CN118344463B - 一种人纤维蛋白原的制备方法及产品 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人纤维蛋白原的制备方法及产品，属于蛋白生产技术领域。本发明提供的制备方法组分Ⅰ沉淀为原料，采用特定溶解液结合低温乙醇法获得制备得到人纤维蛋白原原液。本发明提供的制备方法将结合S/D病毒灭活法和干热病毒灭活法进行病毒的灭活，可进一步保证人纤维蛋白原的安全性。采用本发明提供对的制备方法制备得到的人纤维蛋白原纯度高达87.4％‑98.3％。复溶速度快，仅需4‑5min即可复溶，复溶液澄明，仅微带乳光。凝固时间少，仅需19‑22s。
Description
技术领域
本发明属于蛋白生产技术领域，具体涉及一种人纤维蛋白原的制备方法及产品。
背景技术
人纤维蛋白原(human fibrinogen，Fg)是血浆中的蛋白成分，含量高达2-4g，在人凝血系统中发挥着关键作用，凝血的最后阶段是Fg在凝血酶的作用下转变为纤维蛋白，纤维蛋白和其他血细胞成分聚集成不溶性团状物达到止血的目的。除直接参与凝血过程外，Fg还在血小板聚集、血液粘度方面起着重要作用。Fg缺乏常见的相关疾病包括：先天性纤维蛋白原减少或缺乏症；严重肝脏损伤、肝硬化、弥散性血管内凝血、产后大出血和因大手术、外伤或内出血等引起的纤维蛋白原缺乏而造成的凝血障碍。
目前，提取纤原的原料主要包括两种方法：一种是以冷沉淀为原料，通过抽提、吸附、离心、层析等制造工艺得到，采用冷沉淀为原料，通过抽提、吸附、离心、层析等制造工艺得到的人纤维蛋白原沉淀溶解性低，溶解困难。另一种是采用低温乙醇工艺产生的组分Ⅰ沉淀，但该工艺主要存在纯度不高的问题，生产出来的制品纯度都在80％以下，产品杂质含量偏多，患者在注射使用时，容易发生不良反应。另一方面，该工艺的制品复溶时间长，由于制品中同时含有少量的纤维结合蛋白，纤维结合蛋白热稳定性较差，特别是干热灭活时易变性，导致复溶时易蛋白析出。
专利CN108017710B公开了一种双层析法制备人纤维蛋白原的方法，制备工艺中包括组分Ⅰ沉淀溶解、过滤；S/D病毒灭活；Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析；一次超滤浓缩；肝素亲和层析；二次超滤浓缩；检测配制；分装冻干；轧盖及干热灭活。制备的制品蛋白含量为2.2-2.4％，采用甘氨酸、枸橼酸钠作为保护剂。该方法制备得到的人纤维蛋白原的纯度提高至96.2％，复溶时间为9min。但对于产品稳定性效果的提升仍未涉及。
鉴于目前市场人纤维蛋白原的制备工艺和临床应用状况，开发出新的高纯度、溶解性好、稳定性好的人纤维蛋白原提取工艺显得尤为必要。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种人纤维蛋白原的制备方法及产品。本发明提供的制备方法组分Ⅰ沉淀为原料，采用特定溶解液结合低温乙醇法获得制备得到人纤维蛋白原原液。本发明提供的制备方法将结合S/D病毒灭活法和干热病毒灭活法进行病毒的灭活。可进一步保证人纤维蛋白原的安全性。采用本发明提供对的制备方法制备得到的人纤维蛋白原纯度高达87.4％-98.3％。复溶速度快，仅需4-5min即可复溶，复溶液澄明，仅微带乳光。凝固时间少，仅需19-22s。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种人纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
S1、组分Ⅰ沉淀的溶解后过滤，获得滤液A；
S2、滤液A经过S/D灭活，获得灭活液；
S3、灭活液通过两次低温乙醇沉淀制备得到人纤维蛋白原原液。
具体地，步骤S1中所述的组分Ⅰ沉淀的制备方法为：去除冷沉淀后的血浆采用低温乙醇沉淀法获得组分Ⅰ沉淀。
进一步具体地，所述的去除冷沉淀包括：将原料血浆先用75％酒精浸泡2 3min，再用注射用水冲洗表面，然后将原料血浆破袋输送至融浆罐，用10 37℃的水进行夹层循环融浆，融化后停止循环，血浆温度控制在0 4℃之间，离心分离冷沉淀，去除冷沉淀后的血浆输送至反应罐进行提取分离。
进一步具体地，所述的低温乙醇沉淀法包括向去除冷沉淀后的血浆中加入缓冲液调节pH，加入低温乙醇，离心后，得到组分Ⅰ沉淀。
优选地，所述的去除冷沉淀后的血浆的温度控制在0-4℃之间。
优选地，所述的低温乙醇为-15至-20℃的90％-95％的乙醇。
进一步优选地，所述的低温乙醇为-15℃的95％的乙醇。
优选地，所述的乙醇与血浆的体积比浓度为10％，添加乙醇的流速不大于1.0L/min。
进一步优选地，添加乙醇的流速包括0.5L/min、0.6L/min、0.7L/min、0.8L/min、0.9L/min、1.0L/min。
优选地，所述的调节pH为加入pH4.0的醋酸缓冲液调节pH至6.8-7.2。
具体地，步骤S1中所述的溶解所用的溶解液为溶解液A，所述的溶解液A含有1.6％-2.0％枸橼酸钠、0.9％-1.1％氯化钠；
优选地，所述的溶解液A含有1.85％枸橼酸钠、0.9％氯化钠。
优选地，所述的溶解液A的配制方法为将枸橼酸钠、氯化钠溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入1mol/L HCl调节pH至6.6-7.0。
具体地，步骤S1中所述的组分Ⅰ沉淀与溶解液A的比例为1：15-20w/v。
优选地，步骤S1中所述的组分Ⅰ沉淀与溶解液A的比例为1：15w/v。
具体地，步骤S1中所述的过滤为使用板框滤器进行过滤。
优选地，所述的板框滤器的平衡液为平衡液A，所述的平衡液A含有3.2％-4.0％氯化钙和0.9％-1.1％氯化钠。
进一步优选地，所述的板框滤器所用滤板为K700滤板。
进一步优选地，所述的板框滤器的平衡液为平衡液A，所述的平衡液A含有3.7％氯化钙和0.9％％氯化钠。
进一步优选地，所述的平衡液A，所述的平衡液A的配制方法为将氯化钙、氯化钠溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入1mol/L HCl调节pH至6.6-7.0。
进一步优选地，所述的溶解液A中的枸橼酸钠与平衡液A中的氯化钙的比例为1：1-3。
再进一步优选地，所述的溶解液A中的枸橼酸钠与平衡液A中的氯化钙的比例为1：2。
具体地，步骤S1中所述的过滤的流速不大于1.5L/min。
优选地，步骤S1中所述的过滤的流速为1.0-1.5L/min。
具体地，步骤S2中所述的S/D灭活为以每升滤液添加100mL S/D灭活液的比例，向滤液A中添加S/D灭活液进行灭活。
优选地，所述的灭活的温度维持在24℃，灭活6h。
具体地，步骤S3中所述的两次低温乙醇沉淀包括：
(1)添加乙醇得到第一沉淀，用溶解液B溶解第一沉淀后过滤，收集滤液；(2)滤液中再加入乙醇得到第二沉淀，用溶解液C溶解第二沉淀后，过滤，获得人纤维蛋白原原液。
优选地，所述的溶解液B含有0.85％-1.2％枸橼酸钠、0.9％-1.1％氯化钠、0.35％-0.4％盐酸精氨酸。
进一步优选地，所述的溶解液B含有1.15％枸橼酸钠、0.9％氯化钠、0.37％盐酸精氨酸。
优选地，所述的溶解液B的配制方法为将枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入pH＝3.6的甘氨酸-盐酸缓冲液调节pH至6.6-7.0。
优选地，所述的第一沉淀与溶解液B的比例为1：15-20w/v。
进一步优选地，所述的第一沉淀与溶解液B的比例为1：15w/v。
优选地，步骤S3(1)中所述的乙醇为-15至-20℃的45％-55％的乙醇。
进一步优选地，所述的低温乙醇为-15℃的50％的乙醇。
进一步优选地，所述的乙醇与血浆的体积比浓度为10％，添加乙醇的流速不大于1.0L/min。
优选地，所述的溶解液C含有1.35％-1.75％枸橼酸钠、3.5％-4.0％盐酸精氨酸。
进一步优选地，所述的溶解液C含有1.5％枸橼酸钠、3.7％盐酸精氨酸。
优选地，所述的溶解液C的配制方法为将枸橼酸钠、盐酸精氨酸溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入1mol/L HCl调节pH至6.8-7.0。
优选地，所述的第二沉淀与溶解液C的比例为1：5-6w/v。
进一步优选地，所述的第二沉淀与溶解液C的比例为1：5w/v。
优选地，步骤S3(1)中所述的过滤为使用板框滤器进行过滤。
进一步优选地，所述的板框滤器所用滤板为SUPRA EK 1P滤板。
进一步优选地，所述的滤器使用溶解液B平衡滤器。
优选地，步骤S3(2)中所述的乙醇为-15至-20℃的45％-55％的乙醇。
进一步优选地，所述的低温乙醇为-15℃的50％的乙醇。
进一步优选地，所述的乙醇与血浆的体积比浓度为10％，添加乙醇的流速不大于1.0L/min。
优选地，步骤S3(2)中所述的过滤为使用板框滤器进行过滤。
进一步优选地，所述的板框滤器所用滤板为SUPRA EK 1P滤板。
进一步优选地，所述的滤器使用溶解液C平衡滤器。
优选地，步骤S3(1)和(2)中所述的过滤的流速不大于1.5L/min。
进一步优选地，步骤S3(1)和(2)中所述的过滤的流速为1.0-1.5L/min。
具体地，所述的制备方法还包括：
S4、调节蛋白浓度后，过滤，分装，冻干后轧盖，制得人纤维蛋白原冻干粉；
S5、人纤维蛋白原冻干粉干热法灭活病毒，获得人纤维蛋白原制剂成品。
优选地，步骤S4中所述的调节蛋白浓度使用的溶液为溶解液C。
优选地，步骤S4中所述的调节蛋白浓度为调节蛋白浓度至2.5％-3.5％。
优选地，步骤S4中所述的过滤为使用0.45μm滤芯过滤。
优选地，步骤S4中所述的冻干过程如下：
制品常温入柜，降至-6℃，保温180分钟进行预冻；降至-40℃，保温180分钟进行冻结；升至-15℃，保温120分钟进行退火；降至-45℃，保温360分钟继续冻结；开始抽真空度至10Pa，保持10Pa±5Pa；升至-40℃，保温60分钟；升至-15℃，保温120分钟；升至0℃低温升华，保温2220分钟；升至10℃真空干燥，保温120分钟；升至33℃真空干燥，保温240分钟；抽极限真空，保持33℃至真空合格，冻干过程制品温度最高不得超过35℃。
优选地，步骤S5中所述的干热法灭活病毒为99.5±5℃温度条件下灭活30min。
进一步优选地，步骤S5中所述的干热法灭活病毒为100℃温度条件下灭活30min。
另一方面，本发明提供了一种人纤维蛋白原，所述的人纤维蛋白原通过上述的制备方法制备得到。
本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的制备方法制备得到的人纤维蛋白原纯度高达87.4％-98.3％。
(2)本发明提供的制备方法制备得到的人纤维蛋白原复溶速度快，仅需4-5min即可复溶，复溶液澄明，仅微带乳光。凝固时间少，仅需19-22s。
具体实施方式
下面将结合本发明具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用的基础溶液的配制方法如下：
1、pH4.0的醋酸缓冲液：取65.6g无水醋酸钠，加冰醋酸244.9mL，用适量注射用水充分溶解，加注射用水定容至1L混匀；
2、pH＝3.6的甘氨酸-盐酸缓冲液：取250mL 0.2mol/L甘氨酸，加25mL0.2mol/LHCl，使用注射用水充稀释至1L。
3、S/D灭活液的配制：S/D灭活液中含有10％ Tween80和3.3％磷酸三丁酯(TNBP)；配制时先用温的注射用水溶解Tween80，待其完全溶解后再添加TNBP，此时灭活液会变澄清，温度控制在25℃，灭活8h，得S/D灭活液。
实施例1
1、溶解液的配制：
溶解液A的配制：溶解液A含有1.85％枸橼酸钠、0.9％氯化钠。溶解液A的配制方法为将枸橼酸钠、氯化钠溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入1mol/LHCl调节pH至6.6-7.0。
平衡液A的配制：平衡液A含有3.7％氯化钙和0.9％氯化钠。平衡液A的配制方法为将氯化钙、氯化钠溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入1mol/L HCl调节pH至6.6-7.0。
溶解液B的配制：溶解液B含有1.15％枸橼酸钠、0.9％氯化钠、0.37％盐酸精氨酸。溶解液B的配制方法为将枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入pH＝3.6的甘氨酸-盐酸缓冲液调节pH至6.6-7.0。
溶解液C的配制：溶解液C含有1.5％枸橼酸钠、3.7％盐酸精氨酸。溶解液C的配制方法为将枸橼酸钠、盐酸精氨酸溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入1mol/L HCl调节pH至6.8-7.0。
2、人纤维蛋白原制备方法
严格按照《中国药典》2020年版三部中“血液制品生产用人血浆”的规定及“实施原料血浆检疫期管理技术指导原则”的要求进行原料血浆收集和检验。
(1)将原料血浆先用75％酒精浸泡23min，再用注射用水冲洗表面，然后将原料血浆破袋输送至融浆罐，用1037℃的水进行夹层循环融浆，融化后停止循环，血浆温度控制在04℃之间，离心分离冷沉淀，去除冷沉淀后的血浆输送至反应罐进行提取分离；
(2)组分Ⅰ沉淀的制备：血浆温度控制在0至4℃之间，加入pH4.0的醋酸缓冲液调节pH至6.8-7.2，添加-15℃的95％乙醇，使乙醇与血浆的体积比浓度为10％，添加乙醇的流速为1L/min，使反应液的最终温度控制在-1至-3℃，加完乙醇后10000rpm连续离心，得到组分Ⅰ沉淀；
(3)组分Ⅰ沉淀的溶解与过滤：按照组分Ⅰ沉淀：溶解液A＝1：15(w/v)的比例，向组分Ⅰ沉淀中加入溶解液Ⅰ，温度控制在30-37℃，搅拌1小时，使组分Ⅰ沉淀完全溶解，得到组分Ⅰ沉淀溶解液。安装K700滤板，使用平衡液A平衡滤器，平衡20min后，开始过滤组分Ⅰ沉淀溶解液，流速为1.5L/min，得到滤液A；
(4)S/D灭活：按照每升滤液添加100mL S/D灭活液的比例，在搅拌下以0.5L/min的速度将S/D灭活液加入滤液A中，温度维持在24℃，灭活6h，得到灭活液；
(5)第一次沉淀：灭活液降温至0至1℃之间，添加-15℃的50％乙醇，使乙醇与血浆的体积比浓度为10％，添加乙醇的流速为1L/min，使反应液的最终温度控制在-1至-3℃，加完乙醇后10000rpm连续离心，得到第一沉淀；
(6)第一沉淀溶解与过滤：按照第一沉淀：溶解液B＝1：15(w/v)的比例，向第一沉淀中加入溶解液B，搅拌1小时，温度控制在30-37℃，使第一沉淀完全溶解，得到第一沉淀溶解液。安装SUPRA EK 1P滤板，使用溶解液B平衡滤器，平衡20min后，开始过滤第一沉淀溶解液，流速为1.5L/min，得到滤液B；
(7)第二次沉淀：滤液B降温至0至1℃之间，添加-15℃的50％乙醇，使乙醇与血浆的体积比浓度为10％，添加乙醇的流速为1L/min，使反应液的最终温度控制在-1至-3℃，加完乙醇后10000rpm连续离心，得到第二沉淀；
(8)人纤维蛋白原原液制备：按照第二沉淀：溶解液C＝1：5(w/v)的比例，向第二沉淀中加入溶解液C，搅拌30min，温度控制在30-37℃，使第二沉淀完全溶解，得到第二沉淀溶解液。安装SUPRA EK 1P滤板，使用溶解液C平衡滤器，平衡20min后，开始过滤第二沉淀溶解液，流速为1.5L/min，得到人纤维蛋白原原液；
(9)配液：向人纤维蛋白原原液使用溶解液C调节蛋白浓度为2.5％，使用0.45μm滤芯过滤后制得配液半成品；
(10)分装及冻干：将配液半成品除菌分装至25mL注射剂瓶，冷冻干燥，冻干后轧盖，制得人纤维蛋白原冻干粉；
(11)干热法灭活病毒：所述人纤维蛋白原冻干粉置于干热灭菌器中，100℃温度条件下灭活30min，得到人纤维蛋白原制剂成品。
实施例2
1、溶解液的配制：
溶解液A的配制：溶解液A含有1.6％枸橼酸钠、1.1％氯化钠。溶解液A的配制方法为将枸橼酸钠、氯化钠溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入1mol/LHCl调节pH至6.6-7.0。
平衡液A的配制：平衡液A含有3.2％氯化钙和1.1％氯化钠。平衡液A的配制方法为将氯化钙、氯化钠溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入1mol/L HCl调节pH至6.6-7.0。
溶解液B的配制：溶解液B含有1.2％枸橼酸钠、1.1％氯化钠、0.35％盐酸精氨酸。溶解液B的配制方法为将枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入pH＝3.6的甘氨酸-盐酸缓冲液调节pH至6.6-7.0。
溶解液C的配制：溶解液C含有1.35％枸橼酸钠、3.5％盐酸精氨酸。溶解液C的配制方法为将枸橼酸钠、盐酸精氨酸溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入1mol/L HCl调节pH至6.8-7.0。
2、人纤维蛋白原制备方法
严格按照《中国药典》2020年版三部中“血液制品生产用人血浆”的规定及“实施原料血浆检疫期管理技术指导原则”的要求进行原料血浆收集和检验。
(1)将原料血浆先用75％酒精浸泡2 3min，再用注射用水冲洗表面，然后将原料血浆破袋输送至融浆罐，用10 37℃的水进行夹层循环融浆，融化后停止循环，血浆温度控制在0 4℃之间，离心分离冷沉淀，去除冷沉淀后的血浆输送至反应罐进行提取分离；
(2)组分Ⅰ沉淀的制备：血浆温度控制在0至4℃之间，加入pH4.0的醋酸缓冲液调节pH至6.8-7.2，添加-15℃的95％乙醇，使乙醇与血浆的体积比浓度为10％，添加乙醇的流速为1L/min，使反应液的最终温度控制在-1至-3℃，加完乙醇后10000rpm连续离心，得到组分Ⅰ沉淀；
(3)组分Ⅰ沉淀的溶解与过滤：按照组分Ⅰ沉淀：溶解液A＝1：20(w/v)的比例，向组分Ⅰ沉淀中加入溶解液Ⅰ，温度控制在30-37℃，搅拌1小时，使组分Ⅰ沉淀完全溶解，得到组分Ⅰ沉淀溶解液。安装K700滤板，使用平衡液A平衡滤器，平衡20min后，开始过滤组分Ⅰ沉淀溶解液，流速为1.5L/min，得到滤液A；
(4)S/D灭活：按照每升滤液添加100mL S/D灭活液的比例，在搅拌下以0.5L/min的速度将S/D灭活液加入滤液A中，温度维持在24℃，灭活6h，得到灭活液；
(5)第一次沉淀：灭活液降温至0至1℃之间，添加-15℃的50％乙醇，使乙醇与血浆的体积比浓度为10％，添加乙醇的流速为1L/min，使反应液的最终温度控制在-1至-3℃，加完乙醇后10000rpm连续离心，得到第一沉淀；
(6)第一沉淀溶解与过滤：按照第一沉淀：溶解液B＝1：20(w/v)的比例，向第一沉淀中加入溶解液B，搅拌1小时，温度控制在30-37℃，使第一沉淀完全溶解，得到第一沉淀溶解液。安装SUPRA EK 1P滤板，使用溶解液B平衡滤器，平衡20min后，开始过滤第一沉淀溶解液，流速为1.5L/min，得到滤液B；
(7)第二次沉淀：滤液B降温至0至1℃之间，添加-15℃的50％乙醇，使乙醇与血浆的体积比浓度为10％，添加乙醇的流速为1L/min，使反应液的最终温度控制在-1至-3℃，加完乙醇后10000rpm连续离心，得到第二沉淀；
(8)人纤维蛋白原原液制备：按照第二沉淀：溶解液C＝1：6(w/v)的比例，向第二沉淀中加入溶解液C，搅拌30min，温度控制在30-37℃，使第二沉淀完全溶解，得到第二沉淀溶解液。安装SUPRA EK 1P滤板，使用溶解液C平衡滤器，平衡20min后，开始过滤第二沉淀溶解液，流速为1.5L/min，得到人纤维蛋白原原液；
(9)配液：向人纤维蛋白原原液使用溶解液C调节蛋白浓度为2.5％，使用0.45μm滤芯过滤后制得配液半成品；
(10)分装及冻干：将配液半成品除菌分装至25mL注射剂瓶，冷冻干燥，冻干后轧盖，制得人纤维蛋白原冻干粉；
(11)干热法灭活病毒：所述人纤维蛋白原冻干粉置于干热灭菌器中，100℃温度条件下灭活30min，得到人纤维蛋白原制剂成品。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：溶解液的配制方法不同。
溶解液A的配制：溶解液A含有2.0％枸橼酸钠、0.9％氯化钠。溶解液A的配制方法为将枸橼酸钠、氯化钠溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入1mol/LHCl调节pH至6.6-7.0。
平衡液A的配制：平衡液A含有4.0％氯化钙和0.9％氯化钠。平衡液A的配制方法为将氯化钙、氯化钠溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入1mol/L HCl调节pH至6.6-7.0。
溶解液B的配制：溶解液B含有0.85％枸橼酸钠、0.9％氯化钠、0.4％盐酸精氨酸。溶解液B的配制方法为将枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入pH＝3.6的甘氨酸-盐酸缓冲液调节pH至6.6-7.0。
溶解液C的配制：溶解液C含有1.75％枸橼酸钠、4.0％盐酸精氨酸。溶解液C的配制方法为将枸橼酸钠、盐酸精氨酸溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入1mol/L HCl调节pH至6.8-7.0。
对比例1
对比例1与实施例1的区别仅在于：将步骤(3)中的平衡液A替换为溶解液A。
对比例2
对比例2与实施例1的区别仅在于：溶解液B的配制方法不同。
溶解液B的配制：溶解液B含有1.2％枸橼酸钠、1.1％氯化钠、0.35％盐酸精氨酸。溶解液B的配制方法为将枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入1mol/L HCl调节pH至6.6-7.0。
对比例3
对比例3与实施例1的区别仅在于：
1、将步骤(3)中的平衡液A替换为溶解液A。
2、溶解液B的配制方法不同。
溶解液B的配制：溶解液B含有1.2％枸橼酸钠、1.1％氯化钠、0.35％盐酸精氨酸。溶解液B的配制方法为将枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入1mol/L HCl调节pH至6.6-7.0。
对比例4
对比例4与实施例1的区别仅在于：溶解液A的配制方法不同。
溶解液A的配制：溶解液A含有1.4％枸橼酸钠、0.9％氯化钠、1.1％蔗糖。溶解液A的配制方法为将枸橼酸钠、氯化钠、蔗糖溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入1mol/L HCl调节pH至6.6-7.0。
对比例5
对比例5与实施例1的区别仅在于：溶解液C的配制方法不同。
溶解液C的配制：溶解液C含有0.9％枸橼酸钠、0.36％盐酸精氨酸。溶解液C的配制方法为将枸橼酸钠、盐酸精氨酸溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入1mol/L HCl调节pH至6.8-7.0。
实验例1
对实施例1-3以及对比例1-5的pH、纯度、凝固活力、复溶时间、可见异物、稳定性、水分进行测定。测定方法如下：
pH测定：参照2020年版《中国药典》通则0631。
纯度测定：参照2020年版《中国药典》通则0731第一法。
凝固活力：用0.9％氯化钠溶液分别稀释凝血酶溶液至3IU/mL，供试品溶液至3mg/mL备用。于反应管内加入已预热至37℃的凝血酶溶液(3IU/mL)适量，再加入等量的供试品溶液(3mg/mL)，摇匀。置37℃用自动检测仪器记录凝固时间。
复溶时间测定：将供试品平衡至37℃，按标示量(25mL)加入37℃灭菌注射用水，轻轻摇动，应于30分钟内完全溶解。
可见异物测定：参照2020年版《中国药典》通则0904。
稳定性测定：将供试品复溶后置30-37℃水浴中保温60分钟，观察是否有凝块或纤维蛋白析出。
水分测定：参照2020年版《中国药典》通则0832。
实施例1-3的检测结果见表1，对比例1-5的检测结果见表2。
表1实施例1-3检测结果
表2对比例1-5检测结果
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围。应当指出的是，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附要求为准。
Claims (6)
1.一种人纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
S1、组分 Ⅰ 沉淀的溶解后过滤，获得滤液A；
S2、滤液A经过S/D灭活，获得灭活液；
S3、灭活液通过两次低温乙醇沉淀制备得到人纤维蛋白原原液；
步骤S1中所述的溶解所用的溶解液为溶解液A，所述的溶解液A含有1.6%-2.0%枸橼酸钠、0.9%-1.1%氯化钠；
步骤S1中所述的过滤为采用板框滤器进行过滤，所述板框滤器的平衡液为平衡液A，所述的平衡液A含有3.2%-4.0%氯化钙和0.9%-1.1%氯化钠；步骤S3中所述的两次低温乙醇沉淀包括添加乙醇得到第一沉淀，用溶解液B溶解第一沉淀后过滤，收集滤液，滤液中再加入乙醇得到第二沉淀，用溶解液C溶解第二沉淀后，过滤，获得人纤维蛋白原原液；
所述的溶解液B含有0.85%-1.2%枸橼酸钠、0.9%-1.1%氯化钠、0.35%-0.4%盐酸精氨酸；所述的溶解液B的制备方法为将枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸溶解于注射用水后，搅拌均匀，加入pH = 3.6的甘氨酸-盐酸缓冲液调节pH；
所述的溶解液C含有1.35%-1.75%枸橼酸钠、3.5%-4.0%盐酸精氨酸；
所述的溶解液A中的枸橼酸钠与平衡液A中的氯化钙的比例为1：2。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述的组分Ⅰ 沉淀与溶解液A的比例为1：15-20 w/v。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述的第一沉淀与溶解液B的比例为1：15-20 w/v。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述的第二沉淀与溶解液C的比例为1：5-6 w/v。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括：
S4、调节蛋白浓度后，过滤，分装，冻干后轧盖，制得人纤维蛋白原冻干粉；
S5、人纤维蛋白原冻干粉干热法灭活病毒，获得人纤维蛋白原制剂成品。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述的调节蛋白浓度为使用溶解液C调节蛋白浓度至2.5%-3.5%。
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