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CN118308276B - 一株具有改善高尿酸血症造成的肠道损伤功能的副干酪乳酪杆菌jypf-186、菌剂及产品 - Google Patents

一株具有改善高尿酸血症造成的肠道损伤功能的副干酪乳酪杆菌jypf-186、菌剂及产品 Download PDF

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CN118308276B CN202410742561.2A CN202410742561A CN118308276B CN 118308276 B CN118308276 B CN 118308276B CN 202410742561 A CN202410742561 A CN 202410742561A CN 118308276 B CN118308276 B CN 118308276B
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lactobacillus paracasei
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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有改善高尿酸血症造成的肠道损伤功能的副干酪乳酪杆菌JYPF‑186、菌剂及产品，副干酪乳酪杆菌JYPF‑186于2024年2月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.29895。本发明利用副干酪乳酪杆菌JYPF‑186预防、修复高尿酸血症导致的肠道损伤，显著降低尿酸且不存在任何副作用。

Description

一株具有改善高尿酸血症造成的肠道损伤功能的副干酪乳酪 杆菌JYPF-186、菌剂及产品
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有改善高尿酸血症造成的肠道损伤功能的副干酪乳酪杆菌JYPF-186、菌剂及产品。
背景技术
高尿酸血症是由嘌呤代谢障碍导致的一种慢性代谢性疾病，可以分为原发性和继发性两类。原发性高尿酸血症主要由尿酸排泄减少或生成增多引起，而继发性高尿酸血症则是由某些系统性疾病或服用某些药物抑制尿酸排泄而引起。另外，食用过多含嘌呤高的食物也可能诱发高尿酸血症的发病。高尿酸血症与多种慢性病密切相关，是继高血压、高血糖、高血脂之后的“第四高”，其最常引发的疾病是痛风。
高尿酸血症的治疗主要通过非药物治疗和药物治疗两种方式来实现。非药物治疗以改善饮食习惯和运动习惯等生活方式为主，通过减少高嘌呤饮食，增加饮水量和运动量，保持规律生活从而控制尿酸代谢水平，该种治疗方式见效缓慢，只能轻度降低尿酸代谢量，并且受限于患者的自控力，难以长久坚持。药物治疗以服用促进尿酸排泄或减少尿酸生成的药物为主，该种治疗方式虽然能有效控制尿酸代谢水平，但是大多数药物都会对人体产生一定的副作用且有较多的禁忌人群，如常用来增加尿酸排泄的药物苯溴马隆、丙磺舒等对于肾功能不全者的肝、肾功能存在不良影响，且不能用于重度肾功能不全者；如常用来抑制尿酸合成的非布司他等药物可能会产生肝损害、血细胞进行性下降、恶心、呕吐等不良反应；如常用来促进尿酸分解的药物可能过会产生过敏反应、溶血等不良反应。对于肾功能不全的高尿酸血症患者来说，采用药物治疗的方式无论在药物选择上还是药物用量上都具有相当的局限性。
由于人体的尿酸有三分之二是通过肾脏排出，三分之一是通过肠道排出，肾功能不全的患者体内的尿酸主要是通过肠道排泄，肠道的尿酸转运主体主要是ABCG2，高尿酸血症会导致肠道黏膜受损，肠道屏障受损肠道通透性增加，从而损伤ABCG2的功能，导致尿酸的肠道排泄异常。现有技术一般采用具有降低嘌呤、鸟苷与肌苷水平功能的乳酸菌通过降低尿酸的合成治疗肾功能不全的高尿酸血症患者，该种治疗方法虽然不会对人体产生副作用，但是无法修护高尿酸造成的肠道损伤，导致尿酸难以降低。
发明内容
针对肾功能不全的高尿酸血症患者因肠道受损导致尿酸难以降低的技术问题，本发明提供一株具有改善高尿酸血症造成的肠道损伤功能的副干酪乳酪杆菌JYPF-186、菌剂及产品，利用副干酪乳酪杆菌JYPF-186预防、修复高尿酸血症导致的肠道损伤，显著降低尿酸且不存在任何副作用。
第一方面，本发明提供一株具有改善高尿酸血症造成的肠道损伤功能的副干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）JYPF-186，副干酪乳酪杆菌JYPF-186于2024年2月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.29895。
第二方面，本发明提供一种含有如上所述的副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌剂，菌剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一：将副干酪乳酪杆菌JYPF-186在MRS平板培养基上活化；
步骤二：将经过活化的副干酪乳酪杆菌JYPF-186接种于MRS液体培养基中培养，得到副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌液；
步骤三：将副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌液依次进行离心和洗涤后，重悬于复原脱脂乳中，得到副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌悬液；
步骤四：将副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌悬液进行冷冻干燥，得到副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌粉；
步骤五：将副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌粉与低聚异麦芽糖混合，得到副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌剂。
进一步的，步骤一中，MRS平板培养基包括以下原料：蛋白胨 10g、牛肉粉 5g、三水醋酸钠 5g、七水磷酸氢二钾 2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰 0.05g、柠檬酸三铵 2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁 0.2g、琼脂 15g、蒸馏水 1000mL。MRS平板培养基为经过灭菌处理的平板培养基，灭菌处理的温度为121℃，灭菌处理的压强为0.1MPa，灭菌处理的时间为20min。
进一步的，步骤二中，经过活化的副干酪乳酪杆菌JYPF-186的接种量为1%；培养温度为37℃，培养时间为24h。
进一步的，步骤二中，MRS液体培养基包括以下原料：蛋白胨 10g、牛肉粉 5g、三水醋酸钠 5g、七水磷酸氢二钾 2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰 0.05g、柠檬酸三铵 2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁 0.2g、蒸馏水 1000mL。MRS液体培养基为依次经过pH调节和灭菌处理的液体培养基，pH调节的目标值为6.8，灭菌处理的温度为121℃，灭菌处理的压强为0.1MPa，灭菌处理的时间为20min。
进一步的，步骤三中，复原脱脂乳的浓度为15wt%，副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌悬液的浓度为1.0×1010-2.0×1010cfu/mL，菌悬液的浓度优选2.0×1010cfu/mL。
进一步的，步骤五中，副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌剂的菌体数量为100亿/g。
第三方面，本发明提供一种含有如上所述的菌剂的产品，产品包括饲料、饲料添加剂和药品。
进一步的，药品为用于预防、修复高尿酸血症患者肠道粘膜损伤的药品。
进一步的，高尿酸血症患者为肾功能不全的患者。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的具有改善高尿酸血症造成的肠道损伤功能的副干酪乳酪杆菌JYPF-186、菌剂及产品，利用副干酪乳酪杆菌JYPF-186提高紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的表达水平，ZO-1蛋白是细胞间紧密连接中贡献度比较高的蛋白，ZO-1蛋白的主要功能是维持细胞间连接的稳定性和完整性，从而保持细胞的形态和功能，ZO-1蛋白与细胞骨架有着十分密切的关系；Occludin蛋白可以与ZO-1蛋白相互作用，将其组装到紧密连接中，提高Occludin蛋白的表达水平能够避免因Occludin蛋白的缺失造成的肠道屏障功能损伤；Claudin-1蛋白可通过形成紧密连接参与细胞间隔离、细胞极性维持以及细胞间信号转导等重要生物学过程，提高Claudin-1蛋白的表达水平能够避免因Claudin-1蛋白表达异常引起的肠道屏障功能紊乱、紧密连接功能失调和组织渗透性增加。尿酸主要通过尿酸转运蛋白排出体外，尿酸转运蛋白的表达异常与尿酸合成增加都会导致高尿酸血症的发生，ABCG2是非常重要的尿酸转运蛋白，本发明利用副干酪乳酪杆菌JYPF-186促进尿酸转运蛋白ABCG2/mRNA表达，有利于促进尿酸排出体外，避免由尿酸摄入过多造成的肠道损伤。本发明提供的副干酪乳酪杆菌JYPF-186、菌剂及产品能够预防和修复高尿酸造成的肠道细胞损伤和肠上皮结构的损伤，维持肠道屏障的完整性，使尿酸可通过肠道顺利排泄，从而降低尿酸。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例3中模型组、JYPF-186组①和JYPF-186组②的细胞存活率平均值的条形统计图，其中，*表示P＜0.05。
图2是实施例4中空白实验组小鼠的小肠组织结构图。
图3是实施例4中模型实验组小鼠的小肠组织结构图。
图4是实施例4中JYPF-186组①实验组小鼠的小肠组织结构图。
图5是实施例4中JYPF-186组②实验组小鼠的小肠组织结构图。
图6是实施例4中空白实验组、模型实验组、JYPF-186组①实验组和JYPF-186组②实验组小鼠的小肠绒毛高度与隐窝深度比的条形统计图，其中，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
图7是实施例5中空白实验组、模型实验组、JYPF-186组①实验组和JYPF-186组②实验组的小鼠小肠内紧密连接蛋白的相对表达水平的条形统计图。
图8是实施例6中空白实验组、模型实验组、别嘌呤醇实验组和JYPF-186组②实验组的小鼠小肠中ABCG2的相对表达量的条形统计图，其中，*表示P＜0.05、**表示P＜0.01。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1 菌株的分离鉴定
1、菌株筛选及纯化
（1-1）菌株来源：糟辣椒，于2022年1月16日采集于中国贵州省黔东南苗族侗族自治州凯里市西马河街道金山社区安康小区。
（1-2）制备样品：
S1：依次将9mL浓度为0.85wt%的灭菌生理盐水和1g糟辣椒加入至无菌三角瓶中振荡混合均匀，得到混合液待用；
S2：使用灭菌生理盐水将步骤S1所得混合液进行10倍梯度稀释，分别稀释至原浓度的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍，并依次标号为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6、样品7，备用。
（1-3）制备MRS平板培养基：
将蛋白胨 10g、牛肉粉 5g、三水醋酸钠 5g、七水磷酸氢二钾 2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰 0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁 0.2g、琼脂 15g、蒸馏水 1000mL在自然pH下混合，并搅拌均匀后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，得到灭菌的MRS培养基，将灭菌的MRS培养基倒入平皿中放凉，得到MRS平板培养基。
（1-4）培养：使用涂布器将步骤S2所得样品1-样品7分别涂布在步骤（1-3）制备的MRS平板培养基上，于37℃、厌氧条件下培养48h。
（1-5）挑选菌落：待菌落形成后，按照以下菌落特征挑选五个单菌落：直径1-2mm，菌落不规则、边缘刺、乳白色。
（1-6）分离纯化：采用划线法将步骤（1-5）挑选出的五个单菌落接种至新的MRS平板培养基上，于37℃、厌氧条件下培养48h，挑取单菌落，置于甘油管中在-70℃下保藏。
2、菌株鉴定
将经过步骤（1-6）分离纯化的单菌落送去鉴定，鉴定单位：天一生物（济南）股份有限公司，鉴定过程中，使用的引物如下：
引物序列：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’
得到的基因序列如下：
AGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGG
鉴定结果为：该菌株为副干酪乳酪杆菌Lacticaseibacillus paracasei。
将鉴定后的菌株命名为副干酪乳酪杆菌JYPF-186，将该菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏信息如下；
分类命名为：副干酪乳酪杆菌Lacticaseibacillus paracasei，保藏日期：2024年2月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.29895。
实施例2 菌剂的制备
（2-1）制备MRS液体培养基：将蛋白胨 10g、牛肉粉 5g、三水醋酸钠 5g、七水磷酸氢二钾 2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰 0.05g、柠檬酸三铵 2g、葡萄糖 20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水 1000mL混合后，调pH为6.8，搅拌均匀后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，备用；
（2-2）制备菌液：将副干酪乳酪杆菌JYPF-186在MRS平板培养基上活化后，以1%的接种量接种于MRS液体培养基中，然后在37℃条件下有氧培养24h，获得菌液；
（2-3）制备菌剂：将步骤（2-2）所得菌液离心后，收集菌体，并使用0.85wt%的灭菌生理盐水洗涤菌体，将经过洗涤的菌体重悬于15wt%的复原脱脂乳中，获得悬浊液；将悬浊液的浓度调整为2.0×1010cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
将菌粉与低聚异麦芽糖混合，制成菌体数量为100亿/g的菌剂。其中，低聚异麦芽糖购自保龄宝生物股份有限公司。
实施例3 副干酪乳酪杆菌JYPF-186对高尿酸模型细胞存活率的影响
将结肠癌细胞模型Caco-2在包含17%的胎牛血清（上海麦克林生化科技股份有限公司）、80%的MEM（北京索莱宝科技有限公司）（非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、酚红、不含HEPES、丙酮酸钠）、1%青霉素和链霉素（北京索莱宝科技有限公司）、1%非必需氨基酸（北京索莱宝科技有限公司）、1%谷氨酰胺（北京索莱宝科技有限公司）的完全培养基中于37℃、CO2体积浓度为5%的条件下培养，当细胞浓度融合度进行到80%-90%时按传代比例为1:3进行细胞传代。
将传代后的细胞以1×105个/mL的密度接种在96孔板上，于完全培养基中培养一天使细胞贴壁，得到贴壁细胞，96孔板的外围孔每孔各接种100μL的pH为7.4的PBS溶液，以保持96孔板内的湿度。
将贴壁细胞平均分成四组，并依次标记为对照组、模型组、JYPF-186组①和JYPF-186组②，增设空白组，对照组、模型组、JYPF-186组①、JYPF-186组②和空白组每组各设置六个平行孔。
其中，对照组：该组的贴壁细胞继续在各孔室含有10％CCK-8溶液的空白培养基中培养24h、48h、72h。
模型组：分别向该组的各孔室中加入100μL含500mg/L尿酸（UA）（湖南汇百益新材料有限公司）的培养基培养24h、48h、72h；含500mg/L尿酸的培养基的制备方法如下：首先将25mg的UA标准品用1M的NaOH溶液完全溶解，然后加入30mL完全培养基，混合均匀后观察培养基颜色，使用0.5M的HCl溶液将培养基颜色调至原样，最后使用完全培养基定容至50mL，得到含500mg/L尿酸的培养基。
JYPF-186组①：首先分别向该组的各孔室中加入100μL含副干酪乳酪杆菌JYPF-186的培养基培养24h，培养基中副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌体数量为1×107cfu/mL，然后弃去培养基，分别向该组的各孔室中加入含尿酸与副干酪乳酪杆菌JYPF-186的共同培养基100μL培养24h、48h、72h；含副干酪乳酪杆菌JYPF-186的培养基的制备方法如下：使用完全培养基将50mg实施例2所得菌剂溶解后定容至50mL；含尿酸与副干酪乳酪杆菌JYPF-186的共同培养基中，尿酸的浓度为500mg/L，副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌体数量为1×107cfu/mL，共同培养基的制备方法如下：首先将25mg的UA标准品用1M的NaOH溶液完全溶解，然后加入30mL完全培养基，混合均匀后观察培养基颜色，使用0.5M的HCl溶液将培养基颜色调至原样，再加入溶解有50mg实施例2所得菌剂的完全培养基，最后使用完全培养基定容至50mL。
JYPF-186组②：各孔室分别加入含尿酸与副干酪乳酪杆菌JYPF-186的共同培养基100μL培养24h、48h、72h。
空白组：仅含有10％CCK-8溶液（北京索莱宝科技有限公司）。
培养结束后，弃掉对照组、模型组、JYPF-186组①和JYPF-186组②各孔室中的原培养基，分别用PBS溶液将对照组、模型组、JYPF-186组①和JYPF-186组②中的贴壁细胞洗涤两次后往每个孔室中加入100μL含有10％CCK-8溶液的空白培养基培养1.5h，得到待测细胞样本。
用酶标仪分别测定对照组、模型组、JYPF-186组①、JYPF-186组②和空白组各孔室在450nm处的吸光值，并按照如下公式计算模型组、JYPF-186组①和JYPF-186组②各孔室待测细胞样本的细胞存活率：
细胞存活率（％）=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100％
As：模型组、JYPF-186组①和JYPF-186组②各孔室待测细胞样本的吸光值；
Ac：对照组各孔室的吸光值平均值；
Ab：空白组各孔室的吸光值平均值。
分别计算模型组、JYPF-186组①和JYPF-186组②各孔室待测细胞样本的细胞存活率平均值，模型组、JYPF-186组①和JYPF-186组②的细胞存活率平均值的计算结果如图1所示。
由图1可知，模型组的细胞存活率平均值在24h、48h、72h时分别为84.35％、73.00％、68.23％，模型组的细胞存活率平均值随着培养时间的增加呈下降趋势，说明高尿酸造成的细胞损伤具有时间依赖性。JYPF-186组①与JYPF-186组②的细胞存活率平均值随着时间的增加呈上升趋势，其中，JYPF-186组①先使用含副干酪乳酪杆菌JYPF-186的培养基培养24h，再使用含尿酸与副干酪乳酪杆菌JYPF-186的共同培养基共同培养24h、48h、72h后的细胞存活率平均值与模型组相同培养时间的细胞存活率平均值相比分别增加了11.99％、26.03％、32.09％（P＜0.05），说明在细胞未被高尿酸损伤前加入副干酪乳酪杆菌JYPF-186预防高尿酸导致的细胞损伤；JYPF-186组②同时加入含尿酸与副干酪乳酪杆菌JYPF-186的共同培养基培养24h、48h、72h后的细胞存活率平均值与模型组相同培养时间的细胞存活率平均值相比分别增加了5.28％、23.55％、29％（P＜0.05），说明副干酪乳酪杆菌JYPF-186能修复高尿酸导致的细胞损伤。副干酪乳酪杆菌JYPF-186对高尿酸引起的肠道损伤具有预防及修复作用。
实施例4 副干酪乳酪杆菌JYPF-186对高尿酸血症小鼠肠道绒毛损伤的影响
取购自北京维通利华实验动物技术有限公司的SPF级C57BL/6J健康的小鼠五十只，将小鼠适应性饲养一周后，随机分为空白实验组、模型实验组、JYPF-186组①实验组、JYPF-186组②实验组和别嘌呤醇实验组，每组小鼠的数量均为十只。采用如下方式对上述五组小鼠连续给药十周：
空白实验组：每只小鼠每天灌胃一次0.5mL生理盐水。
模型实验组：第一至二周，每只小鼠每天灌胃一次0.5mL生盐水；第三至十周，每只小鼠每天灌胃一次0.5mL生理盐水，每日饲喂1g/kg小鼠体重的酵母、250mg/kg小鼠体重的氧嗪酸钾和100mg/kg小鼠体重的腺嘌呤。
JYPF-186组①实验组：第一至二周，每只小鼠每天灌胃0.5mL含副干酪乳酪杆菌JYPF-186的生理盐水溶液，含副干酪乳酪杆菌JYPF-186的生理盐水溶液中，副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌体数量为1×107cfu/mL；第三至十周，每只小鼠每天灌胃一次0.5mL含副干酪乳酪杆菌JYPF-186的生理盐水溶液，每日饲喂1g/kg小鼠体重的酵母、250mg/kg小鼠体重的氧嗪酸钾和100mg/kg小鼠体重的腺嘌呤。
JYPF-186组②实验组：第一至二周，每只小鼠每天灌胃一次0.5mL生理盐水；第三至十周，每只小鼠每天灌胃一次0.5mL含副干酪乳酪杆菌JYPF-186的生理盐水溶液，每日饲喂1g/kg小鼠体重的酵母、250mg/kg小鼠体重的氧嗪酸钾和100mg/kg小鼠体重的腺嘌呤。
别嘌呤醇实验组：每只小鼠每天灌胃一次含有25mg/kg小鼠体重的别嘌呤醇的0.5mL生理盐水，每日饲喂1g/kg小鼠体重的酵母、250mg/kg小鼠体重的氧嗪酸钾和100mg/kg小鼠体重的腺嘌呤
在连续给药期间，各组小鼠均给予正常饲料与自由饮水。连续给药的最后一天各组小鼠均禁食不禁水12h，然后用颈椎脱臼法处死小鼠，将各组小鼠解剖后依次按照如下步骤进行处理：
步骤①：固定：留取肠道组织切成1cm肠段，并用生理盐水清洗干净，随后用10％的多聚甲醛固定24h，得到固定好的肠段组织。
步骤②：脱水：流水冲洗固定好的肠段组织，然后将其依次放入50％、60％、70％、80％、90％的乙醇中各脱水1h，95％的乙醇中脱水4h，无水乙醇中脱水30分钟，最后将经过脱水的肠段组织置于蒸馏水中浸泡2分钟。
步骤③：包埋：将经过步骤②处理的肠段组织用石蜡进行包埋。
步骤④：脱蜡：用切片机将包埋好的肠段组织切片，得到切片组织，将切片组织两次放入二甲苯中浸泡，每次浸泡10分钟，浸泡完毕后，将切片组织分别放入100％、75％、50％的乙醇中各浸泡5分钟，最后将其置于蒸馏水中浸2分钟。
步骤⑤染色：脱蜡后的切片组织用苏木精染色液染色20分钟，后用自来水冲洗。将冲洗后的切片组织在盐酸酒精中分化30秒，再放入水中浸泡15分钟，最后用伊红染色液染色30秒，后用自来水冲洗，得到染色切片。
步骤⑥封片：将染色切片在水中浸泡5分钟后，分别放入85％、95％、100％的乙醇中各脱水10分钟，脱水后的染色切片在二甲苯中浸泡10分钟使其透明，用中性胶密封，得到组织标本。
步骤⑦观察：用光学显微镜观察组织标本中的小肠组织结构并拍照，空白实验组、模型实验组、JYPF-186组①实验组和JYPF-186组②实验组小鼠的小肠组织结构图分别如图2、图3、图4、图5所示。采用Image J软件测量各组组织标本中的小肠绒毛高度和隐窝深度，计算小肠绒毛高度与隐窝深度比，空白实验组、模型实验组、JYPF-186组①实验组、JYPF-186组②实验组小鼠的小肠绒毛高度与隐窝深度比如图6所示。
由图2-6可知，模型实验组小鼠的小肠组织结构图与空白实验组小鼠的小肠组织结构图相比，模型实验组小鼠的小肠组织局部上皮脱落，肠绒毛萎缩塌陷，肠道病理学损伤明显且模型实验组小鼠的小肠绒毛高度与隐窝深度的比值为1.39，空白实验组小鼠的小肠绒毛高度与隐窝深度的比值为2.3，模型实验组小鼠的小肠绒毛高度与隐窝深度的比值远小于空白实验组（P＜0.01），说明高尿酸血症小鼠的小肠上皮结构被破坏；空白实验组小鼠的小肠上皮结构完整，肠组织病理形态正常，未见明显病理损伤，JYPF-186组①实验组与JYPF-186组②实验组小鼠的小肠上皮相对完整，小肠绒毛断裂程度较轻，小肠绒毛高度与隐窝深度的比值分别为2.44与2.23，明显高于模型实验组（P＜0.05）。综上，高尿酸血症小鼠的肠上皮结构被破坏，副干酪乳酪杆菌JYPF-186可以预防和修复高尿酸造成的肠上结构的损伤，维持肠道屏障的完整性。
实施例5 副干酪乳酪杆菌JYPF-186对高尿酸血症小鼠肠道紧密连接蛋白表达的影响
采用蛋白印记法测定实施例4中各组小鼠的小肠内紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1的表达情况，测定方法如下：
（1）将小肠组织切成小块，在RIPA组织裂解液中匀浆后，放入离心机中以14000r的转速离心15min，收集上清液。
（2）严格按照BCA（Bicinchoninic acid）检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）的说明书检测上清液中蛋白质的浓度。
（3）每个样品蛋白量为45µg，加入5×蛋白上样缓冲液，混匀后放入100℃恒温器使蛋白充分变性，10min后置于冰上冷却，完全放凉后在-20℃下保存待用。
（4）电泳：按照说明书步骤配置12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE），插入齿梳，待凝胶在室温下完全凝固后，放入到电泳槽，并缓慢加入电泳缓冲液，垂直移除齿梳，将每个蛋白样品按照顺序加入上样孔，接通电源，电压为80伏，待跑到分离胶和浓缩胶分界处（大约30min），将电压升高到120伏，直到蛋白跑到分离胶底部（大约90min），关闭电源。
（5）将大小与凝胶相同的6张滤纸和1张甲醇处理后的聚偏氟乙烯膜（PVDF）以及海绵垫浸泡在转膜缓冲液中，在转移夹的黑色面严格按照顺序放入“海绵垫-三层滤纸-凝胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵垫”，将气泡排尽后夹紧，采用冰浴的方式，倒入电泳液，电流300mA，90min。
（6）将PVDF膜置于5%的脱脂牛奶中，室温下在摇床上平缓震荡2h。
（7）将PVDF膜用TBST洗涤后放入含有一抗的溶液中，4℃过夜，具体的一抗溶液及滴度如下：β-actin（1:800），ABCG2（1:1000），GLUT9（1:1500），URAT1（1:1000），TLR4（1:1000），MyD88（1:800），p-IκB（1:1000），Claudin-1（1:1000），Occludin（1:1000），ZO-1（1:1000）。用TBST洗膜3次，每次10min。放入配置好的二抗中，室温震荡1h。
（8）ECL显色和半定量：PVDF膜上加入增强化学发光试剂（Enhancedchemiluminescence，ECL），使蛋白带可见。用Image-Plus软件进行灰度半定量，蛋白表达以β-actin为内参蛋白，各组小鼠的小肠内紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1的相对表达水平如图7所示。
由图7可知，与空白实验组相比，模型实验组的小鼠的小肠内紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1的相对表达水平显著降低（P＜0.05），说明高尿酸对于紧密连接蛋白表达起到了抑制作用，破坏了肠道屏障的完整性。JYPF-186组①实验组、JYPF-186组②实验组与模型实验组相比，Occludin、Claudin-1和ZO-1三种蛋白的相对表达水平均显著提高（P＜0.05），说明副干酪乳酪杆菌JYPF-186在JYPF-186组①实验组中能够起到预防肠道屏障受损和保护肠道屏障的作用，同时可以维持小肠紧密连接蛋白正常表达；副干酪乳酪杆菌JYPF-186在JYPF-186组②实验组中能够起到修复肠道损伤，促进小肠紧密连接蛋白的表达的作用。
实施例6 副干酪乳酪杆菌JYPF-186对高尿酸血症小鼠肠道ABCG2/mRNA表达的影响
按照如下方式从实施例4中的各组小鼠的肠道组织中提取RNA：
①取10mg左右的小肠组织放入无酶离心管中，加入500μLRNAiso Plus裂解液（宝日医生物技术（北京）有限公司）进行裂解，匀浆，得到匀浆液。
②将匀浆液置于冰上静置5min，加入120μL预冷后的氯仿，晃匀变为粉红色后继续放于冰上静置10min，随后放入离心机中，在4℃下以12000r的转速离心15min，得到离心上清液。
③将离心上清液转移至新的无酶离心管中，并向离心上清液中加入200μL异丙醇，上下颠倒无酶离心管，使离心上清液与异丙醇混合均匀后，在室温下静置10min，随后放入离心机中，在4℃下以12000r的转速离心10min，留取白色沉淀。
④向白色沉淀中加入用DEPC水配置的预冷后的75％的乙醇500μL清洗RNA，离心后倒出乙醇，再次重复用75％的乙醇清洗，清洗结束后吸出残留乙醇，放入无酶超净台烘干，得到干燥的RNA。
⑤向干燥的RNA中加入预冷的DEPC水10μL，静置直至RNA完全溶解。
⑥用超微量紫外分光光度计检测RNA浓度。
检测过程：
按照反转录试剂盒（宝日医生物技术（北京）有限公司）进行逆转录反应进行合成cDNA。用鼠源的内参基因GAPDH进行cDNA的扩增反应体系为5μL SYBR® Premix Ex Taq (2×)、0.6μL PCR Forward Primer、0.6μL PCR Reverse Primer、4.6μL cDNA，用ThermoPikoReal荧光定量PCR仪进行检测。用2-ΔΔCt相对表达量法对cq值数据进行处理，空白实验组、模型实验组、JYPF-186组②实验组和别嘌呤醇实验组的小鼠小肠中ABCG2的相对表达量如图8所示。
由图8可知，模型实验组的ABCG2/mRNA的相对表达量为0.454，与空白实验组相比其相对表达量显著下降（P＜0.01）。与模型实验组相比，别嘌呤醇实验组的相对表达量有所升高，经副干酪乳酪杆菌JYPF-186的干预后小肠ABCG2/mRNA相对表达量为0.92且与空白实验组相接近（P＜0.05）。说明副干酪乳酪杆菌JYPF-186能够改善高尿酸血症小鼠肠道内ABCG2/mRNA的表达。
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1. 一株具有改善高尿酸血症造成的肠道损伤功能的副干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）JYPF-186，其特征在于，副干酪乳酪杆菌JYPF-186于2024年2月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.29895。
2.一种含有如权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌剂，其特征在于，菌剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一：将副干酪乳酪杆菌JYPF-186在MRS平板培养基上活化；
步骤二：将经过活化的副干酪乳酪杆菌JYPF-186接种于MRS液体培养基中培养，得到副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌液；
步骤三：将副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌液依次进行离心和洗涤后，重悬于复原脱脂乳中，得到副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌悬液；
步骤四：将副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌悬液进行冷冻干燥，得到副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌粉；
步骤五：将副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌粉与低聚异麦芽糖混合，得到副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌剂。
3. 如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，步骤一中，MRS平板培养基包括以下原料：蛋白胨 10g、牛肉粉 5g、三水醋酸钠 5g、七水磷酸氢二钾 2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵 2g、葡萄糖 20g、七水硫酸镁 0.2g、琼脂 15g、蒸馏水 1000mL。
4.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，步骤二中，经过活化的副干酪乳酪杆菌JYPF-186的接种量为1%；培养温度为37℃，培养时间为24h。
5. 如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，步骤二中，MRS液体培养基包括以下原料：蛋白胨 10g、牛肉粉 5g、三水醋酸钠 5g、七水磷酸氢二钾 2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵 2g、葡萄糖 20g、七水硫酸镁 0.2g、蒸馏水 1000mL。
6.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，步骤三中，复原脱脂乳的浓度为15wt%，副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌悬液的浓度为1.0×1010-2.0×1010cfu/mL。
7.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，步骤五中，副干酪乳酪杆菌JYPF-186的菌剂的菌体数量为100亿/g。
8.一种含有如权利要求2-7任一项所述的菌剂的产品，其特征在于，产品包括饲料、饲料添加剂和药品。
9.如权利要求8所述的产品，其特征在于，药品为用于预防、修复高尿酸血症患者肠道粘膜损伤的药品。
10.如权利要求9所述的产品，其特征在于，高尿酸血症患者为肾功能不全的患者。
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Effective date of registration: 20241030

Address after: 262500 Intersection of Qiwang Road and Jizhou Road, Jiaoshan Economic Development Zone, Shaozhuang Town, Qingzhou City, Weifang City, Shandong Province

Patentee after: Minsheng Zhongke Jiayi (Shandong) Biotechnology Co.,Ltd.

Country or region after: China

Address before: 9777 Qiwang Road, Qingzhou City, Weifang City, Shandong Province 262500

Patentee before: SHANDONG ZHONGKE-JIAYI BIO-ENGINEERING CO.,LTD.

Country or region before: China