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CN118325927A - 编码nk细胞衔接器和car的多核苷酸及包含其的修饰细胞 - Google Patents

编码nk细胞衔接器和car的多核苷酸及包含其的修饰细胞 Download PDF

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CN118325927A
CN118325927A CN202410761472.2A CN202410761472A CN118325927A CN 118325927 A CN118325927 A CN 118325927A CN 202410761472 A CN202410761472 A CN 202410761472A CN 118325927 A CN118325927 A CN 118325927A
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CN
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cell
car
polynucleotide encoding
polynucleotide
cells
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尹海滨
周玲
刘锦
周超
王桃希
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Guangzhou Anjie Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Anjie Biomedical Technology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种编码NK细胞衔接器和CAR的多核苷酸及包含该多核苷酸的修饰细胞。本发明提供的多核苷酸包括编码NK细胞衔接器的第一多核苷酸、连接子和编码CAR的第二多核苷酸；其中，所述第一多核苷酸包括第一信号肽、抗CD16的单域抗体、IL‑15和识别GPRC5D的scFv；所述第二多核苷酸包括识别BCMA的scFv。将本发明提供的多核苷酸通过基因递送载体导入宿主细胞中得到的修饰细胞具有靶向BCMA+肿瘤细胞的能力，同时，还可以长时间持续表达和分泌能够靶向GPRC5D+肿瘤细胞的NK细胞衔接器，由此，可以充分调动机体自身和过继的免疫细胞，靶向多个TAA，限制肿瘤免疫逃逸，提高肿瘤的治疗效率。

Description

编码NK细胞衔接器和CAR的多核苷酸及包含其的修饰细胞
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种编码NK细胞衔接器和CAR的多核苷酸及包含该编码NK细胞衔接器和CAR的多核苷酸的修饰细胞。
背景技术
多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）占血液肿瘤发病率的10%，目前仍缺少一种安全有效的治疗方法，常规化疗仅能使半数患者获得暂时缓解；而化疗结合造血干细胞移植能够显著提高缓解率，但其复发率高仍然是一大难题。随着单克隆抗体、嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）、免疫检查点抑制剂和肿瘤疫苗等免疫疗法的出现，MM患者的预后得到了极大的改善。虽然MM的治疗目前取得了一些进展，但其仍然被认为是无法治愈的，并且复发和难治性MM患者的预后仍然不理想。目前仍有待开发新的治疗药物和/或治疗方法，以提高MM患者的临床治疗效果和改变MM易复发、难治的现状。
作为免疫细胞导向疗法的一个分支，细胞衔接器通过肿瘤相关抗原（TumorAssociated Antigen，TAA）靶向部分和效应细胞识别部分将不同类型的两种细胞连接起来，选择性地攻击并杀伤靶向的肿瘤细胞。依据细胞类型的不同，可进一步分为T细胞衔接器和NK细胞衔接器。T细胞衔接器通过TAA和TCR成分（主要为CD3）将T细胞和肿瘤细胞连接起来，避开了MHC的限制性。NK细胞衔接器则通过靶向TAA和NK细胞毒性受体成分（包括CD16、NKG2D、NKp44等）组成使NK细胞靶定肿瘤细胞并发挥杀伤功能。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种编码NK细胞衔接器和CAR的多核苷酸。
本发明的另一个目的在于提供包含上述多核苷酸的基因递送载体。
本发明的又一个目的在于提供包含上述基因递送载体的修饰细胞，该修饰细胞可用于制备治疗多发性骨髓瘤的药物。
根据本发明的一个方面，提供了一种编码NK细胞衔接器和CAR的多核苷酸，其中，该多核苷酸包括编码NK细胞衔接器的第一多核苷酸、连接子和编码CAR的第二多核苷酸。
在一些实施方式中，编码NK细胞衔接器的第一多核苷酸包括第一信号肽、抗CD16的单域抗体、IL-15和识别G蛋白偶联受体C类第5组成员D（G protein-coupled receptorclass C group 5 member D，GPRC5D）的单链可变片段（single-chain variablefragment，scFv），第一多核苷酸的序列包括编码第一信号肽的核苷酸序列、编码抗CD16的单域抗体的核苷酸序列、编码IL-15的核苷酸序列和编码可识别GPRC5D的scFv的核苷酸序列。由此，通过基因递送载体将多核苷酸导入宿主细胞中后，宿主细胞能够长时间持续表达并分泌出能靶向GPRC5D+肿瘤细胞的NK细胞衔接器，触发NK细胞对GPRC5D+肿瘤细胞的抗肿瘤免疫应答。同时，将IL-15作为双特异性抗体交联剂引入NK细胞衔接器，可以增强NK细胞的增殖、激活和细胞毒性，克服天然NK细胞毒性的非特异性机制。
在一些实施方式中，第一信号肽来自或包含任意分泌蛋白或膜蛋白的信号肽；例如，可以选自ALB信号肽、IL-2信号肽、GM-CSF信号肽、免疫球蛋白重链信号肽、胰岛素信号肽中的至少一种。
在一些实施方式中，第一信号肽为ALB信号肽。
在一些实施方式中，编码NK细胞衔接器的第一多核苷酸的核苷酸序列具有与SEQID NO：1所示的核苷酸序列至少80%同源性。核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列至少80%同源性的编码NK细胞衔接器的第一多核苷酸可以为基于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行密码子优化、降低CpG二核苷酸含量、在有义和反义方向上移除任何额外的ORF等操作中的至少一种后得到的、核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列至少80%同源性、能正常编码氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的NK细胞衔接器的多核苷酸。
在一些实施方式中，编码CAR的第二多核苷酸包括识别BCMA的scFv。由此，多核苷酸修饰的细胞可以直接靶向BCMA+肿瘤细胞发挥杀伤功能。
在一些实施方式中，编码CAR的第二多核苷酸包括第二信号肽、识别BCMA的scFv、CD8ɑ铰链、CD137（4-1BB）共刺激结构域和CD3ζ信号结构域。
在一些实施方式中，第二信号肽来自或包含任意分泌蛋白或膜蛋白的信号肽；例如，可以选自CD8ɑ信号肽、IL-2信号肽、GM-CSF信号肽中的至少一种。
在一些实施方式中，第二信号肽为CD8ɑ信号肽。
在一些实施方式中，编码CAR的第二多核苷酸还可以包括Kozak序列。
在一些实施方式中，编码CAR的第二多核苷酸的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列至少80%同源性。核苷酸序列具有与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列至少80%同源性的编码CAR的第二多核苷酸可以为基于SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列进行密码子优化、降低CpG二核苷酸含量、在有义和反义方向上移除任何额外的ORF等操作中的至少一种后得到的、核苷酸序列具有与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列至少80%同源性、能正常编码氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的CAR的多核苷酸。
在一些实施方式中，连接NK细胞衔接器和CAR的连接子可以选自P2A、T2A和E2A中的至少一种。
在一些实施方式中，连接NK细胞衔接器和CAR的连接子为T2A。
在一些实施方式中，多核苷酸的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列至少80%同源性。核苷酸序列具有与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列至少80%同源性的多核苷酸可以为基于SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列进行密码子优化、降低CpG二核苷酸含量、在有义和反义方向上移除任何额外的ORF等操作中的至少一种后得到的、核苷酸序列具有与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列至少80%同源性、能正常编码氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的蛋白的多核苷酸。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含上述编码NK细胞衔接器和CAR的多核苷酸的基因递送载体。
在一些实施方式中，可以将本发明提供的编码NK细胞衔接器和CAR的多核苷酸导入宿主细胞中的基因递送载体包括但不限于病毒载体、转座子、基因敲入、脂质体、纳米金颗粒、外泌体等。
在一些实施方式中，基因递送载体为病毒载体，其中，包括但不限于慢病毒载体、逆转录病毒载体等。
在一些实施方式中，基因递送载体可以为慢病毒载体，其主要通过将重组慢病毒表达质粒、慢病毒包装质粒和慢病毒包膜质粒包装重组慢病毒制得。
在一些实施方式中，重组慢病毒表达质粒含有EF1α启动子和本发明提供的编码NK细胞衔接器和CAR的多核苷酸。
在一些实施方式中，慢病毒载体包括但不限于三质粒慢病毒系统和四质粒慢病毒系统。
在一些实施方式中，慢病毒载体的制备使用四质粒包装系统；其包括含有EF1α启动子和本发明提供的编码NK细胞衔接器和CAR的多核苷酸的重组慢病毒表达质粒、慢病毒包装质粒pMDLg/pRRE（Kan+）和pRSV-REV（Kan+），慢病毒包膜质粒pMD2.G（Kan+）。
在一些实施方式中，慢病毒载体的制备包括如下步骤：
将重组慢病毒表达质粒、慢病毒包装质粒、慢病毒包膜质粒通过转染试剂共转染至慢病毒包装细胞中，包装出慢病毒并对其进行纯化，即得慢病毒载体。
在一些实施方式中，转染试剂可以为聚醚酰亚胺（polysciences，PEI）。
在一些实施方式中，慢病毒包装细胞可以为HEK293T细胞。
根据本发明的又一个方面，提供了一种包含上述基因递送载体的修饰细胞。
本发明提供的修饰细胞具有靶向BCMA+肿瘤细胞的能力，同时，可以长时间持续表达和分泌NK细胞衔接器，NK细胞衔接器通过双特异性抗体赋予NK细胞靶向GPRC5D+肿瘤细胞的能力；由此，通过将CAR和NK细胞衔接器联合起来，充分调动机体自身和过继的免疫细胞，靶向多个TAA，限制肿瘤免疫逃逸，有效提高肿瘤的治疗效率。本发明提供的修饰细胞可应用于制备治疗多发性骨髓瘤的药物。
在一些实施方式中，宿主细胞可以为原核细胞或者真核细胞；优选地，可以选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞中的至少一种。
在一些实施方式中，宿主细胞可以为哺乳动物细胞；其中，哺乳动物细胞可以选自上皮细胞、成髓细胞、成纤维细胞、淋巴细胞中的至少一种。
在一些实施方式中，宿主细胞可以为淋巴细胞，其中，淋巴细胞可以为T细胞、B细胞或NK细胞。
在一些实施方式中，修饰细胞可以通过将慢病毒载体导入T细胞中制得，具体的制备方法可以包括如下步骤：
用慢病毒载体和聚凝胺感染T细胞，24 h后用培养基换液，继续培养72~216 h后收获细胞，即得修饰细胞；其中，慢病毒载体的MOI可以为1~10，聚凝胺的终浓度可以为1~10 μg/mL。
附图说明
图1为琼脂糖凝胶电泳检测BamH I-EF1α-Xba I片段的PCR扩增产物的检测结果；其中，M为1kb-I DNA marker，lane 1和lane 2为BamH I-EF1α-Xba I片段；
图2为琼脂糖凝胶电泳检测Xba I-BCMA-BB-Mlu I片段的PCR扩增产物的检测结果；其中，M为1kb-I DNA marker，lane 1和lane 2为Xba I-BCMA-BB-Mlu I片段；
图3为琼脂糖凝胶电泳检测Mlu I-T2a-engager-Sal I片段的PCR扩增产物的检测结果；其中，M为1kb-I DNA marker，lane 1和lane 2为Mlu I-T2a-engager-Sal I片段；
图4为pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)-T2a-engager重组慢病毒表达质粒的质粒图谱；
图5为琼脂糖凝胶电泳检测BCMA-BB in pRRLSIN酶切产物的检测结果；其中，M为1kb-I DNA marker，lane 1为BCMA-BB in pRRLSIN的酶切片段；
图6为菌落PCR鉴定pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)-T2a-engager重组慢病毒表达质粒；
图7为pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)重组慢病毒表达质粒的质粒图谱；
图8为western blotting检测慢病毒感染后在不同时间点细胞培养上清中engager表达情况的检测结果；
图9为pRRLSIN.EF1α.CAR(5E5).Kan质粒的质粒图谱。
具体实施方式
下面结合实施方式对本发明作进一步详细的说明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。如无特殊说明，实施例中所用原料和试剂为可以通过市售获得的常规产品；实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。
实施例1 共表达NK细胞衔接器的CAR基因修饰细胞的制备
1、构建重组慢病毒表达质粒
（1）由通用生物（安徽）股份有限公司人工合成CAR(anti-BCMA)基因（核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示）并克隆到pRRLSIN质粒（由广州安捷生物医学技术有限公司提供）的Xba I和Mlu I酶切位点之间，构建得到的载体命名为BCMA-BB in pRRLSIN。
（2）由通用生物（安徽）股份有限公司人工合成T2A-engager基因（含T2A序列及SEQID NO：1所示的核苷酸序列，具体序列如SEQ ID NO：7所示）并克隆到pGEM-4Z质粒（由广州安捷生物医学技术有限公司提供）的Mlu I和Sal I酶切位点之间，构建得到的载体命名为T2a-engager in pGEM。
（3）以pRRLSIN.EF1α.CAR(5E5).Kan（由广州安捷生物医学技术有限公司提供，其图谱如图9所示）为模板，设计引物并通过PCR方法扩增EF1α序列；其中，引物序列如下：
EF1α-F(BamH I)：5’-CGGGATCCGCTCCGGTGCCCGTCAGT-3’（SEQ ID NO：8）
EF1α-R(Xba I)：5’-CTAGTCTAGATCACGACACCTGAAATGGAAG-3’（SEQ ID NO：9）
PCR反应参数：预变性：94℃，2min；变性：94℃，15s；退火：55℃，30s；延伸：68℃，70s；循环32次；68℃延伸8min；4℃，forever。
用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并分离BamH I-EF1α-Xba I片段的PCR扩增产物，鉴定结果如图1所示，其中lane 1和lane 2为BamH I-EF1α-Xba I片段，大小约为1.1kb。
采用DNA凝胶回收试剂盒回收并纯化BamH I-EF1α-Xba I扩增片段。
（4）以BCMA-BB in pRRLSIN为模板，设计引物并通过PCR方法扩增BCMA-BB序列；其中，引物序列如下：
Xba I-BCMA-BB F：
5’-CTAGTCTAGAGCCACCATGGCCTTACCAGT-3’（SEQ ID NO：10）
BCMA-BB-Mlu I R：
5’-CGACGCGTGCGAGGGGGCAGGGCCTGCAT-3’（SEQ ID NO：11）
PCR反应参数：预变性：94℃，2min；变性：94℃，15s；退火：55℃，30s；延伸：68℃，100s；循环32次；68℃延伸8min；4℃，forever。
用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并分离Xba I-BCMA-BB-Mlu I片段的PCR扩增产物，鉴定结果如图2所示，其中lane 1和lane 2为Xba I-BCMA-BB-Mlu I片段，大小约为1.5kb。
采用DNA凝胶回收试剂盒回收并纯化Xba I-BCMA-BB-Mlu I扩增片段。
（5）以T2a-engager in pGEM为模板，设计引物并通过PCR方法扩增T2a-engager序列；其中，引物序列如下：
Mlu I-cam16 F：
5’-CGACGCGTGGAAGCGGAGAGGGCAGA-3’（SEQ ID NO：12）
GPRC5D-Sal I R：
5’-TGCGGTCGACTCACTTGATCTCCAGCTTGGT-3’（SEQ ID NO：13）
PCR反应参数：预变性：94℃，2min；变性：94℃，15s；退火：55℃，30s；延伸：68℃，100s；循环32次；68℃延伸5min；4℃，forever。
用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并分离Mlu I-T2a-engager-Sal I片段的PCR扩增产物，鉴定结果如图3所示，其中lane 1和lane 2为Mlu I-T2a-engager-Sal I片段，大小约为1.5kb。
采用DNA凝胶回收试剂盒回收并纯化Mlu I-T2a-engager-Sal I扩增片段。
（6）将EF1α序列、BCMA-BB序列和T2a-engager序列插入BCMA-BB in pRRLSIN的BamH I和Sal I酶切位点之间，构建得到重组慢病毒表达质粒，命名为pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)-T2a-engager质粒，其质粒图谱如图4所示。具体过程如下：
S1：通过BamH I和Xba I双酶切BamH I-EF1α-Xba I扩增片段，通过Xba I和Mlu I双酶切Xba I-BCMA-BB-Mlu I扩增片段，通过MluI和SalI双酶切Mlu I-T2a-engager-Sal I扩增片段，酶切产物直接回收；
S2：通过BamH I和Sal I双酶切载体BCMA-BB in pRRLSIN，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶回收，鉴定结果如图5所示，其中lane 1为载体BCMA-BB in pRRLSIN的酶切片段，大小约为6.0kb；
S3：回收的酶切产物用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化TransStbl3化学感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司提供）并划线涂板培养；
S4：挑取12个单菌落，以EF1α-F(BamHI)/EF1α-R(XbaI)为引物进行通过菌落PCR进行鉴定，菌落PCR反应参数：预变性：94℃，5min；变性：94℃，30s；退火：55℃，30s；延伸：72℃，70s；循环32次；72℃延伸10min；4℃，forever。
结果如图6所示，lane 10克隆扩增出目的条带且条带明显，说明可能是阳性克隆；
S5：取阳性克隆摇菌后用UE质粒小量制备试剂盒（苏州优逸兰迪生物科技有限公司）提取质粒，将质粒测序，测序引物为EF1α-F(BamHI)/WPRE R，测序结果显示序列均正确，表明重组慢病毒表达质粒已成功构建，命名为pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)-T2a-engager质粒；其中，引物WPRE R的序列如下：5’-CATAGCGTAAAAGGAGCAACA-3’（SEQ ID NO：14）
S6：用无内毒素质粒大提试剂盒（Endo-free Plasmid Maxi Kit，Omega）提取质粒，置于-20℃冰箱保存。
2、慢病毒包装与纯化
（1）取冻存的HEK293T细胞复苏，用DMEM完全培养基（DMEM培养基+10%FBS）传代培养。将HEK293T细胞接种至10层细胞工厂，加入DMEM完全培养基，过夜培养使细胞能达到80~90%的融合度，进行质粒转染。
（2）将pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)-T2a-engager质粒、慢病毒包装质粒pMDLg/pRRE（Kan+）和pRSV-REV（Kan+）、慢病毒包膜质粒pMD2.G（Kan+）加入无血清DMEM中，混匀后静置5min，得质粒混合液；
将PEI加入无血清DMEM中，混匀后静置5min，得转染试剂；
将转染试剂加入质粒混合液中，充分混匀，静置20min，形成DNA-PEI复合物；
（3）将DNA-PEI复合物加入1L含5% FBS 的DMEM培养基中，充分混匀，替换掉步骤（1）中的10层细胞工厂中的培养液，置于37℃、5% CO2培养箱培养；
（4）于转染后的48 h和72 h收集培养上清液，置于2~8℃冰箱中保存；
（5）将收集的培养上清液混合，使用囊式滤器（Sartorius）去掉细胞和细胞碎片；然后将澄清过滤的慢病毒上清通过仕必纯切向流过滤系统（KROSFLO®KR2I）浓缩10~15倍，浓缩液经过0.45μm滤膜过滤后，进行层析纯化；将纯化的慢病毒经过0.22μm滤器（Sartorius）除菌过滤，分装，-80℃冰箱保存。
所得慢病毒即为pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)-T2a-engager慢病毒表达载体，记为pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)-T2a-engager慢病毒。
3、共表达NK细胞衔接器的CAR基因修饰细胞
（1）将收集到的血液样本转移至离心管中，1100 g离心10 min，收集下层细胞并加入0.9%生理盐水稀释，将稀释的细胞加至淋巴细胞分离液上，800 g离心20 min，吸取“白膜层”得到PBMC。使用0.9%生理盐水洗涤细胞并计数。取需要使用的磁珠量，涡旋30 s重悬磁珠；加入PBS洗涤磁珠并弃去上清。用T细胞扩增培养基（含1000IU/mL IL2的KBM581培养基）重悬磁珠和细胞混合物并调整细胞密度为1.0×106个/mL，37℃、5% CO2培养箱培养。
（2）培养48h后，加入pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)-T2a-engager慢病毒（MOI=10）和聚凝胺（polybrene，终浓度6 μg/mL），离心感染（500 g，1.5 h）后置于37℃、5% CO2培养箱培养。
（3）慢病毒感染24 h后换液，加入含1000IU/ml IL2的KBM581培养基，置于37℃、5%CO2培养箱继续扩增培养。
（4）慢病毒感染72 h后收获细胞，其中，收获的细胞即为共表达NK细胞衔接器的CAR基因修饰细胞。
试验例1
（1）参照实施例1的方法，制备得到不含T2a-engager序列的重组慢病毒表达质粒，命名为pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)质粒，其质粒图谱如图7所示。将pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)质粒、慢病毒包装质粒和慢病毒包膜质粒共转染HEK293T细胞，包装出慢病毒并进行纯化，所得慢病毒即为pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)慢病毒表达载体，记为pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)慢病毒。
（2）参照实施例1的方法分别用pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)慢病毒、pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)-T2a-engager慢病毒感染T细胞，慢病毒感染24 h后换液，加入含1000IU/ml IL2的KBM581培养基，置于37℃、5% CO2培养箱继续扩增培养，分别收集慢病毒感染后5d、7d和9d的培养上清。
（3）通过western blotting检测慢病毒感染后不同时间engager（即NK细胞衔接器）的表达。
结果如图8所示，M为蛋白marker（图中，70kD条带未示出），lane1-3分别为慢病毒感染T细胞后5d、7d和9d培养上清中engager的表达检测结果，其中，上面一行感染病毒为pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)慢病毒，下面一行感染病毒为pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)-T2a-engager慢病毒，lane4为正常T细胞培养上清中engager表达检测结果。结果显示感染pRRLSIN.EF1α.CAR(anti-BCMA)-T2a-engager慢病毒后，细胞在所有时间点均能检测到大小符合预期的条带，并且蛋白表达水平随着时间的增加而增加，说明本发明提供的共表达NK细胞衔接器的CAR基因修饰细胞能表达NK细胞衔接器且能持续分泌到细胞外，这对于充分调动机体的免疫应答具有十分重要的作用。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.编码NK细胞衔接器和CAR的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括编码NK细胞衔接器的第一多核苷酸、连接子和编码CAR的第二多核苷酸；其中，所述编码NK细胞衔接器的第一多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述编码CAR的第二多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的编码NK细胞衔接器和CAR的多核苷酸，其特征在于，所述连接子选自P2A、T2A和E2A中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的编码NK细胞衔接器和CAR的多核苷酸，其特征在于，所述连接子为T2A，所述编码NK细胞衔接器和CAR的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.包含权利要求1~3任一项所述的编码NK细胞衔接器和CAR的多核苷酸的基因递送载体。
5.根据权利要求4所述的基因递送载体，其特征在于，所述基因递送载体选自病毒载体、转座子、基因敲入、脂质体、纳米金颗粒、外泌体中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的基因递送载体，其特征在于，所述基因递送载体为慢病毒载体，主要通过将重组慢病毒表达质粒、慢病毒包装质粒和慢病毒包膜质粒包装重组慢病毒制得；所述重组慢病毒表达质粒含有EF1α启动子和权利要求1~3任一项所述的编码NK细胞衔接器和CAR的多核苷酸。
7.包含权利要求4~6任一项所述的基因递送载体的修饰细胞。
8.根据权利要求7所述的修饰细胞，其特征在于，所述修饰细胞的宿主细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞中的至少一种。
9.根据权利要求7或8所述的修饰细胞在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。
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