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CN118345053A - 利用假病毒模型制备高滴度重组流感病毒方法及其应用 - Google Patents

利用假病毒模型制备高滴度重组流感病毒方法及其应用 Download PDF

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CN118345053A
CN118345053A CN202310062753.4A CN202310062753A CN118345053A CN 118345053 A CN118345053 A CN 118345053A CN 202310062753 A CN202310062753 A CN 202310062753A CN 118345053 A CN118345053 A CN 118345053A
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CN
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titer
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virus
influenza virus
influenza
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Application number
CN202310062753.4A
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王桂芹
王海坤
常小艳
卢洪洲
张国良
刘冬平
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Nanjing Institute Of Life And Health Sciences
Third Peoples Hospital of Shenzhen
Original Assignee
Nanjing Institute Of Life And Health Sciences
Third Peoples Hospital of Shenzhen
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Publication date
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Abstract

本发明提供了利用假病毒模型制备高滴度重组流感病毒方法及其应用，高滴度的流感病毒制备疫苗可有效的缩短疫苗制备的周期和降低疫苗制备的成本。具体地，本发明提供了将低滴度H5亚型流感病毒改造为高滴度H5亚型流感病毒的方法，在实例中，通过本发明的方法，低滴度的A/blackbird/Hunan/1/2004的病毒被改造后，其滴度显著提高，免疫原性影响较小。

Description

利用假病毒模型制备高滴度重组流感病毒方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及利用假病毒模型制备高滴度重组流感病毒方法及其应用。
背景技术
流感病毒(influenza virus)属于正粘病毒科，感染宿主主要包括禽类、人类和哺乳动物，会引发季节性流感和禽流感。季节性流感每年在全球范围内都会造成人员伤亡，且每隔几十年就会出现全球性流感大流行，对经济和社会都造成了极大的影响。据流感病毒膜蛋白1(M1)和核蛋白(NP)抗原性的不同分为A、B、C、D四型。根据血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，A型流感病毒分为18种HA亚型和11种NA亚型。A型流感病毒呈球形，由包含HA、NA和膜蛋白(M2)的磷脂双分子层构成病毒外壳，基因组是由8个分节段的单负链RNA组成，主要编码11种病毒蛋白。
禽流感病毒根据致病性的差异可分为高致病性禽流感和低致病性禽流感，H5N1属于高致病性禽流感。禽类是H5N1高致病性禽流感的天然宿主，但已有研究证明H5N1流感病毒可突破种间屏障在不同物种间传播，甚至在人和人之间传播，一旦流行就会严重威胁公共卫生安全。当某一禽类种群中出现H5N1禽流感病例，种群中的禽类就会被全部捕杀，据统计仅2022年上半年，在美国、非洲、亚洲和欧洲的25个国家和地区就爆发了1154例H5N1流感，导致约3千万动物死亡和被捕杀，对世界养殖业构成严重的威胁。
疫苗是当前预防流感大流行最有效的方法，灭活疫苗因其安全性高、免疫原性强、可制备多价苗和不会出现变异等优点被广泛使用。但在流感灭活疫苗制备过程中某些毒株滴度过低，是灭活疫苗大规模生产常见问题。目前商品化的H5亚型高致病性灭活疫苗的制备时通常会以流感病毒的HA和NA作为病毒的囊膜蛋白，高滴度的PR8(或D7)的6个内部基因做为重组病毒的内部基因，并且改造HA，以降低重组病毒对鸡胚的致病性，从而获得种子病毒，并通过鸡胚连续传代，这种方法制备的重组病毒疫苗株滴度低，而且还具有以下3个缺陷①鸡胚连续传代耗时长，②结果不可控，不一定能通过连续的鸡胚传代来获得高滴度的病毒疫苗株，③鸡胚连续传代，重组病毒株易发生突变。
高致病性流感病毒传染性和致病性极强，需要在BSL-3实验环境操作和研究，所以实验环境一直是操作的一个瓶颈。而流感假病毒是由其包膜蛋白HA和NA嵌合在反转录病毒基因组编码的骨架蛋白上产生的一种病毒，它具有流感病毒的包膜特征，并且保持着反转录病毒的本身特征。流感假病毒不仅可以模拟真病毒感染早期过程，而且与野生型病毒相比为复制缺陷型，仅具有单轮感染活力，因流感假病毒不具备自身复制的能力，对实验环境要求较低，因此其安全性远远高于活病毒。
因此本领域迫切需要开发一种简单快速的将低滴度的流感病毒改造为高滴度的流感病毒的方法与应用来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用假病毒模型简单快速的将低滴度的流感病毒改造为高滴度的流感病毒的方法。
本发明的第一方面，提供了一种将H5亚型低滴度流感病毒改造为高滴度流感病毒的方法，包括：
(a)提供一构建的H5亚型高滴度流感病毒库和待改造的H5亚型低滴度流感病毒株，基于所述病毒库中的H5亚型高滴度流感病毒和所述H5亚型低滴度流感病毒的HA氨基酸序列，从而获得遗传进化树；
(b)通过所述遗传进化树，获得与所述H5亚型低滴度流感病毒株遗传距离最近的H5亚型高滴度流感病毒株；
(c)将步骤(b)获得的H5亚型高滴度的流感病毒株和H5亚型低滴度的流感病毒中的HA或NA蛋白进行互换，制备嵌合假病毒，对所述嵌合假病毒的滴度进行检测，确定影响流感病毒滴度的蛋白是HA还是NA；
(d)比较步骤(b)所获得的H5亚型高滴度流感病毒株和步骤(a)所述的H5亚型低滴度流感病毒的HA(或NA)中的氨基酸的差异；
(e)将步骤(b)所获得的H5亚型高滴度流感病毒的HA(或NA)中与和步骤(a)所述的H5亚型低滴度流感病毒株的HA(或NA)中的全部不同的氨基酸分别进行单点突变，从而制备获得HA(或NA)突变型流感假病毒；
(f)分别检测步骤(e)获得的HA(或NA)突变型流感假病毒和步骤(b)所获得的H5亚型高滴度流感病毒株的假病毒滴度，从而确定可能影响H5亚型低病毒滴度病毒株的氨基酸位点信息；
(g)根据步骤(f)获得的氨基酸位点，将待改造的H5亚型低滴度流感病毒的HA(或NA)中上述关键氨基酸分别进行单位点氨基酸突变制备假病毒，通过滴度检测确定可能提高病毒滴度的氨基酸位点；进一步进行双位点或多位点氨基酸突变，通过假病毒滴度检测，从而确定影响H5亚型低滴度流感病毒的关键氨基酸；
(h)根据步骤(g)确定的关键性氨基酸位点，构建质粒，通过反向遗传，制备HA突变型流感病毒，通过滴度检测，验证确认的关键性氨基酸位点，从而获得H5亚型高滴度流感病毒。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤(i)，对步骤(h)获得的所述H5亚型高滴度流感病毒的吸附能力和融合能力进行检测。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤(j)，对步骤(h)获得的所述H5亚型高滴度流感病毒的免疫原性进行检测，从而获得免疫原性影响小或没有免疫原性影响的H5亚型高滴度流感病毒。
在另一优选例中，所述方法还包括对参照用H5亚型低滴度流感病毒的病毒滴度的检测步骤。
在另一优选例中，所述参照用H5亚型低滴度流感病毒为A/WSN/33。
在另一优选例中，所述H5亚型高滴度流感病毒库用如下方法进行构建：根据GISAID提供的流感病毒HA序列，通过生物信息学方法，筛选潜在的H5亚型高滴度的流感病毒株，并通过4质粒表达系统，以流感病毒的HA和NA为囊膜蛋白、萤火虫荧光素为内部核酸包装制备流感假病毒，并通过相对荧光素酶活性检测，筛选出高滴度的H5亚型流感病毒株，从而构建高滴度的H5亚型流感病毒株库。
在另一优选例中，所述生物信息学方法包括序列对比、分析。
在另一优选例中，所述H5亚型高滴度病毒株突变后的氨基酸为低滴度的H5亚型流感病毒株同位点的氨基酸。
在另一优选例中，所述H5亚型低滴度病毒株突变的氨基酸为遗传进化树上与低滴度的H5亚型流感病毒株遗传距离最近的高滴度的H5亚型流感病毒株同位点的氨基酸。
在另一优选例中，所述遗传距离最近的H5亚型高滴度的流感病毒株是指所述遗传进化树上与H5亚型低滴度的流感病毒株位于同一个结点、同一进化支的病毒株。
在另一优选例中，所述H5亚型高滴度流感病毒是指对应的假病毒的相对荧光素酶活性(Relative Luciferase Activity，RLA)数值显著高于1000。
在另一优选例中，所述H5亚型低滴度流感病毒是指对应的假病毒的相对荧光素酶活性(Relative Luciferase Activity，RLA)数值显著低于500。
在另一优选例中，所述H5亚型高滴度流感病毒株如下：
在另一优选例中，所述H5亚型低滴度流感病毒包括A/blackbird/Hunan/1/2004。
在另一优选例中，HA与NA嵌合病毒、HA(或NA)单点或多点突变的病毒滴度的检测是通过病毒感染宿主细胞后，报告基因(萤火虫荧光素酶)在宿主细胞中的表达，宿主细胞裂解后，通过与含有萤火虫荧光素酶底物及缓冲液反应后，检测560nm处的荧光素酶的发光值从而确定病毒的滴度。
在另一优选例中，如果低滴度的病毒株的HA更换为高滴度病毒株的HA后，病毒滴度显著变化(比如，滴度提高)，且低滴度的病毒株的NA更换为高滴度病毒株的NA后，病毒滴度无显著变化，则可判断影响低滴度病毒株的关键氨基酸不是位于NA而是位于HA；或
如果低滴度的病毒株的HA更换为高滴度病毒株的HA后，病毒滴度无变化，但低滴度的病毒株的NA更换为高滴度病毒株的NA后，病毒滴度显著变化(滴度提高)，则可判断影响低滴度病毒株的关键氨基酸不是位于HA而是位于NA；或
如果低滴度的病毒株的HA更换为高滴度病毒株的HA后，病毒滴度显著变化(比如，滴度提高)，并且低滴度的病毒株的NA更换为高滴度病毒株的NA后，病毒滴度也有显著变化(比如，滴度提高)，则可判断影响低滴度病毒株的关键氨基酸同时位于HA和NA。
在另一优选例中，在步骤(f)中，如果HA(或NA)突变型流感病毒的病毒滴度显著低于其对应的野生型病毒的滴度，则表明HA突变型流感病毒中的相应突变位点为影响H5亚型低滴度流感病毒滴度的氨基酸。
在另一优选例中，在步骤(f)中，如果NA突变型流感病毒的病毒滴度显著低于其对应的野生型病毒的滴度，则表明NA突变型流感病毒中的相应突变位点为影响H5亚型低滴度流感病毒的氨基酸。
本发明第二方面提供了一种H5亚型高滴度流感病毒，用本发明第一方面所述的方法制备获得。
在另一优选例中，所述病毒为突变型病毒，所述病毒的基因组中的对应于HA蛋白的突变位点及其相应的突变氨基酸为本发明第一方面中遗传距离最近的H5亚型高滴度流感病毒株的提高病毒滴度的关键性氨基酸位点及其对应的关键氨基酸。
在另一优选例中，所述突变为单位点氨基酸突变或双位点氨基酸突变，或者多位点的氨基酸突变。
在另一优选例中，所述H5亚型高滴度流感病毒为HA头部(head zone)与杆部(stemzone)的HA嵌合体病毒。
本发明第三方面提供了一种药物组合物，所述的组合物含有本发明第二方面所述的高滴度流感假病毒，以及药学上可接受的载体和/或辅料。
在另一优选例中，所述的药物组合物为疫苗组合物。
在另一优选例中，所述疫苗组合物为单价或多价。
在另一优选例中，所述的药物组合物还含有佐剂，首选各种铝佐剂。
在另一优选例中，所述药物组合物中的高滴度流感假病毒、和佐剂(如铝)的摩尔数或重量比在1:100之间，优选为1:40到1:60之间。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括单方药物、复方药物、或协同药物。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为液态、固体、或凝胶态。
在另一优选例中，所述的药物组合物用选自下组的方式施用：皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射、微针注射、口服、或口鼻腔喷入和雾化吸入。
本发明第四方面提供了一种疫苗组合物，所述的组合物含有本发明第二方面所述的高滴度流感假病毒，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。
在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。
在另一优选例中，所述佐剂包括：颗粒型和非颗粒型佐剂。
在另一优选例中，所述颗粒型佐剂选自下组：铝盐、油包水乳剂、水包油乳剂、纳米颗粒、微小颗粒、脂质体、免疫刺激复合物，或其组合。
另一优选例中，所述非颗粒型佐剂选自下组：胞壁酰二肽及其衍生物、皂苷、脂质A、细胞因子、衍生多糖、细菌毒素，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、蜂胶、或其组合。
在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、quil A、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12、和CpG)。
在另一优选例中，所述的疫苗组合物包括注射剂型。
本发明第五方面提供了如本发明第二方面所述的高滴度流感假病毒或本发明第三方面所述的药物组合物或本发明第四方面所述的疫苗组合物的用途，(a)用于制备针对H5亚型流感病毒HA或NA的抗体；和/或(b)用于制备预防和/或治疗流感病毒感染或其相关疾病的药物。
在另一优选例中，所述抗体包括针对流感病毒HA或NA，或HA头部区域，或Ha杆部区域，或针对HA的提高病毒滴度的关键性氨基酸位点，如本发明第二方面所述制备的高滴度病毒株改造的位点。
在另一优选例中，所述抗体包括针对H5亚型流感病毒HA或NA的抗体。
在另一优选例中，所述抗体包括针对H5亚型流感病毒的抗体。
在另一优选例中，所述流感病毒包括H5亚型流感病毒、以及如本发明第一方面方法所述改造获得的高滴度的H5亚型突变型流感病毒。
在另一优选例中，所述H5亚型流感病毒包括H5N1亚型流感病毒。
在另一优选例中，所述的流感病毒感染或其相关疾病选自下组：发热、头疼、流鼻涕、打喷嚏、嗅觉减退、咳嗽、寒颤、咽喉痛、身体疼痛或肌肉疼痛、或其组合。
在另一优选例中，所述治疗包括用基因治疗的方法进行的治疗。
本发明第六方面提供了一种产生针对流感病毒的免疫反应的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第二方面所述的高滴度流感假病毒或本发明第三方面所述的药物组合物或本发明第四方面所述的疫苗组合物。
在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括非人灵长动物(如猴)。
在另一优选例中，所述方法在所述对象中诱导产生针对H5亚型流感病毒的中和抗体。
本发明第七方面提供了一种治疗方法，给需要的对象施用本发明第二方面所述的高滴度流感病毒株或本发明第三方面所述的药物组合物或本发明第四方面所述的疫苗组合物。
在另一优选例中，所述治疗方法包括基因治疗方法。
在另一优选例中，所示治疗方法包括体外使用电穿孔技术转染的人类DC细胞移植，淋巴mRNA疫苗注射。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为HA蛋白对病毒滴度影响。
图2为流感假病毒制备四质粒示意图。
图3为A/Thailand/1(KAN-1)/2004和A/blackbird/Hunan/1/2004HA氨基酸比较及不同假病毒相对荧光强度比较。
图4为A/blackbird/Hunan/1/2004突变假病毒与A/blackbird/Hunan/1/2004假病毒感染能力比较。
图5为A/blackbird/Hunan/1/2004重组病毒和突变重组病毒血凝滴度比较。
图6为A/blackbird/Hunan/1/2004重组病毒和突变重组病毒免疫原性比较。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现，通过构建高滴度H5亚型高致病禽流感病毒株库，绘制遗传进化树，并从进化树上挑选出与待改造的低滴度病毒株遗传距离近的病毒株；构建HA和NA互换的嵌合假病毒，通过假病毒滴度的变化确定影响重组病毒滴度的关键氨基酸是位于HA还是NA；并比较高滴度病毒株和低滴度病毒株HA(或NA)的氨基酸序列差异，进一步定点突变HA(或NA)上不同位点的氨基酸；构建突变假病毒，比较突变假病毒和假病毒滴度，找出影响假病毒滴度的氨基酸。根据假病毒检测结果，构建突变的重组病毒，比较突变重组病毒和野生型重组病毒滴度，确定提高病毒在鸡胚和MDCK细胞上复制能力的氨基酸，挑选对疫苗株的免疫原性影响较小的氨基酸进行突变，构建高滴度的重组病毒，从而可将低滴度的流感病毒改造为高滴度的流感病毒，进一步进行实验确认重组病毒株的吸附能力、融合能力等的变化，解释高滴度病毒株制备的原理。相对于低滴度的流感疫苗株的制备，用本发明的高滴度的病毒株可有效的缩短疫苗制备的时间和疫苗制备的成本，更有效的防控。具体的，本发明以H5N1亚型低滴度流感病毒株A/blackbird/Hunan/1/2004为例，通过本专利的方法，进行了有效的改造，通过对血凝素(HA)(NCBI序列号AAS65615)第42，44，53位的氨基酸突变，可有效的提高病毒的滴度，从而可以高效的生产制备高滴度的H5亚型流感疫苗。在此基础上，本发明人完成了本发明。
术语
为方便描述病毒株A/Thailand/1(KAN-1)/2004简写为“TH”，病毒株A/blackbird/Hunan/1/2004简写为“HN”。
术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如“I42V”表示第42位的氨基酸I突变为V，以此类推。
术语“高滴度流感(假)病毒”是指本发明通过检测假病毒的相对荧光素酶活性(relative luciferase activity，RLA)数值>1000的(假)病毒。
术语“低滴度流感(假)病毒”是指本发明通过检测(假)病毒的相对荧光素酶活性(relative luciferase activity，RLA)数值<500的(假)病毒。
术语“遗传距离”是指序列间差异数值的单位长度。
术语“遗传距离近”是指在进化树上，位于同一结点、进化分支长度数值差异最小。
H5亚型高滴度流感病毒库
H5亚型高滴度流感病毒库如下表所示，具体的，本发明提供了一种高滴度流感病毒库，构建方法如下：根据WHO公布的H5亚型高致病性禽流感病毒株的HA序列，通过生物信息学分析筛选出每个亚类的代表病毒株，分别进行质粒合成，并通过4质粒表达系统，以流感病毒的HA蛋白和NA为囊膜蛋白、萤火虫荧光素为内部核酸包装制备假病毒，通过检测相对荧光素酶活性，再挑选出高滴度的病毒株，从而构建高滴度的H5亚型高致病性禽流感病毒株库。
序号 病毒株 亚类
1 A/Hong Kong China/156/1997 0
2 A/Cambodia/p0322095/05 1
3 A/Thailand/(KAN-1)/2004 1
4 A/Indonesia/5/2005 2.1.3.2
5 A/Turkey/65596/2006 2.2.1
6 A/CommonMagpie/HongKong China/5052/2007 2.3.2.1
7 A/duck/Guangdong/S1322/10(R6) 2.3.2.1
8 A/Shenzhen/406H/2006 2.3.4
9 A/chicken/Guizhou/4/13(R8) 2.3.4.4
10 A/sichuan/26221/2014(H5N6) 2.3.4.4
11 A/chicken/Netherlands/14015526/2014(H5N8) 2.3.4.4
12 A/Chicken/Guangxi/12/2004 2.4
13 A/Chicken/Korea/es/2003 2.5
14 A/Silky Chicken/Hong Kong China/SF189/01 3
15 A/Goose/Guiyang/337/2006 4
16 A/Duck/Guangxi/1378/2004 5
17 A/blackbird/Hunan/1/2004 6
18 A/Duck/Hubei/wg/2002 6
19 A/Beijing/01/2003 7.1
20 A/Chicken/Shanxi/2/2006 7.2
21 A/Chicken/Henan/16/2004 8
22 A/Goose/Shantou/1621/05 9
禽流感病毒
H5亚型高致病性禽流感是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的一类人兽共患传染病。血凝素(Hemagglutinin，HA)因可以诱导出具有中和活性的抗体，并且这些抗体能够预防病毒感染、阻止病毒入侵和清除体内的流感病毒，是A型流感广谱性疫苗主要的靶蛋白。
将低滴度的流感病毒株改造成高滴度病毒株的方法
本发明提供了一种将H5亚型低滴度高致病性流感病毒改造成H5亚型高滴度流感病毒的方法，包括步骤：
(a)提供一构建的H5亚型高滴度流感病毒库，基于所述病毒库中的高滴度流感病毒和所述低滴度流感病毒的HA氨基酸序列，构建遗传进化树；
(b)通过进化树，获得与所述低滴度流感病毒株遗传距离最近的高滴度流感病毒株；
(c)将高滴度的流感病毒株和低滴度流感病毒中的HA或NA蛋白进行互换，构建制备嵌合体流感假病毒，对所述嵌合假病毒的滴度进行RLA检测，从而确定影响流感病毒滴度的关键氨基酸是位于HA还是NA；
(d)在确定关键氨基酸是位于HA(或NA)后，比较步骤(b)所获得的高滴度流感病毒和待改造的低滴度流感病毒的HA(或NA)中的氨基酸差异；
(e)以步骤(b)所获得的高滴度流感病毒的HA(或NA)作为骨架，将步骤(d)中获得的不同的氨基酸位点分别进行氨基酸单点突变，并构建HA(或NA)突变型流感假病毒；
(f)分别检测步骤(e)获得的突变型假病毒和步骤(b)所获得的高滴度病毒株的假病毒的滴度，确定可能影响低病毒滴度病毒株的关键氨基酸位点和数量；
(g)根据步骤(f)获得的关键氨基酸的结果，对低滴度流感假病毒的HA(或NA)中的上述关键氨基酸中的单位点或多位点进行定点突变，构建突变假病毒，通过滴度检测确定提高病毒滴度的关键性氨基酸位点。
(h)根据步骤(g)确定的关键性氨基酸位点，构建质粒，通过反向遗传，制备HA突变型流感病毒，通过滴度检测，验证通过假病毒模型确认的可以提高低滴度病毒株的关键性氨基酸位点，从而获得高滴度流感病毒株。
本发明以H5N1亚型低滴度流感病毒株A/blackbird/Hunan/1/2004为例，首次确定了HA蛋白(血凝素)中的第42位、44位和53位氨基酸，是影响病毒滴度的关键氨基酸，将HA蛋白(血凝素)中的第42位、第44位和第53位的氨基酸同时进行突变(分别将第42位的V突变为I、将第44位的D突变为E、将第53位的E突变为D)会提高病毒滴度，从而获得相应的高滴度流感病毒。
根据本专利提供的方法，成功的将低滴度的H5亚型流感病毒株改造为了高滴度的流感病毒株，具体实施方法为：通过构建遗传进化树(根据方法步骤(a)),确定了与A/blackbird/Hunan/1/2004遗传距离最近的高滴度病毒株A/Thailand/(KAN-1)/2004(根据方法步骤(b))；通过制备的假病毒滴度结果显示A/Thailand/(KAN-1)/2004病毒株与A/blackbird/Hunan/1/2004病毒株的病毒滴度存在显著差异：A/Thailand/(KAN-1)/2004为高滴度病毒株，A/blackbird/Hunan/1/2004为低滴度病毒株；通过A/Thailand/(KAN-1)/2004病毒株与A/blackbird/Hunan/1/2004病毒株HA互换，构建嵌合体假病毒，结果显示当A/blackbird/Hunan/1/2004病毒株的HA更换为A/Thailand/(KAN-1)/2004的HA后，病毒滴度显著提高，说明影响A/blackbird/Hunan/1/2004病毒株滴度的关键氨基酸位于HA(根据方法步骤(c))；通过进一步对A/Thailand/(KAN-1)/2004病毒株的HA与A/blackbird/Hunan/1/2004病毒株的HA进行氨基酸序列对比发现，共有17个氨基酸差异(根据方法步骤(d))。以A/Thailand/(KAN-1)/2004的HA为骨架，将有差异的17个氨基酸位点分别进行单位点突变(突变后的氨基酸与A/blackbird/Hunan/1/2004同位点的氨基酸一致)，合成HA突变质粒，制备HA单位点突变的假病毒(根据方法步骤(e))，滴度检测显示其中3个氨基酸位点(42位，44位和53位)突变均会显著降低A/Thailand/(KAN-1)/2004假病毒的滴度，且双位点突变的假病毒滴度也显著降低(根据方法步骤(f))；为了进一步验证3个氨基酸位点的氨基酸对A/blackbird/Hunan/1/2004病毒株滴度的影响，以A/blackbird/Hunan/1/2004病毒株的HA为骨架，分别进行单位点突变，双位点突变以及3位点突变(突变后的氨基酸为A/Thailand/(KAN-1)/2004的HA同位点氨基酸)，结果显示当3个位点同时突变，A/blackbird/Hunan/1/2004的病毒滴度显著提高，由此确认了A/blackbird/Hunan/1/2004的HA氨基酸序列的42位，44位和53位为影响A/blackbird/Hunan/1/2004病毒滴度的关键氨基酸(根据方法步骤(g))。与此同时，对A/blackbird/Hunan/1/2004突变假病毒的吸附能力和融合能力做了实验检测，判断突变假病毒滴度提高的可能机制。通过反向遗传方法构建重组病毒进行验证，结果一致：3个氨基酸位点突变的A/blackbird/Hunan/1/2004重组病毒滴度显著提高，并且A/blackbird/Hunan/1/2004突变型重组病毒免疫原性与A/blackbird/Hunan/1/2004重组病毒无显著差异(根据方法步骤(h))。
目前商品化的H5亚型高致病性灭活疫苗的制备时通常会以流感病毒的HA和NA作为病毒的囊膜蛋白，高滴度的PR8(或D7)的6个内部基因做为重组病毒的内部基因，从而制备种子病毒。HA和NA为流感病毒的囊膜蛋白，为影响病毒滴度的主要蛋白。因此，基于此，本发明提供了一种利用假病毒模型提高病毒滴度的方法。并且根据本发明提供的方法，通过步骤(a)到步骤(h)成功的将原本为低滴度的病毒株A/blackbird/Hunan/1/2004，改造为了高滴度的病毒株。A/blackbird/Hunan/1/2004病毒株的改造成功，说明了方法的有效性，不仅适用于A/blackbird/Hunan/1/2004，同样适用于其他低滴度的H5亚型的流感病毒株：先挑选出与待改造的低滴度的H5亚型流感病毒遗传距离最近的高滴度H5亚型流感病毒株，通过假病毒模型确定影响病毒滴度的关键性氨基酸是来源于HA或者NA，或者HA和NA，进一步通过关键氨基酸位点的改变，从而来提高病毒的滴度，本发明属于平台技术，具有通用性。
灭活疫苗或减毒疫苗
本发明还提供了用于预防H5亚型禽流感病毒的灭活疫苗。
灭活疫苗是指通过对病毒或细菌进行培养，然后使用物理(如加热)或化学试剂(如β-丙内酯)将其灭活，使其丧失感染性或毒性，但仍保持免疫原性。灭活疫苗可以由整个病毒或细菌组成，也可由它们的裂解片段组成为裂解疫苗，并进一步纯化，直至疫苗仅仅包含所需的抗原成分。减毒疫苗则是指病原体经过各种处理后，病原微生物毒性减弱，但仍保留其免疫原性。
典型的，灭活疫苗和减毒疫苗的方法包括根据H5亚型禽流感病毒的核苷酸序列，利用反向遗传技术，通过质粒共转染细胞，获得禽流感病毒，并进一步通过细胞或者鸡胚进行病毒扩增后进行灭活或处理，从而使病毒的感染性(或毒性)丧失或减弱。应理解，在本发明的一个优选例中，利用反向遗传技术获得的流感病毒的血凝素蛋白为突变蛋白，在野生型流感病毒(比如H5N1亚型低滴度流感病毒株A/blackbird/Hunan/1/2004)的血凝素蛋白的第42位、44位和53位氨基酸的氨基酸分别进行1个或多个氨基酸(优选2个或3个)的突变(分别将第42位的V突变为I、将第44位的D突变为E、将第53位的E突变为D)。
制备疫苗组合物
本发明还提供了一种制备疫苗组合物的方法，具体地，包括步骤：
将本发明制备的高滴度流感假病毒与药学上可接受的疫苗佐剂混合，从而形成疫苗组合物。
在另一优选例中，所述的佐剂为铝佐剂、GLA佐剂，较佳的为铝佐剂。
组合物和施用方法
本发明还提供了一种组合物，所述组合物含有：(i)用本发明方法制备的高滴度流感假病毒，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。本发明的组合物可以是单价的，也可以是多价的。
本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。
(i)药物组合物
本发明的药物组合物包括有效量的用本发明方法制备的重组蛋白或疫苗多肽，所述重组蛋白或疫苗多肽可以是单价的，也可以是多价的。
本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.2μg/千克至2μg/千克。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如重组蛋白或其它治疗剂)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。
组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。
(ii)疫苗组合物
本发明的疫苗组合物可以是预防性的(即预防感染)，也可以是治疗性的。所述的疫苗组合物包含免疫性抗原(包括本发明的高滴度流感假病毒)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。
增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO90/14837)，(b)SAF，和(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如霍乱毒素CT，百日咳毒素PT或大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体，参见例如WO93/13302和WO92/19265；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。
包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。
更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。
(iii)给药途径和剂量
所述组合物可以直接给予对象。对象可以是人或非人哺乳动物，较佳地为人。当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的高滴度流感病毒样颗粒直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。
给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、阴道内、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“有效量”给予病毒样颗粒疫苗，即病毒样颗粒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗禽流感病毒的感染。
在各疫苗剂份中所选用的病毒样颗粒的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000μg，较佳地为1μg-100μg，更佳地10μg-50μg蛋白质或VLP。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明首次利用流感假病毒模型，开发了一种简单快速的将低滴度的流感病毒改造为高滴度的流感病毒的方法；
(2)本发明首次提供了一高滴度的H5亚型高致病性禽流感病毒库；
(3)本发明首次发现，通过本发明构建的高滴度H5亚型高致病禽流感病毒库与低滴度H5亚型的HA氨基酸序列绘制遗传进化树。挑选出进化树上和低滴度病毒株遗传距离近的病毒株，构建HA和NA互换的嵌合假病毒，确定影响重组病毒滴度的关键氨基酸是位于HA还是NA，比较高滴度病毒株和低滴度病毒株的HA(或NA)氨基酸序列，进一步定点突变HA(或者NA)上不同位点的氨基酸，构建突变假病毒，找出影响假病毒滴度的氨基酸。根据假病毒检测结果，构建突变的重组病毒，比较突变重组病毒和野生型重组病毒滴度，确定提高病毒在鸡胚和MDCK细胞上复制能力的氨基酸，挑选对疫苗株的免疫原性影响较小的氨基酸进行突变，构建高滴度的重组病毒，从而可将低滴度的流感病毒改造为高滴度的流感病毒，高滴度的流感病毒制备疫苗可有效提高疫苗制备的时间和节约制备的成本。
(4)本发明首次发现，包含来自H5N1亚型低滴度流感病毒株A/blackbird/Hunan/1/2004的血凝素突变型(比如42，44，53位的氨基酸发生突变)可有效的提高病毒的滴度，从而可以高效的生产制备高滴度的H5亚型流感疫苗。
(5)本发明首次发现，通过本发明提供的方法，找到了3个关键的氨基酸位点，构建的突变重组病毒株病毒滴度显著提高，并且免疫原性不受影响，从而可以制备高滴度的重组病毒。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验指南(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)；或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
本发明使用的HA假病毒及重组假病毒均获自中国科学院上海巴斯德研究所、野生型流感病毒则获自深圳第三人民医院，且野生型病毒及重组病毒相关实验均在深圳第三人民医院深圳市疾病预防控制中心微生物检验科完成。质粒pHR-Luc和pCMV/RΔ8.2由都灵大学医学院Luigi Naldini教授赠送(University Torino Medical School,Torino,Italy)。
本发明涉及到的血凝素氨基酸位点均使用H3 numbering编号方法。
1.实验材料
1.1实验主要用耗材和试剂如表1所示
表1.实验用试剂及耗材信息
名称 品牌 货号
6孔细胞培养板 Thermo fisher 140675
T75细胞培养瓶 Thermo fisher 156499
质粒提取试剂盒 Macherey-Nagel 740412.50
96孔平底细胞培养板 Corning 3599
96孔U型底细胞培养板 Corning 3799
荧光素酶检测试剂盒 Promega E1500
支原体检测试剂盒 Yeasen 40612
DMEM高糖培养基 Gibco 12800-017
青-链霉素(双抗) Gibco 15140-122
Gluta MAX Gibco 35050061
胎牛血清 Gibco 16000-044
0.25％胰酶-EDTA Gibco 25200-072
BSA Sigma 9048-46-8
Lipo2000 Thermo fisher 11668-019
HIV p24蛋白检测试剂盒 Zeptometrix 0801111
TRIzol reagent Thermo 15596018
反转录试剂盒 Takara RR037Q
1.2细胞
HEK293T细胞(Human embryonic kidney，ATCC，CRL-3216)；
MDCK.1细胞(Madin-Darby canine kidney，ATCC，CRL-2935)；
MDCK-NBL-2细胞(Madin-Darby canine kidney，ATCC，CCL-34)；
细胞培养基为DMEM高糖完全培养基(含10％胎牛血清，100units/mL青霉素，100μg/mL链霉素)；
细胞培养条件为37℃、5％ CO2；
所用细胞均通过支原体检测，且检测结果均为阴性。
1.3质粒
1)将A/WSN/1933病毒的6个基因片段PB1、PB2、PA、NP、M和NS基因分别插入pHW2000载体，构建载体pHW2000-PB1、pHW2000-PB2、pHW2000-PA、pHW2000-NP、pHW2000-M和pHW2000-NS；
2)将H5亚型禽流感重组病毒A/blackbird/Hunan/1/2004(HN)HA蛋白碱性裂解位点PERERRRKKRG突变为PEIETRG，并将42位、44位和53位氨基酸进行突变：V42I,D44E,E53D，突变后的氨基酸同TH的HA氨基酸序列的第42位、44位和53位氨基酸，以此进行HA核苷酸序列的合成，构建载体pHW2000-HNHA(424453)；
3)以TH,HN的HA和NA基因为模版，进行人偏好的密码子优化后，由公司进行核苷酸序列合成，构建载体pCMV/R-THHA,pCMV/R-HNHA,pCMV/R-THNA,pCMV/R-HNNA；
4)TH和NA的HA氨基酸序列共有17个氨基酸不同，以TH的HA氨基酸序列为模版，进行17个氨基酸位点的突变，突变后的氨基酸同HN相位点的氨基酸，并以突变后的17个不同HA核苷酸序列为模版，进行人偏好的密码子优化后交由公司进行序列合成，构建载体pCMV/R-THHA(I42V)、pCMV/R-THHA(E44D)、pCMV/R-THHA(D53E)、pCMV/R-THHA(N92aS)、pCMV/R-THHA(V93A)、pCMV/R-THHA(S129D)、pCMV/R-THHA(L133bS)、pCMV/R-THHA(R143G)、pCMV/R-THHA(K144N)、pCMV/R-THHA(S145P)、pCMV/R-THHA(T160A)、pCMV/R-THHA(E174A)、pCMV/R-THHA(R216K)、pCMV/R-THHA(T266A)、pCMV/R-THHA(D449E)、pCMV/R-THHA(K498N)和pCMV/R-THHA(I511T)。
5)将TH的HA氨基酸序列的42位、44位和53位氨基酸分别进行双位点突变和三位点突变，以突变后的氨基酸序列为模版，人偏好的密码子优化后交由公司进行序列合成，构建载体pCMV/R-THHA(4244)、pCMV/R-THHA(4253)、pCMV/R-THHA(4453)和pCMV/R-THHA(424453)。
所有质粒序列均通过Sanger测序鉴定确认。
1.4其他
SPF鸡蛋购于山东昊泰实验动物繁育有限公司。
2.实验方法
具体方法见如下2.1至2.10。
2.1重组病毒制备
本发明利用反向遗传操作系统以A/WSN/33病毒(参照用H5亚型低滴度流感病毒)的PB1、PB2、PA、NP、M、NS为内部基因，以A/blackbird/Hunan/1/2004病毒的血凝素HA和神经酰胺NA作为外部基因，包装制备A/blackbird/Hunan/1/2004重组病毒；以A/WSN/33病毒的PB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA、NA包装制备A/WSN/33重组病毒。A/blackbird/Hunan/1/2004血凝素氨基酸序列为SEQ ID NO.:1，氨基酸序列号为EPI25072。
A/blackbird/Hunan/1/2004(H5亚型低滴度流感假病毒的示例)血凝素氨基酸序列(NCBI序列号AAW19638,通过登录NCBI网址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/56672737下载获得)：
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDVLDKTHNGKLCELDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKASPANDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGNPSFFRNVVWLIKKNSAYPTIKRSYNNTNQADLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYEKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLNREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI
A/Thailand/1(KAN-1)/2004(H5亚型高滴度流感假病毒的示例)血凝素氨基酸序列(NCBI序列号AAS65615，可通过登录NCBI网址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAS65615.2下载获得)：MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQRKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI
具体方法为：
1)用DMEM完全培养基制备10mL总数为9x106的HEK293T、MDCK-NBL-2混合单细胞悬液(HEK293T：MDCK-NBL-2＝6：1)，接种至T75培养瓶37℃、5％ CO2培养20h；
2)按照脂质体lipo2000转染试剂说明书将含有WSN病毒内部基因片段的6个质粒pHW2000-PB1、pHW2000-PB2、pHW2000-PA、pHW2000-M、pHW2000-NP、pHW2000-NS分别和pHW2000-HN HA，pHW2000-HNNA(或pHW2000-WSN HA，pHW2000-WSN NA)共转染至HEK293T和MDCK-NBL-2混合细胞，制备重组病毒HN(或WSN)；
3)转染72h后，3000rpm、4℃离心20min收集含有病毒的上清液。
2.2重组病毒扩增
2.2.1 MDCK.1细胞扩增
1)DMEM完全培养基制备10mL总数为9x106的MDCK.1单细胞悬液，接种至T75培养瓶37℃、5％ CO2培养；
2)24h后弃去细胞原始培养基，分别将重组病毒WSN和HN从10-1倍稀释到10-10倍，加入细胞中，37℃、5％ CO2孵育1h后加入10mL无血清培养基，37℃、5％ CO2继续培养；
3)培养48h～72h，当CPE达到80％时，收集细胞培养基至50mL离心管，3000rpm、4℃离心20min弃细胞残渣，收集上清病毒液体，取适量用于血凝滴度检测，剩余病毒分装后-80℃存储备用。
血凝实验结果显示，通过MDCK.1细胞扩增后的重组病毒A/WSN/33滴度明显高于重组病毒A/blackbird/Hunan/1/2004，且差异显著(如图1中的A所示)。
2.2.2 SPF鸡胚扩增
将重组病毒WSN和HN从10-1倍稀释到10-10倍，以0.1～0.2mL的量分别接种至9～10日龄的SPF级鸡胚的尿囊腔，37℃孵化器内培养48h后，将鸡胚放置于4℃冰箱6h或过夜后收集尿囊液，3000rpm、4℃离心20min后收集病毒上清液，取适量病毒用于血凝滴度检测，剩余病毒分装后-80℃存储备用。
血凝实验结果显示通过鸡胚扩增后的重组病毒A/WSN/33的血凝滴度也明显高于重组病毒A/blackbird/Hunan/1/2004的血凝滴度，且差异显著(如图1中的B所示)。
2.3病毒滴度检测
2.3.1病毒血凝滴度检测
1)向96孔U型底细胞培养板的第2-12孔加入50μL 1×PBS，第1孔加入100μL病毒液。从孔1中吸取50μL病毒液加入孔2混合5次，从第二孔开始将病毒进行2倍梯度稀释直至第11孔，并从第11孔弃除50μL，孔12作为阴性对照。
2)向孔1-12中每孔中加入50μL 0.5％鸡红细胞，并轻轻混匀3次后室温静置30～60min，或直至阴性对照孔红细胞沉入孔底。
3)红细胞出现100％凝集时对应的病毒最高稀释倍数为病毒血凝滴度。
2.3.2假病毒p24蛋白含量检测
1)取出适量的HIV-1P24 antigen ELISA试剂盒的微孔条，室温平衡，洗涤，将待测样品裂解，裂解后的待测样品和P24蛋白标准品梯度稀释，加入微孔条内，4℃孵育过夜。
2)室温封闭，加入检测抗体，37℃孵育。
3)加入化学标记的二抗，37℃孵育。
4)加入底物，室温避光孵育30min。
5)加入终止液终止反应，放入酶标仪内读取样品光吸收值(OD 450nm)。
6)根据标准品绘制的标准曲线计算出待测样品所对应的P24蛋白含量。
2.3.3假病毒报告基因拷贝数检测
实验采用反转录和实时荧光定量PCR的方法检测假病毒报告基因拷贝数，实验步骤参考“Invitrogen TRIzol reagent”试剂说明书。具体步骤如下：
1)用Trizol对假病毒进行裂解，释放病毒的RNA。
2)纯化和浓缩病毒的RNA，参照takara“PrimeScriptTMRT Master Mix(PerfectReal Time)”说明书利用通用引物将RNA反转录为cDNA。
3)通过实时荧光定量PCR对cDNA和标准品进行扩增，根据CT值对病毒粒子进行定量。
2.3.4假病毒相对荧光强度检测
流感病毒感染MDCK.1细胞后，内部萤火虫萤火素酶报告基因将在宿主细胞MDCK.1细胞内表达。被流感病毒感染后的MDCK.1细胞被裂解后，萤火素酶从细胞内释放，可通过萤火虫荧光素酶检测试剂盒，检测在560nm波长处的萤火素酶的荧光信号(即相对荧光强度)。本发明中流感病毒或假病毒的滴度即是通过检测相对荧光强度来界定滴度的高低。具体方法如下：
1)用DMEM完全培养基制备MDCK.1单细胞悬浮液5×104cell/mL，每孔100μL接种于96孔平底细胞培养板，37℃、5％ CO2培养20h；
2)向96孔圆底细胞培养板第3-11孔每孔加入50μL DMEM完全培养基，第2孔加入100μL假病毒液，从孔2中吸取50μL混合液加入孔3，吹吸5次混匀，从第2孔开始将病毒进行2倍梯度稀释至孔11，并弃除50μL液体；
3)将稀释后的假病毒与培养基混合液置于37℃、5％ CO2孵育；
4)1h后将孵育的假病毒分别加入到MDCK.1细胞中，37℃、5％ CO2培养；
5)60h后观察细胞状态，按照荧光素酶检测试剂盒说明书检测相对荧光强度。
2.4假病毒制备
本发明以HEK-293T细胞为宿主细胞，使用4质粒表达系统，通过“磷酸钙介导的质粒DNA转染细胞”方法进行假病毒的包装制备。实验操作参考《分子克隆》实验手册第4版。
4质粒系统分别为：
1)pCMV/R用于表达流感假病毒的囊膜蛋白HA；
2)pCMV/R用于表达流感假病毒的囊膜蛋白NA(或对照假病毒水泡性口炎病毒的G蛋白(VSV-G))；
3)pCMV/RΔ8.2用于表达假病毒的壳蛋白；
4)pHR’CMV-luc用于表达假病毒的报告基因蛋白-萤火虫荧光素酶。
质粒示意图如图2所示。
具体方法为：
1)将HEK293T细胞按照9×106/10mL接种至T75细胞培养瓶，37℃、5％CO2培养20小时后将原始培养基替换为10mL含有10μmol/L二磷酸氯喹的DMEM完全培养基，37℃、5％ CO2培养2小时；
2)按照表2配置质粒及转染试剂和缓冲液混合液后室温静置20min，将混合液加至步骤1)中的培养瓶内；
3)37℃、5％ CO2培养15h后更换加入15mL新鲜DMEM完全培养基继续培养；
4)48h后收取细胞培养基，3000rpm、4℃离心20min后收取病毒上清液，取适量用于相对荧光强度检测，剩余病毒分装后-80℃存储备用。
表2.假病毒制备混合体系
质粒/试剂 体积
ddH2O 529.2μL
pCMV/R-HA(100ng/μL) 27.0μL
pCMV/R-NA(50ng/μL) 13.5μL
pHR-Luc(1000ng/μL) 18.9μL
pCMVΔ8.9(1000ng/μL) 18.9μL
CaCl2(2.5M) 67.5μL
2×HEPES(pH 7.1) 675.0μL
A/Thailand(KAN-1)/2004假病毒滴度和A/blackbird/Hunan/1/2004假病毒的滴度检测方法如2.3.4所述，血凝检测结果显示，A/Thailand(KAN-1)/2004假病毒和A/blackbird/Hunan/1/2004假病毒的血凝滴度没有明显差异(如图1中的C所示)；p24蛋白检测结果显示，A/Thailand(KAN-1)/2004假病毒和A/blackbird/Hunan/1/2004假病毒的p24蛋白含量没有明显差异(如图1中的D所示)；报告基因拷贝数结果显示，A/Thailand(KAN-1)/2004假病毒和A/blackbird/Hunan/1/2004假病毒报告基因的拷贝数没有明显差异(如图1中的E所示)；但相对荧光强度结果显示，A/Thailand(KAN-1)/2004假病毒的相对荧光强度较强，与A/blackbird/Hunan/1/2004假病毒的相对荧光强度存在极显著差异(如图1中的F所示)。
2.5嵌合假病毒制备
通过互换A/Thailand(KAN-1)/2004和A/blackbird/Hunan/1/2004的NA，构建嵌合假病毒THHAHNNA和HNHATHNA(如图1中的G所示)，假病毒的制备方法如2.4所述。
嵌合假病毒的滴度检测如2.3.4所述，荧光素酶相对荧光强度值显示：THHAHNNA嵌合假病毒的荧光强度显著高于HNHATHNA嵌合假病毒(如图1中的H所示)。
实验结果说明A/Thailand(KAN-1)/2004的NA替换改变后，假病毒的滴度变化不大，但将A/Thailand(KAN-1)/2004的HA替换改变后，假病毒滴度显著改变；且A/blackbird/Hunan/1/2004的NA替换改变后，假病毒的滴度变化不大，但将A/blackbird/Hunan/1/2004的HA替换改变后，假病毒滴度显著改变。由此可知囊膜蛋白HA，影响和改变假病毒的滴度及感染能力。
2.6 A/Thailand(KAN-1)/2004和A/blackbird/Hunan/1/2004的HA氨基酸差异
本发明通过比较A/Thailand(KAN-1)/2004和A/blackbird/Hunan/1/2004的HA氨基酸序列后发现共有17处氨基酸不同(如表3所示)，并且这17个氨基酸分别位于HA蛋白的头部区域和杆部区域(如图3A所示)。
表3.A/Thailand(KAN-1)/2004和A/blackbird/Hunan/1/2004的HA 17个氨基酸差异
H3 Numbering 42 44 53 92a 93 129
Amino acids(TH) I E D N V S
Amino acids(HN) V D E S A D
H3 Numbering 133b 143 144 145 160 174
Amino acids(TH) L R K S T E
Amino acids(HN) S G N P A A
H3 Numbering 216 266 449 498 511 /
Amino acids(TH) R T D K I /
Amino acids(HN) K A E N T /
2.7 A/Thailand(KAN-1)/2004HA突变型假病毒构建
2.7.1单点氨基酸突变假病毒构建
本发明将TH的血凝素氨基酸中与HN不同的17个氨基酸进行突变，突变后的氨基酸为HN对应氨基酸位点的氨基酸，根据2.4假病毒制备的方法，获得了17个突变假病毒(如表4所示)并按照2.3.4所述方法检测突变假病毒的滴度。实验结果显示(如图3中B所示)：
1)假病毒TH(I42V)、TH(E44D)、TH(D53E)的相对荧光强度均比未突变的TH假病毒的荧光强度弱，且差异显著；
2)除TH(I42V)、TH(E44D)、TH(D53E)以外的其余14个氨基酸突变的假病毒的相对荧光强度与TH假病毒的荧光强度无差异。
由此可知，TH的血凝素42位、44位和53位氨基酸的改变可能影响TH的病毒滴度。
表4.17株A/Thailand(KAN-1)/2004单位点氨基酸突变假病毒
2.7.2双位点氨基酸突变假病毒构建
进一步将TH血凝素的42位、44位和53位的氨基酸进行双位点突变构建假病毒(如表5所示)，并检测假病毒的滴度。结果显示：
假病毒TH(I42V,E44D)、TH(I42V,D53E)、TH(E44D,D53E)感染MDCK.1细胞后的相对荧光强度均比未突变的TH假病毒感染MDCK.1细胞后的荧光强度弱，且数值差异明显，但是假病毒TH(I42V,E44D)、TH(I42V,D53E)、TH(E44D,D53E)之间的差异不显著(如图3中的C所示)。
表5.3株A/Thailand(KAN-1)/2004双位点氨基酸突变假病毒
双突变假病毒1 双突变假病毒2 双突变假病毒3
TH(I42V,E44D) TH(I42V,D53E) TH(E44D,D53E)
2.8 A/blackbird/Hunan/1/2004突变型假病毒构建
2.8.1 A/blackbird/Hunan/1/2004突变型假病毒滴度检测
将HN血凝素的42位、44位、53位氨基酸,分别进行单点、两点和三点突变，共构建7株突变假病毒，突变后的氨基酸与TH对应的42位、44位、53位的氨基酸一致，如表6所示。
表6.7株A/blackbird/Hunan/1/2004突变假病毒构建
7株突变假病毒的滴度检测方法如2.3.4所述，结果显示(如图4中的A所示)：
1)单点突变后的假病毒HN(V42I)、HN(D44E)与HN(E53D)的相对荧光强度与未突变的HN假病毒的相对荧光强度无显著性差异，说明HN血凝素的第42位、第44位和第53位氨基酸单位点突变不影响HN假病毒的滴度；
2)双点突变的假病毒HN(V42I,D44E)、HN(V42I,E53D)、HN(D44E,E53D)的相对荧光强度值明显高于未突变的HN假病毒的荧光强度值，且数值具有显著差异，说明HN血凝素中第42、第44和第53位点的氨基酸两两突变均可以显著提高HN假病毒的滴度；
3)三点突变的假病毒HN(V42I,D44E,E53D)的相对荧光强度值也明显高于未突变的HN假病毒的荧光强度值，且数值具有极显著差异，并且HN(V42I,D44E,E53D)的相对荧光强度值也明显高于HN(V42I,D44E)、HN(V42I,E53D)、HN(D44E,E53D)三组双点突变的假病毒的相对荧光强度值，且数值具有极显著差异，说明第42位，第44位，第53位氨基酸是影响HN假病毒滴度的关键氨基酸，当3位点同时突变时，可显著提高HN假病毒的滴度。
为进一步确定假病毒HN(V42I,D44E,E53D)的病毒滴度提高是由于假病毒的对宿主细胞的吸附能力增强还是与宿主细胞的融合能力提升，本发明继续进行了下面实验。
2.8.2A/blackbird/Hunan/1/2004血凝素突变型假病毒吸附能力检测
1)DMEM完全培养基制备MDCK.1单细胞悬液4×104/mL，100μL/孔接种至96孔平底细胞培养板，37℃、5％ CO2培养20h。
2)将假病毒和DMEM(1％BSA)培养基混合，4℃孵育过夜。
3)弃去96孔平底细胞培养板的原始培养基，加入DMEM(1％BSA)培养基，100μL/孔，4℃共孵育1h。
4)用步骤2中的假病毒和血清混合物取代步骤3中的细胞培养基，4℃孵育2h。
5)用无菌PBS(1％ BSA)洗涤96孔平底细胞培养板4次，去除未结合的病毒。加入100μL荧光素酶裂解液，室温裂解细胞30min。
6)按照HIV-p24检测试剂盒说明书，读取450nm吸光值并计算结合到细胞上的病毒数量。
实验结果显示(如图4中的B所示)：
1)单个位点氨基酸突变假病毒HN(V42I)、HN(D44E)与HN(E53D)中，仅D44E位点氨基酸突变后的假病毒的吸附能力有改变，且吸附能力较HN弱，数值有差异；
2)双位点的氨基酸突变假病毒HN(V42I与D44E)、HN(V42I,E53D)、HN(D44E,E53D)中，仅HN(V42I,E53D)突变的假病毒的吸附能力与HN有差异，且吸附能力均较HN弱，假病毒HN(V42I与D44E)与HN(D44E,E53D)的吸附能力与HN则无差异；
3)三位点的氨基酸突变假病毒HN(V42I,D44E,E53D)的吸附能力则与HN无差异。
由此可知，44位氨基酸可单独影响HN假病毒的吸附能力，42位氨基酸和53位氨基酸可共同影响HN假病毒的吸附能力。
2.8.3A/blackbird/Hunan/1/2004血凝素三位点突变型假病毒融合能力检测
1)假病毒和2％的红细胞冰上共孵育10min。
2)柠檬酸钠缓冲液与步骤1中混合物混合，调节终pH至5.0，在室温下孵育30分钟。
3)3000rpm离心3min取上清液用于Elisa实验，检测上清液中血红蛋白含量。
图4C的实验结果则显示：
1)单个位点氨基酸突变假病毒HN(V42I)、HN(D44E)与HN(E53D)的融合能力与假病毒HN无差异；
2)双位点的氨基酸突变假病毒HN(V42I与D44E)、HN(V42I,E53D)与HN(D44E,E53D)的融合能力均与假病毒HN比较均增强，且实验数值差异及其显著；
3)三点氨基酸突变的假病毒HN(V42I,D44E,E53D)与假病毒HN相比，融合能力增强，且数值差异极其显著；且三点突变的假病毒HN(V42I,D44E,E53D)均比双位点的氨基酸的假病毒HN(V42I与D44E)、HN(V42I,E53D)与HN(D44E,E53D)的融合能力强。
由此可知，氨基酸突变中第42位、第44位和第53位三点氨基酸同时突变可显著提高假病毒融合能力，这也可能是HN(V42I,D44E,E53D)滴度显著提高的原因。
综合图3中A、B、C的实验数据结果可知，当第42位、第44位和第53位氨基酸同时突变获得的假病毒HN(V42I,D44E,E53D)吸附能力不受影响，与宿主细胞的融合能力显著提高，从而HN(V42I,D44E,E53D)的病毒滴度显著提高。
根据2.6-2.8的实验结果，因此可以判断HN血凝素HA中，第42位、第44位和第53位氨基酸为关键位点的氨基酸，可通过这3个位点的氨基酸突变，就能获得高滴度的HN病毒。因此本发明通过构建突变型重组病毒HN(V42I,D44E,E53D)并检测病毒滴度以验证。
2.9 A/blackbird/Hunan/1/2004突变型重组病毒构建
按照2.1-2.4所述方法，构建突变型重组病毒HN-424453，以A/blackbird/Hunan/1/2004病毒株的血凝素氨基酸序列为基础，将A/blackbird/Hunan/1/2004病毒株的血凝素氨基酸序列的第42位，44位和53位的氨基酸分别进行如下突变：V42I,D44E,E53D，从而构建重组病毒HN-424453的血凝素氨基酸序列，并合成质粒，制备重组病毒。重组病毒HN-424453的血凝素氨基酸序列如下所示：
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKASPANDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGNPSFFRNVVWLIKKNSAYPTIKRSYNNTNQADLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYEKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLNREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI。
对获得的突变重组病毒进行血凝滴度检测结果显示(如图5所示)：
1)通过MDCK.1细胞扩增获得的突变重组病毒(HN-424453)的血凝滴度高于重组病毒HN，且数值差异显著(如图5中的A所示)。
2)通过鸡胚扩增获得的重组病毒(HN-424453)的血凝滴度高于重组病毒HA，且数值差异显著(如图5中的B所示)。
综上，本发明通过A/blackbird/Hunan/1/2004血凝素的3个关键位点氨基酸的突变，提高了A/blackbird/Hunan/1/2004病毒的滴度。
2.10 A/blackbird/Hunan/1/2004重组病毒和突变型重组病毒免疫原性比较
MDCK.1细胞扩增重组病毒HN和突变型重组病毒HN-424453，收集细胞上清，25,000rpm超离浓缩，蔗糖梯度离心纯化，β-丙内酯灭活后透析，ELISA试剂盒对灭活病毒HA蛋白定量，将定量好的灭活病毒用MF59佐剂乳化，4℃保存备用。
12只6-8周龄的Balb/c小鼠随机被分成两组，每组6只，一组小鼠进行灭活疫苗HN免疫，另一组小鼠进行灭活疫苗HN-M免疫。2组小鼠均进行两次免疫，将乳化好的免疫原通过肌肉注射免疫小鼠，每只小鼠免疫10μg蛋白，第二次免疫后14天，收集免疫血清，56℃灭活，离心，分装，-80℃保存备用。
MDCK.1细胞提前一天铺板，免疫血清倍倍稀释后，与假病毒在37℃条件下孵育，60min后加入到MDCK细胞继续培养，60小时后，检测RLA，用Graphpad软件进行拟合，绘制sigma曲线，计算免疫血清的中和滴度。
免疫血清对HN和HN突变假病毒的中和滴度通过PN实验检测，VSV假病毒作为阴性对照，结果如图6所示，免疫血清对VSVG假病毒无中和活性，但对HN和HN突变病毒有较好的中和活性；HN灭活病毒免疫血清对HN和HN突变型假病毒的PN滴度无显著性差异(图5A)。同样，HN突变灭活病毒对HN和HN突变假病毒的免疫血清PN滴度也没有显著差异(图5B)。说明HN和HN突变体重组病毒的免疫原性无明显变化。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (13)

1.一种将H5亚型低滴度流感病毒改造为高滴度流感病毒的方法，其特征在于，包括：
(a)提供一构建的H5亚型高滴度流感病毒库和待改造的H5亚型低滴度流感病毒株，基于所述病毒库中的H5亚型高滴度流感病毒和所述H5亚型低滴度流感病毒的HA氨基酸序列，从而获得遗传进化树；
(b)通过所述遗传进化树，获得与所述H5亚型低滴度流感病毒株遗传距离最近的H5亚型高滴度流感病毒株；
(c)将步骤(b)获得的H5亚型高滴度的流感病毒株和H5亚型低滴度的流感病毒中的HA或NA蛋白进行互换，制备嵌合假病毒，对所述嵌合假病毒的滴度进行检测，确定影响流感病毒滴度的蛋白是HA还是NA；
(d)比较步骤(b)所获得的H5亚型高滴度流感病毒株和步骤(a)所述的H5亚型低滴度流感病毒的HA(或NA)中的氨基酸的差异；
(e)将步骤(b)所获得的H5亚型高滴度流感病毒的HA(或NA)中与和步骤(a)所述的H5亚型低滴度流感病毒株的HA(或NA)中的全部不同的氨基酸分别进行单点突变，从而制备获得HA(或NA)突变型流感假病毒；
(f)分别检测步骤(e)获得的HA(或NA)突变型流感假病毒和步骤(b)所获得的H5亚型高滴度流感病毒株的假病毒滴度，从而确定可能影响H5亚型低病毒滴度病毒株的氨基酸位点信息；
(g)根据步骤(f)获得的氨基酸位点，将待改造的H5亚型低滴度流感病毒的HA(或NA)中上述关键氨基酸分别进行单位点氨基酸突变制备假病毒，通过滴度检测确定可能提高病毒滴度的氨基酸位点；进一步进行双位点或多位点氨基酸突变，通过假病毒滴度检测，从而确定影响H5亚型低滴度流感病毒的关键氨基酸；
(h)根据步骤(g)确定的关键性氨基酸位点，构建质粒，通过反向遗传，制备HA突变型流感病毒，通过滴度检测，验证确认的关键性氨基酸位点，从而获得H5亚型高滴度流感病毒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对参照用H5亚型低滴度流感病毒的病毒滴度的检测步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述H5亚型低滴度病毒株突变的氨基酸为遗传进化树上与低滴度的H5亚型流感病毒株遗传距离最近的高滴度的H5亚型流感病毒株同位点的氨基酸。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述遗传距离最近的H5亚型高滴度的流感病毒株是指所述遗传进化树上与H5亚型低滴度的流感病毒株位于同一个结点、同一进化支的病毒株。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述H5亚型高滴度流感病毒是指对应的假病毒的相对荧光素酶活性(Relative Luciferase Activity，RLA)数值显著高于1000。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述H5亚型低滴度流感病毒是指对应的假病毒的相对荧光素酶活性(Relative Luciferase Activity，RLA)数值显著低于500。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述H5亚型高滴度流感病毒株如下：
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述H5亚型低滴度流感病毒包括A/blackbird/Hunan/1/2004。
9.一种H5亚型高滴度流感病毒，其特征在于，用权利要求1所述的方法制备获得。
10.如权利要求9所述的H5亚型高滴度流感病毒，其特征在于，所述病毒为突变型病毒，所述病毒的基因组中的对应于HA蛋白的突变位点及其相应的突变氨基酸为权利要求1中遗传距离最近的H5亚型高滴度流感病毒株的提高病毒滴度的关键性氨基酸位点及其对应的关键氨基酸。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求9所述的高滴度流感假病毒，以及药学上可接受的载体和/或辅料。
12.一种疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求9所述的高滴度流感假病毒，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。
13.如权利要求9所述的高滴度流感假病毒或权利要求11所述的药物组合物或权利要求12所述的疫苗组合物的用途，其特征在于，(a)用于制备针对H5亚型流感病毒HA或NA的抗体；和/或(b)用于制备预防和/或治疗流感病毒感染或其相关疾病的药物。
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