CN118345086B - 柑橘溃疡病抗性Cs7g24050基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了柑橘溃疡病抗性Cs7g24050基因及其编码蛋白与应用，涉及植物基因工程技术领域。柑橘溃疡病抗性Cs7g24050基因，Cs7g24050基因的核苷酸序列为(a1)或(a2)：(a1)SEQ ID No.1所示核苷酸序列；(a2)来源于柑橘且与(a1)具有95％以上同一性的核苷酸序列。本发明对于培育抗溃疡病柑橘具有重要的意义。

Description

柑橘溃疡病抗性Cs7g24050基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及柑橘溃疡病抗性Cs7g24050基因及其编码蛋白与应用。

背景技术

柑橘溃疡病是由黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp.citri，Xcc)引起。溃疡病菌主要侵染柑橘叶片、枝梢、果实等，其中苗木、幼树受害较为严重(何秀玲等，2007)。病树会出现落叶、枯梢、树势衰弱以及落果等现象，严重的影响了柑橘的产量和品质。受到柑橘溃疡病危害的芸香科植物有几十种，其中绝大部分为经济栽培品种。有研究发现甜橙最易感病，其次是酸橙和柚类(袁承东等，1997；李敏等，2013)。目前全世界已经有30多个国家和地区将柑橘细菌性溃疡病列为重要的植物检疫对象。

培育抗病品种是解决柑橘溃疡病的根本。随着分子生物学的兴起，基因工程手段也在抗溃疡病研究中进行了尝试(段敏杰等，2016；贾瑞瑞等，2017)，并获得了一些对溃疡病有抗性的转基因材料。例如陈善春等获得了对柑橘溃疡病有抗性的转柞蚕抗菌肽D基因的锦橙、新会橙、脐橙株系(陈善春等，1996)。外源基因NLS，chit42，Xa21和PthA在转移至冰糖橙，椪柑和甜橙后对柑橘溃疡病具有抗性(Mendes et al，2010；Yang et al，2011)。Li等(2017)过表达柑橘CsBZIP40获得了抗溃疡病材料；CsLOB1基因作为溃疡病病原基因PthA的靶蛋白，被认为是是柑橘溃疡菌的感病因子，使得植物对溃疡病更为敏感(Li et al，2014)，Peng等对柑橘溃疡病感病基因CsLOB1启动子进行CRISPR/Cas9靶向敲除从而获得了对柑橘溃疡病抗性提高的植株。虽然已经通过生物技术手段已获得一些抗溃疡病柑橘资源，但优质候选基因仍然匮乏，且功能和作用机制研究不深，制约了柑橘抗溃疡病分子育种发展。因此，仍需有针对性地挖掘与柑橘抗溃疡病反应途径密切相关的基因，并深入分析其功能和分子机制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有柑橘对于溃疡病的抗性弱，易出现落叶、枯梢、树势衰弱以及落果等现象，严重的影响了柑橘的产量和品质，本发明的目的在于提供一种解决上述问题的柑橘溃疡病抗性Cs7g24050基因及其编码蛋白与应用。

本发明通过下述技术方案实现：

第一方面，本发明提供一种柑橘溃疡病抗性Cs7g24050基因，所述Cs7g24050基因的核苷酸序列为(a1)或(a2)：

(a1)SEQ ID No.1所示核苷酸序列；

(a2)来源于柑橘且与(a1)具有95％以上同一性的核苷酸序列。

进一步地，上述95％以上同一性可至少为95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

第二方面，本发明还提供一种柑橘溃疡病抗性蛋白，该蛋白由上述柑橘溃疡病抗性Cs7g24050基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列组成的蛋白质。

进一步地，上述柑橘溃疡病抗性蛋白为柑橘蛋白分选转运装置系统ESCRT-2的组成蛋白，命名为VPS36蛋白。

进一步地，上述柑橘溃疡病抗性蛋白蛋白为(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：

(b1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

(b2)在(b1)所述蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

(b3)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与柑橘细菌性溃疡病抗病性相关的蛋白质；

(b4)来源于柑橘且与(b1)具有98％以上同一性且与柑橘溃疡病抗病性相关的蛋白质。

进一步地，上述98％以上同一性可至少为98％或99％的同一性。

第三方面，本发明还提供上述柑橘溃疡病抗性Cs7g24050基因在提高柑橘溃疡病抗性的应用，包括如下步骤：

(1)克隆柑橘Cs7g24050编码序列，进行超量表达载体构建；

(2)超量表达载体转化柑橘，得到溃疡病抗性提高的转基因植株。

进一步地，步骤(1)中，柑橘Cs7g24050基因编码序列的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，最后采用高保真酶PCR扩增Cs7g24050基因编码序列DNA片段。

进一步地，步骤(1)中，克隆柑橘Cs7g24050基因编码序列所采用的PCR引物为OE-F和OE-R，分别具有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示核苷酸序列。

进一步地，步骤(1)中，超量表达载体构建方法为：以p1300为载体，p1300载体带有CaMV 35S启动子，CaMV 35S启动子为花菜花叶病毒启动子，具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，利用BamH1和Sal1酶切目的片段后连接到BamH1和Sal1酶切回收的载体上，构建超量表达载体p1300-VPS36。

进一步地，步骤(2)中，超量表达载体转化柑橘的方法为：超量表达载体通过热激法转化根癌农杆菌，再用根癌农杆菌介导转化柑橘外植体，遗传转化后的外植体细胞经离体培养、GFP荧光鉴定和嫁接后得到转基因植株。

进一步地，步骤(2)中，在得到转基因植株后，对转基因植株进行抗性评价。

进一步地，对转基因植株进行抗性评价前，通过PCR验证转基因植株，采用的引物为ID-F和ID-R，ID-F是根据35S序列设计，ID-R是根据Cs7g24050基因末端序列设计，分别具有如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示核苷酸序列；

PCR验证后，利用实时荧光定量PCR进行Cs7g24050基因表达量检测，采用的引物为RT-F和RT-R，分别具有如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示核苷酸序列，实时荧光定量PCR内参为柑橘GAPDH基因，采用引物为AC-F和AC-R，分别具有如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示核苷酸序列。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

本发明提供了Cs7g24050基因和编码蛋白，通过超量表达Cs7g24050基因，能够显著提高柑橘在面对细菌性溃疡病的时表现出的免疫能力，减小柑橘的病斑面积，减轻柑橘细菌性溃疡病的发病程度，减少了溃疡病对柑橘产量和品质的影响。本发明对于培育抗溃疡病柑橘具有重要的意义。

本发明的特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：

图1为本发明Cs7g24050蛋白的结构域示意图。

图2为本发明Cs7g24050植物超量表达载体构建流程图：GFP是绿色荧光蛋白；CaMV35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；NOS，冠瘿碱合成酶基因终止子；载体p1300具有CaMV 35S启动子调控下的GFP基因，便于在植物遗传转化过程中对转化子进行筛选。

图3为本发明Cs7g24050基因在柑橘基因组中PCR重组验证：M为DNA分子量标准；OE-1、OE-2分别代表2个转基因植株，WT为野生型晚锦橙植株。

图4为本发明转基因植株中Cs7g24050基因相对表达量分析图：*表示同野生型比较差异显著(P＝0.05)，**表示同野生型比较差异显著(P＝0.01)。

图5为本发明转基因植株表型图。

图6为本发明超量表达植株叶片接种溃疡病菌的10天后症状图。

图7为本发明转基因柑橘叶片病斑大小统计图。

图8为本发明转基因柑橘叶片发病程度(病情指数)统计图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

柑橘Cs7g24050基因编码序列的克隆

1.RNA提取及cDNA合成

用RNA提取试剂盒(艾德莱，CAT：RN09)提取柑橘(晚锦橙)叶片总RNA，琼脂糖凝胶电泳验证RNA质量，浓度计测定其浓度。使用Recombinant DNase I合成cDNA(TAKARA)，cDNA于-20℃保存备用。

2.Cs7g24050基因编码序列的PCR扩增

参照图1，使用引物OE-F(SEQ ID No.3)和OE-R(SEQ ID No.4)从柑橘cDNA中扩增获得Cs7g24050片段，片段长度为1344bp(包含酶切位点)，扩增的DNA片段经测序分析为柑橘Cs7g24050基因编码序列，软件分析对应的氨基酸序列及结构域，验证蛋白质的正确性，其具有PH-like super family和EAP30两个结构域。

扩增体系：10X PCR mix：2.5μL；引物OE-F(5μmol/L)：1μL；引物OE-R(5μmol/L)：1μL；cDNA约60ng；加ddH₂O至25μL。

扩增程序：94℃，5min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。

3.DNA片段回收

紫外灯下，用洁净的刀片切下含有目的片段的琼脂糖凝胶块。使用试剂盒(艾德莱)回收片段。

实施例2

超量表达载体的构建并转化农杆菌

载体构建流程图如图2，所有限制性内切酶购自(THERMO)公司，按照使用说明操作。

具体操作如下：将Cs7g24050基因片段和超表达载体p1300用限制性内切酶BamH1和Sal1双酶切后回收进行连接，连接采用T4 DNA Ligase kit(TAKARA)。连接产物转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆提取质粒即得到Cs7g24050的超量表达载体p1300-VPS36。质粒提取采用试剂盒(艾德莱)。

用热激法将构建的超量表达载体导入根癌农杆菌EHA105。预先取冻存的EHA105农杆菌感受态细胞(50μL)，于冰上融化，加入1μL所构建的超量表达载体的质粒于感受态细胞中，吹打混匀后，冰上放置5min。42℃热处理45s。冰上放置2min。加入700mL LB液体培养基至无菌离心管中，220r/min，28℃摇床振荡培养120min。12000r/min将菌液离心1min，弃上清液(剩约100μL重悬菌体)，重悬后涂布，28℃倒置暗培养2天。待菌斑长出后，挑取单菌落进行PCR验证。

实施例3

遗传转化柑橘(晚锦橙)

1.柑橘实生苗上胚轴的获得

新鲜柑橘(晚锦橙)果实洗净，取出种子，使用26％二氯异氰尿酸钠无菌水消毒，剥掉种皮，种子萌发培养基上萌发，28℃下暗培养2周，然后在16h光照/8h黑暗条件下培养3周。无菌条件取萌发幼苗上胚轴切成1cm茎段，用于根癌农杆菌遗传转化。

2.根癌农杆菌菌液制备

用于转染的农杆菌菌液(含Cs7g24050超量表达载体)加入20％的无菌甘油保存于-80℃的超低温培养箱中。转染前，在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线培养。挑单菌落，接种于30ml含有相同抗生素的LB液体培养基中，28℃震荡培养过夜。测浓度后将菌液稀释后进行复摇，复摇至菌液OD＝0.5时，5000r/min离心10min，弃上清，用PH 5.4的MS液体培养基重悬用于转染。

3.柑橘上胚轴茎段转化

将柑橘上胚轴茎段在农杆菌菌液中浸泡10min后擦干，将茎段转移到共培养培养基中，26℃暗培养3天。

4.转化子的筛选

共培养完成后，将上胚轴转移到筛选培养基中，28℃暗培养7天，外殖体在28℃，16h光照/8h黑暗培养，每两周继代一次，然后GFP荧光初步鉴定。

5.转化子的成苗培养

待幼苗长到1cm以上时，将其切下后嫁接到无菌试管中的晚锦橙苗，在成苗培养基中进行培养；待幼苗长到5cm左右时将其嫁接到枳实生苗上，在温室中进行培养。

实施例4

转基因植株验证

1.PCR检测外源基因整合

初筛得到的植株叶片100mg，使用DNA提取试剂盒(艾德莱，CAT：DN15)提取基因组DNA，PCR检测Cs7g24050基因在柑橘基因组的整合。PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，30次循环；72℃10min。检测引物为ID-F(SEQ ID No.6)和ID-R(SEQ IDNo.7)。PCR结果见图3，阳性植株可以得到1876bp的扩增片段WT植株无扩增。

2.转基因植株GFP鉴定

使用荧光激发光源检测转基因植株叶片，阳性植株叶片呈绿色，阴性植株叶片呈红色。

3.Cs7g24050基因表达量分析

提取柑橘叶片总RNA(艾德莱，CAT No：RN09)，使用Recombinant DNase I(TAKARA)合成cDNA。利用qRT-PCR检测目的基因的表达量，检测引物为RT-F(SEQ ID No.8)和RT-R(SEQ ID No.9)；内参基因GAPDH的检测引物为RT-F(SEQ ID No.10)和RT-R(SEQ IDNo.11)。

反应体积20μL，反应条件：95℃3min，94℃10s；56℃10s，72℃10s，40次循环；72℃10min。实验重复三次。

采用2-△△Ct法计算转基因植株中Cs7g24050基因的相对表达量：定义野生型的样本为参照因子，即其Cs7g24050的在野生型植株中表达水平为1，然后计算转基因柑橘中相对参照因子基因表达的倍数2-△△Ct，为其相对表达量。检测结果见图4。结果显示，Cs7g24050基因在转基因植株中相比野生型植株有高水平表达(>50倍)。

4.转基因植株表型观察

观察分析3株转基因植株表型，发现外观和长势上并无明显异常(参照图5)。这说明超量表达Cs7g24050基因并未对植株的表型和发育产生直接的明显的变化。

实施例5

转基因植株的抗性评价

成熟叶片清洗后用75％的酒精消毒并用无菌水冲洗；以叶脉为中心进行针刺，六针为一组，每侧两组，用移液器点样溃疡病菌液，每针孔点样1μL(1X 105CFU/mL)。于28℃恒温光照培养箱中培养(16h光照/8h黑暗)。叶片点菌后培养10天拍照，用Image J V1.47软件统计病斑面积。根据病情指数公式计算发病程度。按照病斑面积将病情分为0-7级，以字母R表示病斑面积，0级(R≤0.4mm2)，1级(0.4mm2＜R≤0.8mm2)，2级(0.8mm2＜R≤1.2mm2)，3级(1.2mm2＜R≤1.6mm2)，4级(1.6mm2＜R≤2.0mm2)，5级(2.0mm2＜R≤2.4mm2)，6级(2.4mm2＜R≤2.8mm2)，7级(R＞2.8mm2)；根据公式计算发病程度：DI＝100XΣ【各级病斑数X相应级数值】/(病斑总数X最大级数)。

超量表达植株和同时期嫁接的WT植株，选取发育一致的叶片针刺接种溃疡病菌。离体接种溃疡病菌10天后，接种溃疡病菌的植株均不同程度发病，病斑大小存在一定的差异(参照图6)。上述实验重复三次以确保结果的准确性。

对离体接种柑橘溃疡病菌的叶片的病斑大小进行统计。分析发现转基因植株病斑面积均显著小于转空载体对照组，其中OE-1最小(参照图7)。转基因植株的发病程度统计发现转基因植株发病程度显著小于转空载体对照组，尤其是OE-2，约为对照组的30％(参照图8)。

由此可见，Cs7g24050的超量表达能够显著减小柑橘细菌性溃疡病的病斑面积，减轻柑橘细菌性溃疡病的发病程度。

本发明中，根癌农杆菌转化所用培养基：

种子萌发培养基：

MS+30g/L蔗糖+2.5g/L Gelrite，PH 5.8。

共培养培养基：

MS+2mg/L BA+0.5mg/L IAA+1mg/L 2，4–D+100μmol AS+30g/L蔗糖+2.5g/LGelrite，PH 5.8。

筛选培养基：

MS+2mg/L BA+0.5mg/L IAA+500mg/L Cef+50mg/L Kan+30g/L蔗糖+2.5g/LGelrite，PH 5.8。

成苗培养基：

MS+30g/L蔗糖，PH 5.8。

以下为各基因或蛋白质的核苷酸序列或氨基酸序列。

SEQ ID No.1：

atggccagtaataactttttcctgccagcctccgtcacgagcagcggtcggcctgttctcgtgccaaacgaagtagaatgcaacctcctctcaaatgtcgacattgaacacgaccaagacgatgccgtctcattccctcccttaaaatccggccactttattctcaccacccatcgcctcctcttcctttcctcctcctgctcctccaccgccgttgccatccctctctccgccatcacccacatcttctcctccaagcgatcacttaagtccgtgttccactcccctcgctttcgattccaggtctccgccactcccgataatcggatcttcgactcggaccctggccgggtcacaggtttgcggtcggttgtgattacggtggttgtgagggggaaaggggattgggagttgtttttgtccaagatgtgggagtgttggagggggagggcgtgggcgtgggaaacgacgccgtcggagactggcccggcttcagcttcggcttcagcttcattgtatgcgagtgatgggtcggtgcgaatggtgggggttgggggtttacttagaaaagaacaagagatgtgggaaagtactgatagaagcttgcaggaggcttttcaggacttgaatgctctcatgaataaagctaaagagatggtaatgctagctgagaaaatgaggcaaaaacttctggctggctcgagttctcaatccaattcagcaaatgatgaggaattgggttctaaagaagagatgcaagattggttgctaagtgtcggtattgtatcccccgttaccaaagaatctgcaggtgccttgtatcaccaacaactgtctcgccagttggcagattttgtcaaaattcccctagagagagctggaggaatgatcaatcttatagatgtctattgtctctttaatcgtgcacggggcacagccttgatctcaccagacgatttgtcgcaagcgtgttctctttgggagaagtttgatgttccggtaatgcttcggaagtttgatagcggggtcatggccatccagagcaagtcccacagtgatgaggaggtttttggtagacttagagccctagtgacaaagcctgaagcccttcgacatggtataagtgcaagtgatgctgcaatgaccttagggattgcacctgccatggccaaggagcatcttctgactgctgaggg caaaggtcttttatgcagagatatcagccctgatggctttcgcttttatatcaatctgttttctgaaatcattcttgatgatttgttcttggtgaaagattatgggatctacagtacatgggtcaaagcttcttctgcttctgggtga

SEQ ID No.2：

MASNNFFLPASVTSSGRPVLVPNEVECNLLSNVDIEHDQDDAVSFPPLKSGHFILTTHRLLFLSSSCSSTAVAIPLSAITHIFSSKRSLKSVFHSPRFRFQVSATPDNRIFDSDPGRVTGLRSVVITVVVRGKGDWELFLSKMWECWRGRAWAWETTPSETGPASASASASLYASDGSVRMVGVGGLLRKEQEMWESTDRSLQEAFQDLNALMNKAKEMVMLAEKMRQKLLAGSSSQSNSANDEELGSKEEMQDWLLSVGIVSPVTKESAGALYHQQLSRQLADFVKIPLERAGGMINLIDVYCLFNRARGTALISPDDLSQACSLWEKFDVPVMLRKFDSGVMAIQSKSHSDEEVFGRLRALVTKPEALRHGISASDAAMTLGIAPAMAKEHLLTAEGKGLLCRDISPDGFRFYINLFSEIILDDLFLVKDYGIYSTWVKASSASG*

SEQ ID No.3：

ATGGCCAGTAATAACTTTTTCC

SEQ ID No.4：

TCACCCAGAAGCAGAAGAAG

SEQ ID NO.5：

agtcccccgtgttctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatcccttacgtcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatcttcaacgatggcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggagccaccttccttttccactatcttcacaataaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttccggatattaccctttgttgaaaagtctcaattgccctttggtcttctgagactgtatctttgatatttttggagtagacaagtgtgtcgtgctccaccatgttgacgaagattttcttcttgtcattgagtcgtaagagactctgtatgaactgttcgccagtctttacggcgagttctgttaggtcctctatttgaatctttgactccatg

SEQ ID No.6：

tccatggagtcaaagattcaaatagagg

SEQ ID No.7：

TCACCCAGAAGCAGAAGAAG

SEQ ID No.8：

GCAGGAGGCTTTTCAGGACT

SEQ ID No.9：

GCAGGTGCAATCCCTAAGGT

SEQ ID No.10：

TCTTGCCTGCTTTGAATGGA

SEQ ID No.11：

TGTGAGGTCAACCACTGCGACAT

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.柑橘溃疡病抗性Cs7g24050基因在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，包括如下步骤：

（1）克隆柑橘Cs7g24050编码序列，进行超量表达载体构建，所述Cs7g24050编码序列如SEQ ID No. 1所示；

（2）超量表达载体转化柑橘，得到溃疡病抗性提高的转基因植株。

2.根据权利要求1所述的柑橘溃疡病抗性Cs7g24050基因在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，步骤（1）中，柑橘Cs7g24050基因编码序列的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，最后采用高保真酶PCR扩增Cs7g24050基因编码序列DNA片段。

3.根据权利要求2所述的柑橘溃疡病抗性Cs7g24050基因在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，步骤（1）中，克隆柑橘Cs7g24050基因编码序列所采用的PCR引物为OE-F和OE-R，核苷酸序列分别如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示。

4.根据权利要求1所述的柑橘溃疡病抗性Cs7g24050基因在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，步骤（1）中，超量表达载体构建方法为：以p1300为载体，p1300载体带有CaMV 35S启动子，CaMV 35S启动子为花菜花叶病毒启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，利用BamH1和Sal1酶切目的片段后连接到BamH1和Sal1酶切回收的载体上，构建超量表达载体p1300-VPS36。

5.根据权利要求1或4所述的柑橘溃疡病抗性Cs7g24050基因在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，步骤（2）中，超量表达载体转化柑橘的方法为：超量表达载体通过热激法转化根癌农杆菌，再用根癌农杆菌介导转化柑橘外植体，遗传转化后的外植体细胞经离体培养、GFP荧光鉴定和嫁接后得到转基因植株。

6.根据权利要求1所述的柑橘溃疡病抗性Cs7g24050基因在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，步骤（2）中，在得到转基因植株后，对转基因植株进行抗性评价。

7.根据权利要求6所述的柑橘溃疡病抗性Cs7g24050基因在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，对转基因植株进行抗性评价前，通过PCR验证转基因植株，采用的引物为ID-F和ID-R，ID-F是根据35S序列设计，ID-R是根据Cs7g24050基因末端序列设计，核苷酸序列分别如SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示；

PCR验证后，利用实时荧光定量PCR进行Cs7g24050基因表达量检测，采用的引物为RT-F和RT-R，核苷酸序列分别如SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 9所示，实时荧光定量PCR内参为柑橘GAPDH基因，采用引物为AC-F和AC-R，核苷酸序列分别如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示。