18、19、41、42、44、51、74、92、105、110、111和112处(分别在根据Kabat命名法的位置10、12、14、15、17、18、19、36、37、39、46、69、87、100、105、106和107处)的氨基酸。
在实施例中，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段的VL包含如上文实施例中任一者中定义的CDR，并且进一步包含SEQ ID NO:2的对应于根据Kabat命名法的位置10、12、14、15、17、18、19、36、37、39、46、69、87、100、105、106和107的氨基酸。。
在实施例中，第一方面的单克隆抗体或抗原结合片段包含：
(i)重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的氨基酸序列；以及
(ii)轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的氨基酸序列。
在具体实施例中，第一方面的单克隆抗体或抗原结合片段包含：
(i)重链可变结构域(VH)，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的氨基酸序列组成；以及
(ii)轻链可变结构域(VL)，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的氨基酸序列组成。
在实施例中，第一方面的单克隆抗体或抗原结合片段包含：重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；和轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在具体实施例中，第一方面的单克隆抗体或抗原结合片段包含：重链可变结构域(VH)，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成；和轻链可变结构域(VL)，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
在实施例中，本文提供的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或抗原结合片段包含：重链可变结构域(VH)，其包含：(a)CDR-H1，其包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中，(b)CDR-H2，其包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中，以及(c)CDR-H3，其包含在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中；并且其中轻链可变结构域(VL)包含：(d)CDR-L1，其包含在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中，(e)CDR-L2，其包含在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中，以及(f)包含在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中。在本上下文中，原则上可以采用本领域已知的和/或本文别处描述的任何CDR定义方法。在优选的实施例中，CDR根据Kabat命名法定义。
抗体重链和轻链二者的可变区/结构域/序列包含决定抗体特异性的CDR，以及更通用的框架区。
轻链可变结构域/序列由框架区(FW)和CDR组成，如式I所示：FW(LC)1–CDR(LC)1–FW(LC)2–CDR(LC)2–FW(LC)3–CDR(LC)3–FW(LC)4(式I)。
重链可变结构域/序列由FW和CDR组成，如式II所示：FW(HC)1–CDR(HC)1–FW(HC)2–CDR(HC)2–FW(HC)3–CDR(HC)3–FW(HC)4(式II)。
式I所示的一级结构代表本发明抗体的轻链可变结构域的组分从N端到C端的顺序。式II所示的一级结构代表本发明抗体的重链可变结构域的组分从N端到C端的顺序。在每种情况下，框架区(FW)1代表各自可变链结构域的最N端部分，而FW 4代表各自可变链结构域的最C端部分。
一旦在本公开中给出了全长可变链序列和其中包含的CDR序列，技术人员就可以完美地推断出每个FW区的序列。
如本领域技术人员将理解的，框架区一定程度的序列变异不会影响本文所述的抗体功能和特征。
在实施例中，根据本发明的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的VH可以包含：
(i)包含在SEQ ID NO:1中的FW(HC)1或其与包含在SEQ ID NO:1中的FW(HC)1具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的变体；
(ii)包含在SEQ ID NO:1中的FW(HC)2或其与包含在SEQ ID NO:1中的FW(HC)2具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的变体；
(iii)包含在SEQ ID NO:1中的FW(HC)3或其与包含在SEQ ID NO:1中的FW(HC)3具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的变体；以及
(iv)包含在SEQ ID NO:1中的FW(HC)4或其与包含在SEQ ID NO:1中的FW(HC)4具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的变体。
在实施例中，根据本发明的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的VL可以包含：
(i)包含在SEQ ID NO:2中的FW(LC)1或其与包含在SEQ ID NO:2中的FW(LC)1具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的变体；
(ii)包含在SEQ ID NO:2中的FW(LC)2或其与包含在SEQ ID NO:2中的FW(LC)2具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的变体；
(iii)包含在SEQ ID NO:2中的FW(LC)3或其与包含在SEQ ID NO:2中的FW(LC)3具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的变体；以及
(iv)包含在SEQ ID NO:2中的FW(LC)4或其与包含在SEQ ID NO:2中的FW(LC)4具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的变体。
在实施例中，根据本发明的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的VH可以包含：
(i)SEQ ID NO:11的FW(HC)1或其与其具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的变体；
(ii)包含在SEQ ID NO:12中的FW(HC)2或其与其具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的变体；
(iii)包含在SEQ ID NO:13中的FW(HC)3或其与其具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的变体；以及
(iv)包含在SEQ ID NO:14中的FW(HC)4或其与其具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的变体。
在实施例中，根据本发明的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的VL可以包含：
(i)包含在SEQ ID NO:15中的FW(LC)1或其与其具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的变体；
(ii)包含在SEQ ID NO:16中的FW(LC)2或其与其具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的变体；
(iii)包含在SEQ ID NO:17中的FW(LC)3或其与其具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的变体；以及
(iv)包含在SEQ ID NO:18中的FW(LC)4或其与其具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的变体。
与各自具体列举的氨基酸序列相比在框架区的上述变化程度可能是由于氨基酸的取代、插入、添加和/或缺失。FW的变体限于此类变体：仍然有功能，即特异性结合Aβ42，确实显示出减少的或没有如现有技术抗体所观察到的Rf干扰，并且当用于免疫测定时显示出与如本文所述的抗体3.2.52至少相同的临床性能。
在实施例中，框架区的氨基酸序列的变化是由于氨基酸的取代。取代可以是保守氨基酸取代(或高度保守氨基酸取代)或非保守氨基酸取代。
在实施例中，与各自具体列举的氨基酸序列相比，框架区中取代中的每一者可以是保守取代。在具体实施例中，框架区中相对于所示序列的取代中的每一者可以是高度保守取代。
在实施例中，第一方面的单克隆抗体或抗原结合片段包含：
(i)重链，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的氨基酸序列；以及
(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的氨基酸序列。
在具体实施例中，第一方面的单克隆抗体或抗原结合片段包含：
(i)重链，其由SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的氨基酸序列组成；以及
(ii)轻链，其由SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的氨基酸序列组成。
在实施例中，第一方面的单克隆抗体或抗原结合片段包含：重链，其包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列，和轻链，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在具体实施例中，第一方面的单克隆抗体或抗原结合片段包含：重链，其由SEQ IDNO:9的氨基酸序列组成，和轻链，其由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成。
在实施例中，单克隆抗体或抗原结合片段是F(ab’)2片段。
本领域技术人员可以使用本领域已知的亲和力成熟方法生成对Aβ42具有相似或改善的亲和力的抗体或抗原结合片段。因此，本文还提供了通过亲和力成熟获得的本文定义的与Aβ42特异性结合的抗体或抗原结合片段中的任一者的变体。“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个互补决定区(CDR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变引起抗体对抗原的亲和力的改善。在实施例中，亲和力成熟的抗体的每个CDR具有至多一个氨基酸取代、插入和/或缺失。
通过构建并自二级文库重新选择而实现的亲和力成熟已被例如Hoogenboom等人在Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中进行描述。在亲和力成熟的某些方面，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任何一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建一个二级文库。随后对该文库进行筛选以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。鉴定抗体变体的筛选方法的示例是噬菌体展示技术或核糖体展示技术。
本发明的单克隆抗体或抗原结合片段可以是小鼠抗体。单克隆抗体或抗原片段可以属于任何IgG亚类。本发明的小鼠单克隆抗体或抗原结合片段可以属于IgG1、IgG2a/c、IgG2b或IgG3亚类。在实施例中，本发明的小鼠单克隆抗体或抗原结合片段可以属于IgG2b亚类。在实施例中，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段可以包含小鼠亚类IgG2b的序列。
在实施例中，根据第一方面的单克隆抗体或抗原结合片段用于在用于(例如，体外)检测或量化样品中的Aβ42的测定中使用。
在实施例中，单克隆抗体或抗原结合片段可以具有与其附接的标记。标记可以是检测标记。标记可以是捕获标记。
具有与其附接的捕获标记的单克隆抗体或抗原结合片段可以用作捕获剂，例如，在异相免疫测定(例如，夹心免疫测定)中的捕获剂。
具有与其附接的检测标记的单克隆抗体或抗原结合片段可以用作检测剂，例如，在异相免疫测定(例如，夹心免疫测定)中的检测剂。
检测标记原则上包括任何非天然形成抗体部分的功能部分，从而允许检测抗体或其抗原结合片段。组和个体检测标记的非限制性示例在下文中公开。
捕获标记是介导或允许抗体或抗原片段与固体表面(诸如微珠，例如，磁性微珠)结合的标记。在实施例中，捕获标记可以是结合对的成员，其可以与结合对的另一成员(所述其他成员例如涂覆在固体表面上)相互作用。结合对的非限制性示例是生物素-链霉亲和素、能够彼此形成双链体的一对杂交寡核苷酸或多核苷酸或其类似物、生物素-(链霉)亲和素、抗体-半抗原、抗体-抗原、酶-底物、[甘露糖、麦芽糖、直链淀粉]-[各自的糖结合蛋白]、[寡糖或多糖]-凝集素、细胞因子-[各自的受体]或配体-[各自的配体结合结构域]、[Zn2+、Ni2+、Co2+或Cu2+金属螯合物]-[组氨酸标签]、[铟螯合物]-[CHA255抗体]、[葫芦[n]脲宿主残基]-[客体残基]、[第一蛋白质二聚化结构域]-[第二蛋白质二聚化结构域]。
在一个实施例中，本发明的单克隆Aβ42特异性抗体是分离的单克隆抗体。“分离的”抗体或其抗原结合片段是已经鉴定并且自其自然环境的组分中分离和/或回收的抗体或其抗原结合片段。其自然环境的污染物组分是会干扰特异性结合剂(例如，抗体)的研究、诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施例中，将特异性结合剂纯化至(1)大于90重量％(例如通过Lowry方法确定)，并且在一些实施例中，大于95重量％；(2)足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度(例如通过使用旋转杯测序仪)，或(3)均质(在还原或非还原条件下进行SDS-PAGE，使用例如考马斯蓝或银染)。通常，分离的特异性结合剂(例如，分离的抗体)将通过至少一个纯化步骤来制备，例如使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术。
在第二方面，本发明还提供了编码如上文所定义的本发明的单克隆抗体或其任何抗原结合片段的核酸分子或核酸分子集(例如，第一和第二)。特别地，提供了一种多核苷酸，其编码如上文所定义的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体的重链和/或轻链或者重链可变结构域和/或轻链可变结构域。在一些实施例中，多核苷酸可以包含进一步的序列，以确保不仅表达重链和/或轻链可变结构域，而且表达剩余的重链和/或轻链恒定区，使得表达包含本发明的重链和轻链可变结构域的全长IgG抗体。因此，对于涉及如本文所述的特异性结合Aβ42的单克隆抗体或抗原结合片段的实施例中的每一者，提供了编码各自的抗体或抗原结合片段的相应多核苷酸或多核苷酸集。
单克隆抗体或其抗原结合片段的重链和轻链或者重链可变区和轻链区可以在单个核酸上或在第一和第二多核苷酸集(编码重链或重链可变区的第一多核苷酸，编码轻链或轻链可变区的第二多核苷酸)上编码。
本发明的核酸分子可以例如通过标准化学合成方法和/或重组方法合成，或以半合成的方式产生，例如通过将化学合成方法和重组方法组合。编码序列与转录调控元件和/或其他氨基酸编码序列的连接可以使用已建立的方法(例如限制性消化、连接和分子克隆)来执行。
在第三方面，本文提供了一种包含第二方面的多核苷酸或多核苷酸集的载体。特别地，提供了载体，其包含编码本发明的抗体或抗体抗原结合片段的核酸分子。如本文中所用的，术语“载体”涉及可以在已导入其的宿主细胞中自主复制的环状或线性核酸分子。适于用于本发明的载体的非限制性实例包括黏粒、质粒(例如，裸质粒或包含在脂质体中)、病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)和噬菌体。然而，本领域提供了许多合适的载体，其选择取决于所需的功能。合适载体的开发和使用在本领域有据可查；参见，例如，在Sambrook和Russel“Molecular Cloning,A Laboratory Manual”,Cold SpringHarbor Laboratory,N.Y.(2001)以及Ausubel,“Current Protocols in MolecularBiology”,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989),(1994)中描述的技术。与本发明关联使用的载体包含核酸序列，该核酸序列编码如本文所公开的全长抗aβ42抗体或其抗原结合片段。因此，对于涉及如本文所述的特异性结合Aβ42的单克隆抗体或抗原结合片段的实施例中的每一者，提供了一种包含编码各自的抗体或抗原结合片段的相应多核苷酸的载体。
关于如本文中所用的术语“包含……的载体”，本领域中可以理解，在载体中存在进一步的核酸序列，这些核酸序列对于宿主细胞中所需的载体活性是必需和/或充分的，例如驱动载体的复制(以及由此编码核酸序列)并且/或者用于引导宿主细胞表达本发明的抗体或抗原结合片段。此类进一步的核酸序列包括但不限于控制载体复制和/或特定细胞系统中所需序列表达的序列。例如，载体可以包含编码本发明的抗体或抗体抗原结合片段的核酸分子，该核酸分子可操作地连接调控序列和/或在调节序列的控制下。术语“调节序列”是指对于实现与其可操作地连接的编码序列的表达是必需的DNA序列。术语“控制序列”旨在至少包括表达可能同样必需的所有组分，并且可以进一步包括其他有利的组分，例如，用于允许复制。如本领域所理解的，此类调节和控制序列的性质因宿主生物体而异。例如，在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，控制序列通常包括启动子、终止子，并且在一些情况下包括增强子、反式激活子和/或转录因子。
在本发明中使用的载体优选为表达载体。表达载体能够指导本发明的核酸分子在宿主细胞中的复制和表达，并因此提供例如如本文所公开的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体的重链和/或轻链可变结构域或者重链和/或轻链的表达。在一些实施例中，载体可以包含进一步的序列，以确保不仅表达重链和轻链可变结构域，而且表达剩余的重链和轻链恒定区，使得表达出包含本发明的重链和轻链可变结构域的全长IgG抗体或抗体片段诸如F(ab)2片段。合适的表达载体已经在文献中广泛描述，并且本领域技术人员可以使用常规方法容易地确定适用于特定细胞系统的表达载体。优选地，本文公开的载体包含重组多核苷酸(即，编码根据本发明的单克隆抗体的核酸序列)以及可操作地连接的表达控制序列。如本文提供的载体优选进一步包含启动子。本文所述的载体还可以包括选择标记基因和复制起点，从而确保在宿主中复制；而且，本文提供的载体还可以包括用于转录的终止信号。本领域已知的表达载体可以驱动宿主细胞中的瞬时或组成型表达。
载体的非限制实例包括pQE-12、pUC-系列、pBluescript(Stratagene)、pET-系列表达载体(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)、lambda gt11、pJOE、pBBR1-MCS系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT、E-027pCAG Kosak-Cherry(L45a)载体系统、pREP(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pcDNA3.1、pSPORT1(GIBCO BRL)、pGEMHE(Promega)、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10(Edge Biosystems)pTriEx-Hygro(Novagen)和pCINeo(Promega)。适用于毕赤酵母的质粒载体的非限制性实例包括例如质粒pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K(均来自Invitrogen)。另一种适用于在非洲爪蟾胚胎、斑马鱼胚胎以及多种哺乳动物和鸟类细胞中表达蛋白质的载体是多用途表达载体pCS2+。
通常，载体可以含有一个或多个复制起点(ori)和用于克隆或表达的遗传系统、一个或多个用于在宿主中的选择的标志物(例如抗生素抗性)，以及一个或多个表达盒。此外，载体中包含的编码序列可以使用已建立的方法与转录调控元件和/或其他氨基酸编码序列连接。此类调控序列是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于确保转录起始的调控序列、内部核糖体进入位点(IRES)(Owens,G.C.等人[2001]Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:1471-1476)以及确保转录终止和转录物稳定的任选调控元件。此类确保转录起始的调控元件的非限制性实例包括启动子、翻译起始密码子、增强子、绝缘子和/或确保转录终止的调控元件，它们将被包含在本发明的核酸分子的下游。进一步的实例包括Kozak序列和侧翼为用于RNA剪接的供体和受体位点的插入序列、编码分泌信号的核苷酸序列，或根据所使用的表达系统，能够将表达的蛋白质引导至细胞区室或培养基的信号序列。载体还可以含有编码一种或多种分子伴侣的另外的可表达多核苷酸，以促进正确的蛋白质折叠。
合适的复制起点的其他实例包括例如全长ColE1、截短的ColEI、SV40病毒和M13复制起点，而合适的启动子的其他实例包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40-启动子、RSV-启动子(Rous肉瘤病毒)、lacZ启动子、四环素启动子/操作子(tetp/o)、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG-启动子(鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒立即早期增强子的组合)、gai10启动子、人延伸因子1α-启动子、AOX1启动子、GAL1启动子、CaM-激酶启动子、lac、trp或tac启动子、T7或T5启动子、lacUV5启动子、苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV)多面体启动子，或哺乳动物和其他动物细胞中的球蛋白内含子。增强子的一个实例是例如SV40增强子。确保转录终止的调控元件的其他非限制性实例包括SV40-poly-A位点、tk-poly-A位点、rho非依赖性lpp终止子或AcMNPV多面体多腺苷酸化信号。可选择的标记物的进一步非限制性示例包括dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Reiss,Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)13(1994),143-149)；npt，其赋予对氨基糖苷类新霉素、卡那霉素和巴龙霉素的抗性(Herrera-Estrella,EMBO J.2(1983),987-995)；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Marsh,Gene 32(1984),481-485)。已描述了其他可选择基因，即trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸的；hisD，其允许细胞利用组氨醇(histinol)代替组氨酸的(Hartman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988),8047)；甘露糖-6-磷酸异构酶，其允许细胞利用甘露糖(WO 94/20627)和ODC(鸟氨酸脱羧酶)，赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸DFMO的抗性(McConlogue,1987,In:Current Communications in MolecularBiology,Cold Spring Harbor Laboratory ed.)；或者来自土曲霉的脱氨酶，其赋予对杀稻瘟菌素S的抗性(Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59(1995),2336-2338)。
在进一步的实施例中，载体是含有表达盒的真核表达质粒，该表达盒由包含内含子A的5'CMV启动子和3'BGH多腺苷酸化序列组成。除了表达盒之外，质粒还含有源于pUC18的复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，以用于在大肠杆菌中进行质粒扩增。为了分泌抗体，可以在抗体基因的5'侧克隆真核前导序列。
本发明的核酸分子和/或载体可以设计用于通过本领域已知的或本文描述的任何手段转染到原核或真核宿主细胞中。合适的方法的非限制性实例包括基于化学的方法(聚乙烯亚胺、磷酸钙、脂质体、DEAE-葡聚糖、核转染)、非化学方法(电穿孔、声穿孔、光转染、基因电转移、流体动力学递送或在使细胞与本发明的核酸分子接触后自然出现的转化)、基于颗粒的方法(基因枪、磁转染、穿刺感染)、基于噬菌体载体的方法和病毒方法。例如，衍生自病毒(例如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、Semliki森林病毒或牛乳头状瘤病毒)的表达载体可用于将核酸分子转染至目标细胞群中。此外，杆状病毒系统也可在针对本发明核酸分子的真核表达系统中用作载体。
因此，在第四方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含根据本发明的多核苷酸或根据本发明的载体。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。
术语“原核生物”意在包括可以用DNA或DNA或RNA分子转化、转导或转染以表达本发明的蛋白质的所有细菌。原核宿主可以包括革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，例如大肠杆菌、鼠伤寒沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌、棒状杆菌属(谷氨酸棒状杆菌)、假单胞菌属(荧光假单胞菌)、乳杆菌属、链霉菌属、沙门氏菌属和枯草杆菌。
术语“真核的”是指包括酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。本领域中常用的哺乳动物宿主细胞的非限制性示例包括Hela、HEK293、H9、Per.C6和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3、NS/0、SP2/0和C127细胞、COS细胞(例如COS1或COS 7)、CV1、鹌鹑QC1-3细胞、小鼠L细胞、小鼠肉瘤细胞、Bowes黑色素瘤细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。根据本发明的示例性哺乳动物宿主细胞是CHO细胞。其他合适的真核宿主细胞包括但不限于鸡细胞，例如DT40细胞，或酵母，例如酿酒酵母、毕赤酵母、粟酒裂殖酵母和乳酸克鲁维酵母。适合用于表达的昆虫细胞是例如果蝇S2、果蝇Kc、灰翅夜蛾Sf9和Sf21或粉纹夜蛾Hi5细胞。合适的斑马鱼细胞系包括但不限于ZFL、SJD或ZF4。
所描述的载体可以整合到宿主的基因组中，也可以在染色体外维持。一旦将载体掺入合适的宿主中，就将宿主维持在适合于核酸分子高水平表达的条件下，并且根据需要，可以随后收集和纯化本发明的抗体。上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域已知的。
在一个实施例中，所述宿主是哺乳动物细胞，例如人类细胞或人类细胞系。在进一步的实施例中，用本发明的载体转化的宿主细胞是HEK293或CHO。在又一个实施例中，用本发明的载体转化的宿主细胞是CHO。这些宿主细胞以及合适的培养基和细胞培养条件已在本领域中描述，参见例如Baldi L.等人,Biotechnol Prog.2005年1月至2月；21(1):148-53，Girard P.等人,Cytotechnology 2002年1月；38(1-3):15-21，以及Stettler M.等人,Biotechnol.Prog.2007年11月至12月；23(6):1340-6。
在优选的实施例中，宿主细胞为真核细胞。在特别的实施例中，细胞为HEK细胞。在另一特别的实施例中，宿主细胞为CHO细胞。
根据本发明的宿主细胞包含编码如上文定义的轻链可变区和重链可变区两者的一种载体，或者其包含两种单独的载体，其中一种载体携带编码根据本发明的轻链可变区的核酸分子并且第二种载体携带编码根据本发明的匹配的重链可变区的核酸分子。
当编码如本文所公开的本发明抗体的重链和/或轻链的重组表达载体被引入宿主细胞时，抗体或抗体抗原结合片段是通过将宿主细胞培养足以允许抗体或抗原结合片段在宿主细胞中表达或者优选地允许抗体或抗原结合片段分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间产生的。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体和/或抗原结合片段。用于纯化抗体的方法是本领域众所周知的。示例性的纯化方法描述于所附实例中。
因此，本发明还提供了一种用于产生如本文所公开的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或抗原结合片段的方法。该方法包括在合适的条件下培养本发明的宿主细胞和分离产生的抗体。通过纯化步骤(例如如所附实例中所述)，可以衍生本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。本发明进一步提供了一种可通过本文公开的方法中的任一者获得的抗体或抗原结合片段。
转化的宿主细胞可以在生物反应器中生长并根据本领域中已知的技术进行培养以实现最佳细胞生长。本发明的抗体和/或抗体抗原结合片段可以随后从细胞级分或生长培养基分离，该分离通过任何常规方法进行，例如但不限于，亲和色谱(例如使用融合标签，如Strep-标签II或His6标签)、凝胶过滤(尺寸排阻色谱)、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、高压液相色谱(HPLC)、反相HPLC或免疫沉淀。
可以理解的是，上述程序的变化都在本发明的保护范围内。例如，重组DNA技术可用于去除或修饰编码本文公开的抗体和/或抗体抗原结合片段(例如编码如本文上文定义的重链和/或轻链可变结构域)的DNA序列。例如，重组DNA技术可用于去除编码序列中对于维持与靶抗原的特异性和选择性结合不是必需的部分。由此类截短的DNA分子表达的分子也被本发明的抗体所涵盖。另外，还提供了多价抗体或抗原结合片段，其包含本发明的重链和/或轻链可变结构域(例如，形成和特异性且选择性地结合Aβ42的抗体Fv结构域)至少两次(优选四、五、六、七或八次)。此外，提供了多价抗体或抗体片段，其包含本发明的重链和/或轻链或其片段(例如，形成和特异性且选择性地结合Aβ42的抗体Fab或F(ab)2结构域)至少两次(优选四次、五次、六次、七次或八次)。
抗体衍生物可以例如通过添加外源性序列来产生，以修饰免疫原性或减少、增强或修饰结合、亲和力、缔合速率、解离速率、高亲和力、特异性、半衰期或任何其他合适的特性。
在第五方面，本发明提供了一种包含本发明的抗体、本发明的多核苷酸(或多核苷酸集)、本发明的载体或本发明的宿主细胞的组合物。在优选的实施例中，组合物是诊断组合物，即用于诊断应用的组合物。在优选的实施例中，组合物用于在用于检测或量化Aβ42的体外诊断测试中使用。在优选的实施例中，诊断组合物可以是用于免疫测定的试剂，该免疫测定用于检测或量化Aβ42。优选配置诊断组合物使得其允许检测从受试者获得的样品中的Aβ42。样品优选为血液样品(例如，全血、血清或血浆)。在实施例中，样品为血浆或血清。
在实施例中，本发明的组合物是用于体外检测(优选量化)样品(例如，血液样品，诸如血浆或血清)中的Aβ42的组合物，优选使用免疫测定进行该体外检测。在实施例中，免疫测定是异相免疫测定。在实施例中，免疫测定是夹心免疫测定。
在第六方面，本文提供了一种用于确定样品中Aβ42的存在和/或水平的方法。该方法包括：(a)在允许抗体或抗原结合片段与样品中的Aβ42结合的条件下，使根据本发明第一方面的特异性识别Aβ42的抗体或其抗原结合片段与样品接触；以及(b)确定样品中Aβ42的存在或水平。确定Aβ42的存在或水平可以通过检测(a)的抗体或抗原结合片段与样品中包含的Aβ42的结合来实现。
第六方法的方法中使用的样品可以为包含或疑似包含Aβ42的任何样品。在实施例中，样品可以为体液。体液样品的非限制性示例是脑脊液(CSF)和血液(例如，全血、血浆或血清)。在实施例中，样品为血清或血浆。在实施例中，样品为血浆。
已从其获得用于该方法的样品的受试者优选为人类。
在实施例中，根据第六方面的方法包括夹心免疫测定，并且根据第一方面的单克隆抗体或抗原结合片段可以用作一种结合剂(例如，作为捕获剂或检测剂)。作为此类夹心测定中的第二结合剂，可以使用与氨基酸1至42中的任一者特异性结合(即，Aβ特异性但非Aβ42特异性)并且不与本发明第一方面的抗体或抗原结合片段竞争与Aβ42的结合的Aβ特异性结合剂(例如，作为检测或捕获剂)。此类结合剂的示例性但非限制性示例为3D6、6E10(BioLegend目录号803004)和1E8(Nanotools目录号0315-100/bA4N-1E8)。在优选的实施例中，第二结合剂是3D6，如下文所定义。
因此，本发明第六方面的方法可以包括在(a)时、期间或之后使样品与和氨基酸1至42中任一者特异性结合(即，Aβ特异性但非Aβ42特异性)并且不与本发明第一方面的抗体或抗原结合片段竞争与Aβ42的结合的Aβ结合剂(例如，抗体)接触。该方法可以包括在样品中包含的Aβ42、本发明第一方面的抗体或抗原结合片段和Aβ特异性结合剂之间形成夹心复合物/检测复合物。因此，确定样品中Aβ42的存在或水平可以包括检测所述夹心复合物的形成。在实施例中，所形成的夹心复合物可以与游离结合剂例如经由与固相结合(例如，经由与结合剂中的一者附接的捕获标记)来分离。在实施例中，夹心复合物的分离可以包括使夹心复合物与微珠(例如，磁珠)结合以及将这些珠(例如，经由磁力)与剩余组分、特别是游离检测剂和/或检测标记分离。
在实施例中，可以使用检测标记来确定根据本发明第一方面的抗体或抗原结合片段与Aβ42的结合。类别和特异性检测标记的非限制性示例在本文别处公开，并且可经必要修改后应用于该方面。检测标记可以与本发明的抗体或抗原结合片段附接。可替代地，如果使用第二结合剂(例如，Aβ结合剂，诸如抗体，其与氨基酸1至42中的任一者特异性结合(即，Aβ特异性但非Aβ42特异性)并且不与本发明第一方面的抗体或抗原结合片段竞争与Aβ42的结合)，则可以使检测标记与其附接。
本发明第六方面的方法可以包括或者为异相免疫测定。本发明第一方面的抗体或抗原结合片段可以用作捕获剂，即与或可以与固体表面(例如，微珠或磁性微珠)结合的试剂。可替代地，本发明第一方面的抗体或抗原结合片段可以用作检测剂。
在实施例中，该方法包括使用以下两种Aβ42结合剂的异相夹心免疫测定：捕获结合剂和检测结合剂。第一结合剂可以为本发明第一方面的Aβ42特异性抗体或抗原结合片段。第一结合剂可以为捕获剂或检测剂。在实施例中，第一结合剂为捕获剂。
根据本发明第六方面的方法中使用的样品可以为先前从受试者获得的样品(例如，血液样品，诸如血浆或血清)，即该方法可以为体外方法。样品可以从怀疑患有或发展淀粉样蛋白阳性和/或与其相关联的病理病症(例如，阿尔茨海默病)的受试者获得。在实施例中，受试者可能患有神经系统症状和/或具有发展为阿尔茨海默病的遗传倾向(例如，可以为ApoE4携带者)。在实施例中，从其获得样品的受试者可以为认知正常的或可以显示出轻度认知症状。
在第七方面，本发明提供了本文所提供的特异性结合Aβ42的抗体或抗原结合片段用于检测或量化样品(例如，血液样品，诸如血清或血浆)中的Aβ42的用途。
本文别处所公开的内容，尤其是用于确定样品中Aβ42的存在和/或水平的方法的实施例，经必要修正后应用。
在第八方面，本文提供了一种用于帮助检测受试者的淀粉样蛋白阳性的方法。换句话说，该方法可以为用于诊断受试者的淀粉样蛋白阳性的方法。该方法可以包括a)使用本发明的抗体或抗原片段确定样品中的Aβ42水平，以及b)将经确定的Aβ42水平与预定的Aβ42的参考水平进行比较，其中Aβ42水平相对于参考水平的改变(例如，降低)指示淀粉样蛋白阳性。可替代地或另外地，所述方法可以为一种帮助检测受试者是否患有淀粉样蛋白阳性痴呆(例如，阿尔茨海默病)或处于发展淀粉样蛋白阳性痴呆(例如，阿尔茨海默病)的风险中的方法。在这些实施例中，Aβ42水平相对于参考水平的降低指示淀粉样蛋白阳性痴呆或发展淀粉样蛋白阳性痴呆的风险增加。
本文别处公开的关于用于确定Aβ42的存在和/或水平的方法的实施例经必要修改后应用于根据第八方面的方法。
在特别优选的实施例中，样品为血液样品，例如，血清或血浆。
本发明的一个目的是提供一种用于将个体可靠地鉴定为患有淀粉样蛋白阳性痴呆(优选在早期阶段)或处于发展淀粉样蛋白阳性痴呆的风险中的方法。因此，个体可能已经显示出痴呆的体征和症状，并且可以使用该方法来将当前的痴呆鉴定为淀粉样蛋白阳性或淀粉样蛋白阴性。可替代地，个体可能尚未显示出痴呆的体征和症状。在这种情况下，该方法可用于将个体鉴定为处于发展淀粉样蛋白阳性痴呆的风险中。
使用本发明的抗体或抗原片段确定样品中的Aβ42水平可以包括使根据本发明的抗体或抗原结合片段与已由受试者获得的样品在一定条件下接触并持续一定时间，该条件和时间允许抗体或抗原结合片段与Aβ42的结合；以及通过检测本发明的抗体或抗原结合片段与Aβ42的结合来确定样品中Aβ42的水平。
该方法可以进一步包括基于经确定的Aβ42水平与参考水平的比较来评定受试者是否为淀粉样蛋白阳性、患有淀粉样蛋白阳性痴呆或发展淀粉样蛋白阳性痴呆的风险增加，和/或将被选择用于随后的基于CSF的生物标记物分析或PET诊断。
在实施例中，参考水平可以为在包含淀粉样蛋白阳性和阴性个体的参考队列中确定的水平，例如，如由CSF生物标记物(例如，CSF pTau181/Aβ42比率，例如，使用0.024的截止值)或PET扫描分析所确定的。参考队列可以具有至少50个、优选至少100个或至少500个成员。
在实施例中，参考水平可以为在同一受试者的较早样品中检测到的水平，例如，基线Aβ42水平。
在实施例中，该方法可以包括a)使用本发明的抗体或抗原片段确定样品中的Aβ42水平，b)确定样品中的Aβ40水平；c)由Aβ42水平和Aβ40水平确定组合值(例如，比率，诸如Aβ42/Aβ40比率)，以及d)将组合值与预定的参考组合值进行比较，其中改变的组合值指示淀粉样蛋白阳性。技术人员将理解，可以以不同方式生成组合值，使得根据配置，与参考组合值相比增加或减少的组合值指示淀粉样蛋白阳性。如果使用Aβ42/Aβ40比率，则组合值降低指示淀粉样蛋白阳性。
因此，本文提供了一种用于帮助检测受试者的淀粉样蛋白阳性的方法，所述方法包括：a)使用本发明的与Aβ42特异性结合的抗体或抗原片段确定样品中的Aβ42水平，b)确定样品中的Aβ40水平；c)由Aβ42水平和Aβ40水平确定Aβ42/Aβ40比率(即，经确定的Aβ42水平与经确定的Aβ40水平之间的比率)，以及d)将组合值与预定的参考组合值进行比较，其中改变的组合值(优选降低)指示淀粉样蛋白阳性。
如所附实例中所证明的，确定Aβ42/Aβ40比率(包括利用使用本发明的Aβ42抗体的免疫测定来量化Aβ42)显著改善了鉴定淀粉样蛋白阳性的临床性能。
在实施例中，参考组合值可以为在包含淀粉样蛋白阳性和阴性个体的参考队列中确定的组合值，例如，如由CSF生物标记物(例如，CSF pTau181/Aβ42比率，例如，使用0.024的截止值)或PET扫描分析所确定的。参考队列可以具有至少50个、优选至少100个或至少500个成员。在实施例中，参考队列可以为实例4中采用的队列。
在实施例中，参考组合值可以为在同一受试者的较早样品中检测到的组合值，例如，基线综合值。
存在多种用于测量Aβ40水平的方法。用于Aβ40的测定特异性测量Aβ40，但不特异性测量例如Aβ42或Aβ43。Aβ40的测量通常基于针对1-40Aβ序列COOH末端的特异性结合。用于测量Aβ40的商业可得产品包括淀粉样蛋白β40人ELISA试剂盒(Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA)、SimoaTMAβ40免疫测定(Quanterix Corporation,Lexington,MA,USA)和淀粉样蛋白β1-40测定试剂盒(Cisbo Assays,Codolet,France)。优选地，根据制造商的说明和实例中的详述，使用ECL技术在测量池中测量Aβ40。
在本发明的上下文中，“组合值”或也称为组合分数是指通过组合从相同样品获得的Aβ42水平和第二生物标记物(例如，Aβ40水平)的数学程序获得的值。根据数学运算，优选地根据使用各自的生物标记物的量/浓度的算术运算来计算组合值。运算的结果是值，即组合值。然后可以将组合值与已使用相同的数学过程获得的对照的组合值进行比较。在本发明中，通常使用所有标记物的量或浓度(优选浓度)以获得个体和对照的组合值。优选地，通过将针对标记物的浓度获得的值相加来获得组合值。在另一优选实施例中，可通过样品中的标记物分子的量或浓度的加权计算来获得组合值。这意味着标记物在数学过程中被赋予不同的权重。
例如，可以用二元结果“淀粉样蛋白阳性”和“淀粉样蛋白阴性”作为因变量以及使用生物标记物水平的组合作为自变量来进行逻辑回归分析。分类准确度可以通过ROC(接受者操作特征)曲线下的面积(AUC)来评定，并且可以计算灵敏度和特异性(见下文)。
在实施例中，使用确定Aβ42/Aβ40比率(或反之亦然)的方法来确定参考群体的样品中淀粉样蛋白阳性的准确度高于分别使用Aβ42抗体21F12和/或H31L21的相同方法的准确度。准确度优选地通过ROC分析来确定，并且用于检测参考群体(具有已知的淀粉样蛋白状态)的样品中的淀粉样蛋白阳性的AUC(曲线下面积)用作准确度的量度。在实施例中，使用本发明的Aβ42测定来检测参考群体的样品中淀粉样蛋白阳性的Aβ42/Aβ40比率的AUC可以为至少0.8，优选至少0.85并且最优选至少0.86。
在实施例中，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段可以为与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中当抗体用于针对血液样品(例如，血清或血浆样品)中的Aβ42的夹心免疫测定时，使用Aβ42/Aβ40比率(或反之亦然)来确定参考群体的样品中淀粉样蛋白阳性的准确度至少与使用分别具有SEQ ID NO:9的重链和SEQ ID NO:10的轻链的本发明抗体的相同夹心免疫测定一样好。准确度优选地通过ROC分析来确定，并且用于检测参考群体(具有已知的淀粉样蛋白状态)的样品中的淀粉样蛋白阳性的AUC(曲线下面积)用作准确度的量度。
参考群体可以例如是如所附实例中所使用的参考群组，例如，可以包含淀粉样蛋白阳性和淀粉样蛋白阴性受试者。淀粉样蛋白阳性受试者可能没有认知障碍、具有轻度认知障碍或者具有认知障碍。
用于ROC分析的淀粉样蛋白阳性的参考读数可以是(例如，在CSF样品中测量的CSF pTau181/Aβ42比率，例如使用0.024的截止值)或PET扫描分析。在优选的实施例中，用于参考群体的样品的ROC分析的淀粉样蛋白阳性的参考读数是在CSF样品中测量的CSF pTau181/Aβ42比率，优选使用0.024的截止值。
在第九方面，本发明提供了包括本发明的与Aβ42特异性结合的抗体或抗原结合片段的试剂盒。该试剂盒特别可以为用于检测和/或量化样品中的Aβ42的试剂盒。样品可以为本文别处定义的任何样品。
本文所公开的关于本发明的与Aβ42特异性结合的抗体或抗原结合片段的所有实施例及其组合经必要修改后应用。
在实施例中，本文提供的试剂盒可以为用于夹心免疫测定的试剂盒，该夹心免疫测定用于特异性检测和/或量化Aβ42。
因此，在实施例中，试剂盒可以进一步包括第二结合剂(例如，抗体)，其与Aβ的氨基酸1至42特异性结合，但不与本发明的抗体或抗原结合片段竞争与Aβ42的结合。
可以使用标准方法评定两种抗体的竞争，诸如ELISA技术、基于的免疫测定实验或基于表面等离子共振光谱法(例如，Biacore)的竞争实验。优选表面等离子体共振光谱法竞争实验。不与本发明的抗体或抗原结合片段竞争结合的Aβ结合剂不减少本发明的抗体或抗原结合片段与Aβ42或Aβ42模拟肽的结合。技术人员将理解，根据所使用的测量方法，将存在一定的测量误差。例如，如果本发明的抗体或抗原结合片段与Aβ42或Aβ42模拟肽的结合减少10％或更少，优选5％或更少，则认为抗体不与本发明的抗体或抗原结合片段竞争。
第二结合剂原则上可以为任何类型的结合剂，例如，针对Aβ42的氨基酸1至42的抗体、适体或任何其他特异性结合配偶体，其不与本发明的抗体或抗原结合片段竞争与Aβ42的结合。
在实施例中，第二结合剂为与Aβ的氨基酸1至42特异性结合的抗体。由于氨基酸1至42或其大部分也存在于其他Aβ肽中，因此第二结合剂对Aβ42不具有特异性，而是对一般Aβ肽具有特异性。
与Aβ的氨基酸1至42特异性结合但不与本发明的抗体或抗原结合片段竞争与Aβ42的结合的抗体是本领域已知的。此类抗体的非限制性示例为：3D6、6E10(BioLegend目录号803004)和1E8(Nanotools目录号0315-100/bA4N-1E8)。
在实施例中，第二结合剂可以为如本文别处所定义的抗体3D6。
在实施例中，第二结合剂可以与Aβ的氨基酸1至5(即，APP的氨基酸672至676；参见数据库UniProtKB登录号：P05067；条目版298)特异性结合。该表位被3D6识别(Feinberg H,Alzheimer's Research&Therapy第6卷,文章号：31,2014)，因此它是与该表位结合的示例性抗体。
在实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段可以具有与其附接的检测标记(如本文别处所定义的)。在实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段可以具有与其附接的捕获标记(如本文别处所定义的)。
在实施例中，试剂盒可以包括具有与其附接的捕获标记的本发明的抗体或抗原结合片段以及具有与其附接的检测标记的如上文所定义的第二结合剂。捕获和检测标记也可以反过来附接。
在实施例中，试剂盒进一步包括微珠，特别是磁性微珠。所述微珠优选被配置为使得它们的表面可以与捕获标记结合(例如，它们可以涂覆有捕获标记的结合配偶体；例如，涂覆有与捕获标记生物素或其衍生物结合的链霉抗生物素或其衍生物)。可替代地，试剂盒中结合剂中的一者可以直接与微珠的表面附接。
在实施例中，本发明的试剂盒用于进行本文公开的方法中的任一者。本文中关于这些方法所述的内容经必要修改后应用。
在实施例中，试剂盒包括任何制造品，诸如使用说明等。
试剂盒的组分可以包含在单个容器中或者可以分布到两个或更多个容器中。
本发明还涉及以下项目：
1.一种与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：
(i)重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的氨基酸序列；以及
(ii)轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的氨基酸序列。
2.根据项目1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变结构域(VH)包含(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，(b)CDR-H2，其包含SEQID NO:4的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，以及(c)
CDR-H3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，并且其中所述轻链可变结构域(VL)包含(d)
CDR-L1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，以及(f)CDR-L3，其包含SEQID NO:8的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体。
3.根据项目1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变结构域(VH)包含(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，以及(c)
CDR-H3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变结构域(VL)包含(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
4.一种与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域(VH)包含(a)
CDR-H1，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，以及(c)CDR-H3，其包含SEQID NO:5的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，并且其中轻链可变结构域(VL)包含(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，以及(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体。
5.根据项目4所述的与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变结构域(VH)包含(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，以及(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且轻链可变结构域(VL)包含(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
6.根据项目4或5所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中：
(i)所述重链可变结构域(VH)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的氨基酸序列；并且
(ii)所述轻链可变结构域(VL)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的氨基酸序列。
7.根据项目1至6中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述重链包含以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的氨基酸序列。
8.根据项目1至7中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述轻链包含以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少70％、优选80％、甚至更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％的序列同一性的氨基酸序列。
9.根据项目1至8中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或所述抗原结合片段将Aβ42与所有其他Aβ肽区分开来，其中在实施例中，其他Aβ肽由Aβ38、Aβ40和Aβ43组成。
10.根据项目1至9中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或所述抗原结合片段与Aβ42的结合取决于Aβ42肽的C末端。
11.根据项目1至10中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或抗原结合片段在37℃以20nM或更低、优选10nM或更低并且最优选7nM或更低的解离平衡常数KD结合Aβ42。
12.根据项目1至11中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或抗原结合片段在37℃以1*104M-1s-1或更高、优选1*105M-1s-1或更高、甚至更优选1*106M-1s-1或更高、甚至更优选3*106M-1s-1或更高并且最优选3.8*106M-1s-1或更高的缔合速率常数ka结合Aβ42。
13.根据项目1至12中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或抗原结合片段在37℃以10-2s-1或更低、优选2*10-2s-1或更低并且最优选2.5 10-2s-1或更低的解离速率常数tkd结合Aβ42。低解离速率常数确保与Aβ42的高复合物稳定性。
14.根据项目1至13中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中当所述单克隆抗体或所述抗原结合片段在夹心免疫测定中用作Aβ42特异性结合剂用于检测和/或量化血液样品(例如，血清或血浆样品)中的Aβ42时，使用Aβ42/Aβ40比率(或反之亦然)
来确定具有已知淀粉样蛋白状态的参考群体的血液样品中的淀粉样蛋白阳性的准确度高于使用Aβ42抗体21F12和/或H31L21的相同Aβ42夹心免疫测定的准确度。
15.根据项目1至14中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中当所述单克隆抗体或所述抗原结合片段在夹心免疫测定中用作Aβ42特异性结合剂用于检测和/或量化血液样品(例如，血清或血浆样品)中的Aβ42时，使用Aβ42/Aβ40比率(或反之亦然)
来确定具有预定淀粉样蛋白状态的参考群体的血液样品中的淀粉样蛋白阳性的准确度至少与使用由SEQ ID NO:9的重链和SEQID NO:10的轻链组成的抗体的相同夹心免疫测定的准确度一样好。
16.根据项目14或15所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中通过ROC分析的AUC评定准确度。
17.根据项目1至16中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中当所述单克隆抗体或所述抗原结合片段在免疫测定(例如，夹心免疫测定法)中用作Aβ42特异性结合剂用于检测和/或量化血液样品(例如，血清或血浆样品)中的Aβ42时，不显示出类风湿因子(Rf)干扰，其中所述血液样品在用于免疫测定时显示出伴随所述Aβ42抗体21F12和/或H31L21的Rf干扰。
18.根据项目1至17中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，当在免疫测定(例如，夹心免疫测定)中用作Aβ42特异性结合剂时，比用于其他方面相同的免疫测定时的其他先前描述的Aβ42抗体更准确地(例如，比21F12和/或H31L21更准确地)检测血液样品中Aβ42的量，其中所述血液样品显示出伴随其他Aβ42特异性结合剂(例如，Aβ42抗体21F12和/或H31L21)的Rf干扰并且包含可检测的和预定的Aβ42量。
19.根据项目17或18所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述血液样品具有介于36IU/ml与1200IU/ml之间的RF活性，在一些实施例中具有介于100IU/ml与1200IU/ml之间的RF活性，并且在一些实施例中具有介于300IU/ml与1200IU/ml之间的RF活性。
20.根据项目17至19中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述血液样品掺有从已从类风湿性关节炎患者获得的血浆或血清样品池中获得的纯化的Rf浓缩物。
21.根据项目17至20中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述血液样品为血清或血浆。
22.根据项目1至21中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中当与具有300IU/ml或更高(例如，300IU/ml至1200IU/ml)的Rf活性的血液样品一起孵育时，所述抗体或抗原结合片段不与IgM亚型的一种或多种抗体结合，所述血液样品包含与包含Aβ1-42抗体21F12的可变区的F(ab’)2区和/或与包含Aβ1-42抗体H31L21的可变区的F(ab’)2区结合的IgM亚型的抗体。
23.根据项目1至22中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:1的序列并且所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:2的序列。
24.根据项目1至22中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:9的序列并且所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:10的序列。
25.根据项目1至24中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段标记有捕获标记。
26.根据项目1至25中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段标记有检测标记。
27.一种多核苷酸或多核苷酸集，其编码
(i)根据项目1至26以及58和59中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段的重链或重链可变结构域，和/或
(ii)根据项目1至26以及58和59中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段的轻链或轻链可变结构域。
28.一种载体，其包含根据项目27所述的多核苷酸或多核苷酸集。
29.一种宿主细胞，其包含根据项目27所述的多核苷酸或多核苷酸集或者根据项目28所述的载体。
30.根据项目29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
31.根据项目29或30所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为HEK或CHO细胞。
32.一种生产根据项目1至26以及58和59中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括培养根据项目29至31中任一项所述的宿主细胞以及分离所述抗体。
33.根据项目1至26中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其能够通过根据项目32所述的方法获得。
34.一种组合物，其包含根据项目1至26以及58和59中任一项所述的抗体或抗原结合片段、根据项目27所述的多核苷酸、根据项目28所述的载体或者根据项目29至31中任一项所述的宿主细胞。
35.一种包含根据项目1至26以及58和59中任一项所述的抗体或抗原结合片段的组合物，其为诊断组合物。
36.根据项目1至26以及58和59中任一项所述的抗体或抗原结合片段作为Aβ42结合剂用于检测或量化样品中的Aβ42的用途。
37.根据项目36所述的用途，其中所述样品为血液样品。
38.根据项目36或37所述的用途，其中所述样品为血清或血浆。
39.根据项目36至38中任一项所述的用途，其中所述检测或量化涉及免疫测定，在实施例中为夹心免疫测定。
40.根据项目36至39中任一项所述的用途，其中在没有Rf干扰的情况下检测所述样品中的所述Aβ42。
41.根据项目36至39中任一项所述的用途，其中所述样品显示出伴随Aβ1-42抗体21F12的F(ab')2区和/或伴随Aβ1-42抗体H31L21的F(ab')2区的Rf干扰。
42.一种用于确定样品中的Aβ42的存在和/或水平的体外方法，所述方法包括：
(a)使根据项目1至26以及58和59中任一项所述的抗体或抗原结合片段与所述样品在允许根据项目1至26以及58和59中任一项所述的抗体或抗原结合片段与所述样品中的Aβ42结合的条件下接触；以及
(b)通过检测根据项目1至26以及58和59中任一项所述的抗体或抗原结合片段与Aβ42的结合来确定所述样品中Aβ42的存在或水平。
43.一种用于帮助检测受试者的淀粉样蛋白阳性的体外方法，所述方法包括
(a)使用根据项目1至26以及58和59中任一项所述的抗体或抗原结合片段确定Aβ42的水平；以及
(b)将经确定的Aβ42水平与预定的Aβ42参考水平进行比较，其中Aβ42水平相对于所述参考水平的改变(例如，降低)指示淀粉样蛋白阳性。
44.一种用于帮助检测受试者的淀粉样蛋白阳性的体外方法，所述方法包括
a)使用根据项目1至26以及58和59中任一项所述的抗体或抗原结合片段确定所述样品中的Aβ42的水平，
b)确定所述样品中的Aβ40的水平；
c)由Aβ42的水平和Aβ40的水平确定组合值(例如，Aβ42/Aβ40水平比率)；以及
d)将所述组合值与预定的参考组合值进行比较，其中改变的组合值(例如，降低)指示淀粉样蛋白阳性。
45.根据项目43或44所述的方法，其中所述方法进一步包括基于受试者是否为淀粉样蛋白阳性的比较进行评定。
46.根据项目43至45中任一项所述的方法，其中所述受试者为认知未受损的或认知受损的。
47.根据项目42至46中任一项所述的方法，其中所述样品为体液，在实施例中为血液样品。
48.根据项目42至47中任一项所述的方法，其中所述样品为血清或血浆样品。
49.根据项目42至48中任一项所述的方法，其中利用使用根据项目1至26以及58和59中任一项所述的抗体或抗原结合片段作为第一Aβ42结合剂并使用与Aβ42结合但不与根据项目1至26以及58和59中任一项所述的抗体或抗原结合片段竞争与Aβ42的结合的Aβ特异性结合剂作为第二Aβ42结合剂的夹心免疫测定来确定所述Aβ42水平。
50.根据项目42至49中任一项所述的方法，其中利用使用根据项目1至26以及58和59中任一项所述的抗体或抗原结合片段作为捕获剂的夹心免疫测定来确定所述Aβ42水平，其中使所述样品和与Aβ42结合但不与根据项目1至26以及58和59中任一项所述的抗体或抗原结合片段竞争与Aβ42的结合的Aβ特异性检测剂接触，其中形成包含来自所述样品的Aβ42，根据项目1至26以及58和59中任一项所述的抗体或抗原结合片段以及检测剂的检测复合物，并且其中所述样品中的所述Aβ42水平的检测包括检测所述检测复合物的水平。
51.根据项目50所述的方法，其中所述方法包括将所述检测复合物与未结合的检测复合物分离。
52.根据项目50或51所述的方法，其中捕获化合物与固体表面结合，在实施例中为磁性颗粒，在实施例中为磁性微珠。
53.一种用于检测和/或量化样品中的Aβ42的试剂盒，所述试剂盒包括根据项目1至26以及58和59中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
54.根据项目53所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括与Aβ特异性结合的第二结合剂，其中所述第二结合剂与Aβ42结合但不与根据项目1至26以及58和59中任一项所述的抗体或抗原结合片段竞争与Aβ42的结合。
55.根据项目53或54所述的试剂盒，其中所述第二结合剂与Aβ42在其AS1和5之间的区域(即Aβ42的N末端的5个氨基酸)特异性结合
56.根据项目53至55中任一项所述的试剂盒，其中第二结合剂为Aβ抗体3D6。
57.根据项目53至56中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括磁性颗粒，在实施例中为磁性微珠。
58.根据项目1至26中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含在SEQ ID NO:1的位置12、19、20、23、24、29、37、72、77、79、82、95、97、113、114和118处在与其相对应的位置处的氨基酸。
59.根据项目1至26中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述VL包含在SEQ ID NO:2的位置10、12、14、15、17、
18、19、41、42、44、51、74、92、105、110、111和112处在与其相对应的位置处的氨基酸。
从上文明显看出，本发明提供了与Aβ42特异性结合的抗体或抗原结合片段以及如上文所定义的相关方面。
如本文所用，淀粉样蛋白β(Aβ、Ab或Abeta)表示36至43个氨基酸的肽，它们是患有阿尔茨海默病的人大脑中发现的淀粉样蛋白斑的主要组分(Hamley IW,2012；ChemicalReviews.112(10):5147–92)。这些肽源自淀粉样蛋白前体蛋白(APP；参见数据库UniProtKB登录号：P05067；条目版298)，其在胆固醇依赖性过程中被β分泌酶和γ分泌酶裂解产生Aβ(Wang H等人,Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America.118(33):e2102191118)。Aβ分子可以聚集形成柔性的可溶性低聚物，其可以以多种形式存在。现在认为某些错误折叠的寡聚物(称为“种子”)可以诱导其他Aβ分子也采取错误折叠的寡聚物形式，从而产生类似于朊病毒感染的连锁反应。寡聚物对神经细胞有毒性(Haas C,Nature Reviews.Molecular Cell Biology.8(2):101–12.)。
淀粉样蛋白肽的两种最丰富的同种异型形式(在大脑中的淀粉样蛋白沉积物中发现)的长度为40和42个氨基酸(分别称为Aβ40和Aβ42)。尽管这两种肽之间的结构差异小，但它们展示出不同的临床、生物学和生物物理行为。人Aβ40和Aβ42分别由蛋白质APP的氨基酸672至711和672至713组成(参见数据库UniProtKB登录号：P05067；条目版298)特异性结合。
本文提及以下Aβ肽：Aβ38、Aβ40、Aβ42和Aβ43。
Aβ38(也称为Ab38、Abeta38、Aβ1-38或Abeta1-38)对应于APP的氨基酸672至709(参见数据库UniProtKB登录号：P05067；条目版298)特异性结合。Aβ40(也称为Ab40、Abeta40、Aβ1-40或Abeta1-40)对应于APP的氨基酸672至711(参见数据库UniProtKB登录号：P05067；条目版298)特异性结合。Aβ42(也称为Ab42、Abeta42、Aβ1-42或Abeta1-42)对应于APP的氨基酸672至713(参见数据库UniProtKB登录号：P05067；条目版298)特异性结合。Aβ43(也称为Ab43、Abeta43、Aβ1-43或Abeta1-43)对应于APP的氨基酸672至714(参见数据库UniProtKB登录号：P05067；条目版298)特异性结合。
阿尔茨海默病已被鉴定为一种蛋白质错误折叠疾病(蛋白质病)，最可能是由大脑中异常折叠的淀粉样蛋白β蛋白质斑块和tau蛋白缠结引起的。斑块由小肽构成，长度为36至43个氨基酸，称为淀粉样蛋白β肽(Aβ)。Aβ是指来自较大的淀粉样蛋白β前体蛋白(APP)的一组片段，APP是一种穿透神经元膜的跨膜蛋白。APP对于神经元生长、存活和损伤后修复至关重要。在阿尔茨海默病中，γ分泌酶和β分泌酶在使APP被分成更小片段的蛋白水解过程中共同作用。这些片段中的一者会产生淀粉样蛋白β的原纤维，其然后形成以致密的形式沉积在神经元外部的团块，称为老年斑块。缠结是由tau蛋白异常聚集引起的，tau蛋白在磷酸化时通常会稳定细胞骨架的微管。在阿尔茨海默病中，Tau变得过度磷酸化并开始与其他丝配对，产生神经原纤维缠结并瓦解神经元的运输系统。
淀粉样蛋白β肽的产生和聚集的紊乱究竟如何引起阿尔茨海默病的病理学尚不清楚。淀粉样蛋白假说传统上认为淀粉样蛋白β肽的积累是触发神经元变性的核心事件。聚集的淀粉样蛋白原纤维被认为是破坏细胞钙离子稳态的蛋白质的有毒形式，其积累会诱导程序性细胞死亡(细胞凋亡)。还已知Aβ会选择性地在受阿尔茨海默病影响的大脑细胞的线粒体中积聚，并且还会抑制某些酶的功能以及神经元对葡萄糖的利用。
β-淀粉样蛋白代谢的病理变化属于迄今为止已知的AD发展期间最早的可以用于诊断的变化。例如，它们通过CSF或血浆Aβ42浓度的降低或Aβ42/Aβ40比率的降低来反映。浓度降低的机制尚不完全清楚，但一种可能的解释是，由于Aβ42被隔离在大脑斑块中，可以清除到CSF或血液中的Aβ42减少(Blenow K和Zetterberg H,Journal of InternalMedicine,第284卷,第6期,第643至663页,2018；和Lewczuk P等人,Adv Med Sci,2015年三月；60(1):76-82.doi:10.1016/j.advms.2014.11.002)。Aβ42/Aβ40比率在AD检测方面可能显示出优于单独Aβ42的诊断性能，因为它针对不同个体之间可能出现的Aβ肽的不同基线水平进行归一化(Wiltfang J,Journal of Neurochemistry,第101卷,第4期,第1053-1059,2007页)。
如本文所用，术语“淀粉样蛋白阳性”或“淀粉样蛋白阳性的”意指根据淀粉样蛋白PET、CSF测定(例如，pTau/Aβ42)或用于检测Aβ斑块的任何其他金标准技术，受试者对于Aβ斑块呈阳性。
如本文所用，术语“抗体”、“多个抗体”和类似术语涉及全免疫球蛋白分子，并且涵盖天然存在的抗体形式(包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgE)以及重组抗体构建体，包括但不限于单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体-融合蛋白和多特异性抗体；以及前述中所有项的抗原结合片段和衍生物。如本文所用，术语“抗体”、“多个抗体”和类似术语也指其抗原结合片段，其可以在本文中指代为抗体抗原结合片段，并且/或者简单地指代为抗原结合片段。这些术语是指保留与靶抗原特异性结合(即，与Aβ42特异性结合)的能力的抗体的一个或多个片段，如本领域所知，包括但不限于包含Fv结构域的抗原结合片段，即配对的重链和轻链可变结构域，诸如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段以及重组构建体，诸如在本领域中称为scFv的单链Fv结构域。该术语还包括包含本领域已知的单个未配对的重链或轻链可变结构域的抗体抗原结合片段，该可变结构域保留特异性和选择性地结合如本文定义的抗原的能力，包括但不限于单结构域抗体(在本领域也指代为sdAb、dAb和/或纳米抗体)和基于骆驼类的重链的VHH结构域。术语抗体还包括包含本发明的重链和/或轻链可变结构域(例如，形成和特异性且选择性地结合Aβ42的抗体Fv结构域)至少两次(优选四次、五次、六次、七次或八次)的多价抗体或抗原结合片段。此外，包括多价抗体或抗体片段，其包含本发明的重链和/或轻链或其片段(例如，形成和特异性且选择性地结合Aβ42的抗体Fab或F(ab)2结构域)至少两次(优选四次、五次、六次、七次、八次或十次)。本文中的术语抗体所包括的示例性多价形式公开于WO2019/057816中，该文献通过引用以其整体并入本文。
在某些实施例中，本发明的单克隆抗体可以为全免疫球蛋白、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。在一个具体实施例中，本发明的单克隆抗体可以为F(ab')2片段或Fab'片段。
如本文中所用的“Fab片段”由一条轻链以及一条重链的CH1(恒定区)和可变区组成。Fab分子的重链无法与另一个重链分子形成二硫键。
如本文所用，“Fa'片段”包含一条轻链及一条重链的一部分，该重链含有VH结构域和CH1结构域以及CH1与CH2结构域之间的区域，这样就可以在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键，从而形成F(ab')2分子。
“F(ab')2片段”包含两条轻链和两条重链，该重链包含CH1与CH2结构域之间的一部分恒定区，如此，在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')2片段由两个Fab’片段组成，这两个Fab'片段通过两条重链之间的二硫键结合在一起。
“Fv”包含重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。在本发明范围内，“单链Fv”(也缩写为“scFv”)是具有抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中所述结构域存在于单个多肽链。通常，scFv多肽进一步在VH和VL结构域之间包含多肽接头，使得scFv能形成所需的抗原结合结构。所描述的用于产生单链抗体的技术例如描述于Plückthun,The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,Rosenburg和Moore编辑Springer-Verlag,N.Y.113(1994),269-315。
抗体可以是多克隆的或单克隆的。本发明的抗体是单克隆的。如本文中提及抗体或其抗原结合片段使用的术语“单克隆”是指由单个B细胞克隆产生的抗体多肽或其片段的群体，该群体仅含有能够与抗原的特定表位进行免疫反应的抗原结合位点的一种物种。这与“多克隆”抗体和组合物相反，“多克隆”抗体和组合物是指含有多种抗原结合位点的抗体多肽或抗原结合片段的群体。还包括本发明的单克隆抗体的修饰形式，诸如其人源化或嵌合版本，以及重组抗体构建体，如抗体(或抗原结合片段)融合蛋白，其中抗体或抗原结合片段包括一个或多个另外的结构域，例如用于分离和/或制备重组产生的抗体/片段/构建体。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括例如杂交瘤方法(例如，Kohler和Milstein.,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press,第2版1988)；Haemmerling等人:Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如，Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,PNAS USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))和在动物中生产具有编码人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因座或基因的部分或全部的人类抗体或类人类抗体的技术(参见，例如，WO1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人,PNAS USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016；Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
本文中的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列以及这些抗体的片段相同或同源，只要它们表现出所需的生物学活性即可(例如美国专利号4,816,567和Morrison等人,PNAS USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括抗体，其中抗体的抗原结合区源自通过例如用目标抗原免疫猕猴产生的抗体。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman和Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。
通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；以及
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另有说明，否则CDR根据Kabat等人所述的方法(同上)确定。本领域的技术人员将理解，也可以根据Chothia(同上)、McCallum(同上)所述的方法或任何其他在科学上接受的命名系统来确定CDR名称。
“框架”或“FR”是指除互补决定区(CDR)之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，CDR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4。
如本文所用，术语“取代”、“交换”或“突变”是指用另一氨基酸来替换氨基酸。术语“取代”显然不包含删除某个位置的氨基酸并在另一个位置引入一个(或多个)氨基酸的情况。如前所述，本发明涵盖如本文上文已经定义的保守或高度保守的氨基酸取代。
根据本发明，术语“插入”是指将一个或多个氨基酸添加到具体列举的氨基酸序列，其中添加不是添加到多肽的N-端或C-端。
根据本发明，术语“添加”是指将一个或多个氨基酸添加到具体列举的氨基酸序列，该添加是添加到多肽的N-端或C-端或两者。
根据本发明使用的术语“缺失”是指从具体列举的氨基酸序列中丢失一个或多个氨基酸。
本文中的氨基酸使用1字母代码或三字母代码拼写或缩写。
在本发明的上下文中，它是指序列的变体(特别是CDR)。这些变体通常包含一个或多个氨基酸取代。很明显，变体CDR是功能变体，即具有可能与参考氨基酸序列不同的氨基酸序列，但该不同的序列在所描述的重链和/或轻链可变结构域的情况下表现出或保持与参考序列相同的功能活性。具体地，如本文所用，术语相同的功能活性意指包含一个或多个变体CDR的本发明的抗体或抗体结合片段将保持其对Aβ42的特异性，将Aβ42与其他Aβ肽区分开来，不会显示出如现有技术Aβ42特异性抗体(如本文别处所述)所观察到的Rf干扰和/或将显示出用于在免疫测定中检测淀粉样蛋白阳性的优异临床性能(特别是当以Aβ42/Aβ40比率使用时)。
如本发明的上下文中所用，“保守氨基酸取代”意指氨基酸被选自其相同物理化学组的另一氨基酸取代，其中氨基酸的物理化学组是
a)非极性疏水性氨基酸，由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp和Met组成；
b)极性中性氨基酸，由Ser、Thr、Asn和Gln组成；
c)带正电荷的碱性氨基酸，由Arg、Lys和His组成；和
d)带负电荷的酸性氨基酸，由Asp和Glu组成
其中如果Cys要被保守地取代，则其是用Ser或Ala取代，并且其中如果Pro要被保守地被取代，则其是用Ala取代。
如本发明的上下文中所用，“高度保守的氨基酸取代”意指以下氨基酸取代：
a)用Val、Leu、Ile或Gly取代Ala；
b)用Lys取代Arg；
c)用Gln取代Asn；
d)用Glu取代Asp；
e)用Ser取代Cys；
f)用Asn取代Gln；
g)用Asp取代Glu；
h)用Ala取代Gly；
i)用Arg取代His；
j)用Leu、Val或Ala取代Ile；
k)用Ile、Val或Ala取代Leu；
l)用Arg取代Lys；
m)用Leu、Ile或Val取代Met；
n)用Tyr或Trp取代Phe；
o)用Ala取代Pro；
p)用Thr取代Ser；
q)用Ser取代Thr；
r)用Phe或Tyr取代Trp；
s)用Phe或Trp取代Tyr；以及
t)用Leu、Ile或Ala取代Val。
如本文所用的，与多肽/肽和/或核酸序列或核酸分子的氨基酸序列关联的术语“％序列同一性”描述了两个或更多个比对的序列的相同氨基酸或核酸残基的匹配数与构成比较序列的总长度(或其总的比较部分)的残基数相比。使用两个或更多个序列或子序列的比对，当(子)序列在比较窗口上或者在如使用本领域已知的序列比较算法测量的指定区域上进行比较和对齐以获得最大对应性时，或者当手动对齐和目视检查时，可以确定相同残基的百分比。用于确定序列同一性的算法的非限制性示例包括例如基于NCBI BLAST算法(Altschul等人,Nucleic Acids Res 25(1997),3389-3402)、CLUSTALW计算机程序(Thompson,Nucl.Acids Res.2(1994),4673-4680)或FASTA(Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.,85(1988),2444)的那些。尽管FASTA算法在其计算中通常不考虑序列中的内部不匹配的删除或添加，即间隙，但可以手动校正以避免高估％序列同一性。然而，CLUSTALW在其同一性计算中确实考虑了序列间隙。BLAST和BLAST 2.0算法也是可用的(Altschul等人,Nucl Acids Res.,25(1977),3389)。
如本文所用的，“核酸分子”、“核酸序列”、“多核苷酸”和类似术语既包括基因组DNA和cDNA，也包括能够驱动本发明抗体或抗原结合片段表达的RNA。可以理解，如本文所用的术语“RNA”包括所有形式的RNA，包括mRNA、tRNA和rRNA以及还有基因组RNA，如在RNA病毒的RNA的情况下。优选地，记载“RNA”的实施方案是针对mRNA。本发明的核酸分子/核酸序列可以是天然的，也可以是合成的或半合成的。在实施例中，本发明的核酸/核酸序列可以是分离的。因此，核酸分子可以是，例如，根据有机化学的常规方案、根据重组方法，或半合成地产生(例如通过将化学合成和重组方法结合)而已经合成的核酸分子。本领域技术人员熟悉此类核酸分子的制备和使用。
如本文所用，“免疫测定”是公认的生物分析方法，其中分析物的检测或量化取决于分析物和至少一种分析物特异性结合剂的反应，从而形成分析物：结合剂复合物。在本发明的上下文中，至少一种分析物特异性结合剂中的至少一者是本发明的抗体。“夹心”免疫测定的具体实施例可以用于具有一个以上识别表位的分析物。因此，夹心测定需要至少两种与分析物上不重叠表位附接的结合剂。在“异相夹心免疫测定”中，结合剂中的一者具有分析物特异性捕获结合剂的功能作用；该结合剂固定在固相上或(在测定过程中)变得固定在固相上。第二分析物特异性结合剂以溶解形式在液相中提供。一旦各自的分析物与第一和第二结合剂结合(结合剂-1：分析物：结合剂-2)，就形成了夹心状复合物。所述夹心状复合物也称为“检测复合物”。在检测复合物中，分析物夹在结合剂之间，即在此类复合物中，分析物代表第一结合剂和第二结合剂之间的连接元件。
术语“异相”(相对于“均相”)表示测定过程中的两个基本且独立的步骤。在第一步中，形成并固定了含标记的检测复合物，但是未结合的标记仍围绕复合物。在确定标记依赖性信号之前，将未结合的标记从固定的检测复合物除去，因此代表第二步。相反，均相测定通过一步温育产生分析物依赖性可检测信号，并且不需要洗涤步骤。
在异相免疫测定中，固相官能化，这样在与分析物接触之前，固相可能已经在其表面结合了功能捕获结合剂(第一结合剂)；或固相的表面官能化以便能够在第一结合剂与分析物反应后锚定第一结合剂。在后一种情况下，锚定过程不得干扰结合剂特异性捕获和结合分析物的能力。液相中存在的第二结合剂用于检测结合的分析物。因此，在异相免疫测定中，允许分析物与第一(捕获)和第二(检测)结合剂结合。由此形成“检测复合物”，其中分析物夹在捕获结合剂和检测结合剂之间。在一个典型的实施例中，检测结合剂在与分析物接触之前被标记；可替代地，在分析物结合后，将标记特异性与检测结合剂附接。在将检测复合物固定在固相上的情况下，在固相上可检测的标记的量对应于夹在中间的分析物的量。在去除未结合的标记后，可以检测到指示分析物的存在和量的固定的标记。
如本文所用，“竞争性免疫测定”优选地采用与分析物(即Aβ42)直接相互作用的单一结合剂。“竞争性异相免疫测定”通常检测与样品中分析物的量成反比的检测标记信号。在本文的优选实施例中，竞争性免疫测定可以为异相竞争性免疫测定。在实施例中，使具有分析物的样品与人工产生的分析物的标记类似物混合，该类似物能够与分析物特异性结合剂(例如，本发明的抗体或抗原结合片段)反应。在测定中，分析物和类似物竞争与固定的或变得固定的捕获结合剂(例如，本发明的抗体)的结合。结合剂的量被选择为在该设置中受到限制。在结合步骤之后，固定的标记的量越高，能够竞争捕获结合剂的非标记分析物的量越少。在洗涤步骤后确定固定的标记物。在该设置中，在固相上可检测到的标记的量与样品中最初存在的分析物的量成反比。
术语“特异性结合剂”是指与靶标特异性结合的天然或非天然分子。特异性结合剂的实例包括但不限于蛋白质、肽和核酸。在某些实施例中，特异性结合剂为抗体或核酸。在某些实施例中，特异性结合剂为抗体。在某些实施例中，特异性结合剂包含抗体的抗原结合区。术语靶标和抗原可以互换使用。在一个实施例中，靶标为抗原并且特异性结合剂为抗体。特异性结合剂对其相应的靶标分子具有至少107l/mol的亲和力。在一个实施例中，特异性结合剂对其靶标分子具有至少108l/mol或更好的亲和力，或者在进一步的实施例中，具有至少109l/mol或更好的亲和力。在一个实施例中，如本文所公开的特异性结合剂选自由抗体或适体组成的组。在一个实施例中，特异性结合剂为也称为适体的特异性结合核酸。
术语“适体”是指识别多肽并与多肽结合的核酸。适体可以通过选择方法诸如SELEX(参见例如Jayasena(1999)Clin.Chem.,45,1628-50；Klug和Famulok(1994)M.Mol.Biol.Rep.,20,97-107；US 5,582,981)从大量不同的单链RNA分子分离。适体也可以以其镜像形式合成和选择，例如作为L-核糖核苷酸(Nolte等人(1996)Nat.Biotechnol.,14,1116-9；Klussmann等人(1996)Nat.Biotechnol.,14,1112-5)。以后一方式分离的形式具有它们不会被天然存在的核糖核酸酶降解的优点，并且因此具有更大的稳定性。
在本公开的上下文中，参考了以下两种现有技术Aβ42特异性抗体：21F12或H31L21。两种抗体均商业可得：21F12来自Absolute Antibody(目录号Ab02391-3.0)或H31L21来自ThermoFisher Scientific(目录号700254)。21F12的VH和VL的氨基酸序列公开于WO2014/007982中，该文献通过引用以其整体并入本文。21F12的VH结构域具有如SEQ IDNO:19中所描绘的氨基酸序列。21F12的VL结构域具有如SEQ ID NO:20中所描绘的氨基酸序列。当本文提及“21F12”时，该术语涵盖全长21F12抗体(如商业可得的)、包含21F12的VH和VL(例如，分别包含SEQ ID NO:19和20)的任何抗体或抗原结合片段以及包含如SEQ ID NO:19和20中所包含的CDR的任何Aβ42特异性抗体。
本文还提及抗体3D6。该抗体不具有Aβ42特异性，但也识别其他Aβ肽。它与Aβ42的氨基酸1至5结合。该抗体(作为小鼠抗体和作为人源化抗体)的重链和轻链序列也已公开于EP1613347中，其通过引用以其整体并入本文。3D6抗体也是商业可得的(CreativeBiolabs，目录号：PABL-011)。3D6的VH结构域优选具有如SEQ ID NO:21中所描绘的氨基酸序列。3D6的VL结构域优选具有如SEQ ID NO:22中所描绘的氨基酸序列。当本文提及3D6时，该术语涵盖全长3D6抗体(例如，作为小鼠抗体或其任何人源化变体)、包含3D6的VH和VL(例如，分别包含SEQ ID No:21和22)的任何抗体或抗原结合片段以及包含SEQ ID NO:21和22中所包含的CDR的任何Aβ抗体。
如本文所用，“可检测标记”涉及允许检测的标记。根据本发明的一个实施例，可检测标记是酶或发射光(在一个实施例中是荧光、发光、化学发光、电化学发光或放射性)的标记。在一个优选的实施例中，标记是电化学发光标记，在一个实施例中是三(2,2'-联吡啶)钌(II)-络合物(Ru(bpy))。由于干扰是由吸引自身抗体和类似干扰分子的标记分子的三维结构引起的，而不是由所述标记的信号发射机制(诸如例如光或放射性)引起的，所以所有上述标记均可以用于本发明。
大量的检测标记(也称为染料)通常可分为以下类别，全部类别的总体及其每一个类别均表示根据本公开的实施例：
(a)荧光染料
荧光染料例如由以下描述：Briggs等人"Synthesis of FunctionalizedFluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids,"J.Chem.Soc.,Perkin-Trans.1(1997)1051-1058)。
荧光标记或荧光团包括稀土螯合物(铕螯合物)；荧光素类型标记，包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明标记，包括TAMRA；丹磺酰；丽丝胺(Lissamine)；花青；藻红蛋白；得克萨斯红(Texas Red)；及其类似物。使用本文所公开的技术，可以将荧光标记缀合至靶标分子所包含的醛基。荧光染料和荧光标记试剂包括可从Invitrogen/MolecularProbes(Eugene,Oregon,USA)和Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,Ill.)购得的这类荧光染料和试剂。
(b)发光染料
发光染料或标记还可进一步划分为以下子类别：化学发光染料和电化学发光染料。
不同类别的化学发光标记包括鲁米诺、吖啶类化合物、腔肠素和类似物、二氧杂环丁烷、基于过氧草酸的系统及其衍生物。对于免疫诊断程序，主要使用基于吖啶的标记(详细综述见Dodeigne C.等人，Talanta 51(2000)415-439)。
用作电化学发光标记的主要相关性标记分别是钌基和铱基电化学发光复合物。已经证明，电化学发光(ECL)作为高灵敏度和选择性方法在分析应用中非常有用。该方法使化学发光分析的分析优势(无背景光信号)和通过采用电极电位更方便地控制反应相结合。通常，钌络合物，尤其是与TPA(三丙胺)在液相或液固界面再生的[Ru(Bpy)3]2+(发射出约620nm的光子)被用作ECL标记。最近，对铱基ECL标记已有描述(WO2012107419(A1))。
(c)放射性标记使用放射性同位素(放射性核素)，诸如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或131Bi。
(d)金属螯合物的络合物适合用作成像和治疗目的的标记，这是本领域众所周知的(US2010/0111856；US 5,342,606；US 5,428,155；US 5,316,757；US 5,480,990；US 5,462,725；US 5,428,139；US 5,385,893；US 5,739,294；US 5,750,660；US 5,834,456；Hnatowich等人，J.Immunol.Methods 65(1983)147-157；Meares等人，Anal.Biochem.142(1984)68-78；Mirzadeh等人，Bioconjugate Chem.1(1990)59-65；Meares等人，J.Cancer(1990)，增刊10:21-26；Izard等人，Bioconjugate Chem.3(1992)346-350；Nikula等人，Nucl.Med.Biol.22(1995)387-90；Camera等人，Nucl.Med.Biol.20(1993)955-62；Kukis等人，J.Nucl.Med.39(1998)2105-2110；Verel等人，J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670；Camera等人，J.Nucl.Med.21(1994)640-646；Ruegg等人，Cancer Res.50(1990)4221-4226；Verel等人，J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670；Lee等人，Cancer Res.61(2001)4474-4482；Mitchell等人，J.Nucl.Med.44(2003)1105-1112；Kobayashi等人，Bioconjugate Chem.10(1999)103-111；Miederer等人，J.Nucl.Med.45(2004)129-137；DeNardo等人，ClinicalCancer Research 4(1998)2483-90；Blend等人，Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals 18(2003)355-363；Nikula等人，J.Nucl.Med.40(1999)166-76；Kobayashi等人，J.Nucl.Med.39(1998)829-36；Mardirossian等人，Nucl.Med.Biol.20(1993)65-74；Roselli等人，Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals,14(1999)209-20)。
在本公开的上下文中使用的“样品”可以为包含或疑似包含Aβ42的液体样品。样品可以特别为体液，诸如但不限于血液样品、脑脊液、精液、唾液或尿液。在实施例中，样品为血液样品，诸如全血、血清或血浆。在实施例中，样品为血清或血浆。
样品中的生物标记物(例如，Aβ42或Aβ40)的“水平”意指确定样品中各自的生物标记物分子的量或浓度。物质的量可以是绝对量(例如，以质量给出)或标准定义的量，其衡量基本实体(例如，原子、分子、电子和其他粒子)整体的大小。它有时被称为化学量。国际单位制(SI)将物质的量定义为与存在的基本实体的数量成比例。针对物质的量的SI单位为摩尔。它的单位符号为mol。物质的浓度是一种成分的量除以混合物的总体积。可区分几种类型的数学描述：质量浓度、摩尔浓度、数量浓度和体积浓度。浓度一词可以应用于任何种类的化学混合物，但最常见的是指溶液中的溶质和溶剂。摩尔(量)浓度有变量(诸如正常浓度和渗透浓度)。
浓度、量和其他数值数据在本文中可以“范围”格式表达或呈现。应当理解，此类范围格式仅出于方便和简洁而使用，因此应灵活地解释为不仅包括明确列举为范围限值的数值，而且包括该范围所涵盖的所有单独的数值或子范围，就如同明确列举出每个数值和子范围一样。作为说明，数值范围“150mg至600mg”应解释为不仅包括明确列举的值150mg至600mg，而且包括所指示范围内的单独值和子范围。因此，此数值范围中包括个体值，诸如150、160、170、180、190、……580、590、600mg和子范围，诸如从150至200、150至250、250至300、350至600等。此相同原则适用于仅引用一个数值的范围。此外，无论所述范围或特征的广度如何，均适用此类解释。
词语“包含(comprise)”以及变体诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤组。
如在本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另外明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数指代物。
当与数值相连使用时，术语“约”意为涵盖处于一定范围内的数值，该范围具有比所指示的数值小5％的下限和比所指示的数值大5％的上限。
本文中提供的所有氨基酸序列均以从最N末端残基开始并以最C末端残基结束呈现，如同本领域的惯用做法，并且本发明中用于鉴定氨基酸的单字母或三字母的代码缩写对应常用于氨基酸的那些代码缩写。
在本发明的上述详细描述中，公开了许多单独的元件、表征特征、技术和/或步骤。容易认识到，这些中的每一个不仅在单独考虑或单独使用时都有好处，而且在相互结合地考虑和使用时也有好处。因此，为了避免过度重复和多余的段落，这种描述避免重复每一种可能的组合和排列。然而，无论是否明确记载，可以理解的是，这种组合完全在目前公开的主题范围内。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。对本文中采用的技术的提及意在指本领域通常理解的技术，包括对本领域技术人员显而易见的那些技术的变化或等效技术的替代。
在本说明书中，引用了大量文件，包括专利申请书和制造商手册。所述文件的公开内容，被认为与本发明的专利性无关，而是以全文引用的方式并入本文。更具体而言，所有参考文件的引用程度如同将每个单独的文件具体且单独地以引用方式并入本文。
序列描述
SEQ ID NO:1:抗体3.2.52的VH序列
EVQLQQSGPELVKLGASVRVSCRTSGFTITEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGINPITGGSRNNLKFKDKATLTGDKSSSTVYMDLRSLTSEGSTVNYCVRGRTMGPLDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:2:抗体3.2.52的VL序列
DVVMTQTPLTLSVTIGQPVSISCKSSQSLLYTNGKTFLNWLFQRPGQSPKRLIYMVSKLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCMQSTHFPLTFGGGTKLELK
SEQ ID NO:3:根据Kabat的抗体3.2.52的CDR-H1序列
EYTMH
SEQ ID NO:4:根据Kabat的抗体3.2.52的CDR-H2序列
GINPITGGSRNNLKFKD
SEQ ID NO:5:根据Kabat的抗体3.2.52的CDR-H3序列
GRTLGPLDY
SEQ ID NO:6:根据Kabat的抗体3.2.52的CDR-L1序列
KSSQSLLYTNGKTFLN
SEQ ID NO:7:根据Kabat的抗体3.2.52的CDR-L2序列
LVSKLES
SEQ ID NO:8:根据Kabat的抗体3.2.52的CDR-L3序列
LQSTHFPLT
SEQ ID NO:9:抗体3.2.52的F(ab')2片段的重链序列
EVQLQQSGPELVKLGASVRVSCRTSGFTITEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGINPITGGSRNNLKFKDKATLTGDKSSSTVYMDLRSLTSEGSTVNYCVRGRTMGPLDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCP
SEQ ID NO:10:抗体3.2.52的F(ab')2片段和全长IgG的轻链序列
DVVMTQTPLTLSVTIGQPVSISCKSSQSLLYTNGKTFLNWLFQRPGQSPKRLIYMVSKLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCMQSTHFPLTFGGGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
抗体3.2.52的VH的SEQ ID NO:11FW(HC)1
EVQLQQSGPELVKLGASVRVSCRTSGFTIT
抗体3.2.52的VH的SEQ ID NO:12FW(HC)2
WVKQSHGKSLEWIG
抗体3.2.52的VH的SEQ ID NO:13FW(HC)3
KATLTGDKSSSTVYMDLRSLTSEGSTVNYCVR
抗体3.2.52的VH的SEQ ID NO:14FW(HC)4
WGQGTTLTVSS
抗体3.2.52的VL的SEQ ID NO:15FW(LC)1
DVVMTQTPLTLSVTIGQPVSISC
抗体3.2.52的VL的SEQ ID NO:16FW(LC)2
WLFQRPGQSPKRLIY
抗体3.2.52的VL的SEQ ID NO:17FW(LC)3
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYC
抗体3.2.52的VL的SEQ ID NO:18FW(LC)4
FGGGTKLELK
抗体21F12的SEQ ID NO:19VH序列
EVQLQQSGPELLKPGASVKISCKASGFTFTDYTMHWMKQSHGKSLEWIG
GINPNSGGTIYNEKFKDKATLTVDKSSRTAYMELRSLTSEDSAVYFCTRG
VYDGYFYWGQGTLVTVSA
抗体21F12的SEQ ID NO:20VL序列
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVYSNGNTFLHWYLQKPGQSPK
LLIYKVSTRFSGVPDRFSGSGSGSDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQTTHAPFT
FGSGTKLAIR
小鼠3D6的SEQ ID NO:21VH序列
EVKLVESGGGLVKPGASLKLSCAASGFTFSNYGMSWVRQNSDKRLEWV
ASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCVR
YDHYSGSSDYWGQGTTVTVSS
小鼠3D6的SEQ ID NO:22VL序列
YVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPK
RLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRIEAEDLGLYYCWQGTHFPR
TFGGGTKLEIK
3.2.52的SEQ ID NO:23重链序列
EVQLQQSGPELVKLGASVRVSCRTSGFTITEYTMHWVKQSHGKSLEWIG
GINPITGGSRNNLKFKDKATLTGDKSSSTVYMDLRSLTSEGSTVNYCVRG
RTMGPLDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVK
GYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTV
TCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIF
PPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVRISWFVNNVEVHTAQTQTH
REDYNSTIRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLV
RAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKD
TAPVLDSDGSYFIYSKLDIKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRS
PGK
SEQ ID NO:24Aβ42氨基酸35至42
MVGGVVIA
提供以下实例和附图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求和上文中阐明。应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可对所阐述的程序进行修改。
附图说明
图1显示了小鼠克隆M-3.2.52结合Aβ42的动力学概况。抗体与Aβ42以1.2nM、3.7nM、11nM、33nM和100nM相互作用(黑色)，覆盖有Langmuir 1:1结合模型(灰色)。尽管存在较高浓度的复杂的抗体Aβ-42结合行为，但通过使用具有RMAX全局的二元Langmuir模型，以足够高的精度促进了动力学量化。复杂的结合行为可能归因于M-3.2.52捕获步骤后的基线漂移。
图2显示了来自使用不同的Aβ免疫测定研究血浆生物标记物比率与淀粉样蛋白状态之间的一致性的接受者操作特征曲线下面积(ROC AUC)分析的结果。淀粉样蛋白状态由CSF pTau181/Aβ42比率使用0.024的截止值确定(113例淀粉样蛋白阳性，118例淀粉样蛋白阴性)。95％CI使用DeLong方法计算。使用新3.2.52抗体的血浆Aβ42/Aβ40比率的性能以灰色显示(Ab42(新)/Ab40)，而使用21F12抗体的Aβ42/Aβ40比率以黑色显示(Ab42(旧)/Ab40)。DeLong检验用于计算两个比率比较的p值。
图3显示了来自使用不同Aβ42抗体时测量类风湿因子(Rf)干扰的结果。在不存在外部Rf(0IU/mL，黑色条)的情况下测量血浆样品，并以对应于300IU/ml Rf活性(灰色条)的量掺入Rf浓缩物。通过计算在不存在外部Rf的情况下确定的Aβ42浓度与在存在300IU/mlRf的情况下确定的Aβ42浓度之间的比率来计算浓度回收率百分比。将获得的值乘以100以获得百分比。
图4显示了来自使用21F12(黑色实线)和3.2.52F(ab')2片段(灰色虚线)时在宽浓度范围内测量类风湿因子(Rf)干扰的结果。通过计算在不存在外部Rf的情况下确定的Aβ42浓度与在存在Rf的情况下确定的Aβ42浓度之间的比率来计算浓度回收率百分比。将获得的值乘以100以获得百分比。
图5显示了使用21F12时，向样品混合物中添加全长鼠IgG(与和Aβ42无关的表位结合)对类风湿因子(Rf)干扰的影响。测试了三种不同浓度的鼠IgG：0μg/mL(黑色条)、250μg/mL(灰色条)和500μg/mL(白色空心条)。在不存在外部Rf(0IU/mL)的情况下测量血浆样品，并以对应于300、600和1200IU/ml Rf活性的量掺入Rf浓缩物。通过计算在不存在外部Rf的情况下确定的Aβ42浓度与在存在Rf的情况下确定的Aβ42浓度之间的比率来计算浓度回收率百分比。将获得的值乘以100以获得百分比。
图6显示了使用21F12作为小鼠Fab(黑色条)或嵌合小鼠/人Fab(人IgG1 CH1和CL以及小鼠VH和VL，白色空心条)时的类风湿因子(Rf)干扰。在不存在外部Rf(0IU/mL)的情况下测量血浆样品，并以对应于300、600和1200IU/ml Rf活性的量掺入Rf浓缩物。通过计算在不存在外部Rf的情况下确定的Aβ42浓度与在存在Rf的情况下确定的Aβ42浓度之间的比率来计算浓度回收率百分比。将获得的值乘以100以获得百分比。
图7显示了抗体21F12和3.2.52的VH的比对。CDR以灰色突出显示。
图8显示了抗体21F12和3.2.52的VL的比对。CDR以灰色突出显示。
图9显示了用于研究Aβ42抗体是否与来自Rf水平升高的患者的天然样品中所含的Rf IgM结合的测定设置的示意图。使生物素化的Aβ42抗体与链霉亲和素珠偶联，添加含有Rf IgM的天然样品，并用钌化的抗IgM抗体检测结合的IgM。
实例
实例1：单克隆抗Aβ42特异性抗体的生成和筛选
免疫原和筛选试剂
为了开发单克隆抗Aβ42抗体，合成了肽(Aβ(Cystein-35-42))，其包含Aβ42肽的氨基酸35至42(SEQ:MVGGVVIA；SEQ ID NO:24)，并使其与载体血蓝蛋白偶联以增强免疫原性。生物素化筛选试剂的合成对应于肽Aβ40(Aβ40肽的氨基酸33至40)、Aβ42(Aβ42肽的氨基酸1至12和35至42(通过接头连接))以及Aβ43(Aβ43肽的氨基酸35至43)的C末端，其均包含对各自Aβ肽具有特异性的游离C末端。肽的C末端是游离的，并且例如可用于与抗体结合。
免疫
在这里，我们描述了对Aβ42肽具有特异性的抗体的开发。为了生成该抗体，用血蓝蛋白-(Aβ(Cystein-35-42))肽(序列：35MVGGVVIA 42；SEQ ID NO:24)对NMRI小鼠进行免疫。为了增强免疫原性，使肽与作为载体蛋白的血蓝蛋白偶联。进行偶联以使Aβ42的C末端游离，因为其目的是获得与Aβ42特异性结合的抗体。对小鼠进行三次免疫。对于第一次免疫，将100μg免疫原在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化，并腹膜内施用到小鼠。将100μg免疫原与不完全弗氏佐剂(IFA)混合用于后续两次免疫，并在免疫开始后6周或10周皮下或腹膜内施用。
杂交瘤生成和抗体筛选
处死免疫动物并根据专家已知的方法(例如杂交瘤技术)使脾细胞永生化(Kohler和Milstein,Nature 256(1975),495-497)。更详细地，将免疫小鼠的脾细胞与P3x63Ag8-653骨髓瘤细胞(ATTCC-CRL 8375)以1:5的比率混合并离心。再次洗涤细胞，松开细胞沉淀并添加1ml PEG(MG 4000,Merck)并使其通过移液管。在水浴中1分钟后，在室温并历经10分钟的时段滴加25ml RPMI 1640基础培养基；将溶液混合并在37℃和5％CO2下孵育30min。离心后，将沉淀的细胞放入24孔细胞培养板中的1ml选择培养基(100mM次黄嘌呤，1g/ml重氮丝氨酸，于RPMI 1640+10％FCS中)中，每孔含有5x10"个脾细胞。10天后，针对特异性抗体合成，对这些原代培养物进行测试。
对于所谓的Hit-ELISA，将各自的生物素化筛选肽(Aβ42肽的氨基酸1至12和35至42(通过接头连接))固定在链霉亲和素涂覆的96孔板的表面上，浓度为200ng/ml。将肽溶液在板上在RT孵育60分钟。洗涤后，将板用0.5％(w/v)Byco C在室温封闭30分钟，以减少背景信号。再次洗涤板，并将30μl杂交瘤培养物转移到96孔板中，并在RT孵育1小时。为了检测与筛选肽结合的抗体，添加了过氧化物酶缀合的AffiniPure F(ab′)2片段抗小鼠IgG和ABST(Roche)作为底物
Hit ELISA揭示了1508个识别Aβ42模拟肽(Aβ42肽的氨基酸1至12和35至42(通过接头连接))的抗体。
通过Biacore评估相应特异性的原代培养物，并经由FACS(细胞分选仪)在96孔细胞培养板中克隆具有良好动力学特性的克隆，包括克隆3.2.52(如下文实例2所示)。将白细胞介素-6(Boehringer Mannheim，目录号1271172，100U/ml)添加到培养基中作为生长添加剂。通过ELISA重新评估所有克隆的特异性，确定浓度和IgG亚类。
由于其动力学特征和Aβ42特异性(参见下面的实例2)，选定的抗体中的一者是克隆3.2.52。
为了进一步的实验，根据供应商的说明，经由一步式蛋白A亲和纯化(HiTrapMabSelect SuRe,GE)从培养物上清液中纯化IgG。
实例2：Aβ42抗体3.2.52的表征
如以上实例1中所述，选择作为特异性Aβ42结合剂的克隆中的一者是克隆3.2.52。该克隆被进一步表征，以评估其在夹心免疫测定中特异性检测(尤其是在血液样品中的)Aβ42的适用性。
动力学表征
进一步表征了在杂交瘤中表达的小鼠抗Aβ-42抗体3.2.52(IgG2b)。
使用BIAcoreTM8K+仪器进行测量。将范围为1.2nM至900nM的Aβ-42浓度系列以30μL/min进样。在37℃，监测缔合阶段3min，监测解离阶段5min至10min。
使用PBS-DT+，pH7.4(10mM磷酸盐缓冲液、2.7mM KCl、137mM NaCl5％DMSO、0.05％Tween 20)作为运行缓冲液进行测量。
使用Langmuir 1:1拟合模型根据Scrubber版本2.0.c计算动力学速率常数和解离平衡常数KD。
测量值在图1中示出。
杂交瘤中表达的小鼠克隆M-3.2.52的37℃动力学：ka＝3.8±0.1*106M-1s-1，kd＝2.53±0.06*10-2s-1，t/2diss<1min，MR＝0.7，亲和力KD＝6.7±0.2nM。抗体3.2.52的这些动力学特征表明该抗体非常适合用于Aβ42夹心免疫测定，尤其是使用系统的情况。
经由Elecsys评定交叉反应性
Aβ38(Aβ38肽的氨基酸1至12和25至38(通过接头连接))、Aβ40(Aβ40肽的氨基酸1至12和25至40(通过接头连接))以及Aβ43(Aβ43肽的氨基酸1至12和34至43(通过接头连接))肽以为自然预期浓度(健康患者中Aβ38预期水平：25pg/mL；Aβ40：250pg/mL；Aβ43：4pg/mL)的2倍、10倍和50倍过量掺入单个血浆样品。本实验中使用了截短的Aβ肽，因为全长Aβ肽会聚集并粘附在管壁上，这使得结果更加不可靠。评定对经确定的Aβ42水平的影响，如通过使用3.2.52作为捕获抗体并使用与N末端(Aβ42的氨基酸1至5)结合但不与3.2.52竞争结合的Aβ(非Aβ42特异性)抗体作为检测抗体(3D6，EP1613347)的所确定的。结果在表1中描绘。结果证实抗体3.2.52与Aβ42特异性结合。
表1显示了来自经由Elecsys(使用3.2.52作为捕获抗体)确定的3.2.52与Aβ38、Aβ40和Aβ43的交叉反应性的评定的结果。针对未掺杂的样品对浓度回收率进行归一化。所有三种肽均可以以为天然预期浓度50倍过量掺入，而对浓度回收率没有影响，指示在天然血浆样品中未观察到与Aβ38、Aβ40或Aβ43的相关交叉反应性。
实例3：与现有技术抗体相比，新Aβ42抗体3.2.52改善了血浆样品中淀粉样蛋白状
态的检测
使用以下血浆测定分析从240名患者(35名认知正常、110名轻度认知障碍、95名阿尔茨海默病[MMSE>22])收集的脑脊液和血浆样品：使用21F12作为捕获抗体的Aβ42，使用3.2.52作为捕获抗体的Aβ42，以及Aβ40。21F12是特异性识别Aβ42但不识别现有技术Aβ42测定中常用的其他Aβ肽的Aβ42抗体。Elecsys方法是一种基于抗体的技术，其基于一种捕获抗体和一种检测抗体。一般Elecsys测定设置如下：首先将最多50μL的样品，生物素化单克隆抗体(捕获抗体)和钌复合物标记的单克隆抗体(检测抗体；有关抗体的详细信息参见下表2)共孵育9分钟以形成包含生物素化抗体、分析物和钌化抗体的夹心复合物。在第二个孵育步骤(9分钟)中，将链霉亲和素涂覆的微粒(Elecsys珠)添加到第一个孵育步骤的混合物中，并且因此，包含生物素化抗体、分析物和钌化抗体的复合物经由生物素和链霉亲和素的相互作用与固相结合。将反应混合物吸入测量池中，其中微粒被磁性捕获到电极表面上。然后用ProCell/ProCell M去除未结合的物质。向电极施加电压，然后通过光电倍增管测量诱导的化学发光发射。样品浓度根据5点校准曲线确定。
淀粉样蛋白状态由CSF pTau181/Aβ42比率，使用0.024的截止值确定(数据可用于231名患者；113名淀粉样蛋白阳性，118名淀粉样蛋白阴性)。接受者操作特征曲线下面积(ROC AUC)分析用于研究血浆生物标记物比率与如CSF pTau181/Aβ42所确定的淀粉样蛋白状态之间的一致性。95％CI使用DeLong方法计算。血浆Aβ42/Aβ40比率在多项研究中已被证明是淀粉样蛋白阳性的有用诊断标记物(例如Hampel等人,Nat RevNeurol,2018.14(11):第639-652页的综述)，其在用于区分Aβ-阳性(在本文也称为淀粉样蛋白阳性)与阴性参与者时在使用新3.2.52抗体时令人惊讶地具有显著较高的AUC(0.865，95％CI 0.815-0.915)，与使用21F12抗体的Aβ42/Aβ40比率的AUC相比(0.797，95％CI0.738-0.856；p＝0.0086)(参见图2)。
该结果证明，本文提供的新的Aβ42特异性抗体具有令人惊讶和意想不到的特征，与现有技术Aβ42抗体相比，其明显改善了血浆中Aβ42测定的临床结果。
实例4：现有技术单克隆抗Aβ42抗体在Aβ42免疫测定中显示出IgM介导的类风湿因
子干扰，该类风湿因子干扰被新的Aβ42抗体克服
对于可靠和稳健地检测(尤其是血液样品(诸如血浆样品)中的)Aβ42而言，一个重要因素是样品中的组分与免疫测定组分(诸如抗体)之间的干扰保持在最低限度。本领域已知的对血液样品的潜在免疫测定干扰是所谓的类风湿因子(Rf)干扰。类风湿因子是自身抗体，最常见的是免疫球蛋白M(IgM)亚型，通常在患有类风湿性关节炎和其他疾病(诸如狼疮或败血症)的患者血液中发现浓度升高。重要的是，健康老年人(>70岁)的Rf也经常升高(Francesca Ingegnoli等人,Dis Markers.2013；35(6):727–734)。Rf干扰可能导致假阳性或假阴性测定结果，并且由此降低此类测定的临床价值。
如下所证明的，我们令人惊讶地发现，广泛并成功地用于脑脊液(CSF)样品的Aβ42免疫测定的两种Aβ42特异性抗体(来自Eli Lilly的21F12，以及来自ThermoFisherScientific的H31L21)在具有增加Rf水平的许多血浆样品中遭受Rf干扰。这些抗体的这一先前未知的特征，可能是由于使用CSF样品(其中Rf干扰不是问题)，似乎是两种先前已知的抗Aβ42抗体的共同问题，即使它们在结构上可能不相关。
引人注目的是，如下所证明的，本文提供的新的Aβ42抗体3.2.52没有显示出与团体中广泛使用的其他两种常用Aβ42抗体所观察到的Rf干扰。由于不存在Rf干扰，本文提供的新抗体3.2.52提供了血液中Aβ42水平的更可靠和准确的量化。如从以上实例3明显看出的，抗体3.2.52还提供了基于血浆的免疫测定与用于检测淀粉样蛋白阳性的基于CSF的护理标准免疫测定的改进的相关性。减少干扰是尤其有助于改善临床性能的一个重要因素。
方法
1)用浓缩的Rf掺入含有Aβ42的血浆样品
为了评估和比较Rf干扰对使用不同Aβ42抗体(即3.2.52、21F12和H31L21)的免疫测定的潜在影响，在血浆样品中掺入Rf浓缩物(包含Rf IgM)，并在存在和不存在Rf浓缩物的情况下检测Aβ42水平。Rf浓缩物是通过从患有类风湿性关节炎(RA)的患者的血浆池中纯化Rf而获得的，基本上遵循J Immunol Methods,1993,158(1):1-4,doi:10.1016/0022-1759(93)90252-3中描述的程序。简而言之，首先对来自RA患者的血浆进行离心，以去除聚集的蛋白质。接下来，使用2M乙酸将上清液的pH调节至4.75，并在RT孵育60分钟后，使用2MTris碱将上清液的pH重新调节至7.5。离心后，使用2.5M CaCl2x2H2O(最终浓度20mM)重新钙化上清液。在RT孵育2小时后，将混合物离心，并通过每升血浆添加100mL 3.53％硫化葡聚糖、4.47M CaCl2溶液对上清液进行脱脂。在RT孵育30分钟后，将混合物离心并保留上清液。为了富集Rf IgM，使用聚乙二醇(PEG)沉淀免疫球蛋白，并经由硫酸铵沉淀进一步纯化以消除残留的PEG。最终沉淀溶解在50mM磷酸钾、150mM NaCl缓冲液中。Rf活性使用RocheRF-II测定确定。
除了使用不同的Aβ42特异性抗体进行测试之外，免疫测定基本相同。方法是一种基于抗体的技术，其基于一种捕获抗体和一种检测抗体。一般Elecsys测定设置如下：首先将最多50μL的样品，生物素化单克隆抗体(捕获抗体)和钌复合物标记的单克隆抗体(检测抗体；有关抗体的详细信息参见下表2)共孵育9分钟以形成包含生物素化抗体、分析物和钌化抗体的夹心复合物。在第二个孵育步骤(9分钟)中，将链霉亲和素涂覆的微粒(Elecsys珠)添加到第一个孵育步骤的混合物中，并且因此，包含生物素化抗体、分析物和钌化抗体的复合物经由生物素和链霉亲和素的相互作用与固相结合。将反应混合物吸入测量池中，其中微粒被磁性捕获到电极表面上。然后用ProCell/ProCell M去除未结合的物质。向电极施加电压，然后通过光电倍增管测量诱导的化学发光发射。样品浓度根据5点校准曲线确定。
所测试的不同免疫测定中使用的抗体总结于下表2中
表2：免疫测定设置。
在第一个实验中，在不存在外部Rf的情况下测量血浆样品，并以对应于300IU/mlRf活性的量掺入Rf浓缩物。通过计算在不存在外部Rf的情况下确定的Aβ42浓度与在存在300IU/ml Rf的情况下确定的Aβ42浓度之间的比率来计算浓度回收率百分比。将获得的值乘以100以获得百分比。在此实验中，使用IgG格式的抗体。
如图3所示，非常令人惊讶的是，广泛使用的Aβ42抗体21F12和H31L21在存在300IU/mL Rf活性的情况下均产生异常结果。这个似乎是现有技术抗体的普遍问题的问题被新的抗Aβ42抗体3.2.52惊人地克服了。
第二个实验使用另一批Rf浓缩物，比较了宽浓度范围内21F12和3.2.52F(ab')2片段上的Rf干扰。如图4所示，第二个实验证实3.2.52不受Rf水平高达1200IU/mL的影响，而现有抗体克隆21F12受到严重影响，导致假阴性结果。值得注意的是，对于第二个实验中使用的Rf浓缩物批次，干扰甚至更为严重。这表明引起干扰的特定Rf浓度在第二个Rf浓缩物批次中较高。
使用F(ab')2片段时也发现了干扰，这一事实进一步证明Rf干扰不是靶向抗体Fc部分的典型Rf干扰。相反，干扰是由21F12抗体的F(ab')2片段引起的。更具体地，有强有力的证据表明Rf干扰是由21F12(和H31L21)的VH和VL引起的。首先，21F12和3.2.52都是鼠抗体，即享有在VH和VL之外的高序列同一性。其次，在样品混合物中添加与和Aβ42无关的表位结合的高达500μg/mL的全长鼠IgG不会改变观察到的干扰(图5)。第三，生产具有人IgG1恒定区(即人IgG1 CH1和CL以及小鼠VH和VL)的21F12 Fab的重组嵌合版本并没有解决干扰问题(图6)。第四，使用21F12和H31L21测量的Aβ浓度低于应有浓度，指示Rf可能会干扰抗原结合；即分别针对21F12和H31L21的抗原结合结构域。尤其是上述第一和第二个论据进一步指示21F12的CDR是Rf干扰的主要贡献者，因为在VH和VL的框架区中在鼠抗体之间存在极高的序列同一性。框架区的高序列同一性通过比较21F12(分别为SEQ ID NO:19和20)和3.2.52(分别为SEQ ID NO:1和2)的VH和VL框架序列而显而易见，如图7和图8所示。因此，总而言之，观察到的Rf干扰似乎是由21F12(也可能是H31L21)的CDR引起的。
2)含有升高水平的Rf的天然样品中 Aβ42水平的量化。
为了评定是否也可以在天然血清样品中观察到先前已知的抗Aβ42抗体和新生成的抗Aβ42抗体3.2.52之间Rf干扰的显著差异，对具有升高的Rf水平(300IU/mL或更高)的血液样品集进行免疫测定。在此实验中，再次使用Aβ42特异性抗体的F(ab')2片段。
如下表3所示，并且与上述掺杂样品的分析一致，3.2.52在样品子集中检测到较高的Aβ42水平(在表3中以粗体突出显示)，表明21F12产生了异常低的结果。这一发现提供了明确的证据表明也在Rf升高的显著血清样品子集中，对于先前可用的抗体(以21F12为例)，发现了导致异常低的Aβ42水平的显著Rf干扰。相比之下，新抗体3.2.52克服了这一缺点。
表3：含有升高水平的Rf的天然样品中Aβ42水平的量化。经由使用21F12或3.2.52作为捕获抗体的Elecsys确定水平。根据21F12结果对浓度回收率(以％计)进行归一化。以灰色/粗体突出显示的结果显示回收率≥120％，或者n.a.(不可得)意指无法计算回收率，因为用21F12确定的Aβ42水平为零。
3)Rf水平升高的天然样品的Rf IgM与21F12结合
为了进一步评定观察到的Rf干扰的性质，评定了Rf水平升高(>300IU/mL)的样品中是否发现Rf IgM与抗体21F12结合。为此，使用了Elecsys测定设置(一般设置见上文)，其允许研究Aβ42抗体是否与来自Rf水平升高的患者的天然样品中含有的Rf IgM结合。简而言之，使作为F(ab')2片段的生物素化的Aβ42抗体与链霉亲和素珠偶联，添加含有Rf IgM的天然样品，并用钌化抗IgM抗体检测结合的IgM。测定设置的示意图在图9中描绘，并且在本文中也称为μ-捕获测定。
使用这种测定格式，我们比较了天然Rf-IgM与Aβ42抗体21F12和3.2.52(均作为F(ab')2片段)以及与不相关的对照抗体TU2的结合(参见表4)。结合被定义为信号>40,000的Elecsys计数，因为阴性对照抗体TU2产生最大39,301计数的信号(样品RF_3_13)。在Rf水平升高的7/24个样品(29.2％)中检测到与21F12的结合，而3.2.52和TU2未检测到结合(参见表4)。
表4：经由Elecsys评定Aβ42抗体21F12和3.2.52(均作为F(ab')2片段)与来自Rf水平升高患者的天然样品中所含Rf IgM的结合。TU2用作无关的阴性对照抗体。结合被定义为信号>40,000的Elecsys计数(以灰色/粗体突出显示)。n.a.(不可得)指示未获得该特定样品的结果。
下面的表5显示了第2)节和第3)节中给出的实验结果的总结。6个样品在两个实验中显示出一致的结果，即使用3.2.52抗体时Aβ42浓度较高，并且还与21F12结合，但不与3.2.52抗体结合。这证实了IgM Rf可能是观察到的现有技术Aβ42抗体的Rf干扰的原因。在显示Rf干扰的其他样品中(即其中检测到使用3.2.52的较高浓度)，可能IgM水平太低而无法检测到或者其他同种型的抗体(例如，IgG)引起干扰。
表5：表3和4的实验结果的总结表明，现有技术单克隆抗Aβ42抗体在Aβ42免疫测定中显示出IgM介导的类风湿因子干扰，该干扰被新的Aβ42抗体3.2.52克服。x指示该特定样品在各自实验中给出了阳性结果。n.a.指示该特定样品/实验未获得任何结果。6个样品在两个实验中显示出一致的结果(以灰色/粗体突出显示)，即使用3.2.52抗体时Aβ42浓度较高，并且还与21F12结合，但不与3.2.52抗体结合。
Claims (15)
1.一种与Aβ42特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域(VH)包含(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，以及(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，并且其中轻链可变结构域(VL)包含(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体，以及(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其具有一个氨基酸取代的变体。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变结构域(VH)包含(a)SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1，(b)SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2，以及(c)SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H3，并且轻链可变结构域(VL)包含(d)SEQID NO:6的氨基酸序列的CDR-L1，(e)SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L2，以及(f)SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L3。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中
(i)所述重链可变结构域(VH)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；并且
(ii)所述轻链可变结构域(VL)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述重链包含以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和/或其中所述轻链包含以下项：SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQID NO:10具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中当所述单克隆抗体或所述抗原结合片段在夹心免疫测定中用作Aβ42特异性结合剂用于检测和/或量化血液样品中的Aβ42时，使用Aβ42/Aβ40比率来确定具有已知淀粉样蛋白状态的参考群体的血液样品中的淀粉样蛋白阳性的准确度高于使用Aβ42抗体21F12和/或H31L21的相同Aβ42夹心免疫测定的准确度，其中所述准确度通过接受者操作特征(ROC)分析的曲线下面积(AUC)评定。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中当所述单克隆抗体或所述抗原结合片段在免疫测定中用作Aβ42特异性结合剂用于检测和/或量化血液样品的Aβ42时，不显示出类风湿因子(Rf)干扰，其中所述血液样品在用于免疫测定时显示出利用所述Aβ42抗体21F12和/或H31L21的Rf干扰。
7.一种多核苷酸或多核苷酸集，其编码
(i)根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段的重链或重链可变结构域，和/或
(ii)根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段的轻链或轻链可变结构域。
8.一种载体，其包含根据权利要求7所述的多核苷酸或多核苷酸集。
9.一种宿主细胞，其包含根据权利要求7所述的多核苷酸或多核苷酸集或者根据权利要求8所述的载体。
10.一种生产根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段的方法，其包括培养根据权利要求9所述的宿主细胞以及分离所述抗体。
11.一种组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段、根据权利要求7所述的多核苷酸、根据权利要求8所述的载体或者根据权利要求9所述的宿主细胞。
12.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段作为Aβ42结合剂用于检测或量化样品中的Aβ42的用途。
13.一种用于确定样品中的Aβ42的存在和/或水平的体外方法，所述方法包括：
(a)使根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段与所述样品在允许根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段与所述样品中的Aβ42结合的条件下接触；以及
(b)通过检测根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段与Aβ42的结合来确定所述样品中Aβ42的存在或水平。
14.一种用于帮助检测受试者的淀粉样蛋白阳性的体外方法，所述方法包括
a)使用根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原片段确定所述样品中的Aβ42的水平；
b)确定所述样品中的Aβ40的水平；
c)由Aβ42的水平和Aβ40的水平确定组合值；以及
d)将所述组合值与预定的参考组合值进行比较，其中改变的组合值指示淀粉样蛋白阳性。
15.一种用于检测和/或量化样品中的Aβ42的试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
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