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CN118326041A - 作为结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点的prtn3 - Google Patents

作为结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点的prtn3 Download PDF

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CN118326041A
CN118326041A CN202410590451.9A CN202410590451A CN118326041A CN 118326041 A CN118326041 A CN 118326041A CN 202410590451 A CN202410590451 A CN 202410590451A CN 118326041 A CN118326041 A CN 118326041A
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colorectal cancer
cancer
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protein
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刘春艳
张洪斌
李雯雯
南娟丽
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First Affiliated Hospital of Kunming Medical University
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Abstract

本发明公开了作为结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点的PRTN3及其识别方法，通过检测和分析发现PRTN3能作为结直肠癌的判断预后、辅助早期诊断、监测复发转移的标志物，由于PRTN3通过调控自噬活性促进结直肠癌发生发展，PRTN3有望成为结直肠癌一个潜在的治疗靶点，有极高的临床价值。

Description

作为结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点的PRTN3
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种作为结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点的PRTN3。
背景技术
目前，结直肠癌是世界上新发病例数第三的癌症，占癌症病例和癌症相关死亡的10％。结直肠癌的风险因素很多，如结直肠癌家族史、炎症性肠病、肥胖、吸烟等都可能增加诱发结直肠癌的几率。针对不同分期的结直肠癌有不同的治疗方法，包括手术治疗、辅助治疗、新辅助治疗、放射治疗和免疫治疗。对于晚期和发生远处转移的病人，尽管一线治疗药物FOLFOX、FOLFIRI和XELOX治疗后症状取得改善，但药物效果不佳且存在复发风险，近40％患者治疗后5年内死于复发或转移。使用药物联合使用并没有增加任何益处，反而增加了毒副作用。由《中国中晚期结直肠癌患者诊疗现状调查》显示83％的结直肠癌患者确诊时已是中晚期，44％的患者已经发生肝、肺等部位的转移，错过了最佳的治疗时间。为了对直肠癌患者进行及时诊断，提高对结直肠癌患者的治疗效果，必须对结直肠癌发病机制进行深入研究，找到新的肿瘤标志物和治疗靶点。
结直肠癌的发生发展的机制复杂，具体机制尚不清楚，但目前已知有APC、KRAS和P53等多种基因突变参与。近年来，新的分子生物学技术不断发展，在结直肠癌发病的分子机制研究取得极大的进展。对于参与结直肠癌发生发展的分子机制逐渐得到阐明，但结直肠癌的发病机制仍需要深入研究。
在精准医学时代，癌症治疗已经迈入精准治疗阶段，该治疗基于患者的基因组和转录组特征进行药物治疗，以追求更优异的疗效和预后。然而，仅仅研究基因组和转录组难以全面阐述疾病的发生机制，因为在生物体内蛋白质是发挥生物学功能的主要生物分子。蛋白质组学是对生物体表达的全部蛋白进行研究的技术，将基因水平的信息与蛋白质的表达功能联系起来。蛋白质组学具有发现新的生物标志物、阐明肿瘤发生发展机制的强大能力，广泛应用于早期诊断、预后评估、治疗靶点识别、治疗反映判断以及新治疗方法的开发。
而且尽管结直肠癌早期诊断生物标志物的相关研究已开展很多，但真正运用于临床实践的很少。尽管目前采用的FIT检测对结直肠癌的敏感度为73.8％，而基于粪便DNA检测筛查KRAS、异常NDRG4和BMP3甲基化的敏感度达到92.3％。然而，这些检测对晚期癌前病变的检测效果并不理想。FIT检测对晚期癌前病变的敏感性仅为23.8％，而粪便DNA检测的敏感性为42.4％。此外，FIT检测对高度异型增生息肉的检出率为46.2％，而粪便DNA检测的检出率为69.2％。对于>1cm的锯齿状无蒂息肉，FIT检测的检出率仅为5.1％，而粪便DNA检测的检出率为42.4％。这些结果显示了当前诊断筛查方法的局限性，同时也凸显了建立适当替代标志物以实现早期疾病检测的困难。当前的非侵入性筛查方法对癌前病变的检测不够敏感，可能导致对重要早期结直肠癌的漏诊。因此，现在迫切需要高灵敏度、特异性的新型生物标志物来支持早期结直肠癌的准确识别。
另外目前临床上结直肠癌治疗仍有许多缺陷。结直肠癌的治疗方法的常见副作用包括恶心和呕吐、腹泻、疲劳、周围神经病变、粘膜炎和手足综合征。这些副作用的发生和严重程度取决于治疗的类型和范围，以及患者的个体差异。据统计，高达3.5％的患者在治疗结束四年后仍有神经病变的症状。结直肠癌的局部治疗方法，如手术、消融、栓塞和放疗，虽然对早期癌症更有效，但在癌症晚期或已扩散的情况下，它们的效果有限。全身性治疗，如化疗、靶向治疗药物和免疫治疗，可以作用于全身的癌细胞，但也伴随着较强的副作用。
发明内容
为此，本发明提供作为结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点的PRTN3，以提供结直肠癌早期诊断、复发及转移监测、预后判断的有效分子标志物。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面，提出了一种检测PRTN3基因和/基因表达产物的制剂在制备诊断结直肠癌产品中的应用。
根据本发明实施例的第二方面，提出了一种含有抑制PRTN3基因的转录或翻译的试剂或化合物在制备治疗结直肠癌产品中的应用。
根据本发明实施例的第三方面，提出了一种结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点的识别方法，所述识别方法包括：
对结直肠癌癌组织和癌旁组织的蛋白质组数据进行分析筛选出差异表达蛋白，对得到的差异表达蛋白进行GO功能分析、KEGG信号通路分析，并结合蛋白质相互作用PPI网络筛选得到在肿瘤组织中显著上调的PRTN3蛋白；
收集直肠癌患者癌组织、癌旁非癌组织样本以及正常结直肠组织样本，检测并比较PRTN3蛋白在直肠癌患者癌组织、癌旁非癌组织样本以及正常结直肠组织样本中的表达水平差异，并分析PRTN3蛋白表达与患者临床信息及预后情况的相关性；
检测PRTN3蛋白在不同结直肠癌细胞系中的表达水平，对PRTN3蛋白高表达的LOVO细胞系进行敲除处理，对PRTN3低表达的HCT116和SW620细胞系进行过表达处理，验证PRTN3促进结直肠癌的发生发展；
利用MTT和流式细胞技术评估干扰PRTN3表达对细胞增殖、凋亡和周期的影响；利用划痕实验和transwell实验评估干预PRTN3表达对细胞迁移和侵袭的影响；应用克隆形成实验评估抑制PRTN3表达对结直肠癌细胞体外成瘤的影响；并检测干预PRTN3的表达后结直肠癌细胞系对化疗药物的敏感性。
进一步地，收集直肠癌患者癌组织、癌旁非癌组织样本以及正常结直肠组织样本，检测并比较PRTN3蛋白在直肠癌患者癌组织、癌旁非癌组织样本以及正常结直肠组织样本中的表达水平差异，并分析PRTN3蛋白表达与患者临床信息及预后情况的相关性，具体包括：
从结直肠癌患者中收集癌组织和癌旁非癌组织样本，收集正常结直肠组织样本作为对照；
对收集的组织样本进行免疫组织化学染色，检测PRTN3蛋白的表达水平，比较结直肠癌组织、癌旁非癌组织和正常结直肠组织中PRTN3蛋白的表达差异；
使用免疫荧光染色确定结直肠癌细胞系中PRTN3蛋白的亚细胞定位；
收集结直肠癌患者和健康个体的外周血样本，使用ELISA测量外周血样本中PRTN3蛋白的水平；
评估PRTN3表达与TNM分期、组织学类型、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、复发和转移的临床参数的相关性；
分析外周血中PRTN3蛋白表达水平与结直肠癌诊断、复发、转移和预后的关系。
进一步地，对PRTN3蛋白高表达的LOVO细胞系进行敲除，具体包括：
细胞培养准备步骤：
在转染前18-24小时，将LOVO细胞以3×10^5细胞/2毫升的密度接种在6孔板中，在5％CO2培养箱中过夜培养细胞，达到50％的融合度；
Turbofectin 8.0/DNA复合物的准备步骤：
在每个含有shRNA表达质粒的EP管中加入50μL去离子水，短暂涡旋以重新悬浮DNA，稀释至溶液的浓度为100ng/μL；
在一个小的无菌EP管中，按顺序混合以下试剂：用250μL Opti-MEM I稀释1μgDNA，轻轻涡旋；向稀释的DNA中加入3μL Turbofectin 8.0，轻轻吸管混合；
室温下孵育15分钟；
转染步骤：
将准备的Turbofectin 8.0/DNA混合物滴加到LOVO细胞上，轻轻摇动培养板以均匀分布复合物，在5％CO2培养箱中孵育48小时后收集RNA，72小时后收集蛋白质分析转染效率。
进一步地，对PRTN3低表达的HCT116和SW620细胞系进行过表达处理，具体包括：
细胞培养准备步骤：
将SW620和HCT116细胞以70-80％融合度接种在培养板中，使用含10％胎牛血清的DMEM培养基；
转染前的准备步骤：
稀释PRTN3过表达载体至0.5-2μg/ml；准备转染试剂Lipofectamine 3000；
转染步骤：
将质粒DNA和转染试剂按照每1μg DNA使用2-3μL的Lipofectamine 3000的比例混合，将混合物添加到培养细胞中，轻轻摇动培养板以均匀分布，转染后继续培养细胞24-48小时；
验证表达效果步骤：
通过荧光定量PCR检测PRTN3 mRNA的表达水平，使用PRTN3特异性引物和探针，按照标准的qPCR程序进行；通过蛋白免疫印迹法检测PRTN3蛋白的表达，使用特异性抗PRTN3抗体进行检测。
进一步地，检测干预PRTN3的表达后结直肠癌细胞系对化疗药物的敏感性，具体包括：
siRNA转染步骤：
使用siRNA和转染试剂将50-100nM PRTN3特异性siRNA转染入细胞；转染24小时后，更换新鲜培养基继续培养；
5-FU处理步骤：
将1-10μM的5-FU加入细胞培养板中，处理实验组和对照组细胞；处理4小时，然后收集细胞进行后续实验；
RNA和蛋白质提取步骤：
使用RNA提取试剂盒提取总RNA，然后使用逆转录试剂合成cDNA；使用蛋白提取试剂提取总蛋白；
mRNA与蛋白水平的检测步骤：
使用荧光定量PCR检测PRTN3 mRNA的表达水平；使用Western Blot检测PRTN3蛋白的表达水平；
细胞功能实验：
使用CCK8或MTT实验评估细胞增殖；使用流式细胞术评估细胞凋亡；进行划痕实验和transwell实验评估细胞迁移和侵袭能力。
本发明具有如下优点：
本发明提出了作为结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点的PRTN3及其识别方法，通过检测和分析发现PRTN3能作为结直肠癌的可以判断预后、辅助早期诊断、监测复发转移的标志物，由于PRTN3通过调控自噬活性促进结直肠癌发生发展，PRTN3有望成为结直肠癌一个潜在的治疗靶点，有极高的临床价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例提供的一种结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点的识别方法的流程示意图；
图2为本发明实施例使用样本三对结直肠癌的癌组织和癌旁组织的生物信息学分析图；
图3为本发明实施例提供的一种结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点PRTN3蛋白在癌组织与正常组织表达量对比图；
图4为本发明实施例提供的一种结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点PRTN3蛋白在结直肠癌组织中的免疫荧光及定量图；
图5为本发明实施例提供的一种结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点PRTN3蛋白与预后的相关性。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明第一实施例提出一种检测PRTN3基因和/基因表达产物的制剂在制备诊断结直肠癌产品中的应用。
本发明实施例第二实施例提出一种含有抑制PRTN3基因的转录或翻译的试剂或化合物在制备治疗结直肠癌产品中的应用。
本发明第三实施例提出一种结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点的识别方法，如图1所示，所述识别方法包括：
S100、对结直肠癌癌组织和癌旁组织的蛋白质组数据进行分析筛选出差异表达蛋白，对得到的差异表达蛋白进行GO功能分析、KEGG信号通路分析，并结合蛋白质相互作用PPI网络筛选得到在肿瘤组织中显著上调的PRTN3蛋白；
S200、收集直肠癌患者癌组织、癌旁非癌组织样本以及正常结直肠组织样本，检测并比较PRTN3蛋白在直肠癌患者癌组织、癌旁非癌组织样本以及正常结直肠组织样本中的表达水平差异，并分析PRTN3蛋白表达与患者临床信息及预后情况的相关性；
S300、检测PRTN3蛋白在不同结直肠癌细胞系中的表达水平，对PRTN3蛋白高表达的LOVO细胞系进行敲除处理，对PRTN3低表达的HCT116和SW620细胞系进行过表达处理，验证PRTN3促进结直肠癌的发生发展；
S400、利用MTT和流式细胞技术评估干扰PRTN3表达对细胞增殖、凋亡和周期的影响；利用划痕实验和transwell实验评估干预PRTN3表达对细胞迁移和侵袭的影响；应用克隆形成实验评估抑制PRTN3表达对结直肠癌细胞体外成瘤的影响；并检测干预PRTN3的表达后结直肠癌细胞系对化疗药物的敏感性。
PRTN3是一个潜在的原癌基因，又称为人蛋白水解酶3或成髓蛋白或c-ANCA(细胞质抗中性粒细胞胞浆抗体)抗原，是中性粒细胞初级天青颗粒中常见的丝氨酸蛋白酶，由髓系细胞分泌，在中性粒细胞表面、内皮细胞和髓系造血细胞中表达，存在于肿瘤微环境，且与炎症相关。PRTN3可以在体外降解弹性蛋白酶、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、玻璃体连接蛋白和Ⅳ型胶原。
本发明实施通过对三对结直肠癌癌组织和癌旁组织的蛋白质组数据分析，筛选出差异表达蛋白MPO、PRTN3、MMP9等，为进一步研究差异表达蛋白的功能，对这些差异表达的蛋白进行GO功能分析、KEGG信号通路分析，发现与PRTN3相关通路的上调。通过基于蛋白组学的PPI网络发现上调的蛋白中PRTN3处在网络中的节点，是在结直、肠癌中的重要的蛋白，并且与CAMP、MPO、LYZ等有很强的相互作用。
此外，利用组织芯片技术研究结直肠癌癌组织和癌旁组织中PRTN3的表达，发现PRTN3在癌组织中的表达明显高于癌旁组织；还对比了PRTN3高表达组和低表达组的存活率，发现高表达组显著低于低表达组。敲低PRTN3表达导致细胞周期组织，同时下调自噬活性。
在此基础上，本发明首先通过蛋白质组学确认了PRTN3在结肠癌患者中的表达情况以证明其作为肿瘤标志物的功能，接下来通过采用转染shRNA敲低PRTN3的表达，研究干预PRTN3后对结直肠癌细胞生物行为的影响及其抗癌作用。初步结果显示，抑制PRTN3的表达明显抑制了结肠癌细胞的增殖能力。因此，靶向PRTN3可能提升结直肠癌治疗的效果，PRTN3有望成为降低结直肠癌细胞恶性行为的重要靶点。同时，研究还将探讨PRTN3通过调节自噬活性对结直肠癌发生发展的潜在影响。
(一)主要内容和结论有：
1.通过分析三对结直肠癌癌组织和正常癌旁组织的蛋白组数据和组织免疫荧光及定量图发现PRTN3蛋白在癌组织中显著上调，如图2、4所示。图2为三对结直肠癌的癌组织和癌旁组织DEPs的生物信息学分析，其中图2A为对三对结直肠癌癌组织和癌旁组织样本进行的PCA聚类图，图2B为对三对结肠癌癌组织和癌旁组织差异蛋白分析的热图；图2C为差异表达蛋白中上调组与下调组的统计图；图2D为差异表达蛋白中上调蛋白与下调蛋白分析的火山图；图2E为上调组的差异蛋白KEGG通路富集统计气泡图。图4为PRTN3蛋白在结直肠癌组织中的免疫荧光及定量图，其中图4A为结直肠癌癌组织与癌旁组织中PRTN3的免疫荧光图(20X，40X)；图4B为结直肠癌癌组织与癌旁组织中PRTN3蛋白免疫荧光。
2.根据所述的结直肠癌癌组织中PRTN3蛋白显著上调的结论搜索TIMER数据库，确定在多种癌组织中表达均有上调，如图3所示。
3.根据结直肠癌癌组织中PRTN3蛋白显著上调的结论，其中PRTN3高表达组的结直肠癌患者生存率显著低于PRTN3低表达组的结直肠癌患者，如图5所示，图5为PRTN3高表达患者与低表达患者的生存曲线差异图。
4.根据结直肠癌癌组织中PRTN3蛋白显著上调的结论，发现PRTN3与结直肠癌临床TNM分期、组织学类型、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、复发和转移等临床指标及预后相关。
4.根据结直肠癌癌组织中PRTN3蛋白显著上调的结论，检测发现PRTN3蛋白在不同结直肠癌细胞系中的表达水平不同。
5.根据PRTN3蛋白在不同结直肠癌细胞系中的表达水平不同，对PRTN3高表达的LOVO细胞系进行敲除，对PRTN3低表达的HCT116和SW620细胞系进行过表达处理。
6.根据PRTN3蛋白在不同结直肠癌细胞系中的表达水平不同，PRTN3敲低后结直肠癌细胞系HCT116细胞增殖速率下降。
7.根据PRTN3敲低后结直肠癌细胞系细胞增殖速率下降，认为靶向PRTN3可以起到抗结肠癌作用。
8.根据所述的靶向PRTN3可以起到抗结肠癌作用，其中所述PRTN3可以通过自噬促进结直肠癌的发生发展。
9.根据所述的靶向PRTN3可以起到抗结肠癌作用，其中所述靶向PRTN3可以通过增加肿瘤对化疗药物的敏感性起到抗肿瘤作用。
(二)具体实施案例1
PRTN3表达在结直肠癌的诊断和判断预后具有重要的价值。
步骤一：从80-90例结直肠癌患者中收集癌组织和癌旁非癌组织样本。
收集20例以上的正常结直肠组织样本作为对照。
步骤二：对收集的组织样本进行免疫组织化学染色，检测PRTN3的表达水平。
比较结直肠癌组织、癌旁非癌组织和正常结直肠组织中PRTN3的表达差异。
步骤三：使用免疫荧光染色确定结直肠癌细胞系中PRTN3的亚细胞定位。
步骤四：收集30例结直肠癌患者和30例健康个体的外周血样本。
使用ELISA测量这些样本中PRTN3的水平。
步骤五：统计分析结直肠癌组织、癌旁非癌组织和正常结直肠组织中PRTN3表达的差异。
评估PRTN3表达与TNM分期、组织学类型、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、复发和转移等临床参数的相关性。
步骤六：分析外周血中PRTN3表达水平与结直肠癌诊断、复发、转移和预后的关系。
(三)具体实施案例2
(1)验证PRTN3促进结直肠癌的发生发展。
具体实施方式如下：
PRTN3稳定干扰的结直肠癌细胞株(LOVO KD)的建立
步骤一：细胞培养准备
在转染前18-24小时，将LOVO细胞以3x10^5细胞/2毫升的密度接种在6孔板中。在5％CO2培养箱中过夜培养细胞，达到50％的融合度。
步骤二：Turbofectin 8.0/DNA复合物的准备
在每个含有shRNA表达质粒的EP管中加入50μL去离子水，短暂涡旋以重新悬浮DNA。稀释至溶液的浓度为100ng/μL。
在一个小的无菌EP管中，按顺序混合以下试剂：
用250μL Opti-MEM I稀释1μg DNA，轻轻涡旋。
向稀释的DNA中加入3μL Turbofectin 8.0，轻轻吸管混合。
室温下孵育15分钟。
步骤三：转染步骤
将第2步准备的混合物滴加到LOVO细胞上。轻轻摇动培养板以均匀分布复合物。在5％CO2培养箱中孵育48小时后收集RNA，72小时后收集蛋白质分析转染效率。
(2)PRTN3过表达细胞模型的构建
步骤一：细胞培养准备
将SW620和HCT116细胞以70-80％融合度接种在培养板中，使用含10％胎牛血清的DMEM培养基。
步骤二：转染前的准备
稀释PRTN3过表达载体至0.5-2μg/ml。
准备转染试剂Lipofectamine 3000。
步骤三：进行转染
将质粒DNA和转染试剂按照每1μg DNA使用2-3μL的Lipofectamine3000的比例混合。将混合物添加到培养细胞中，轻轻摇动培养板以均匀分布。转染后继续培养细胞24-48小时。
步骤四：验证表达效果
通过荧光定量PCR检测PRTN3 mRNA的表达水平。使用PRTN3特异性引物和探针，按照标准的qPCR程序进行。
通过蛋白免疫印迹法检测PRTN3蛋白的表达。使用特异性抗PRTN3抗体进行检测。
(3)细胞功能实验与分子机制研究
利用MTT和流式细胞技术研究干扰PRTN3表达对细胞增殖、凋亡和周期的影响；利用划痕实验和transwell实验研究干预PRTN3表达对细胞迁移和侵袭的影响；应用克隆形成实验研究抑制PRTN3表达对结直肠癌细胞体外成瘤的影响；并通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹研究调控上述行为相关蛋白的表达。阐明PRTN3参与结直肠癌发生发展中的分子机制。
(四)具体实施案例3
干预PRTN3的表达后结直肠癌细胞系对化疗药物的敏感性增加
具体实施方式如下：
步骤一：siRNA转染
使用siRNA和转染试剂将50-100nM PRTN3特异性siRNA转染入细胞。
转染24小时后，更换新鲜培养基继续培养。
步骤二：5-FU处理
将1-10μM的5-FU加入细胞培养板中，处理实验组和对照组细胞。处理4小时，然后收集细胞进行后续实验。
步骤三：RNA和蛋白质提取
使用RNA提取试剂盒提取总RNA，然后使用逆转录试剂合成cDNA。使用蛋白提取试剂提取总蛋白。
步骤四：mRNA与蛋白水平的检测
使用荧光定量PCR检测PRTN3 mRNA的表达水平。
使用Western Blot检测PRTN3蛋白的表达水平。
步骤五：细胞功能实验
使用CCK8或MTT实验评估细胞增殖。
使用流式细胞术(Annexin V/PI染色)评估细胞凋亡。
进行划痕实验和transwell实验评估细胞迁移和侵袭能力。
本发明经过研究和试验发现PRTN3可作为结直肠癌的可以判断预后、辅助早期诊断、监测复发转移的标志物。PRTN3通过调控自噬活性促进结直肠癌发生发展，PRTN3可以成为结直肠癌一个潜在的治疗靶点，通过干预PRTN3表达治疗结直肠癌，有极高的临床价值。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.检测PRTN3基因和/基因表达产物的制剂在制备诊断结直肠癌产品中的应用。
2.含有抑制PRTN3基因的转录或翻译的试剂或化合物在制备治疗结直肠癌产品中的应用。
3.一种结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点的识别方法，其特征在于，所述识别方法包括：
对结直肠癌癌组织和癌旁组织的蛋白质组数据进行分析筛选出差异表达蛋白，对得到的差异表达蛋白进行GO功能分析、KEGG信号通路分析，并结合蛋白质相互作用PPI网络筛选得到在肿瘤组织中显著上调的PRTN3蛋白；
收集直肠癌患者癌组织、癌旁非癌组织样本以及正常结直肠组织样本，检测并比较PRTN3蛋白在直肠癌患者癌组织、癌旁非癌组织样本以及正常结直肠组织样本中的表达水平差异，并分析PRTN3蛋白表达与患者临床信息及预后情况的相关性；
检测PRTN3蛋白在不同结直肠癌细胞系中的表达水平，对PRTN3蛋白高表达的LOVO细胞系进行敲除处理，对PRTN3低表达的HCT116和SW620细胞系进行过表达处理，验证PRTN3促进结直肠癌的发生发展；
利用MTT和流式细胞技术评估干扰PRTN3表达对细胞增殖、凋亡和周期的影响；利用划痕实验和transwell实验评估干预PRTN3表达对细胞迁移和侵袭的影响；应用克隆形成实验评估抑制PRTN3表达对结直肠癌细胞体外成瘤的影响；并检测干预PRTN3的表达后结直肠癌细胞系对化疗药物的敏感性。
4.根据权利要求3所述的一种结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点的识别方法，其特征在于，收集直肠癌患者癌组织、癌旁非癌组织样本以及正常结直肠组织样本，检测并比较PRTN3蛋白在直肠癌患者癌组织、癌旁非癌组织样本以及正常结直肠组织样本中的表达水平差异，并分析PRTN3蛋白表达与患者临床信息及预后情况的相关性，具体包括：
从结直肠癌患者中收集癌组织和癌旁非癌组织样本，收集正常结直肠组织样本作为对照；
对收集的组织样本进行免疫组织化学染色，检测PRTN3蛋白的表达水平，比较结直肠癌组织、癌旁非癌组织和正常结直肠组织中PRTN3蛋白的表达差异；
使用免疫荧光染色确定结直肠癌细胞系中PRTN3蛋白的亚细胞定位；
收集结直肠癌患者和健康个体的外周血样本，使用ELISA测量外周血样本中PRTN3蛋白的水平；
评估PRTN3表达与TNM分期、组织学类型、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、复发和转移的临床参数的相关性；
分析外周血中PRTN3蛋白表达水平与结直肠癌诊断、复发、转移和预后的关系。
5.根据权利要求3所述的一种结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点的识别方法，其特征在于，对PRTN3蛋白高表达的LOVO细胞系进行敲除，具体包括：
细胞培养准备步骤：
在转染前18-24小时，将LOVO细胞以3×10^5细胞/2毫升的密度接种在6孔板中，在5％CO2培养箱中过夜培养细胞，达到50％的融合度；
Turbofectin8.0/DNA复合物的准备步骤：
在每个含有shRNA表达质粒的EP管中加入50μL去离子水，短暂涡旋以重新悬浮DNA，稀释至溶液的浓度为100ng/μL；
在一个小的无菌EP管中，按顺序混合以下试剂：用250μLOpti-MEMI稀释1μgDNA，轻轻涡旋；向稀释的DNA中加入3μLTurbofectin8.0，轻轻吸管混合；
室温下孵育15分钟；
转染步骤：
将准备的Turbofectin8.0/DNA混合物滴加到LOVO细胞上，轻轻摇动培养板以均匀分布复合物，在5％CO2培养箱中孵育48小时后收集RNA，72小时后收集蛋白质分析转染效率。
6.根据权利要求3所述的一种结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点的识别方法，其特征在于，对PRTN3低表达的HCT116和SW620细胞系进行过表达处理，具体包括：
细胞培养准备步骤：
将SW620和HCT116细胞以70-80％融合度接种在培养板中，使用含10％胎牛血清的DMEM培养基；
转染前的准备步骤：
稀释PRTN3过表达载体至0.5-2μg/ml；准备转染试剂Lipofectamine3000；
转染步骤：
将质粒DNA和转染试剂按照每1μgDNA使用2-3μL的Lipofectamine3000的比例混合，将混合物添加到培养细胞中，轻轻摇动培养板以均匀分布，转染后继续培养细胞24-48小时；
验证表达效果步骤：
通过荧光定量PCR检测PRTN3mRNA的表达水平，使用PRTN3特异性引物和探针，按照标准的qPCR程序进行；通过蛋白免疫印迹法检测PRTN3蛋白的表达，使用特异性抗PRTN3抗体进行检测。
7.根据权利要求3所述的一种结直肠癌肿瘤标志物和癌症治疗靶点的识别方法，其特征在于，检测干预PRTN3的表达后结直肠癌细胞系对化疗药物的敏感性，具体包括：
siRNA转染步骤：
使用siRNA和转染试剂将50-100nMPRTN3特异性siRNA转染入细胞；转染24小时后，更换新鲜培养基继续培养；
5-FU处理步骤：
将1-10μM的5-FU加入细胞培养板中，处理实验组和对照组细胞；处理4小时，然后收集细胞进行后续实验；
RNA和蛋白质提取步骤：
使用RNA提取试剂盒提取总RNA，然后使用逆转录试剂合成cDNA；使用蛋白提取试剂提取总蛋白；
mRNA与蛋白水平的检测步骤：
使用荧光定量PCR检测PRTN3mRNA的表达水平；使用WesternBlot检测PRTN3蛋白的表达水平；
细胞功能实验：
使用CCK8或MTT实验评估细胞增殖；使用流式细胞术评估细胞凋亡；
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