CN118374495A

CN118374495A - 一种抑制NLRP3基因表达的siRNA及其前体和应用

Info

Publication number: CN118374495A
Application number: CN202410368927.4A
Authority: CN
Inventors: 裴中; 苏凤娟; 林丽山
Original assignee: Shenzhen Brain Health Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Brain Health Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-03-28
Filing date: 2024-03-28
Publication date: 2024-07-23

Abstract

本发明公开一种抑制NLRP3基因表达的siRNA及其前体和应用。包含该siRNA或其前体序列的表达载体及它们在治疗神经系统疾病特别是帕金森病和阿尔兹海默病的药物中的应用，以及包含所述siRNA、前体序列或表达载体的药物制剂和药物组合物，该siRNA选自下组：SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或其组合。本发明的siRNA可有效抑制脑组织中NLRP3的表达，还可改善运动协调能力和认知功能，有效治疗帕金森病和阿尔兹海默症；本发明通过静脉注射的方式给药，与鞘内注射、颅内注射给药方式相比，侵入性小，更为安全。

Description

一种抑制NLRP3基因表达的siRNA及其前体和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种抑制NLRP3基因表达的siRNA及其前体和应用。

背景技术

神经系统退行性疾病是包括帕金森病(Parkinson’s disease，PD)，阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)在内的一大类疾病，神经炎症是这类疾病的一大共同病理特征，随着疾病的进展，患者脑内的炎症呈不同程度的活化，进而导致PD患者脑内的α-synuclein蛋白积聚以及多巴胺能神经元的丢失；AD患者脑内的Aβ以及tau蛋白积聚进而导致海马等部位神经元的丢失。临床表现上，这类患者疾病进行性进展，表现为运动、认知、精神等多种障碍，目前的治疗均以对症治疗为主，尚无有效的治疗方法。因此，寻找安全有效的治疗方法十分重要。

目前NLRP3的小分子抑制剂虽然在临床前研究中取得良好疗效，但由于小分子药物自身局限性，目前尚未应用于临床试验中；NLRP3通路的下游分子IL1β的抑制剂目前在多个疾病如心血管疾病的临床试验中取得了良好效果，证明了炎症在疾病修饰中的重要作用。因此，本领域迫切需要开发一种能够调控NLRP3活性或表达量且能够到达脑内的siRNA。

因此，现有技术存在缺陷，需要改进。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种抑制NLRP3基因表达的siRNA及其前体和应用，以解决背景技术所提到的问题。

本发明在于提供一种抑制NLRP3基因表达的siRNA。

本发明在于提供一种包含上述siRNA的前体序列。

本发明在于提供一种多核苷酸。所述多核苷酸能被宿主转录形成如前述的前体序列。

本发明在于提供一种表达载体。所述表达载体包含前述的前体序列或前述的多核苷酸。

本发明在于提供一种重组细胞。所述重组细胞包含前述的表达载体。

本发明在于提供上述siRNA、前体序列、多核苷酸、表达载体、重组细胞的应用。应用的产品的功能为以下至少一项：

(1)、治疗NLRP3相关疾病的药物；(2)、抑制哺乳动物组织中NLRP3的表达；(3)、改善哺乳动物的运动协调能力和/或认知能力；(4)、减少哺乳动物脑内神经元丢失；(5)、减少哺乳动物脑内代谢废物沉积。优选地，所述NLRP3相关疾病包括神经系统疾病、外周相关疾病；优选地，所述神经系统疾病包括帕金森病、阿尔茨海默症、脑中风、多发性硬化、亨廷顿病、脑小血管病、脑外伤；所述外周相关疾病包括肥胖、冠心病等。

本发明在于提供一种药物。所述药物包含前述的siRNA或前述的前体序列或前述的多核苷酸或前述的表达载体或前述重组细胞。优选的，所述药物还包括其他治疗帕金森病或阿尔茨海默症或脑中风或亨廷顿病或肥胖的药物。

本发明在于提供一种生产上述siRNA的方法。所述方法包括培养前述的重组细胞产生siRNA。

本发明在于提供一种抑制NLRP3基因表达的方法。包括利用前述的siRNA或前述的前体序列或前述的多核苷酸或前述的表达载体或前述重组细胞抑制NLRP3基因的表达；所述方法为非治疗目的的。

具体的，本发明提供了一种能够调控NLRP3活性或表达量的siRNA。

本发明第一方面提供了一种前体序列，其5’至3’端具有式I所示的结构：

B1为所需要的第一核糖核酸序列，其中所述的第一核糖核酸序列包括NLRP3siRNA正义链序列；

B2为与B1基本互补或完全互补的序列，且B2与C不互补；C为茎环结构序列；

其中，所述NLRP3 siRNA正义链的核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3或其组合。

在另一优选例中，所述前体序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6。

本发明第二方面提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成本发明第一方面所述的前体序列。

本发明第三方面提供了一种表达载体，所述的表达载体含有本发明第一方面所述的前体序列或本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的表达载体包括病毒载体、非病毒载体。

在另一优选例中，所述的表达载体为质粒。

在另一优选例中，所述的表达载体还含有编码融合了nona-d-精氨酸残基的狂犬病毒表面糖蛋白短肽(RVG-9dR肽)的多核苷酸。

本发明第四方面提供了一种药物制剂，所述的制剂含有：(a)用于表达抑制NLRP3基因表达的siRNA的表达载体；以及(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的表达载体含有表达本发明第一方面所述的前体序列或本发明第二方面所述的多核苷酸，或表达本发明第一方面所述的前体序列。

在另一优选例中，所述的表达载体表达式I所示的前体，

B2为与B1基本互补或完全互补的序列，且B2与C不互补；

C为茎环结构序列；

在另一优选例中，所述的制剂为液体剂型。

在另一优选例中，所述的制剂为注射剂。

在另一优选例中，所述的表达载体包括质粒。

在另一优选例中，所述的表达载体或质粒含有启动子、复制起点和标记基因。

在另一优选例中，所述的表达载体中含有表达NLRP3 siRNA的表达盒。

在另一优选例中，所述的表达盒(即多核苷酸)为双链，并且具有以下结构：启动子-attBl-任选的RVG-9dR-任选的标签蛋白(如Lamp2b)-5’siRNA侧翼区序列-式I所示的序列-3'siRNA侧翼区序列-attB2。

在另一优选例中，所述的制剂为脂质体或外泌体制剂。

本发明第五方面提供了一种抑制NLRP3基因表达的siRNA，所述siRNA的正义链核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或其组合。

本发明第六方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有本发明第一方面所述的前体序列、或本发明第三方面所述的表达载体，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括NLRP3 siRNA质粒。

在另一优选例中，所述的药物组合物还包括其他治疗帕金森病和阿尔兹海默病的药物。

在另一优选例中，所述的药物组合物为权利要求3所述的表达载体，较佳地，为含有权利要求1所述前体序列的质粒。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括：片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液、混悬液、乳剂、混悬剂、注射液、或粉针剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型还包括喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、挥发性液体、外用溶液剂、洗剂、浇淋剂、搽剂、巴布膏剂、膏药、橡胶25膏剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂或栓剂。在另一优选例中，所述的剂型为注射剂，较佳地，为静脉注射剂、腹腔注射剂。

本发明第七方面提供了本发明第六方面所述siRNA、本发明第一方面所述前体序列、或本发明第三方面所述表达载体的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于治疗帕金森病和阿尔兹海默病。

在另一优选例中，所述组合物或制剂还用于选自下组的一种或多种用途：(i)抑制哺乳动物组织中NLRP3的表达；和/或(ii)改善哺乳动物的运动协调能力和认知能力；和/或(iii)减少哺乳动物脑内神经元丢失；和/或(iv)减少哺乳动物脑内代谢废物如Aβ、tau、α-synuclein沉积。

在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括：啮齿动物(如鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。

在另一优选例中，所述哺乳动物组织包括脑组织、脂肪组织，所述脑组织包括纹状体、黑质、海马、皮质。

本发明第八方面提供了一种治疗帕金森病和阿尔兹海默病的方法，将安全有效量的本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的药物制剂、或本发明第六方面所述的药物组合物施用于所需对象，从而治疗帕金森病和阿尔兹海默病。

在另一优选例中，所述施用的剂量为l-20mg/kg，较佳地，为5-10mg/kg。

在另一优选例中，所述施用频率为两天一次或2次/周。

在另一优选例中，所述施用包括：口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜或腔道给药。

在另一优选例中，所述施用包括注射质粒。

本发明第九方面提供了一种抑制哺乳动物组织中NLRP3的表达；和/或改善哺乳动物的运动协调能力和认知能力的方法，包括：将安全有效量的本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的药物制剂、或本发明第六方面所述的药物组合物施用于所需对象，从而抑制哺乳动物组织中NLRP3的表达；和/或改善哺乳动物的运动协调能力和认知能力。

采用上述方案，本发明的有益效果是：本发明提供一种抑制NLRP3基因表达的siRNA及其前体序列、包含该siRNA或其前体序列的表达载体及重组细胞、以及包含所述siRNA、前体序列、表达载体或重组细胞的药物组合物，该siRNA选自下组：SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3或其组合；本发明还通过将RVG-9dR与Lamp2b以及siRNA联合，使得在其下游与其串联表达的siRNA，能够顺利、高效穿过血脑屏障，定向到达脑组织的小胶质细胞并发挥功能，提供了一种新的靶向到特异性细胞的基因治疗药物；并通过实验验证了在治疗神经系统退行性疾病特别是帕金森病和阿尔兹海默病的药物中的应用；结果显示本发明的RVG9dR相比较于RVG，能够更有效地递送siRNA到达脑内；本发明的siRNA可有效抑制脑组织中NLRP3的表达，还可改善运动协调能力和认知功能，有效治疗帕金森病和阿尔兹海默症；本发明通过静脉注射的方式给药，与鞘内注射、颅内注射给药方式相比，侵入性小，更为安全。

附图说明

图1为质粒的结构；包含NLRP3-siRNA的RVG-9dR质粒环结构图；此基因环包括三部分：一个共驱动的CMV启动子，一个小胶质细胞导向的RVG-9dR标签，和一个NLRP3-siRNA表达骨架。

图2为质粒的体外干扰效率。BV-2小胶质细胞经过CMV-RVG9dR-siR NLRP3质粒或CMV-ScrR质粒(对照)转染24小时，然后通过脂多糖(LPS)加尼日利亚菌素诱导NLRP3炎症小体活化。A.Western免疫印迹法检测NLRP3的代表性图片；β-actin为对照。B.NLRP3蛋白水平定量分析(每组n＝4)；使用单因素方差分析和Bonferronis多重比较确定显著性。***p<0.001；ns：无显著差异。

图3和图4为外泌体的鉴定。图3A.实验流程图；使用C57BL/6J小鼠，每2天尾静脉注射5mg/kg CMV-ScrR、CMV-siR^NLRP3或CMV-RVG9dR-siR^NLRP3质粒或PBS，共7次；然后从小鼠血浆中纯化外泌体，并与BV-2细胞一起孵育；收集细胞用于进一步的RT-PCR、Western免疫印迹和免疫荧光检测。图3B.用NanoSight NS 300系统(NanoSight技术)测量外泌体的大小分布和数量。图4A.透射电镜TEM(HT7700，日本)观察纯化的外泌体囊泡的代表性图像。图4B.使用western blot检测外泌体标记物：Alix、Tsg101、Hsp70和calnexin。

图5和图6为CMV-RVG9dR-siR^NLRP3衍生的外泌体离体实验疗效评估；小鼠注射不同的质粒后，提取外泌体并将其与BV-2细胞共培养24小时，然后用LPS(200ng/mL)刺激细胞5小时，用尼日利亚菌素(1uM)刺激细胞1小时。然后收集细胞用于进一步的Western免疫印迹、RT-PCR和免疫荧光检测，从而检测NLRP3的表达(NC作为没有LPS和尼日利亚菌素刺激的阴性对照)。图5A.NLRP3的代表性Western免疫印迹检测图像。图5B.图5A中NLRP3蛋白水平的定量(每组n＝3)。图5C.使用RT-PCR定量NLRP3mRNA水平(每组n＝3)。图5D和图5E.用PKH-26标记纯化的外泌体，然后与BV-2细胞共培养6小时；图5D.BV-2细胞中PKH-26染色的代表性图像，表明外泌体可以被BV-2细胞摄取；图5E.图5D中PKH26荧光强度的定量(每组n＝3)。图6A.BV-2细胞中NLRP3和PKH26(外泌体染料)的代表性共染色。图6B.图6A中NLRP3荧光强度的定量(每组n＝3)。数值以平均值±SEM表示。在图5B、图5C和图5E中使用单因素方差分析，然后使用Bonferroni多重比较来确定显著性。**P<0.01；***P<0.001；ns＝无显著差异。

图7为自组装NLRP3-siRNA外泌体向黑质的递送示踪。每2天给C57BL/6J小鼠静脉注射PBS或5mg/kg CMV-ScrR、CMV-siR^NLRP3或CMV-RVG9dR-siR^NLRP3质粒，共3次。随后处死小鼠收集血浆、肝脏和黑质组织。A-C.使用RT-PCR定量血浆(A)、肝脏(B)和黑质(C)中的NLRP3siRNA水平(每组n＝6)。数值表示为平均值±SEM。

图8-图10为注射小胶质细胞特异性CMV-RVG9dR-siR^NLRP3可减弱MPTP诱导的PD样病理表型。图8A.实验设计流程图；4月龄C57BL/6J小鼠连续5天腹腔注射25mg/kg MPTP建立帕金森病模型，每2d静脉注射CMV-ScrR或CMV-RVG9dR-siR^NLRP3 5mg/kg，共6次，后进行运动行为测定，并处死小鼠进行进一步的生化和病理评估。图8B.TH蛋白的代表性western blot图像。图8C.NLRP3炎性小体相关分子的代表性western blot图像，包括NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β，GAPDH作为内参。图8D和图8E.定量测定图8B、图8E组蛋白水平(每组n＝4)。图9A和图9B.黑质IBA-1+小胶质细胞(红色信号)和TH+多巴胺能神经元(绿色信号)的代表性染色图。图10A-图10C.悬挂试验(图10A)、步态试验(图10B)、转棒试验(图10C)的运动表现(每组n＝12)。数值以平均值±SEM表示。图8D、图8E、图10A、图10B采用单因素方差分析后进行Bonferroni多重比较，以检验差异的显著性。*P<0.05，**P<0.01；***p<0.001；ns＝不显著。

图11-图12为注射CMV-RVG9dR-siR^NLRP3可减轻LRRK2相关的PD样病理表型。

图11A.实验设计流程图。图11B和图11C.黑质IBA-1+小胶质细胞(红色信号)和TH+多巴胺能神经元(绿色信号)的代表性染色图。图12A.NLRP3炎性小体相关分子的代表性western blot图像，包括NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β，GAPDH作为内参。图12B.图12A蛋白水平定量(每组n＝4)。图12C.TH蛋白的代表性western blot图像。图12D.图12C蛋白水平定量(每组n＝4)。*P<0.05，**P<0.01；***p<0.001；ns＝不显著。

图13-图16为注射CMV-RVG9dR-siR^NLRP3可减轻A53T-α-synuclein诱导的PD样病理表型。图13A.实验设计流程图；4月龄C57BL/6J小鼠双侧黑质注射AAV9-hsynP或AAV9-GFP作为对照，AAV-synuclein小鼠静脉注射CMV-ScrR和CMV-RVG9dR-siR^NLRP3，每周2次，连续2个月；末次注射后进行运动行为测定，然后处死小鼠进行进一步的生化和病理研究。图13B.NLRP3炎性小体相关分子的代表性western blot图像，包括NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β，GAPDH作为内参。图13C.TH蛋白的代表性western blot图像。图13D和图13E.定量测定图13B、图13E组蛋白水平(每组n＝4)。图14A和图14B.黑质IBA-1+小胶质细胞(红色信号)和TH+多巴胺能神经元(绿色信号)的代表性染色。图15.黑质中TH(蓝色信号)和p-S129(红色信号)的共染色。I.a-syn和pS129-syn具有代表性的western blot图像。图16A-图16D.悬挂试验(图16A)、步态试验(图16C、图16D)和转棒试验(图16B)的运动表现(每组n＝12)。数值以平均值±SEM表示。图13D、图13E、图15、图16A采用单因素方差分析后进行Bonferroni多重比较，以检验差异的显著性。*P<0.05，**P<0.01；***p<0.001；ns＝不显著。

图17为NLRP3 siRNA/RVG-9dR质粒对阿尔兹海默病细胞模型的NLRP3通路抑制效果。siRNA-3抑制BV2细胞NLRP3炎性体活化的Western blot和细胞免疫荧光分析。(a-b)Western blot和定量分析fAβ诱导的NLRP3相对于β-微管蛋白的表达。在最后三组BV2细胞中，我们先用LPS刺激4小时，然后再用fAβ刺激细胞。后两组分别将siCTL或siNLRP3转染BV2细胞4h，然后再添加LPS和fAβ。(c-d)fAβ诱导的ASC活化的Western blot和定量。(e-f)fAβ诱导caspase-1活化的Western blot和定量。(g-h)Western blot和fAβ诱导IL-1β释放的定量。(i-j)BV2细胞NLRP3定量和ASC染色的免疫荧光图像。比例尺为20μm。(k)ASC和NLRP3在BV2细胞细胞质中的共定位。比例尺为10μm。采用单因素方差分析；*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001。

图18为NLRP3 siRNA/RVG-9dR质粒使阿尔兹海默病细胞模型的小胶质细胞从促炎的M1型转化为抗炎的M2型。BV2小胶质细胞极化的Western blot和细胞免疫荧光分析。(a-b)LPS和fAβ诱导的活化BV2细胞中M1标记物MHCⅡ的Western blot和定量分析。(c-d)BV2细胞中M2标记物ARG1的Western blot和定量。(e-f)M1标记CD16和M2标记CD206的免疫荧光图像及统计分析。比例尺为20μm。采用单因素方差分析；*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001。

图19为NLRP3 siRNA/RVG-9dR质粒促进阿尔兹海默病细胞模型的小胶质细胞自噬，从而促进Aβ清除。BV2细胞自噬的Western blot和细胞免疫荧光分析。(a-b)Westernblot和定量LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ与总LC3相对于fAβ诱导的β-微管蛋白表达的比值。(c-d)fAβ诱导的p62表达的Western blot和定量分析。(e-f)定量测定fAβ变性和LC3B的免疫荧光图像。比例尺为20μm。采用单因素方差分析；*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001。

图20为CMV-RVG-9dR-siR^NLRP3相比较于CMV-RVG-siR^NLRP3更高效地递送NLRP3-siRNAs到达脑内。C57BL6/J小鼠每两天静脉注射一次质粒，共注射7次，后取材检测脑组织NLRP3-siRNAs的表达水平。实时荧光定量PCR结果显示，CMV-RVG-9dR-siR^NLRP3递送siRNA到脑内的量大概为CMV-RVG-siR^NLRP3的两倍。采用单因素方差分析；***P≤0.001。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。

本发明人经过广泛而深入地研究，首次筛选了大量核酸序列，首次发现某些特定siRNA对于NLRP3具有非常高的抑制能力。并且本发明首次制备了一种能够高效表达NLRP3siRNA的前体siRNA，本发明前体siRNA经过宿主细胞的加工后，能够高效地表达siRNA，从而有效地避免了目的序列的反向互补序列对目的序列发挥功能的干扰作用。实验证明，本发明前体siRNA能够在体内有效表达NLRP3 siRNA序列，并对帕金森病、阿尔兹海默症都具有更有效的治疗作用。在此基础上，本发明人完成了本发明。

siRNA及其前体

如本文所用，所述的"siRNA"是指一类RNA分子，从可形成siRNA前体的转录物加工而来。成熟的siRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的siRNA分子。siRNA通常可被Northern印迹检测到。人来源的siRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

值得说明的是，siRNA一般通过模拟miRNA产生机制来产生的，这样的siRNA就可从前体RNA(Precursor RNA，Pre-RNA)加工而来。所述的前体RNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体RNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体RNA可以是天然的或是人工合成的。

在本发明中，所述的前体siRNA为人工合成的前体siRNA，且所述的前体siRNA具有式I所示的结构：

作为代表性的例子，B1为NLRP3 siRNA正义链序列；B2为与B1互补(包括基本互补和完全互补)的序列；

C为茎环结构；

其中，所示的前体siRNA能在宿主中加工形成NLRP3 siRNA，在本发明中，形成NLRP3 siRNA的前体miRNA可被剪切生成调节NLRP3基因的siRNA，即NLRP3 siRNA(例如，SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3)；

SEQ ID NO.1：AGAACATTCAACATGAGTGTC(2348)

SEQ ID NO.2：AACACGTTCATCCTCAGGAAA(1717)

SEQ ID NO.3：TACACGTGTCATCCACTCTG(495)

前体RNA可被剪切生成siRNA，所述的siRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。在式I中，B2和B1为基本互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、9个不匹配的核苷酸。

在本发明的一优选实施方式中，本发明的前体如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6。

NLRP3-Si2348sense5-TGAAATTCGAGAACAGGCAATGAGTGTCGT TTTGGCCACTGACTGACGACACTCATTGCCTGTTCTCACCGGT-3(SEQ ID NO.4)。

NLRP3-Si1717sense5-GAAATTCGAACACGTTCATTCAGGAAAGTTT TGGCCACTGACTGACTTTCCTGAATGAACGTGTTCACCGGT-3'(SEQ ID NO.5)。

NLRP3-Si495sense5-GAAATTCGTACACGTGTCACCACTCTGGTTTT GGCCACTGACTGACCAGAGTGGTGACACGTGTACACCGGT-3'(SEQ IDNO.6)。

如本申请所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明中，“茎环结构”可存在于式I所示前体siRNA的末端，例如由于B1和B2形成基本互补后，C会形成一固定的末端茎环结构；所述的“茎环结构”还可存在于式I所式前体siRNA内部，例如由于B1和B2之间并非完全互补，造成未互补结合的Bl或B2的碱基会形成一内部的茎环(internal loop)。

本发明所述的siRNA是指：抑制NLRP3的siRNA家族的微小RNA，所述抑制NLRP3的siRNA家族的微小RNA包括：抑制NLRP3的siRNA或经修饰的抑制NLRP3的siRNA衍生物。

在本发明的一个优选例中，抑制NLRP3的siRNA的核苷酸酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示(分别对应于实施例中的siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)。优选的是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，更优选SEQ ID NO.1。

本发明还包括siRNA变体和衍生物。此外，广义上的siRNA衍生物也可包括siRNA变体。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对抑制酪氨酸激酶的siRNA进行修饰，修饰方式包括(但不限于)：甲基化修饰、煌基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、煌基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、修饰(如“TT”修饰)等。

多核苷酸构建物

根据本发明所提供的siRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的siRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的siRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体RNA，所述的前体RNA可被人细胞剪切且表达成所述的siRNA作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有一个或多个式II所示的结构单元：

Seq正向—X—Seq反向

式Π

式II中，Seq正向为可在细胞中表达成所述的抑制NLRP3的siRNA的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在细胞中表达成所述的siRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；其中，各结构单元可表达相同或不同的siRNA；式II所示的结构在转入细胞后，形成式Π所示的二级结构；式Π中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；|表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。

因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的siRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨笨青霉素抗性。

药物组合物及施用方法

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、□服制剂(片剂、胶囊、□服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、微粒子(micro particle)>微泡(microvesicle)>外泌体(exosomes)、脱落囊泡(shedding vesicle)>纳米胶囊(Nanocapsules/Nanoparticles)、β环糊精胶囊(8-cyclodextriniclusion compound)蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

在本发明中，可将所述的表达载体直接施用于对象，也可将所述的表达载体与药学上可接受的载体制备成药物组合后进行施用。所述的施用包括静脉注射。

治疗方法

本发明还提供了一种治疗帕金森病和阿尔兹海默病的方法，即将安全有效量的本发明表达载体或药物组合物施用于所需对象，从而治疗帕金森病和阿尔兹海默病。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所用原料或仪器，若非特别说明，均市售可得。

通用方法一、基因型鉴定

1、主要试剂和仪器试剂名称：小鼠基因组提取试剂盒(碧云天公司)、Q5高保真DNA聚合酶套装(美国NEB公司)、IOObpDNA ladder(美国NEB公司)、5x DNA loadingbuffer(美国NEB公司)仪器名称：恒温水浴锅(美国Labnet公司)、PCR仪(德国BIOMETRA公司)、常温离心机(德国Eppendorf公司)、电泳仪(美国BIO-RAD公司)、Nano Drop紫外分光光度计(美国Thermo公司)、紫外透射仪(日本SANYO公司)。

2、主要溶液配制

IX TAE电泳缓冲液：0.5M EDTA(pH8.0)2ML，Tris碱4.84g、冰醋酸L 142mL，去离子水定容至1L。

3、基因型鉴定引物序列及扩增程序

FVB/N-Tg(LRRK2*R1441G)/Nju小鼠基因型鉴定引物序列及扩增程序上游引物：5’TGA TTC TCG TTG GCA CAC AT 3’(SEQ ID NO.7)下游引物：5’GCC AAA GCA TCA GAT TCCTC 3’(SEQ ID NO.8)

Stepl 95℃5min Step2 95℃30s Step3 55℃30s Step4 72℃45s

Step5 Go to step 2 35Cycles Step6 72℃5min Step7 10℃维持

4、实验方法及步骤

4.1小鼠基因组DNA提取

(1)转基因小鼠离乳后(3周龄)，剪取鼠尾约2-3mm，加入180uL组织裂解液A及20uL蛋白酶K，56c水浴过夜，至小鼠尾巴呈凝胶状。

(2)加入组织裂解液B 200uL，充分混匀。转移至分离柱内。

(3)12000rpm室温离心1min，弃废液。

(4)加入洗涤液A 500μL，12000rpm室温离心1min，弃废液。

(5)加入洗涤液B 500μL，12000rpm室温离心1min，弃废液。

(6)将分离柱套至新的L5mLEP管，加入洗脱液50μL，室温孵育2min。

(7)12000rpm室温离心1min，所离心下来的液体即含有小鼠基因组DNA。

(8)Nano Drop紫外分光光度计定量小鼠基因组DNA浓度。

4.2小鼠基因型鉴定

(1)按下列配方配置PCR反应体系

5X Q5 reaction buffer 10ul

l0mMdNTP mix lul

10μMPrimer Up 2.5u

10μMPrimer Down 2.5ul

模板DNA l00ng

Q5 DNA聚合酶0.5ul

去离子水补齐至50ul

(2)按3条件设置PCR反应步骤

(3)配制琼脂糖电泳凝胶：本实验选用浓度为1％的凝胶，将琼脂0.5g溶25于50mLIXTAE溶液配制凝胶液，微波炉中火2min加热使之完全溶解。加入GelRed溶液5μL，混匀后趁热倒入制胶槽，插入梳子。(4)待凝胶冷却凝固后，拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加样孔一端朝向阴极，电泳槽内倒入1XΤΑΕ至没过制好的琼脂凝胶。

(5)在PCR产物内加入5XDNALoadingBuffer10μL，吹打混匀后上样至加样孔内，另取加样孔加入l00bp DNA Marker。

(6)开始电泳，电泳条件为恒压120V，时间约30min。

(7)取出凝胶置于紫外透射仪上成像。

二、行为学检测

所有行为学均于9:00-11:00am进行。实验开始前将小鼠提前放进行为学检测室，适应1小时。每个待检行为学设备上方2.4m放置照明光源，功率为60w白色灯泡。每次完成测试后，均用75％乙醇喷洒并擦拭干净相应的行为学设备。

1.疲劳转棒试验(RotaRod Test)为了测试小鼠的运动协调能力，我们选取Rotarod试验。具体实验流程如下：在MPTP实验中，我们在MPTP连续处理5天后的第一天开始进行Rotaroad实验。实验持续3天，转棒将于5min内由4rpm匀加速40rpm，记录小鼠能在转棒上维持直立体位的时间。每天重复3次，每次间隔30min。

2.悬挂实验；为了测试小鼠的四肢力量，我们选取了悬挂实验。在给药完成后的第一天，将小鼠放在鼠笼的铁架网上，后倒扣，让小鼠自由运动，观察小鼠掉落时间，最长潜伏期为180s，每只老鼠重复3次后取平均值。

3.步态测试

VisuGait system(XinRuan Company,ShangHai,China,XR-XFP101)被应用于步态测试。

实验装置为数字步态分析仪，由被动运动轨道和录像系统组成，轨道两侧为暗箱，用于放置小鼠，轨道长约1m，宽10cm，录像采集范围轨道长度为40cm，使用折射绿色LED光源补光，将均匀的绿色荧光射入玻璃侧面，使玻璃体中充满绿色荧光，底部玻璃为压力传感玻璃板，可通过软件识别足印以及压力。实验前，将小鼠转移至行为学房间适应1h。正式实验前一天进行测试前训练，将小鼠放入轨道中5-10min，不进行测试，使小鼠可以自然在轨道中跑动。正式实验时，先用10％酒精擦拭玻璃板，将小鼠放置于轨道一端，另一端用挡板封堵，当小鼠进入录像采集区域时，开始记录，每只老鼠重复记录三次。记录同一脚爪连续步幅之间的距离，即步幅长度。

三、生化检测

1小鼠取材

(1)小鼠戊巴比妥钠过量麻醉并固定妥当，用手术器械暴露胸腔。

(2)将灌流针插入小鼠左心室，随后用眼科剪剪开右心房。

(3)灌入100mL 0.1M PBS(4℃预冷)。

(4)灌流完毕后断头，快速取出脑组织。

(5)于冰上手术分离两侧脑组织皮层、纹状体。

2.小鼠脑组织Western Blot蛋白定量

2.1主要试剂和仪器试剂：RIPA蛋白抽提液(美国Thermo公司)、Phostop磷酸酶抑制剂(瑞土罗氏公司)、PMSF(美国Invitrogen公司)、BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司)、4X SDS Loading Buffer(中国博土德公司)、预染蛋白Marker(美国Thermo公司)、SDS-PAGE配胶试剂盒(中国碧云天公司)、PVDF膜10(美国Millipore公司)小鼠抗TH抗体(美国Millipore公司)、小鼠抗NLRP3抗体(abcam公司)HRP标记羊抗小鼠抗体美国(CST公司)、化学发光液(美国Millipore公司)仪器：电泳仪(美国Bio-Rad公司)、化学发光成像仪(美国GE公司)、水平旋转摇床(美国Labnet公司)、低温离心机(德国Eppendorf公司)、超声裂解仪(日本SANYO公司)。

2.2主要溶液配置

(1)10X电泳液：蒸馏水定容至1000mL。甘氨酸144g SDS10g，Tris base 30。

(2)10X转膜液：蒸馏水定容至1000mL。甘氨酸144g；Tris base 30。

(3)1X转膜液：蒸馏水定容至1000mL，现配现用，4℃预冷。10X转膜液100mL甲醇200mL。

(4)10X TBS：蒸馏水定容至1000mL，调节pH值至7.6。Tris base 24.2g Nacl 80g。

(5)1X TBST：蒸谓水定容至1L。10X TBS100mL Tween-20 1m。

(6)5％封闭用BSA：分装成10mL一管，-20℃保存。1X TBST 100mL BSA 5g。

(7)二抗稀释液：1X TBST 100mL BSA 1g。

(8)6％分离胶：超纯水5.3ml、30％Acr/Bic 2ml、1.5mol/L Tris·HC1(pH8.8)2.5ml、10％ SDS 0.1ml、10％ AP 0.1ml、TEMED 0.008ml。

(9)5％浓缩胶：超纯水2.85ml、30％Acr/Bic 0.85ml、0.5mol/LTris·HC1(pH6.8)1.25mL·10％ SDS 0.05ml、10％ AP 0.025mL·TEMED 0.005ml。

2.3小鼠脑组织蛋白的提取

(1)灌注完成后，迅速取出脑组织，装于1.5mL EP管内，置于液氮中速冻。

(2)按试剂说明书，向RIPA组织裂解液中，加入Phostop磷酸酶抑制剂，按100：1的比例加入蛋白酶抑制剂PMSF。

(3)称量待抽提脑组织，按照l00mg/100uL的比例，加入组织裂解液。

(4)冰浴状态下超声裂解仪裂解5s，重复3-5次，至裂解液中无可见组织块。

(5)冰上静置30min，14000rpm、4℃离心15min，转移上清至新EP管中待测。

(6)用BCA法测定抽提蛋白样品浓度，配平样品蛋白浓度至5ug/uL，并分装成20μL/管，保存备用。

2.4SDS-PAGE蛋白凝胶电泳(Western blot)

(1)将配胶玻璃板清洗干净，37℃烤箱烘干。随后将玻璃板底边对齐后放入配胶装置中夹紧，再将玻璃板卡在架子上，使其底边紧压于密封橡胶条中，防止漏胶。

(2)配置12.5％分离胶，吹打混匀后沿玻璃板一侧缓慢将分离胶加入两玻璃板之间，随后加入异丙醇压胶，左右摇晃2-3次后室温静置30min，待分离胶凝固。

(3)分离胶凝固后，倒掉异丙醇并用滤纸吸干多余的液体，配制5％浓缩胶，吹打混匀后沿玻璃板一侧缓慢加入两玻璃板之间，随后将预先洗净晾干的梳子快速插入两玻璃板之间，注意避免气泡产生，室温静置30min。

(4)从-80C冰箱中取出待测样本，冰浴化冻，按3：1的比例加入4X SDS LoadingBuffer，吹打混匀，100℃煮沸10min，随后冰上静置待用。

(5)将玻璃板放入电泳夹中夹紧，将梳子拔出，倒入1X电泳液。

(6)上待检测的蛋白样品8μL(30u g)，170kDa或350kDa蛋白marker 8μL。

(7)80V电泳至Loading Buffer的澳芬蓝跑过浓缩胶并压缩成一条线后，恒压120V电泳至目的蛋白分离充分。

(8)转膜：剪取7cm X 6cm PVDF膜，甲醇彻底浸泡20s后，置IX转膜液中平衡5mino分离玻璃板，弃置浓缩胶，将分离胶置于铺放好的滤纸上。于IX转膜液水浴中，从正极到负极，按下列顺序依次放置夹子透明面、海绵、两层滤纸、PVDF膜、分离胶、两层滤纸、海绵，夹子黑面制作转膜三文治结构。

(9)然后将夹子放入转膜槽，夹子黑面对槽的黑面，夹子的透明面对槽的红面，加入IX转膜液，冰上湿转，300mA恒流180min。

(10)取出PVDF膜，IX TBST漂洗1min，5％BSA室温摇床封闭lh。

(11)封闭后，根据蛋白Marker条带显示的位置将目的蛋白及内参蛋白所在PVDF膜剪出放置于抗体孵育盒中，加入用5％BSA稀释后的一抗，4℃摇床孵育过夜。

(12)过夜孵育后，将膜放在IX TBST中常温摇床漂洗3次，每次5mino

(13)随后加入1％BSA稀释后的二抗，室温摇床孵育lh。

(14)IX TBST中常温摇床漂洗3次，每次5min。

(15)按照说明书配置化学发光液。

(16)将PVDF膜置于化学发光液中浸泡均匀，取出放于化学发光仪样品托板上，用滤纸印干多余发光液，进行化学发光成像。

实施例1：siRNA设计及质粒前体构建

1.查阅文献获得目的基因得CCDS区；

2.通过Thermo Fisher siRNA Designer(以下简称siRNA Designer)设计siRNA。网址:https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setOption.do？designOptio n＝stealth&pid＝-1775149845246103582。

a.“Target Design Options:”选择“miR RNAi”

b.输入基因mRNA序列，选择在哪个物种里做BLAST，进行RNAi Design。输入NCBI网址：https://www.baidu.com/link？url＝dUmrVe4EsC_MuWtXrGJWhABWI0oSNPZ MZ-_SqY2wRQZ7mTBGqe1ow8xNRb_gg9nv&wd＝&eqid＝d6b3ce58000119cf00000005650bc8ca，从Gene栏目输入NLRP3，物种选择house mouse。之后从NCBI Reference Sequences(RefSeq)栏目选择Consensus CDS——CCDS24771.1，进入后即可得到Nucleotide Sequence(3102nt)，即目的基因的mRNA序列：

ATGACGAGTGTCCGTTGCAAGCTGGCTCAGTATCTAGAGGACCTTGA

AGATGTGGACCTCAAGAAATTCAAAATGCATTTGGAAGATTACCCGC

CCGAGAAAGGCTGTATCCCAGTCCCCAGGGGCCAGATGGAGAAGGC

AGATCACTTGGATCTAGCCACACTCATGATTGACTTCAATGGCGAGG

AGAAGGCCTGGGCCATGGCTGTGTGGATCTTTGCTGCGATCAACAGG

CGAGACCTCTGGGAAAAAGCTAAGAAGGACCAGCCAGAGTGGAATG

ACACGTGTACATCACATTCCTCTATGGTATGCCAGGAGGACAGCCTT

GAAGAAGAGTGGATGGGTTTGCTGGGATATCTCTCCCGCATCTCCAT

TTGTAAAAAGAAGAAAGATTACTGTAAGATGTACAGACGACATGTG

AGAAGCAGGTTCTACTCTATCAAGGACAGGAACGCGCGTCTAGGTGA

GAGTGTGGACCTCAACAGTCGCTACACGCAGCTCCAACTGGTCAAGG

AGCATCCAAGCAAGCAGGAGCGGGAGCATGAACTCCTGACCATCGG

CCGGACTAAAATGCGGGACAGCCCCATGAGTTCCCTTAAGCTGGAGC

TGCTGTTTGAGCCCGAGGACGGGCACTCGGAGCCTGTGCACACAGTG

GTGTTCCAGGGAGCAGCAGGCATCGGGAAAACCATCCTAGCCAGGA

AGATTATGTTGGACTGGGCACTGGGAAAGCTCTTCAAAGACAAATTT

GACTATTTGTTCTTTATCCACTGCCGAGAGGTGAGCCTCAGGACGCC

AAGGAGTCTAGCAGACCTGATTGTCAGCTGCTGGCCTGACCCAAACC

CACCAGTGTGCAAGATCCTGCGCAAGCCTTCCAGGATCCTCTTCCTC

ATGGATGGCTTTGATGAGCTACAAGGGGCCTTTGACGAGCACATTGG

GGAGGTCTGCACAGACTGGCAAAAGGCTGTGCGGGGAGACATTCTG

CTAAGCAGCCTCATCCGAAAGAAACTGCTGCCCAAGGCCTCTCTGCT

CATAACGACGAGGCCGGTAGCCTTGGAGAAACTGCAGCATCTCCTGG

ACCACCCCCGCCATGTGGAGATCCTAGGTTTCTCTGAGGCCAAAAGG

AAGGAGTATTTCTTTAAGTATTTCTCCAACGAGCTGCAGGCCCGGGA

GGCCTTCAGGCTGATCCAAGAGAATGAGGTCCTCTTTACCATGTGCT

TCATCCCCCTGGTCTGCTGGATTGTGTGCACGGGGCTAAAGCAACAG

ATGGAGACCGGGAAGAGCCTGGCCCAGACCTCCAAGACCACTACGG

CCGTCTACGTCTTCTTCCTTTCCAGCCTGCTGCAATCCCGGGGGGGCA

TTGAGGAGCATCTCTTCTCTGACTACCTACAGGGGCTCTGTTCACTGG

CTGCGGATGGAATTTGGAACCAGAAAATCCTATTTGAGGAGTGTGAT

CTGCGGAAGCACGGCCTGCAGAAGACTGACGTCTCCGCTTTCCTGAG

GATGAACGTGTTCCAGAAGGAAGTGGACTGCGAGAGATTCTACAGCT

TCAGCCACATGACTTTCCAGGAGTTCTTCGCTGCTATGTACTATTTGC

TGGAAGAGGAGGCAGAGGGGGAGACCGTGAGGAAAGGACCAGGAG

GTTGTTCAGATCTTCTGAACCGAGACGTGAAGGTCCTACTAGAAAAT

TACGGCAAGTTTGAAAAAGGCTATCTGATTTTTGTTGTCCGATTCCTC

TTTGGCCTTGTAAACCAGGAGAGAACCTCTTATTTGGAGAAGAAACT

AAGTTGCAAGATCTCTCAGCAAGTCAGACTGGAACTACTGAAGTGGA

TTGAAGTGAAAGCCAAGGCCAAGAAGCTGCAGTGGCAGCCCAGCCA

ACTGGAACTGTTCTACTGCCTGTACGAGATGCAGGAGGAAGACTTTG

TGCAGAGTGCCATGGACCACTTTCCCAAAATTGAGATCAACCTCTCT

ACCAGAATGGACCACGTGGTTTCCTCCTTTTGTATTAAGAACTGTCAT

AGGGTCAAAACGCTTTCCCTGGGTTTTTTTCACAACTCGCCCAAGGA

GGAAGAAGAAGAGAGGAGAGGAGGTCGACCCTTGGACCAGGTTCAG

TGTGTTTTCCCAGACACTCATGTTGCCTGTTCTTCCAGACTGGTGAAC

TGCTGCCTCACTTCTAGCTTCTGCCGTGGTCTCTTCTCAAGTCTAAGC

ACCAACCGGAGCCTCACTGAACTGGACCTCAGTGACAATACTCTGGG

AGACCCGGGCATGAGGGTGCTGTGTGAGGCACTCCAGCACCCAGGCT

GTAACATTCAGAGACTGTGGTTGGGGCGCTGCGGACTGTCCCATCAA

TGCTGCTTCGACATCTCCTCTGTCCTGAGCAGCAGCCAGAAGCTGGT

GGAGCTGGACCTCAGTGACAATGCCCTGGGGGACTTTGGAATCAGAT

TGCTGTGTGTGGGACTGAAGCACCTGCTCTGCAACCTCCAGAAACTG

TGGTTGGTGAGCTGCTGTCTCACATCCGCGTGTTGTCAGGATCTCGCA

TTGGTTCTGAGCTCCAACCATTCTCTGACCAGACTGTACATTGGAGA

AAATGCCTTGGGAGACTCAGGAGTCCAAGTTTTGTGTGAAAAGATGA

AGGACCCACAGTGTAACTTGCAGAAGCTGGGGTTGGTGAATTCCGGC

CTTACTTCAATCTGTTGTTCAGCTCTGACCTCTGTGCTCAAAACCAAC

CAGAACTTCACACACCTCTATCTACGAAGCAATGCCCTTGGAGACAC

AGGACTCAGGCTCCTCTGTGAGGGGCTTCTGCACCCGGACTGTAAAC

TACAGATGCTGGAATTAGACAACTGCAGCCTCACCTCACACAGCTGC

TGGAATCTCTCCACAATTCTGACCCACAACCACAGCCTTCGGAAGCT

GAACCTGGGCAACAATGATCTTGGCGATCTGTGCGTGGTGACCCTCT

GTGAGGTGCTGAAACAGCAGGGCTGCCTCCTGCAGAGCCTACAGTTG

GGTGAAATGTACTTAAATCGTGAAACAAAACGTGCCTTAGAAGCGCT

CCAGGAAGAAAAGCCTGAGCTGACTATAGTCTTCGAGATTTCCTGGTAG(SEQ ID NO.9)；

c.得到siRNA的靶向序列；

495：passenger：5'-CAGAGTGGAATGACACGTGTA-3'(SEQ ID NO.10)；

1717：passenger：5'-TTTCCTGAGGATGAACGTGTT-3'(SEQ ID NO.11)；

2348：passenger：5'-GACACTCATGTTGCCTGTTCT-3'(SEQ ID NO.12)；

d.使用DNASTAR软件中的“edite seq”，粘入靶向序列，选中，并选择“Goodies”中的“Reverse Complement”，即可得到si序列。

495：siR：5'-TACACGTGTCATTCCACTCTG-3'(SEQ ID NO.13)；

1717：siR：5'-AACACGTTCATCCTCAGGAAA-3'(SEQ ID NO.14)；

2348：siR：5'-AGAACAGGCAACATGAGTGTC-3'(SEQ ID NO.15)；

注：前体序列为miR-155骨架，即我们将siRNA的靶向序列(passenger)和siRNA插入该骨架中构成siRNA前体：骨架序列为：

5'-CTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGAAATTCG(SEQ ID

NO.16)-(siRNA)-GTTTTGGCCACTGACTGAC(SEQ ID

NO.17)-(passenger)-CACCGGTCAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCC(SEQ ID NO.18)-3'

3.质粒双酶切

AgeΙ(Biolabs，货号：r0552s)，EcoRΙ(Biolabs，货号：r0101s)，10*2.1buffer(Biolabs，货号：b7202s)；

a.体系

b.程序

37度，60min；

c.跑胶(1％琼脂糖)；

d.切胶回收，测浓度，将骨架暂存于-20。；

4.引物退火

a.体系

Sense(100μM) 4μl；

Antisense(100μM)4μl(引物稀释到20uM，连接后再稀释100倍)；

ddH20 12μl；

b.程序

95度，5min，室温(在pcr仪器里自动降到室温)；

5.连接

a.体系

注：若载体浓度偏低(<10ng/μl)，则调整载体上样量为10μl，DNA相应调整为11.5μl。

b.程序

16度，过夜；

6.转化、涂板；

a.DH5α冰上融化，100μl加上25μl连接产物，冰浴30min，42度热激90s，冰浴5min。

b.加入1mlLB，37度摇1H。(+500u LB摇菌1h。直接涂板，敞口通风晾干)；

c.4000rpm离心，吸弃800μlLB，重悬，取120μl，涂板(壮观)，37度培养16h。

7.挑单菌落，摇菌，测序；

8.选取测序正确的菌液，使用50％甘油菌进行保种。

实施例2：NLRP3 siRNA/RV9dR质粒的构建以及干扰效率检测

利用限制性内切酶对对照质粒进行处理，回收线性载体后，利用T4连接酶将RVG-9dR-NLRP3 siRNA组合片段与载体进行连接；得到的连接产物进行转化实验并涂布于抗性平板；第二天挑取单克隆，测序确定质粒序列的正确性。按照这种方法，将3个含有不同的针对NLRP3的组合片段连入载体，构成质粒分子(质粒结构如图1所示)，分别命名为NLRP3 si-1、NLRP3 si-2、NLRP3 si-3。

将三种质粒分子分别转染汇合度60-70％的小胶质细胞BV-2，12小时后细胞换液，并用脂多糖(lps)和尼日利亚菌素(nigericin)先后刺激5小时和1小时，后利用western实验检测细胞中NLRP3的表达水平。结果表明前2种NLRP3 siRNA对NLRP3蛋白的干扰效率较高(如图2所示)。

实施例3：NLRP3 siRNA/RV9dR能够特异地进入脑内的小胶质细胞

利用NLRP3 siRNA/RVG-9dR、NLRP3 siRNA以及对照质粒对8周的C57BL/6J小鼠进行尾静脉注射，每两天一次，共持续2周，取材。

对小鼠的血浆、肝脏和黑质致密部提取RNA后进行RT-PCR进行siRNA浓度测定，发现仅有注射NLRP3 siRNA/RVG-9dR质粒的小鼠，其黑质中能检测到siRNA的存在。

接着将这三组小鼠血浆中分离的外泌体与PKH26共培养进行染色，后尾静脉注射到新的C57BL/6J小鼠中，发现只有注射NLRP3siRNA/RVG-9dR外泌体的小鼠，其外泌体能够到达小鼠的黑质区。这两个实验结果说明RVG-9dR肽段的脑导向作用。

此外还利用GFP转基因小鼠(一种全身细胞均表达绿色荧光蛋白的GFP工具鼠)。将GFP siRNA/RVG-9dR、GFP siRNA/RVG质粒分别注射到GFP小鼠中，每两天1次，共持续2周，后取材。利用iba-1(小胶质细胞的特异marker)和GFP共染，TH(多巴胺神经元的抗体)与GFP共染，观察两种不同肽段的质粒对GFP的敲除效果。

结果显示，RVG-9dR肽段的质粒能够显著降低GFP转基因小鼠体内的小胶质细胞的GFP荧光；而RVG肽段则主要降低GFP转基因小鼠神经元的GFP荧光。这些实验结果共同说明NLRP3 siRNA/RVG-9dR质粒能够特异地进入小鼠黑质区，并特异地靶向小胶质细胞从而起到特异性的基因敲除效果。(图3-图4)

实施例4：质粒表达的siRNA在体内对NLRP3的抑制效果

以NLRP3si-1为例，使用NLRP3si-1进行后续的实验。将对照质粒和NLRP3 siRNA/RVG-9dR质粒按照5mg/kg的剂量对2个月的C57BL6/J小鼠进行尾静脉注射，每两天注射一次，共注射6次，在注射的第三次之后进行小鼠MPTP的腹腔注射，注射剂量为25mg/kg，每天一次，连续注射5天。在最后一次质粒注射24小时后处死小鼠，取小鼠的脑组织进行westernblot实验。

结果表明，NLRP3si-1质粒分子在体内可以有效降低脑组织中NLRP3及其下游通路的蛋白表达水平，减少小胶质细胞的活化，减少黑质区中TH神经元的丢失(TH是多巴胺能神经元的抗体)(图5-图6)。

利用LPS 5mg/kg腹腔注射4个月的LRRK2 R1441G模拟帕金森病小鼠模型，并设立R1441G+生理盐水组；R1441G+LPS+对照质粒组；R1441G+LPS+NLRP3 si-1组。将对照质粒和NLRP3 si-1质粒按照5mg/kg的剂量对R1441G小鼠进行尾静脉注射(注射剂量5mg/kg，注射总体积为200ul)，每两天注射一次，共注射7次，最后一次注射24小时后处死小鼠，取小鼠的脑组织进行western blot实验。

结果表明，NLRP3 si-1质粒分子在体内可以有效降低脑组织中NLRP3的蛋白水平，减少TH神经元丢失(图7)。

利用立体定位注射技术，将AAV-A53T-synuclein注射进小鼠双侧黑质纹状体区，构建AAV-SYN的帕金森病小鼠模型，并设立AAV-GFP对照组；AAV-SYN+对照质粒组；AAV-SYN+NLRP3 si-1组。将对照质粒和NLRP3si-1质粒按照5mg/kg的剂量对模型小鼠进行尾静脉注射，每周注射两次，注射8周，最后一次注射24小时后处死小鼠，取小鼠的脑组织进行western blot实验。结果表明NLRP3 si-1质粒分子在体内可以有效降低脑组织中NLRP3的蛋白表达水平，减少黑质中TH神经元的丢失(图8-图10)。

实施例5：NLRP3 siRNA/RVG-9dR质粒对帕金森病小鼠运动能力的改善效果

以NLRP3 si-1为例进行详细说明。同时还对帕金森病模型小鼠进行了评估，在给药完成后对帕金森病的三种模型小鼠分别进行了疲劳转棒实验、悬挂实验和步态实验。在MPTP模型小鼠中，NLRP3 si-1治疗的小鼠，其悬挂实验掉落潜伏期显著高于对照质粒治疗的小鼠，证明NLRP3 si-1能够改善MPTP小鼠的抓握力量。在AAV-SYN模型小鼠中，NLRP3 si-1治疗的小鼠，其疲劳转棒掉落潜伏期、悬挂实验掉落潜伏期均显著高于对照质粒治疗小鼠，其步态长度也远高于对照质粒治疗的小鼠，说明NLRP3 si-1质粒能够有效改善PD小鼠的运动协调能力(图11-图16)。

实施例6：NLRP3 siRNA/RVG-9dR质粒对阿尔兹海默症模型的治疗效果

以NLRP3 si-1为例进行详细说明，利用lps和纤维化Aβ(fAβ)刺激BV-2细胞24小时构建阿尔兹海默症的细胞模型。研究表明，NLRP3 si-1能够显著抑制阿尔兹海默病模型中NLRP3的活化，减少其下游的ASC多聚体形成以及IL-1β和Caspase-1的切割及分泌。NLRP3si-1还能够促使阿尔兹海默病模型中小胶质细胞从促炎的M1型转化为抗炎的M2型，减少MHC-II的表达，增加ARG-1的表达。NLRP3 si-1还能够促进小胶质细胞自噬的活化，从而促进Aβ的清除。以上结果表明，NLRP3 si-1对阿尔兹海默症，能够有效抑制那NLRP3炎症通路的活化，抑制小胶质细胞炎症表型的转化，并促进毒蛋白Aβ的清除，证明该药物对阿尔兹海默症有良好的治疗效果(图17-图20)。

综上所述，本发明的有益效果是：本发明提供一种抑制NLRP3基因表达的siRNA及其前体序列、包含该siRNA或其前体序列的表达载体及重组细胞、以及包含所述siRNA、前体序列、表达载体或重组细胞的药物组合物，该siRNA选自下组:SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或其组合；本发明还通过将RVG-9dR与Lamp2b以及siRNA联合，使得在其下游与其串联表达的siRNA，能够顺利、高效穿过血脑屏障，定向到达脑组织的小胶质细胞并发挥功能，提供了一种新的靶向到特异性细胞的基因治疗药物；并通过实验验证了在治疗神经系统退行性疾病特别是帕金森病和阿尔兹海默病的药物中的应用；结果显示本发明的RVG9dR相比较于RVG，能够更有效地递送siRNA到达脑内；本发明的siRNA可有效抑制脑组织中NLRP3的表达，还可改善运动协调能力和认知功能，有效治疗帕金森病和阿尔兹海默症；本发明通过静脉注射的方式给药，与鞘内注射、颅内注射给药方式相比，侵入性小，更为安全。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抑制NLRP3基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA正义链核苷酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中的一个或至少两个的组合。

2.一种前体序列，其特征在于，前体序列的5’至3’端具有式I所示的结构：

其中，B1为所需要的第一核糖核酸序列，其中所述的第一核糖核酸序列包括NLRP3siRNA正义链序列，所述正义链序列如权利要求1所示；

B2为与B1基本互补或完全互补的序列，且B2与C不互补；

C为茎环结构序列。

3.根据权利要求2所述的一种前体序列，其特征在于，所述前体序列为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6。

4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸能被宿主转录形成如权利要求2或3所述的前体序列。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求2或权利要求3所述的前体序列或权利要求4所述的多核苷酸；优选地，所述的表达载体还含有编码RVG-9dR肽和/或标签蛋白的多核苷酸。

6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含权利要求5所述的表达载体。

7.权利要求1所述的siRNA或权利要求2或3所述的前体序列或权利要求4所述的多核苷酸或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述重组细胞在制备产品中的应用，其特征在于，所述产品的功能具有以下中的至少一项：(1)、治疗NLRP3相关疾病的药物；(2)、抑制哺乳动物组织中NLRP3的表达；(3)、改善哺乳动物的运动协调能力和/或认知能力；(4)、减少哺乳动物脑内神经元丢失；(5)、减少哺乳动物脑内代谢废物沉积。

8.一种药物，其特征在于，包含权利要求1所述的siRNA或权利要求2或3所述的前体序列或权利要求4所述的多核苷酸或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述重组细胞；

优选的，所述药物还包括其他治疗帕金森病或阿尔茨海默症或脑中风或亨廷顿病或肥胖的药物。

9.一种生产siRNA的方法，其特征在于，包括：培养权利要求6所述的重组细胞产生siRNA。

10.一种抑制NLRP3基因表达的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的siRNA或权利要求2或3所述的前体序列或权利要求4所述的多核苷酸或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述重组细胞抑制NLRP3基因的表达。