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CN118251503A - 用于标注生物分子的光反应性及可裂解探针 - Google Patents

用于标注生物分子的光反应性及可裂解探针 Download PDF

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CN118251503A
CN118251503A CN202280063774.1A CN202280063774A CN118251503A CN 118251503 A CN118251503 A CN 118251503A CN 202280063774 A CN202280063774 A CN 202280063774A CN 118251503 A CN118251503 A CN 118251503A
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CN
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张至为
盖相如
钟佳纹
陈一德
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Xinxi Biotechnology Co ltd
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明提供包括光反应性及可裂解探针的组成物以及使用所述探针的方法。所述探针可包括可结合至标记的标签、可连接至诱饵分子的可裂解连接子及光活化弹头，所述光活化弹头用于在施加光能时将锚定链与探测链共价键合。所述组成物及方法可适用于分析生物分子，例如识别细胞或组织样本中的近端生物分子。

Description

用于标注生物分子的光反应性及可裂解探针
通过引用并入本文
本说明书中提及的所有出版物及专利申请均以引用方式整体并入本文，其程度与各单独出版物或专利申请具体且单独地指示以引用方式并入的程度相同。
技术领域
本文描述了用于识别、标注及分析生物分子的方法及组成物。具体描述了适用于光活化及标注生物分子亚群的可裂解探针。所述方法及组成物可能特别适用于分析生物样品，例如识别细胞或组织样品中的近端生物分子。
背景技术
细胞由不同类型的生物分子(biological molecule/biomolecule)构成。细胞中的生物分子与亚细胞环境中的相邻生物分子相互作用，形成复合物、细胞器或其他组装体，且执行各种基本的细胞功能。表征生物分子在亚细胞环境中相互作用以及生物分子如何一起发挥作用极具挑战性。生物分子较小，且其存在于具有数千万个其他分子的细胞环境中。相邻生物分子之间的相互作用通常较弱，且用于研究生物分子的技术会破坏其相互作用。虽然例如酵母双杂交分析及最近的邻近标记等技术提高了我们对细胞环境的理解，但这些技术受到各种限制，例如非特异性结合、反应时间慢及天然细胞环境的破坏，导致假阳性及错过相互作用。需要更好的工具来确定自然发生的生物分子相互作用。本文描述了更好地分析内源性生物分子相互作用的系统、组成物及方法。
发明内容
本文描述了更好地分析内源性生物分子相互作用的系统、组成物及方法。所述方法及组成物可适用于识别、标注及分析生物分子。具体描述了适用于光活化及标注生物分子亚群的可裂解探针。所述方法及组成物可特别适用于分析生物样品，例如识别细胞或组织样品中的近端生物分子。这些探针可特别适用于经由显微镜系统的选择性光照明对生物分子进行选择性标注及邻近标记。通常，在一个实施例中，光反应性及可裂解探针包括核酸锚定链，其中锚定链可包括诱饵附接位点；核酸探测链，其中探测链与锚定链沿着互补序列形成双链结构；双链结构中具可裂解位点，其中锚定链及探测链是用于裂解子的施加而在可裂解位点断裂；位于探针中的光活化弹头，其中光活化弹头是用以在施加光能时将锚定链共价键合至探测链；及结合至探测链的标签，其中标签是用以结合至可检测标记。
此实施例及其他实施例可包括以下一个或多个特征。锚定链及探测链包括DNA、RNA或DNA及RNA的组合。锚定链比探测链长。锚定链及探测链具有至少6个呈连续一排的互补核苷酸及总共至少20个互补核苷酸。双链结构的长度至少为10个核苷酸。双链结构的解链温度Tm为52℃至60℃。双链结构的解链温度Tm为至少50℃。锚定链及探测链的长度为至少10个核苷酸、至少20个核苷酸或至少30个核苷酸。锚定链及探测链的长度不超过40个核苷酸，不超过50个核苷酸，或不超过60个核苷酸。锚定链及探测链的长度在15个核苷酸与40个核苷酸之间。锚定链可包括一级序列，且相对于可裂解位点，标签与诱饵附接位点位于一级序列的同一侧上。探针在诱饵附接位点处附接至诱饵分子。探针共价附接至诱饵分子。诱饵分子包括抗体、CLIP-标签、HaloTag、蛋白A、蛋白G、蛋白L、RNA分子、小分子或SNAP-标签。诱饵分子包括抗体。诱饵分子包括二级抗体。标签包括生物素衍生物、CLIP-标签、点击化学标签、地高辛、HaloTag、肽标签或SNAP-标签。生物素衍生物包括以下的基团：
可裂解位点包括核酸内切酶位点。可裂解位点包括限制酶位点。光活化弹头包括核碱基。光活化弹头包括胸腺嘧啶特异性弹头。光活化弹头包含核碱基特异性补骨脂素，包括的基团或核碱基特异性叠氮化物。光活化弹头包括核碱基特异性3-氰基乙烯基咔唑核苷(CNVK)，包括的基团。光活化弹头包括核碱基特异性三氧沙林，包括的基团。如前述技术方案中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中光活化弹头包含核碱基特异性二氮丙啶，包括的基团。
通常，在一个实施例中，一种用于光活化标记的方法包括将上述光反应性及可裂解探针结合至生物样品中的生物分子，将诱饵分子结合至生物样品中的目标生物分子以交联探针及目标生物分子，递送光辐射以活化光活化弹头且将锚定链共价键合至探测链，裂解探针双链区域中的可裂解位点以自探针的其余部分移除一部分锚定链及探测链，且自生物样品移除经裂解及未结合的探针。
一般而言，在一个实施例中，一种分析方法包括将光反应性及可裂解探针递送至生物样品，所述探针包括核酸锚定链及核酸探测链，其中探测链与锚定链沿着互补序列形成双链结构，选择性地照明生物样品的第一区域，从而活化位于探针中的光活化弹头且将探测链共价键合至第一区域中的锚定链，且不照明生物样品的第二区域，以使探测链及锚定链在第二区域中不共价键合，裂解第一及第二区域中的探针的双链区域中的可裂解位点以自探针的其余部分移除锚定链的经裂解部分及探测链的经裂解部分，将竞争核酸链递送至第一及第二区域，其中竞争核酸链是用以与探测链竞争结合至锚定链，且用竞争核酸链替代在第二区域中的探针的所述探测链中，但不替代在第一区域中的探针中的探测链，其中第一区域中的探测链与锚定链之间的共价键合，以防止竞争链替代第一区域中的探测链。
此实施例及其他实施例可包括以下一个或多个特征。探针可进一步包括结合至探测链的标签，其中标签是用以结合至可检测标记。将可检测标记与标签结合且通过可检测标记的活性，可检测地邻近标记邻近于目标生物分子的相邻分子的步骤。可检测地邻近标记的步骤可包括光选择性邻近标记直径或最长尺寸小于300nm、小于200nm或小于100nm的区域。在裂解可裂解位点之前双链结构的解链温度Tm可为至少50℃。在裂解可裂解位点之前双链结构的解链温度Tm可为52℃至60℃。所述方法可进一步包括其中(i)裂解步骤后探针可包括双链结构，(ii)替代步骤后探针可包括双链结构，及(iii)裂解可裂解位点后第二区域中的双链结构的解链温度Tm低于第二区域中的替代步骤后第二区域中的双链结构的解链温度Tm。裂解可裂解位点后第二区域中的双链结构的解链温度Tm为26℃至34℃。第二区域中的替代步骤后第二区域中的双链结构的解链温度Tm为44℃至53℃。替代步骤可在高于裂解可裂解位点后第二区域中的双链结构的解链温度Tm且低于替代步骤后第二区域中的双链结构的解链温度Tm的温度下进行。锚定链的一级序列、探测链的一级序列和/或竞争链的一级序列与生物样品中天然存在的核酸链是生物正交的，使得序列在内源性序列与探测链或锚定链之间匹配不超过10个核苷酸。裂解可裂解位点的步骤可包括用限制性核酸内切酶和/或限制酶切割可裂解位点。选择性地照明以活化光活化弹头的步骤可包括活化核碱基弹头。选择性地照明以活化光活化弹头的步骤可包括活化胸腺嘧啶特异性弹头。选择性地照明生物样品的步骤可包括自影像引导显微镜系统的成像光源照明，所述方法进一步包括用可控相机对照明样品进行成像，用相机获取第一视野中的生物样品的亚细胞形态的至少一个影像，处理至少一个影像且基于经处理的影像确定样品中的所关注区域，及获得所关注区域的坐标信息。自第一及第二区域移除经裂解及未结合的探针的步骤。选择性地照明的步骤可包括以25微秒/像素至400微秒/像素、50微秒/像素至300微秒/像素或75微秒/像素至200微秒/像素来照明区域。选择性地照明的步骤可包括以100mW至300mW的功率强度照明。可检测标记可包括催化标记。生物样品可包括至少一个、至少100个、至少1000个或至少10,000个活细胞或固定细胞。生物样品可包括固定细胞、组织、细胞提取物或组织提取物。选择性地照明的步骤可包括照明由点扩散函数定义的区域。将生物样品置于显微镜载物台上，所述方法进一步包括自载物台移除生物样品的照明区域的至少一部分。对样品进行质谱分析或测序分析的步骤。标签可包括生物素衍生物、CLIP-标签、点击化学标签、地高辛、HaloTag、肽标签或SNAP-标签。
一般而言，在一个实施例中，用于标记生物分子的试剂盒包括上述任一项所述的光反应性及可裂解探针于第一容器中，以及说明材料。
此实施例及其他实施例可包括以下一个或多个特征中。竞争链，其中竞争链与锚定链互补。当竞争链及锚定链形成双链结构时，所述结构的解链温度Tm为44℃至53℃。
通常，在一个实施例中，用于探针生成的试剂盒包括核酸锚定链，其中锚定链可包括诱饵附接位点；核酸探测链，其中探测链与锚定链沿着互补序列形成双链结构；可裂解位点位于双链结构中，其中锚定链及探测链是用于裂解子的施加而在可裂解位点断裂；光活化弹头，其中光活化弹头是用以在施加光能时将锚定链共价键合至探测链；及结合至探测链的标签，其中标签是用以结合至可检测标记。
通常，在一个实施例中，光反应性探针包括核酸锚定链，其中锚定链可包括诱饵附接位点；核酸探测链，其中探测链与锚定链沿着互补序列形成双链结构；位于探针中的光活化弹头，其中光活化弹头是用以在施加光能时将锚定链共价键合至探测链；及结合至探测链的标签，其中标签是用以结合至可检测标记。
此实施例及其他实施例可包括以下一个或多个特征。锚定链及探测链包括DNA、RNA或DNA及RNA的组合。锚定链比探测链长。锚定链及探测链具有至少6个呈连续一排的互补核苷酸及总共至少20个互补核苷酸。双链结构的长度至少为10个核苷酸。双链结构的解链温度Tm为52℃至60℃。双链结构的解链温度Tm为至少50℃。锚定链及探测链的长度为至少10个核苷酸、至少20个核苷酸或至少30个核苷酸。锚定链及探测链的长度不超过40个核苷酸，不超过50个核苷酸，或不超过60个核苷酸。锚定链及探测链中的长度分别在15个核苷酸与40个核苷酸之间。锚定链可包括一级序列，且相对于可裂解位点，标签与诱饵附接位点位于一级序列的同一侧上。探针在诱饵附接位点处附接至诱饵分子。探针共价附接至诱饵分子。诱饵分子可包括抗体、CLIP-标签、HaloTag、蛋白A、蛋白G、蛋白L、RNA分子、小分子或SNAP-标签。诱饵分子可包括抗体。诱饵分子可包括二级抗体。
标签可包括生物素衍生物、CLIP-标签、点击化学标签、地高辛、HaloTag、肽标签或SNAP-标签。生物素衍生物包括以下的基团：
光活化弹头可包括核碱基。光活化弹头可包括胸腺嘧啶特异性弹头。光活化弹头可包括核碱基特异性补骨脂素，包括的基团。光活化弹头可包括核碱基特异性3-氰基乙烯基咔唑核苷(CNVK)，包括的基团。
光活化弹头可包括核碱基特异性三氧沙林，包括的基团。
一般而言，在一个实施例中，一种用于光活化标记的方法包括将上述任何光反应性探针结合至生物样品中的生物分子，将诱饵分子结合至生物样品中的目标生物分子以交联探针及目标生物分子，将光辐射递送至生物样品的第一区域以活化光活化弹头且将锚定链共价键合至探测链，将探测链自探针的其余部分移除且使竞争链与生物样品的未用光辐射处理的第二区域中的锚定链杂交，及自生物样品移除经裂解及未结合的探针。
一般而言，在一个实施例中，一种分析方法包括将光反应性探针递送至生物样品，所述探针包括核酸锚定链及核酸探测链，其中探测链与锚定链沿着互补序列形成双链结构，选择性地照明生物样品的第一区域，从而活化位于探针中的光活化弹头且将探测链共价键合至第一区域中的锚定链，且不照明生物样品的第二区域，以使探测链及锚定链在第二区域中不共价键合，在第二区域中将探测链自探针的其余部分解链，将竞争核酸链递送至第一及第二区域，其中竞争核酸链是用以与探测链竞争结合至锚定链，且用所述竞争核酸链替代在第二区域中的探针中所述探测链，但不替代第一区域中的探针中的所述探测链，其中第一区域中的探测链与锚定链之间的共价键合，以防止竞争链替代第一区域中的探测链。
此实施例及其他实施例可包括以下一个或多个特征。探针可进一步包括结合至探测链的标签，其中标签是用以结合至可检测标记。将可检测标记与标签结合，且通过可检测标记的活性，可检测地邻近标记邻近于目标生物分子的相邻分子的步骤。可检测地邻近标记的步骤可包括光选择性邻近标记直径或最长尺寸小于300nm、小于200nm或小于100nm的区域。在裂解可裂解位点之前双链结构的解链温度Tm为至少50℃。在裂解可裂解位点之前双链结构的解链温度Tm为52℃至60℃。所述方法可进一步包括其中(i)裂解步骤后探针可包括双链结构，(ii)替代步骤后探针可包括双链结构，及(iii)裂解可裂解位点后第二区域中的双链结构的解链温度Tm低于第二区域中的替代步骤后第二区域中的双链结构的解链温度Tm。裂解可裂解位点后第二区域中的双链结构的解链温度Tm为26℃至34℃。第二区域中的替代步骤后第二区域中的双链结构的解链温度Tm为44℃至53℃。替代步骤是在高于裂解可裂解位点后第二区域中的双链结构的解链温度Tm且低于替代步骤后第二区域中的双链结构的解链温度Tm的温度下进行。锚定链的一级序列、探测链的一级序列和/或竞争链的一级序列与生物样品中天然存在的核酸链是生物正交的，使得序列在内源性序列与探测链或锚定链之间匹配不超过10个核苷酸。
将探测链自第二区域中的探针的其余部分移除的步骤可包括用核酸外切酶消化探测链。将探测链自第二区域中的探针的其余部分移除的步骤可包括用解链因子处理样品。将探测链自第二区域中的探针的其余部分移除的步骤可包括用解链因子(包括解旋酶、小分子或升高的温度)处理样品。选择性地照明以活化光活化弹头的步骤可包括活化核碱基弹头。选择性地照明以活化光活化弹头的步骤可包括活化胸腺嘧啶特异性弹头。选择性地照明生物样品的步骤可包括自影像引导显微镜系统的成像光源照明，所述方法进一步包括用可控相机对照明样品进行成像，用相机获取第一视野中的生物样品的亚细胞形态的至少一个影像，处理至少一个影像且基于经处理的影像确定样品中的所关注区域，及获得所关注区域的坐标信息。自第一及第二区域移除未结合的探针的步骤。选择性地照明的步骤可包括以25微秒/像素至400微秒/像素、50微秒/像素至300微秒/像素或75微秒/像素至200微秒/像素来照明区域。选择性地照明的步骤可包括以100mW至300mW的功率强度照明。可检测标记可包括催化标记。生物样品可包括至少一个、至少100个、至少1000个或至少10,000个活细胞或固定细胞。生物样品可包括固定细胞、组织、细胞提取物或组织提取物。选择性地照明的步骤可包括照明由点扩散函数定义的区域。将生物样品置于显微镜载物台上，所述方法进一步包括自载物台移除生物样品的照明区域的至少一部分。对样品进行质谱分析或测序分析的步骤。标签可包括生物素衍生物、CLIP-标签、点击化学标签、地高辛、HaloTag、肽标签或SNAP-标签。
通常，在一个实施例中，用于标记生物分子的试剂盒包括上述任一项所述的光反应性探针于第一容器中，以及说明材料。此实施例及其他实施例可包括以下一个或多个特征。竞争链，其中竞争链与锚定链互补。竞争链及锚定链形成双链结构，所述结构的解链温度Tm为44℃至53℃。
通常，在一个实施例中，用于探针生成的试剂盒包括核酸锚定链，其中锚定链可包括诱饵附接位点；核酸探测链，其中探测链与锚定链沿着互补序列形成双链结构；光活化弹头，其中光活化弹头是用以在施加光能时将锚定链共价键合至探测链；及结合至探测链的标签，其中标签是用以结合至可检测标记。
附图说明
通过参考下列阐述说明性实施例的详细描述及其附图，可以更好地理解本文所述方法及装置的特征和优点，其中：
图1为显示了可用于对基板上的细胞进行光选择性空间标注及邻近标记的系统的示意图。图2A为显示了多功能光反应性及可裂解探针的示意图。光反应性及可裂解探针具有带有多个附接位点的多价核心。一个标签、一个可裂解连接子及一个光活化弹头与探针上的附接位点结合。图2B示意性地说明了邻近标记系统，所述系统可用于使用图2A中所示的探针标记所关注小区域中的生物分子。
图2C为显示了使用本文所述的多功能光反应性及可裂解探针以标记小关注区域(ROI)中的生物分子，比较直接光化学标记与光辅助酶促邻近标记的结果的示意图。探针示于图2B中。
图3A及图3B为示意性地说明了使用如本文所述的多功能光反应性及可裂解探针及温和裂解条件(图3B)与使用具有苛刻裂解反应的探针的结果(图3A)相比对蛋白质结构的影响。在温和裂解条件下，蛋白质结构保留，且反应是生物正交的，而在苛刻裂解条件下，蛋白质变性，且反应是非生物正交的。
图4A至4K为显示了可用于本文所述的光反应性及可裂解探针中的标签的实例。标签是用以与标记相互作用，用于标记与所关注目标分子相邻的生物分子。图4A至图4E为显示了可与探针一起使用的点击化学标签的实例。图4F至4H为显示了可与探针一起使用的生物素衍生物的实例。图4I为显示了地高辛基团。图4J为显示了肽标签。图4K为显示了SNAP-标签。
图5A至5E为显示了可用于本文所述的光反应性及可裂解探针的位点特异性可裂解连接子的实例。图5A为显示了偶氮苯基团。图5B为显示了硼酸酯基团。图5C为显示了Dde基团。图5D为显示了DNA寡聚体。图5E为显示了肽基团。
图6A至6E为显示了可用于本文所述的光反应性及可裂解探针中以与样品中的所关注分子结合(例如共价或非共价)的诱饵分子的实例。图6A为显示了可用作诱饵分子的抗体。图6B为显示了可用作诱饵分子的核酸部分。图6C为显示了可用作诱饵分子的功能性蛋白质的示意图。图6D为显示了可用作诱饵分子的小分子/药物。例如，显示了厄洛替尼(erlotinib)。图6E为显示了CLIP-标签及可使用自标记部分的其他成员(例如HaloTag或SNAP-Tag)。
图7A至7I为显示了可用于本文所述的光反应性及可裂解探针中的光活性弹头的实例。
图8A至8G为显示了可用于本文所述的光反应性及可裂解探针中的连接子的其他实例。
图9A至9G为显示了光反应性及可裂解探针的实例。探针具有带有多个附接位点的多价核心。一个标签与一个附接位点结合，一个可裂解连接子与另一附接位点结合，且一个光活化弹头与探针上的另一附接位点结合。
图10A至10B为示意性地说明了基于肽的光反应性及可裂解探针。这些探针具有可经肽裂解试剂裂解，例如经识别特定肽序列的蛋白酶裂解的肽区域。图10A为显示了基于肽的探针的实例，所述探针在肽区域的N末端具有标签及弹头。图10B为显示了基于肽的探针的实例，所述探针在肽区域的C末端具有标签及弹头。图10A及10B亦为显示了具有额外柔性连接子及视情况选用的可点击氨基酸的探针。额外连接子(亦称为间隔子)可在桥接诱饵分子与光反应性及可裂解探针之间的附接位点中发挥作用。探针与诱饵之间的距离可通过应用具有不同空间长度的连接子来控制。
图10C至10I为显示了可与图10A及10B中所示的探针一起使用的反应性或可点击氨基酸的实例。点击氨基酸可用于附着诱饵分子，例如抗体。
图10J至10Q为显示了图10A-10B中示意性说明的基于肽的光反应性及可裂解探针的实例。人类鼻病毒3C(HRV 3C)蛋白酶、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶及凝血酶的裂解位点用箭头表示。
图11A至11D为说明了用于合成本文所述的光反应性及可裂解探针的方法及步骤。所述方法产生带有标签、可裂解连接子及光活化弹头的探针。
图12A为示意性地说明了与抗体诱饵结合的光反应性及可裂解探针。
图12B及图12C为示意性地说明了使用与抗体诱饵结合的光反应性及可裂解探针对分子进行光选择性标注，以标注细胞核仁中的蛋白质的反应流程。图12B为说明了反应如何使用受控光进行。图12B为说明了可裂解探针如何经裂解以减少非照明区域中的背景。
图12D为显示了使用图12A及图12B中所示的反应流程的结果。核仁蛋白在存在光的情况下经特异性标记(上图及右图)，但在不存在光的情况下未经标记(下图)。
图13A为成像引导系统的示意图。
图13B为描绘了图13A的成像引导系统的光路。
图14A为另一成像引导系统的示意图。
图14B为描绘了图14A的成像引导系统的光路。
图15A为另一成像引导系统的示意图。图15B为描绘了图15A的成像引导系统的光路。
图16A为示意性地说明了具有核酸锚定链、核酸探测链、光活化弹头及标签的光反应性及可裂解探针。
图16B为示意性地说明了与抗体结合的图16A中的探针。
图16C为示意性地说明了图16B中说明的探针-抗体结合物的用途，例如用于标记样品中的目标生物分子。
图17A为示出了图16C中所示的探针和方法的实例。图17B至17D为示意性地说明了图17A中所示的探针结构以及不同探针结构的解链温度。
图18A为说明了用于自样品的非光活化区域中的分子移除标签的步骤。使用酶处理移除标签，接着进行链置换及替代。
图18B至18D为显示了另一光反应性探针。图18B示意性地说明了探针，且图18C及图18D为说明了图18B中所示探针的改变版本。不同版本的不同解链温度可用于自部分样品中的分子移除标签。
图19A及图19B为示意性地说明了可用于自部分样品中的分子移除标签的另一光反应性探针。解链因子用于移除标签。
图19C为显示了在样品的光活化区域中标注分子及自非光活化区域中的分子移除标签的步骤。
图20A为说明了用于自样品的非光活化区域中的分子移除标签的方法中的步骤。所述方法使用解链因子、链置换及链替代来移除标签。图20B及图20C为说明了图20A所示探针的改变版本的不同解链温度。不同解链温度有利于链置换及替代。
具体实施方式
本文描述了可用于识别、标注、获得及分析生物分子及其相邻生物分子的系统、组成物及方法。所述组成物及方法可特别用于分析生物样品中的生物分子相互作用，例如分析细胞或组织样品中的蛋白质、核酸、碳水化合物或脂质。所述组成物及方法利用光反应性及可裂解探针(例如，生物正交或可温和裂解或酶特异性裂解)，其可标记生物分子及其相邻生物分子，同时在很大程度上保持生物分子中天然存在的分子结构。本文所述的光反应性及可温和裂解探针可特别用于使用具有精确照明控制的影像引导显微镜(例如美国专利公开案第2018/0367717号中所述的系统)特异性标记细胞亚细胞区域中的生物分子亚群，以能够自动标记所关注细胞生物分子。探针可用于原位标注生物分子，例如细胞或组织内的蛋白质，且接着可进行标签转移或邻近标记，例如使用酪胺信号放大(TSA)。可通过例如质谱法及测序等分析技术进一步分析生物分子。这些探针可能特别适用于进行组学研究，例如基因组学、蛋白质组学及转录组学，以及寻找用于诊断及治疗中相关生物标志物。
缩写及定义
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸及合成氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物及氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是指由遗传密码编码的氨基酸，以及随后经修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸及O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，亦即与氢、羧基、氨基及R基团结合的α碳的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基硫。本文所述的氨基酸可经保守取代，只要保守取代的肽能够实现所需功能(例如经蛋白酶识别)。保守取代的实例包括Thr、Gly或Asn取代Ser及His、Lys、Glu、Gln取代Arg。保守取代描述于例如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第四版,Green及Sambrook编,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 2014以及其更正及更新)中。
术语“抗体”是指免疫球蛋白及相关分子，且包括单克隆抗体、多克隆抗体、单体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、仅重链抗体、三链抗体、单链Fv、纳米抗体等，且亦包括抗体片段。抗体可为多克隆的、单克隆的或重组抗体。抗体可为鼠类抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体或衍生自其他物种的抗体。如本文所用，当抗体或其他实体“特异性识别”或“特异性结合”抗原或表位时，其优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的抗原且以亲和力结合抗原或表位，所述亲和力显著高于不显示抗原或表位的其他实体。
术语“芳基”是指具有单环的芳环系统(例如，苯基或经取代的苯基)。所关注芳基包括但不限于衍生自以下的基团：醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、薁、苯、、蔻、荧蒽、芴、2,3,2',3'-蒽并蒽、己芬、己搭烯、二烯并苯、s-二环戊二烯并苯、茚满、茚、萘、稠八苯、辛芬、辛搭烯、卵苯、戊-2,4-二烯、并五苯、戊搭烯、戊芬、苝、非那烯、菲、苉、七曜烯、芘、吡蒽、荭、三亚苯、三萘及类似基团。在某些实施例中，芳基包括6至20个碳原子。在某些实施例中，芳基包括6至12个碳原子。芳基的实例为苯基及萘基。
术语“诱饵分子”是指与所关注分子特异性相互作用的分子，所关注分子可称为目标(或猎物)。诱饵分子的实例包括抗体、CLIP-标签、药物、核酸、荧光原位杂交(FISH)探针、蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G、蛋白A/G/L、另一小分子及SNAP-标签。
术语“结合”是指第一部分与第二部分物理相互作用，其中第一部分及第二部分彼此物理接触。
术语“生物正交”是指不干扰生物学或不与生物学相互作用(例如，对生物分子惰性)。
术语“生物正交反应”或“生物正交裂解反应”是指在生理相关条件下进行且与天然存在的官能基相容且通常具有快速动力学、对水性环境的耐受性及高选择性的反应。生物正交反应在是用以保持天然存在的分子结构，例如蛋白质折叠或三维结构的条件下进行。生物正交反应不会破坏内源性或样品蛋白质或肽中多肽链的不同区域之间的交联。例如，生物正交反应不会破坏天然存在的官能基中的共价键(例如，半胱氨酸侧链中的二硫键(-S-S-键))。生物正交裂解连接子或生物正交裂解探针中的裂解连接子是用以生物正交裂解，例如与使用酶或键特异性化学物质相容，所述酶或键特异性化学物质是用以生物正交地进行裂解而不破坏天然存在的官能基中的共价键。
术语“生物素衍生物”是指生物素部分，包括生物素及生物素的变体，例如具有开环或取代的生物素。通常，生物素衍生物可易于经生物素结合实体或蛋白质，例如抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素检测。
术语“催化报导子沉积”(CARD)是指可检测分子在目标生物分子(例如，碳水化合物、脂质、核酸或蛋白质)上或附近的酶催化沉积。在一些实施例中，酶催化沉积中的酶为辣根过氧化物酶(HRP)且可检测分子为酪胺或地高辛(DIG)。
术语“可裂解连接子键”是指是用以通过裂解试剂特异性裂解的可裂解连接子中的化学键。通常，可裂解连接子键是指单键；然而，在一些变体中，可裂解连接子键可指多于一条键，例如在可经核酸内切酶裂解的双键DNA可裂解连接子的情况下，其中两条DNA链经裂解。
术语“点击化学”是指易于接合分子构造区块的化学方法。通常，点击化学反应高效、高产、可靠、很少产生或不产生副产物，且与水性环境相容或无需添加溶剂。点击化学的一个实例为环加成，例如炔烃及叠氮化物的铜(I)催化的[3+2]-胡伊斯根(Huisgen)1,3-偶极环加成，形成1,2,3-三唑，或狄尔斯-阿德尔反应(Diels–Adler reaction)。点击化学亦包括无铜反应，例如使用经取代环辛炔的变体(参见例如Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2007年10月23日,104(43),16793-16797)。其他点击化学的实例为亲核取代；C-C多键加成(例如迈克尔加成(Michael addition)、环氧化、二羟基化、氮丙啶化)；及壬醛样化学反应(例如N-羟基琥珀酰亚胺活性酯偶合)。点击化学反应可为，但不一定为生物正交反应。
术语“结合”是指两个或更多个分子特异性相互作用(例如，共价或非共价)的过程。在一些实施例中，标签及标记结合。在一些实施例中，诱饵及可裂解探针结合。
术语“可结合”是指可与其可结合的另一分子特异性结合的分子。在一些实施例中，诱饵可与所关注生物分子结合。在一些实施例中，可裂解探针可与标记结合。
术语“可检测标记”是指直接或间接与分子结合或是用以直接或间接与分子结合的化合物或组成物。标记本身可为可检测的且为可直接检测的标记(例如荧光标记，例如荧光化学加合物、放射性同位素标记等)，或者标记可为间接可检测的(例如在酶可检测标记的情况下，酶可催化底物化合物或组成物的化学改变且反应产物为可检测的)。可检测标记的实例包括例如生物素标记、荧光标记、辣根过氧化物酶、免疫学可检测标记(例如血凝素(HA)标签、聚组氨酸标签)、另一发光标记及放射性标记。间接标记的一个实例为生物素，其可使用抗生蛋白链菌素检测方法来检测。
术语“酶促裂解反应”是指由酶介导的分子中的键的裂解或水解。通常，酶介导的反应会裂解共价键且形成更小的分子。
术语“免疫球蛋白-结合蛋白”是指免疫球蛋白结合细菌蛋白及免疫球蛋白结合细菌蛋白的变体。实例包括蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G及蛋白A/G/L。蛋白A及蛋白G为最初分别自金黄色葡萄球菌及G群链球菌中获得的细菌蛋白，且对IgG型抗体的Fc区具有高亲和力。蛋白A/G组合了蛋白A及蛋白G的结合域。蛋白A/G/L组合了蛋白A、蛋白G及蛋白L的结合域。免疫球蛋白-结合蛋白与抗体的特定域结合。
术语“说明材料”包括出版物、记录、图表、链接或任何其他表达媒介，其可用于传达本发明的一或多种组成物对其指定用途的有用性。例如，本发明的试剂盒的说明材料可贴在含有组成物或组分的容器上，或与含有组成物或组分的容器一起运输。或者，说明材料可与容器分开运输，目的为让接收者协同使用说明材料及组成物或组分。
术语“标记”是指产生或可经诱导以产生可检测信号的分子。在一些实施例中，标记产生用于检测相邻生物分子的信号。可使用的标记的实例包括抗生物素蛋白标记、中性抗生物素蛋白标记、抗生蛋白链菌素标记以检测生物素标签。
术语“连接子”是指连接两个或更多个子结构的结构。连接子具有在子结构之间延伸的至少一条不间断原子链。连接子的原子通过化学键、通常是共价键而连接。
术语“光活化弹头”是指具有光活化部分的基团。光活化弹头的实例包括芳基叠氮化物、二苯甲酮及二氮丙啶。一旦活化，光活化弹头可结合至结合搭配物。
术语“质谱仪”是指用于测量样品中一或多个分子的质荷比的仪器。质谱仪通常包括离子源及质量分析仪。质谱仪的实例包括基质辅助雷射解吸电离(MALDI)、连续或脉冲电喷雾(ES)电离、离子喷雾、扇形磁场、热喷雾、飞行时间及大规模集群轰击质谱。
术语“质谱法”是指使用质谱仪来检测气相离子。
术语“质谱分析”包括线性飞行时间(TOF)、反射器飞行时间、单四重、多四重、单扇形磁场、多扇形磁场、傅立叶变换、离子回旋共振(ICR)或离子阱。
术语“解链温度”或核酸的Tm是指50％的双链核酸变为单链核酸时的温度。
术语“光活化(photoactivated)”或“光活化(light activated)”是指通过辐射能(例如通过特定波长或波长范围的光、UV光等)激发原子。在一些实例中，光活化分子与另一分子或紧邻的其自身的另一部分形成共价键。
术语“肽”是指其中单体为氨基酸且单体通过酰胺键接合在一起的聚合物。肽的长度通常为至少2个、至少5个、至少10个、至少20个、至少50个、至少100个或至少500个或更多个氨基酸。
术语分子的“一级序列”是指构成分子一级结构的单元的线性序列。核酸的“一级序列”是指构成核酸一级结构的核苷酸的线性序列。
术语“光反应性基团”是指功能部分，其在暴露于光(例如，特定波长或波长范围的光、UV光等)时被活化。光反应性基团通常与其紧邻的分子形成共价键。
术语“邻近分子”或相邻分子是指靠近另一分子的分子。邻近分子或相邻分子可与分子结合或相互作用(例如，共价或非共价)或可靠近分子且不与分子共价结合。
术语“猎物”是指诱饵分子的结合搭配物。例如，若抗体为诱饵，则诱饵分子可结合的对应蛋白质为对应猎物。在一些实施例中，诱饵可与单个猎物结合。在一些实施例中，诱饵可与超过一个猎物结合。
术语“蛋白质标签”是指氨基酸的肽序列。蛋白质标签通常可与标记结合。蛋白质标签的实例为“自标记”标签。自标记标签的实例包括BL-标签、CLIP-标签、共价TMP-标签、HALO-标签及SNAP-标签。SNAP-标签是一种约20kDa的DNA修复蛋白O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶变体，其可特异性识别芐基鸟嘌呤(BG)衍生物且与所述衍生物快速反应。在标记反应期间，芐基部分与SNAP-标签共价附接，释放鸟嘌呤。CLIP-标签为SNAP-标签的变体，其是用以与O2-芐基胞嘧啶(BC)衍生物而非芐基鸟嘌呤(BG)发生特异性反应。
术语“小分子”是指低分子量分子，包括碳水化合物、药物、酶抑制剂、脂质、代谢物、单糖、天然产物、核酸、肽、肽模拟物、第二信使、有机小分子及外源性物质。通常，小分子小于约1000分子量或小于约500分子量。
术语“标签”是指可实现目标分子检测的官能基、化合物、分子、取代基及类似物。标签可实现可检测的生物或理化信号，所述信号允许经由任何方式进行检测，例如吸光度、化学发光、比色法、荧光、发光、磁共振、磷光、放射性。由于标签部分(例如，荧光团标签)的生化或理化特性而可直接检测到由于标签而提供的可检测信号，或由于标签与另一化合物或试剂的相互作用而可间接检测到所述可检测信号。通常，标签为小官能基或小有机化合物。在一些实施例中，所采用的标签具有小于约1,000Da、750Da、500Da或甚至更小的分子量。
术语“标注”是指将标签添加至官能基、化合物、分子、取代基及类似物的过程。通常，标注实现目标分子检测。
术语“酪胺信号放大”(TSA)是指催化报导子沉积(CARD)，一种酶介导的检测方法，所述方法利用酶(例如辣根过氧化物酶)的催化活性将无活性的酪胺催化为高活性的酪胺。放大可在低浓度过氧化氢(H2O2)的存在下进行。在一些实例中，酪胺可用可检测标记，例如荧光团(例如生物素或2,4-二硝基苯酚(DNP))进行标记。
除非另有说明，否则本文所述技术的实践可采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学、分子生物学(包括细胞培养、重组技术、测序技术)及有机化学技术的习知技术及描述，其在所述领域的文献中进行了解释(例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第四版,Green及Sambrook编,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor 2014以及其更正及更新；John D.Roberts及Marjorie C.Caserio(1977)BasicPrinciples of Organic Chemistry,第二版.W.A.Benjamin,Inc.,Menlo Park,CA.)。
组成物
本文描述物质组成物，包括光反应性及可裂解探针(例如，生物正交或可温和裂解探针)。光反应性及可裂解探针可有利地与显微镜系统，例如本文及美国专利公开案第2018/0367717 A1号中所述的系统一起使用，以实现对所关注生物分子近端的细胞生物分子的自动标记。标记的分子可与所关注生物分子相邻，或者可靠近但不相邻，例如当介入分子位于所关注生物分子与用于捕获或分析的细胞生物分子之间时。靠近但不与所关注分子相邻的分子可为细胞结构的一部分或以其他方式有助于所关注细胞微环境。图1显示了可用于光选择性空间标注及标记的系统的示意图。图1的底部显示了基板406，例如显微镜载物台，以及置于基板上的多个细胞408的单层。在一些实施例中，可使用自动化显微镜系统分析整个基板或基板的一部分的表面以识别所关注区域。例如，可对样品进行染色或标记以识别所关注区域。图1的顶部显示了细胞408a的放大图，所述细胞为多个细胞408中的一个。细胞408a具有细胞核416及多种不同类型的胞器412，例如细胞膜、线粒体、核糖体及液泡。显微镜系统402选择性地将窄带光404照射至所关注区域(ROI)418上以分析所关注区域418。照明可为选择性的，且细胞及基板的大区域414不被照明。如下文更详细解释的，窄带光404仅在所关注区域418中活化光反应性及可温和裂解探针。
图2A示意性地说明多功能探针205(除非具体上下文另有说明，否则在本文中亦可互换地称为多功能光反应性及可裂解探针、光反应性及可裂解探针或探针)。图2A显示多功能探针205具有多价核心230，其具有多个附接位点：第一附接位点232、第二附接位点234及第三附接位点236。图2A的多功能探针具有附接至第一附接位点232的标签201(圆形)、附接至第二附接位点234的可裂解连接子203(矩形)及附接至第三附接位点236的光活化弹头202(三角形)，从而形成三价及三功能探针。诱饵分子204(圆角正方形)附接至可裂解连接子203。图2B显示了标记系统240的实例，所述标记系统可与图2B中所示的多功能探针205一起使用以标记与所关注目标生物分子相邻的生物分子。标记系统240包括用标记206及酶或催化剂207以及酶/催化剂底物218标记复合物208。在一些实施例中，标记206为中性抗生物素蛋白且酶或催化剂207为过氧化物酶且利用过氧化物(未显示)实现活性。在此实例中，标签201及标记206相互识别及结合。酶或催化剂207活化酶/催化剂底物218，且一旦活化，活化的酶/催化剂底物218便可结合且可检测地标记其附近的生物分子。
图2C显示了使用本文所述的多功能光反应性及可裂解探针标记所关注小区域(ROI)中的生物分子，比较直接光化学标记与光辅助酶促标记的结果的示意图。图2B显示了使用本文所述的探针及系统在具有生物分子(A)的样本上的直接光化学标记(顶部，标记的过程B)及光辅助酶标记(底部，标记的过程C)的比较。在执行过程B或过程C之前，分析包含所关注生物分子210的样品(例如，细胞或组织样品)(此处将使用蛋白质作为举例，但可替代地分析其他生物分子)，且识别所关注区域。样品可进行预处理，例如固定及染色。例如，样品可经固定且用细胞染色剂(例如苏木精及伊红(H&E)；马森(Masson)三色染色剂)染色，用识别所关注蛋白质的免疫荧光标记抗体或通过其他方法进行识别。一旦识别了所关注区域，便分析所关注区域内的相邻生物分子的复合物。如过程B中所说明，用直接光反应性探针212处理样品且将图案化的光引导至样品且活化直接光反应性探针212以形成经活化直接光反应性探针212’。经活化直接光反应性探针212’能够与附近的其他分子形成复合物(由过程B中的虚线圆圈示出。经活化直接光反应性探针212’可扩散及标记所关注分子210附近的相邻分子211，经活化直接光反应性探针212a与相邻分子211连接。然而，光反应性探针直接光活化的标记直径(300-600nm)在空间上受到所用光源的绕射极限的限制。另外，由于光反应性探针可自由扩散，因此图案化的光路径中的任何蛋白质可经标记。过程B亦显示其标记更远的生物分子231。通过经活化直接光反应性探针212’标记的区域，或标记的精确度覆盖约300-600nm的区域。此区域可包括不紧邻所关注蛋白质的生物分子，且在一些情况下可导致混淆、误导或无益的结果。
相反地，在图2C底部所示的过程C中，与识别所关注生物分子的诱饵分子预结合的多功能探针205(参见图2A)递送至基板209上的样品。如步骤1中所说明，图案化的光亦导引至样品。然而，在此处，图案化的光活化了与附近的分子或部分结合的光活化弹头202。除了导引有限活化区域的光的外，光活化弹头亦受到其与探针205的附接的限制，且光活化弹头变为附接至所关注生物分子。附接的探针205a现与所关注生物分子双交联(或与其接近)。图2C亦显示步骤2裂解，且可裂解连接子203经裂解，例如若可裂解连接物为可裂解肽连接子，则添加蛋白酶。步骤1及步骤2亦显示如何使用本文所述的探针及方法减少背景或不需要的标记。在步骤1中，探针205’附接至生物分子上；然而，由于探针205’在光传输区域的外，因此光活化弹头202未被活化，且不会与所关注生物分子结合。在步骤2中，探针205’被裂解成两部分，片段205frag未结合且在洗涤步骤中被洗掉，且片段205df因标签201的移除而断开(其作为未结合片段205frag的一部分被洗掉)。探针片段205df或205frag均不能标记任何生物分子。探针205b经裂解，但通过双交联保持附接至所关注生物分子。在一些变化形式中，探针205可与诱饵分子或另一近端生物分子交联；但是，原理保持不变。探针205b含有标签201以标记相邻分子，如下文更详细解释。
标记系统240包括用标记206及酶或催化剂207以及酶/催化剂底物218标记复合物208。
用洗涤溶液洗去多余的探针，且经由如上所述的位点特异性裂解移除单交联探针(例如，在不发光的区域中)。步骤3及4显示了使用图2中所示的标记系统240对所关注分子210附近的分子进行标记。亦可使用其他标记系统。例如，复合物208与标签201结合，酶或催化剂207将酶/催化剂底物218活化为活化的酶/催化剂底物218’，酶/催化剂底物218”接合于相邻分子211。由于探针205b附接至所关注分子210，相邻分子211经标记，而更远的分子231未经标记。本文所述的可裂解连接子可使标记能够自探针转移至<10nm半径(指三功能(多功能)探针的半径大小)内的相邻分子。
通过光选择性地将酶或催化剂207，例如过氧化物酶定位于所关注分子附近且使用刚刚描述的标注及标记来标记所关注区域中的相邻分子211，偶联反应可定位至小至<100nm的区域。在一些变化形式中，可标记更大的区域(例如，至多约200nm、至多约300nm、至多约400nm)。此外，样品中的一些所关注分子具有多于一个定位区域，且因此同时与不同位置的不同分子复合物相互作用。光辅助标签转移(例如，标记相邻分子)可在多于一个位置连续使用。例如，在如图2C过程C所示地施加光且如所指示地标记相邻分子之后，可将光选择性地施加至样品中的第二(第三、第四等)位置，且此过程可根据需要重复多次。除了在样品的极小区域中对相对少量的相邻分子进行标记(沉积标记)，例如由于使用显微镜分析来导引本文所述的光及探针，且如下所述，所述过程亦可通过足够温和或柔和的处理进行，以使细胞架构保持完整(例如，反应亦为生物正交的)。
图3A及图3B示意性地说明了使用如本文所述的多功能光反应性及可裂解探针及温和裂解条件(图3B)与使用具有苛刻裂解反应的探针的结果(图3A)相比对蛋白质结构的影响。在温和裂解条件下，保留蛋白质结构，且反应是生物正交，而在苛刻裂解条件下，蛋白质变性且反应是非生物正交。图3A示意性地说明了相对苛刻的裂解，例如通过在裂解反应中使用还原剂，例如参(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)介导的裂解。除了裂解连接子外，TCEP或DTT亦破坏其他二硫键，包括蛋白质中半胱氨酸氨基酸之间常见的天然共价二硫键，从而使蛋白质变性。据估计，细胞中超过90％的蛋白质含有至少一个半胱氨酸氨基酸，且真核蛋白质组中约三分之一的蛋白质形成二硫键。因此，对样品进行相对苛刻的裂解以破坏二硫键可能会显著破坏蛋白质结构，破坏整体细胞架构，且改变天然存在的生物分子相互作用。裂解反应可视为非生物正交反应。在一些实施例中，生物正交反应保留了源自活生物体(例如，源自真核生物)的结构且排除了对例如病毒的非生物实体结构的考虑。
图4B示意性地说明了与本文所述的多功能探针一起使用的相对温和的裂解反应。裂解反应使用更温和的试剂(例如酶或连接子特异性化学品)来裂解可裂解连接子。在一些实施例中，温和裂解试剂为基本上特异性的。换言之，其基本上及特异性地结合且裂解所关注目标(例如可裂解连接子)，而基本上不结合或裂解其他分子(例如少于1％的时间、少于0.1％的时间等)。在一些实施例中，温和裂解试剂用于裂解其他键，例如C-C键，且使例如二硫键(-S-S-)等键保持完整。如图3B中所说明，由二硫键介导的蛋白质的三维结构在如本文所述的温和裂解后保持完整。由于例如与所关注蛋白质相邻的天然存在的相邻分子的标注及邻近标记取决于相邻分子与所关注蛋白质的相对接近度，因此维持生物分子的三维结构及整体细胞架构可更准确地标注及标记相邻分子，减少温和裂解反应中的假阳性及假阴性。温和裂解反应可为生物正交，因为其基本上不会破坏天然存在的蛋白质结构或细胞架构。
图4A至4K显示了可用于本文所述的光反应性及可裂解探针中的标签的实例。标签是用以与可检测标记相互作用，以标记与所关注目标分子相邻的生物分子。图4A至图4E显示了可与探针一起使用的点击化学标签的实例。点击化学标签可为例如叠氮化物部分或炔烃部分。图4F至4H显示了可与探针标签一起使用的生物素衍生物的实例。图4I显示了地高辛基团标签。图4J显示了肽标签。特定而言，图4J显示了具有6个组氨酸的聚His标签(SEQID NO:1)。然而，组氨酸标签可替代更少或更多的组氨酸，例如5个或7-10个或更多个。图4K显示了SNAP-标签。图6K显示了SNAP-标签且亦可使用CLIP-标签或HaloTag。
图5A至5E显示了可用于本文所述的光反应性及可裂解探针的位点特异性可裂解连接子的实例。图5A显示了偶氮苯基团。偶氮苯连接子可在裂解步骤中经裂解，例如用连二亚硫酸钠或偶氮还原酶。图5B显示了硼酸酯基团。硼酸酯可裂解连接子可用亚硫酰氯及吡啶裂解。图5C显示了Dde基团。Dde可裂解连接子可使用酶或简单的小分子进行裂解。图5D显示了DNA寡聚体可裂解连接子及可替代使用的其他核酸分子。DNA寡聚体可使用限制酶、核酸酶或使用互补寡聚体的竞争方法来裂解，其取决于所标记的分子。图5E显示了肽基团连接子，且肽基团连接子在下文参看图10A至图10Q更详细地论述。肽连接子可在裂解步骤期间使用蛋白酶进行裂解。在一些实施例中，位点特异性可裂解连接子可与诱饵分子结合。例如，与诱饵分子，例如NHS-酯结合的连接子可与蛋白质诱饵，例如抗体结合。可出于各种原因，例如成本或裂解效率来选择特定裂解连接子及相关裂解试剂。
图6A至6E显示了可用于本文所述的光反应性及可裂解探针中以与样品中的所关注分子结合的诱饵分子的实例。图6A显示了可用作诱饵分子的抗体。可使用任何时间的抗体。图6B显示了可用作诱饵分子的核酸基团，例如荧光原位杂交探针(FISH探针)。图6C显示了可用作诱饵分子的功能性蛋白质的示意图。功能性蛋白质的实例包括蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或蛋白质药物。可用于本文所述的光反应性及可裂解探针的其他诱饵分子包括生物药物。可用作诱饵的生物药物的实例包括阿巴西普(abatacept、Orencia)；阿昔单抗(abciximab、ReoPro)；阿波毒素A(abobotulinumtoxinA、Dysport)；阿达木单抗(adalimumab、Humira)；阿达木单抗-阿托(adalimumab-atto、Amjevita)；阿多-曲妥珠单抗恩坦新(ado-trastuzumab emtansine、Kadcyla)；阿柏西普(aflibercept、Eylea)；阿加糖酶β(agalsidase beta、Fabrazyme)；阿比鲁肽(albiglutide、Tanzeum)；阿地介白素(aldesleukin、原介白素)；阿仑单抗(alemtuzumab、Campath，Lemtrada)；阿糖苷酶α(alglucosidase alfa、Myozyme，Lumizyme)；阿莫罗布单抗(alirocumab、Praluent)；阿替普酶(alteplase)，cathflo活化酶(Activase)；阿那白滞素(anakinra、Kineret)；阿司福酶α(asfotase alfa、Strensiq)；天冬酰胺酶(Elspar)；天冬酰胺酶菊欧文氏菌(erwiniachrysanthemi、Erwinaze)；阿特珠单抗(atezolizumab、Tecentriq)；巴西利昔单抗(basiliximab、Simulect)；贝卡普勒明(becaplermin、Regranex)；贝拉西普(belatacept、Nulojix)；贝利木单抗(belimumab、Benlysta)；贝伐单抗(bevacizumab、Avastin)；贝洛托舒单抗(bezlotoxumab、Zinplava)；博纳吐单抗(blinatumomab、Blincyto)；维布妥昔单抗(brentuximab vedotin、Adcetris)；卡那单抗(canakinumab、Ilaris)；卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide、ProstaScint)；赛妥珠单抗(certolizumab pegol、Cimzia)；西妥昔单抗(cetuximab、Erbitux)；胶原酶(Santyl)；溶组织梭菌胶原酶(Xiaflex)；达珠单抗(daclizumab、Zenapax)；达珠单抗(Zinbryta)；达雷妥尤单抗(daratumumab、Darzalex)；达贝泊汀α(darbepoetin alfa、Aranesp)；地尼介白素(denileukin diftitox、Ontak)；地诺单抗(denosumab、Prolia，Xgeva)；地努妥昔单抗(dinutuximab、Unituxin)；链球菌DNA酶α(dornase alfa、Pulmozyme)；度拉糖肽(dulaglutide、Trulicity)；艾卡拉肽(ecallantide、Kalbitor)；依库珠单抗(eculizumab、Soliris)；依洛硫酸酯酶α(elosulfase alfa、Vimizim)；埃罗妥珠单抗(elotuzumab、Empliciti)；依泊汀α(epoetinalfa、Epogen/Procrit)；依那西普(etanercept、Enbrel)；依那西普-szzs(Erelzi)；依洛尤单抗(evolocumab、Repatha)；非格司亭(filgrastim、Neupogen)；非格司亭-sndz(Zarxio)；促卵泡素α(Gonal f)；加硫酶(galsulfase、Naglazyme)；谷卡匹酶(glucarpidase、Voraxaze)；戈利木单抗(golimumab、Simponi)；戈利木单抗(golimumab)注射液(SimponiAria)；替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan、Zevalin)；艾达赛珠单抗(idarucizumab、Praxbind)；艾杜硫酶(idursulfase、Elaprase)；inco肉毒素A(incobotulinumtoxinA、Xeomin)；英夫利昔单抗(infliximab、Remicade)；英夫利昔单抗-dyyb(Inflectra)；干扰素α-2b(内含子A)；干扰素α-n3(Alferon N Injection)；干扰素β-1a(Avonex，Rebif)；干扰素β-1b(Betaseron，Extavia)；干扰素γ-1b(Actimmune)；易普利姆玛(ipilimumab、Yervoy)；依奇珠单抗(ixekizumab、Taltz)；拉罗尼酶(laronidase、Aldurazyme)；美泊利单抗(mepolizumab、Nucala)；甲氧基聚乙二醇-依泊汀β(Mircera)；美曲普汀(metreleptin、Myalept)；那他珠单抗(natalizumab、Tysabri)；耐昔妥珠单抗(necitumumab、Portrazza)；纳武单抗(nivolumab、Opdivo)；奥比妥昔单抗(obiltoxaximab、Anthim)；奥比妥珠单抗(obinutuzumab、Gazyva)；奥克纤溶酶(ocriplasmin、Jetrea)；奥法木单抗(ofatumumab、Arzerra)；奥拉单抗(olaratumab、Lartruvo)；奥马珠单抗(omalizumab、Xolair)；肉毒杆菌毒素A(Botox)；奥普瑞介白素(oprelvekin、Neumega)；帕利夫明(palifermin、Kepivance)；帕利珠单抗(palivizumab、Synagis)；帕尼单抗(panitumumab、Vectibix)；甲状旁腺激素(Natpara)；培门冬酰胺酶(Oncaspar)；培非格司亭(pegfilgrastim、Neulasta)；聚乙二醇干扰素α-2a(Pegasys)；聚乙二醇干扰素α-2b(PegIntron,Sylatron)；聚乙二醇干扰素β-1a(Plegridy)；培戈洛酶(pegloticase、Krystexxa)；派姆单抗(pembrolizumab、Keytruda)；帕妥珠单抗(pertuzumab、Perjeta)；雷莫芦单抗(ramucirumab、Cyramza)；雷珠单抗(ranibizumab、Lucentis)；拉布立酶(rasburicase、Elitek)；雷昔库单抗瑞利珠单抗(raxibacumabreslizumab、Cinqair)；瑞替普酶(reteplase、Retavase)；利洛纳塞(rilonacept、Arcalyst)；rima肉毒素B(rimabotulinumtoxinB、Myobloc)；利妥昔单抗(rituximab、Rituxan)；罗米司亭(romiplostim、Nplate)；沙格司亭(sargramostim、Leukine)；塞贝利酶α(sebelipase alfa、Kanuma)；苏金单抗(secukinumab、Cosentyx)；西妥昔单抗(siltuximab、Sylvant)；tbo-非格司亭(filgrastim、Granix)；替奈普酶(tenecteplase、TNKase)；托珠单抗(tocilizumab、Actemra)；曲妥珠单抗(trastuzumab、Herceptin)；优特克单抗(ustekinumab、Stelara)；维多珠单抗(vedolizumab、Entyvio)；齐夫-阿柏西普(ziv-aflibercept、Zaltrap)。
图6D亦显示了可用作诱饵分子的小分子/药物。例如，显示了厄洛替尼(erlotinib)。图6E显示了CLIP-标签及可使用自标记部分的其他成员(例如HaloTag或SNAP-Tag)。
图7A至7I显示了可用于本文所述的光反应性及可裂解探针中的光活性弹头的实例。图7A显示了二苯甲酮光活性弹头，其可通过单光子激发的320-365nm UV-A照射或双光子激发的720-800nm的UV-A照射来活化。图7B、7C及7D显示了基于芳基叠氮化物的弹头，其可通过单光子激发的250-365nm照射或双光子激发的800nm照射来活化。图7B显示了苯基叠氮化物光活性弹头。图7C显示了四氟苯基叠氮化物光活性弹头。图7D显示了羟苯基叠氮化物光活性弹头。图7E显示了二氮丙啶光活性弹头。图7F显示了三氟甲基苯基二氮丙啶光活性弹头。图7G显示了核碱基特异性的3-氰基乙烯基咔唑核苷(CNVK)光活性弹头。图7H显示了亦为核碱基特异性的补骨脂素光活性弹头。补骨脂素与DNA或RNA反应形成共价加合物。在一些实施例中，补骨脂素光活性弹头可由长波长US光(例如，UVA，310-400nm)活化。图7I显示了依赖于催化剂的苯氧基自由基捕集剂光活性弹头。特定光活化弹头的选择可取决于所需波长及诱饵分子的类型。例如，可选择多功能探针的成分及用于预探针分析的成分，以便彼此不干扰(或干扰最小)。
图8A至8G显示了可用作本文所述的光反应性及可裂解探针中的连接子的连接子的其他实例。图8A显示了BCN-NHS连接子。图8B显示了DBCO-NHS连接子。图8C显示了炔烃-NHS连接子。图8D显示了DBCO-PEG3-NHS连接子。图8E显示了炔烃-PEG5-NHS连接子。图8F显示叠氮基-PEG4-NHS连接子。图8G显示了叠氮丁酸-NHS连接子。
图9A至9G显示了可用于组成物中且用于实施本文所述方法的光反应性及可裂解探针的实例。探针具有带有多个附接位点的多价核心。一个标签、一个可裂解连接子及一个光活化弹头与探针上的附接位点结合。在一些实施例中，多价核心包括式(I)的基团。在一些实施例中，n为1、2、3、4、5或6。在一些实施例中，R1及R2各自独立地为氢、经取代的烷基、经取代的烯基、经取代的炔基、经取代的碳环基、经取代的杂环基、经取代的芳基、经取代的杂芳基或氮保护基团。在一些实施例中，R3及R4中的一者为－(CH2)x(OCH2CH2)y(CH2)zNR5R6，另一者为附接位点，其中x为1、2、3、4、5或6；y为1、2、3、4、5或6；z为0、1、2、3、4、5或6；且R5及R6中的一者为附接位点，且另一者为氢、经取代的烷基、经取代的烯基、经取代的炔基、经取代的碳环基、经取代的杂环基、经取代的芳基、经取代的杂芳基或氮保护基。
图10A至10B示意性地说明了基于肽的光反应性及可裂解探针。这些探针具有可经肽裂解试剂裂解的可裂解区域221，例如经识别特定肽序列的蛋白酶裂解，且肽区域是可特异性裂解的(例如经蛋白酶裂解)。图10A显示了基于肽的探针224的实例，所述探针在肽区域的N末端具有标签201及光活化弹头202。图10B显示了基于肽的探针225的实例，所述探针在肽区域的C末端具有标签201及弹头202。图10A及10B亦显示了具有额外柔性连接子222(本文中亦称为间隔子)及视情况选用的可点击氨基酸223的探针。图10C至10I显示了可与图10A及10B中所示的探针一起使用的反应性或可点击氨基酸的实例。图10C显示了叠氮丙氨酸可点击氨基酸。图10D显示了叠氮赖氨酸可点击氨基酸。图10E显示炔丙基甘氨酸可点击氨基酸。图10F显示了半胱氨酸可点击氨基酸。图10G显示了NHS活化的C末端可点击氨基酸。图10H显示了NHS活化的天冬氨酸可点击氨基酸。图10I显示了NHS活化的谷氨酸。
图10J至10Q显示了图10A及10B中示意性说明的基于肽的光反应性及可裂解探针的实例。指示了人类鼻病毒3C(HRV 3C)蛋白酶(方格箭头)、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶(条纹箭头)及凝血酶(虚线箭头)的裂解位点。可蛋白水解裂解的肽序列可在裂解步骤期间经蛋白酶特异性裂解。可与本文所述的探针一起使用的可蛋白水解裂解的肽序列的实例包括由活化的凝血因子X肠肽酶(本文中亦称为因子X肠肽酶或因子Xa)、人类鼻病毒(HRV)3C蛋白酶、凝血酶及烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶识别的那些。在这些蛋白酶中，因子Xa及凝血酶天然存在于血液中。这些蛋白酶可识别及裂解细胞或细胞提取物中的蛋白质，而非基于肽的探针的可蛋白水解裂解的肽序列。尽管在一些情况下，此可扰乱样品中天然存在的蛋白质环境且导致一些分析中产生误导或人为的结果，但亦应注意，这些裂解反应的数量可能会受到足够的限制，以便对某些目的或在某些情况下适用。不干扰天然存在的生物分子(例如，细胞或组织样品中的天然存在的蛋白质)的裂解反应视为生物正交的，且在保持天然存在的蛋白质结构的情况下可裂解的探针可视为具有生物正交可裂解肽序列的生物正交可裂解探针。如上所论述，虽然磺基-SBED探针可与本文所述的某些方法一起用于特定应用，但在其他实施例中，磺基-SBED探针用二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙醇裂解以裂解其S-S键亦不利地破坏天然存在的蛋白质(例如，其为非生物正交的)。
肠激酶识别以裂解肽序列DDDDK|(SEQ ID NO:2)，其中裂解发生于赖氨酸之后的连接子键。
因子Xa识别以裂解肽序列LVPR|GS(SEQ ID NO:3)，其中裂解发生于精氨酸与甘氨酸之间的连接子键。
人类鼻病毒(HRV)3C蛋白酶识别以裂解肽序列LEVLFQ|GP(SEQ ID NO:4)，其中裂解发生于谷氨酰胺与甘氨酸之间的连接子键。
TEV蛋白酶优偏好裂解序列ENLYFQ|S(SEQ ID NO:5)，其中裂解发生于谷氨酰胺与丝氨酸之间的连接子键。TEV蛋白酶亦可识别序列ENLYFQ|G(SEQ ID NO:6)用于裂解，其中裂解发生于谷氨酰胺与甘氨酸之间的连接子键之间。
凝血酶识别以裂解肽序列LVPR|GS(SEQ ID NO:7)，其中裂解发生于精氨酸与甘氨酸之间的连接子键。
除了用于蛋白水解的特异性识别序列的外，肽部分亦可含有额外氨基酸。光反应性及可裂解探针可具有C末端或N末端标签(例如生物素化)。
图10J显示了C-HRV3C预结合肽探针，其具有HRV 3C可蛋白水解裂解的肽序列GRRRYLEVLFQGP(SEQ ID NO:8)。
图10K显示了N-HRV3C预结合肽探针，其具有HRV 3C蛋白酶切割位点肽序列LEVLFQGPYRRRG(SEQ ID NO:9)。
图10L显示了N-TEV预结合肽探针，其具有TEV蛋白酶切割位点肽序列ENLYFQGGGGS(SEQ ID NO:10)。
图10M显示了N-凝血酶预结合肽探针，其具有凝血酶蛋白酶切割位点肽序列LVPRGSYRRRG(SEQ ID NO:11)。
图10N显示了SN-凝血酶结合肽探针，其具有凝血酶蛋白酶切割位点肽序列LVPRGS(SEQ ID NO:12)。
图10O显示了PN-HRV3C结合肽探针，其具有HRV 3C蛋白酶切割位点肽序列LEVLFQGPGGGGS(SEQ ID NO:13)。
图10P显示了PN-TEV结合肽探针，其具有TEV蛋白酶切割位点肽序列ENLYFQGGYRRRG(SEQ ID NO:14)。
图10Q显示了C-TEV结合肽探针，其具有TEV蛋白酶切割位点肽序列GGGGSYENLYFQG(SEQ ID NO:15)。
如上所述，一些探针包括柔性连接子(在本文中亦称为间隔子)。柔性连接子为柔性分子或分子延伸段，用于将两个分子或部分连接在一起。连接子可由柔性基团构成，以便相邻域可相对于另一者自由移动。柔性连接子可包括柔性氨基酸残基，例如甘氨酸(G)或丝氨酸(S)。柔性连接子亦可包括苏氨酸(T)及丙氨酸(A)残基。一串氨基酸可在连接子中重复。例如，连接子可包括一段甘氨酸残基，后跟丝氨酸残基，例如形成(GGGGS)n寡聚体，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或更大，且GGGGS模体是重复的。柔性连接子亦可包括烷基，例如聚乙二醇(CH2CH2O)m连接子，其中m为1至50，或2-30，或3-6。聚合柔性连接子的其他实例包括聚丙二醇、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺及聚酯。柔性连接子可为链中至少一或两个原子的线性分子，且可包括更多原子。
图11A至11D说明了合成本文所述的光反应性及可裂解探针的方法。所述方法产生带有标签、可裂解连接子及光活化弹头的探针。所述图亦说明了诱饵分子可结合的区域。三功能分子探针可通过使用市售分子作为构造块及常规合成步骤来合成。用于合成探针的图11A至11D中所示的流程是作为实例给出，且不用于限制目的。图11A显示了探针1的合成流程。图11B显示了探针2的合成流程。图11C显示了探针7的合成流程。图11D显示了N-TEV探针的合成流程。
一些实施例提供了一种光反应性及可裂解探针，其包括包含多个附接位点的多价核心。一些实施例提供了与一个附接位点结合的标签，其中所述标签是用以与标记结合。一些实施例提供了与第二附接位点结合且是用以连接诱饵分子的可裂解连接子，其中所述可裂解连接子包括肽序列。
一些实施例提供了与三分之一的附接位点结合的光活化弹头，其中多价核心包括式(II)或(III)的基团：
(II)
(III)
其中m、r及q各自独立地为1、2、3、4、5或6；其中*包含用于可裂解连接子的多个附接位点的一的连接位点，其中**包括用于标签或光反应弹头之一的多个附接位点中的不同附接位点；其中***分别包括用于光活化弹头或标签的多个附接位点中的不同附接位点，且R7、R8、R9、R10、R11及R12各自独立地为氢、视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环基、视情况经取代的杂环基、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂芳基或氮保护基。
在光反应性及可裂解探针的一些实施例中，其中**包括标签的附接位点，且***包括光活化弹头的附接位点。
在光反应性及可裂解探针的一些实施例中，肽序列包括蛋白酶识别序列。
在光反应性及可裂解探针的一些实施例中，其中肽序列包含人类鼻病毒3C(HRV3C)蛋白酶识别序列、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶识别序列或凝血酶识别序列。
在光反应性及可裂解探针的一些实施例中，可裂解连接子进一步包括可结合氨基酸。
在光反应性及可裂解探针的一些实施例中，可裂解连接子进一步包括半胱氨酸或可点击氨基酸氨基酸。
在光反应性及可裂解探针的一些实施例中，可裂解连接子包含具有叠氮基或炔烃基团的可点击氨基酸。
图12A示意性地说明了与抗体诱饵结合的光反应性及可裂解探针。图12B及图12C示意性地说明了使用与抗体诱饵结合的光反应性及可裂解探针对分子进行光选择性标注，以标记细胞核仁中的蛋白质的反应流程。图12B说明了反应如何使用受控光进行。图12B亦说明了可裂解探针如何经裂解以减少非照明区域中的背景。图12B中所示的反应与图2C中所示的反应类似，不同之处在于诱饵分子204为抗体244且探针255包括抗体244作为诱饵。当探针255’的光活化弹头经活化时，其结合至诱饵/抗体244，而非细胞分子，光选区内的探针255’被裂解成片段255a及断开的探针片段255df。然而，探针255仍保留在所关注蛋白质附近，在此情况下为细胞246的细胞核250中的核仁247中的核仁素。在裂解步骤期间，光选区外的探针255仍被裂解成片段255frag及断开的探针片段255df，其在洗涤步骤中被洗掉。图12D显示了使用图12A及图12B中所示的反应流程的结果。核仁蛋白在存在光的情况下经特异性标记(上图及右图)，但在不存在光的情况下未经标记(下图)。与诱饵分子连接的探针经由光活化选择性保留，接着裂解且与酶(例如此实例中的HRP)结合，用于以约10nm至约100nm的半径进行空间标记，具体取决于所用的特定酶及反应时间。在所述方法的一些实施例中，选择性地照明包括照明由点扩散函数定义的区域。
基于核酸的探针
本文亦提供了具有光活化弹头的基于核酸的探针。这些探针可用于对生物样品中的生物分子进行光选择性标注及标记。这些探针可使用核酸链置换来允许选择性地标记生物分子的子集。图16A显示基于核酸的探针365。探针365包括锚定链376；探测链378；探测链378上的标签201，其是用以与可检测标记(包括如本文他处所述)结合；以及锚定链376上的诱饵附接位点382。探测链378与锚定链376部分互补，且与锚定链376沿互补序列形成双链结构。锚定链可与探测链连续互补且沿着锚定链或探测链的整个长度互补。在一些实施例中，锚定链及探测链可具有1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、11个核苷酸至15个核苷酸、16个核苷酸至20个核苷酸、21个核苷酸至25个核苷酸、26个核苷酸至30个核苷酸、31个核苷酸至40个核苷酸、41个核苷酸至50个核苷酸或51个核苷酸至100个核苷酸的互补区域。在一些实施例中，锚定链及探测链可具有多个由非互补区隔开的互补区，且多个互补区中的互补核苷酸的总数可为至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少30个核苷酸、至少35个核苷酸、至少40个核苷酸、至少45个核苷酸、至少50个核苷酸或至少100个核苷酸。在一些实施例中，一或多个互补区域中的互补核苷酸的总数可为至少15个核苷酸或至少20个核苷酸。锚定链和/或探测链可为核酸(DNA、RNA或DNA及RNA的组合)。图16A亦说明了双链结构中的可裂解位点383，且可裂解位点383是用以使得探针的两条链均可经裂解子断裂或裂解。裂解子裂解可裂解位点。可裂解位点可为例如核酸内切酶识别位点，例如具有经酶识别的特定序列的限制性核酸内切酶识别位点，且裂解子可为限制性核酸内切酶，例如限制酶。图16A亦显示了位于探针365中的光活化弹头372。光活化弹头372是用以在施加由光活化弹头372接收的光能时将锚定链376结合(例如共价结合)至探测链378。光活化弹头372可为例如光活化核碱基，例如胸腺嘧啶特异性弹头。尽管如图16A中所示，作为探测链的一部分，光活化弹头可另外或替代地位于锚定链中、链之间等。探针365是用以附接至任何类型的诱饵，例如抗体、CLIP-标签、HaloTag、蛋白A、蛋白G、蛋白L、RNA分子、小分子或SNAP标签。在一些实例中，探针365可附接至抗体，例如一级抗体或二级抗体。图16B显示了探针-诱饵结合物374，其中探针365附接至抗体244。小分子交联剂可用于将探针365附接至抗体244。在一些变化形式中，多个(2、3、4个等)个别探针可附接至单一抗体。个别探针可彼此相同或可不同。
图16C显示了使用中的探针-诱饵结合物374(图16B中所示)的实例，例如用于选择性地标记生物样品的一部分(如他处所示，例如在图1及图2A至图2C中)，其通过选择性地照明生物样品的一部分(以活化光活化弹头)及不照明生物样品的另一部分(其中光活化弹头未经活化)。图16C说明了使用竞争链380选择性地标记光活化区域中的生物分子。竞争链380与锚定链376互补，且在某些情况下，与探测链378竞争结合锚定链376。图16C描绘了当样品区域被照明(顶部)及样品区域未被照明(底部)时的探针使用。图16C(顶部(b))描绘了共价结合锚定链376及探测链378的光活化弹头372’。图16C亦描绘了将限制酶386添加至样品中且限制酶386裂解可裂解位点383(顶部(c))。探测链片段378frag及锚定链片段376frag不再附接至探针或样品，且可自样品中移除(洗掉)。剩余的(且附接至例如碳水化合物、脂质、核酸、蛋白质等生物分子上)是剩余的链，即探针-诱饵结合物374”中的切割探测链378’及切割锚定链376’。(尽管探测链378及锚定链376的切割为向生物样品添加裂解子(例如限制酶)的结果，如下文详细解释且在图16C的底部显示，但添加裂解子(例如限制酶)对于防止样品的未照明区域中的生物分子被标注特别有用)。如顶部最后一幅图中所说明，竞争链380添加至样品中；然而，相对较短的切割探测链378’及弹头372’处的共价交联链阻止了竞争链380取代切割探测链378’且竞争链380自光活化区域被洗掉。图16C的底部说明了本文所述的组成物及方法如何防止标注未照明区域中的生物分子。在不存在光的情况下，光活化弹头372未活化，且锚定链376及探测链378未交联(底部(d))。添加限制酶386，且(如上图)，限制酶386裂解可裂解位点383(顶部(b至c))。探测链片段378frag及锚定链片段376frag不再附接至探针或样品，且可自样品中移除(洗掉)。探针-诱饵结合物374a与探针-诱饵结合物374’的不同之处在于锚定链376’及探测链378’未交联。添加了竞争链380而形成探针-诱饵结合物374b。在不存在链交联的情况下，竞争链380取代切割探测链378’。此亦移动了附接至切割探测链378’的标签201。标签201在此未照明区域中被洗掉，仅留下标注的照明生物样品区域。接着可分析这些标记的分子，例如通过使用酶级联、中性抗生物素蛋白等或本文所述的其他方法。
图17A至17D说明了例示性探针-诱饵结合物及使用竞争链自样品的一些区域移除不需要的标签。图17A的上图显示了生物素标注的探测链(顶部链)及锚定链(底部链)在锚定链的5’端附接至抗体。此分子示意性地显示于图17B中。胸苷特异性光活性弹头(X)及其潜在的胸苷残基结合搭配物(若弹头(X)经光辐射活化)以粗体显示。对酶位点加底线。在此实例所代表的样品区域中，所述区域未暴露于光，且光活化弹头(X)不结合潜在的胸苷残基结合搭配物。通过步骤390的限制酶消化，探测链及锚定链中的核酸链经裂解，产生缩短的探测链及缩短的锚定链。此分子示意性地显示于图17B中。竞争链添加至样品中且样品在步骤392中在所需温度下孵育。所需温度(Temp)高于具有裂解探测链的裂解探针的解链温度Tm2，且亦低于(Tm3>Temp>Tm2)含有竞争链的探针复合物的解链温度Tm3。裂解探测链(包括标签)因此自探针上移除(变性或消失)。竞争链变为与锚定链杂交。诱饵(抗体)所结合的分子因此未经标注(例如，在非光照活化区域中)。如权利要求27-30中任一项的方法，其中在裂解可裂解位点之前，双链结构的解链温度Tm为至少50℃。在一些实例中，探针和/或竞争链的核酸序列与内源性核酸序列充分不同且与其生物正交。例如，探针和/或竞争链的序列可具有不超过5、不超过6、不超过7、不超过8、不超过9、不超过10、不超过15个与所关注生物体类型(例如真核序列、哺乳动物序列、人类序列、大鼠序列、小鼠序列等)中的内源核苷酸序列匹配的核苷酸。在本文的一些方法中，锚定链的一级序列、探测链的一级序列和/或竞争链的一级序列与生物样品中天然存在的核酸序列是生物正交的，因此序列匹配内源序列与探测链、锚定链或竞争链之间长度不超过10个的核苷酸。自样品的非光活化区域中的分子移除标签的另一实例说明于图18A至18D中。探针及方法类似于图16A至17D中所示的探针及方法，不同之处在于替代核酸内切酶裂解(或与其一起)，使用酶或酶片段自非光活化区域选择性地移除探测链，接着用竞争链进行链置换及替代。图18A说明了具有光反应弹头X(粗体)的光反应性探针474，如图18B所示。探针474类似于探针374，但缺少限制性内切酶裂解位点。步骤480说明了一种核酸外切酶，例如具有5’至3’外切核酸酶活性的大肠杆菌DNA聚合酶I的N末端片段，用于沿5’至3’方向选择性地移除探测链。弹头可抑制核酸外切酶活性，且可调整标签(生物素)与弹头(X)之间的距离(核苷酸数量)以提供所需的探针解链温度。竞争链添加至样品中且样品在步骤492中在所需温度下孵育，以促进链的置换及替换。图18B示意性地说明了探针474，且图18C及图18D说明了图18B中所示及图18A中所示的探针的不同版本探针474a及探针474b的不同解链温度可用于自部分样品中的分子移除标签。例如，为在37℃下进行反应，Tm3’>37℃>Tm2’。例如，Tm1’可为52℃至60℃，Tm2’可为26℃至34℃，且Tm3’可为44℃-53℃。
图19A至19C及图20A至20C示意性地说明了可用于自非光活化样品区域中的分子移除标签的另一方法。此探针及方法类似于图18A至18D中所示的探针及方法，不同之处在于使用解链因子而非核酸外切酶移除标签，且所述方法可为不依赖于裂解的解链。图19A示意性地显示了探针465及解链因子405。图19A示意性地显示了附接至诱饵(抗体244，其可附接至非光活化的分子)的探针465。图19C显示了在样品的光活化区域中标注分子及自非光活化区域中的分子移除标签的步骤。这些步骤与图16C中的步骤类似，不同之处在于探测链478及锚定链476缺少核酸内切酶位点。在图19C的上图(b)及(c)中，在光活化以活化弹头472后，探针474”的探测链478及锚定链476’在弹头472处共价结合。尽管存在解链因子405，但探针474’的共价结合的探测链478及锚定链476’无法分离，且标签201仍附接至诱饵及所关注分子。在图19C的下图(d)、(e)及(f)中，弹头472未经活化，且解链因子405能够解链(例如，变性)且将探测链478与锚定链及复合物的其余部分分离。图19C的下图(d)显示解链因子405开始作用于探针474。图19C的下图(e)显示探测链478已自探针474a移除。在图19C的下图(e)中，竞争链380可结合探测链478且阻止所述探测链与探针474b再杂交。解链因子可为酶(例如DNA解旋酶、RNA解旋酶)、小分子和/或有机分子(例如甲酰胺、尿素)、加热/温度处理、盐处理或氢氧化钠处理。图20A至图20C进一步说明了图20A中所示的探针的改变版本的不同解链温度如何可用于在用解链因子处理(步骤490)之后促进链置换及替换(步骤492)。与上文针对图17A-18D所描述类似，具有探测链的探针474(参见图20B)具有与其相关的解链温度Tm1”(例如52℃-62℃)，且具有竞争链的探针474b具有与其相关的解链温度Tm2”(例如59℃-68℃)。在Tm2”大于Tm1”的情况下，可利用反应的温度来推动反应以形成图20C中所示的探针474b。
如本文所述的光选择性标注及标记可在各种类型的样品中进行，例如获自组织、细胞或粒子，例如获自实体(例如人类受试者、小鼠受试者、大鼠受试者、昆虫受试者、植物、真菌、微生物、病毒)的样品，或并非来自生物体的组织样品或细胞样品，例如细胞培养样品或人工组织支架样品(例如培养的实验室细胞、活体外发育的心脏组织、3D打印组织等)。使用本文所述的探针、材料及方法进行分析的样品可为活的(活细胞)或可为非活的(例如经固定的)。用于标记及分层的样品可包括单层样品、多层样品、经固定于基板(例如显微镜载玻片)上的样品、未固定于基板上的样品、细胞悬浮液或提取物，例如活体外细胞提取物、重组细胞提取物或合成提取物。在一些实施例中，样品未经固定(未固定)。适用于标注活细胞的探针的实例包括那些利用小分子或有时称为自标记分子(例如Clip-标签、Halo-标签、SNAP-标签)的探针。在一些实施例中，可使用本文所述的方法及材料自动分析大量细胞(例如至少约1,000个细胞、至少10,000个细胞、至少100,000个细胞、至少100万个细胞)。在一些实施例中，可分析较少数量的细胞，例如不超过1,000个细胞、不超过100个细胞或仅几个细胞或单个细胞。在一些实施例中，样品是经固定的。例如，可用例如乙酸、丙酮、甲醛(4％)、福马林(10％)、甲醇、戊二醛或苦味酸固定细胞或组织样品。固定剂可为相对较强固定剂且可交联分子，或者可较弱且不交联分子。用于分析的细胞或组织样品可在分析之前冷冻，例如使用干冰或速冻。在分析之前，可将细胞或组织样品包埋于固体材料或半固体材料(例如石蜡或树脂)中。在一些实施例中，用于分析的细胞或组织样品可经固定继以包埋，例如福马林固定及石蜡包埋(FFPE)。
本发明提供了一个实施例，所述实施例亦为用于影像引导显微照明的基于显微镜的系统。请参见图13A及13B。此实施例的用于影像引导显微照明的基于显微镜的系统1包含显微镜10、成像组件12、照明组件11及处理模组13a。显微镜10包含物镜102、载物台101及主体103。载物台101是用以负载样品S。信号转换器17用于转换信号。成像组件12可包含(可控)相机121、成像光源122、聚焦装置123及第一快门124。请进一步参见图13B，照明组件11可包含照明光源111及图案照明装置117。图案照明装置117可包括第二快门、透镜模组(例如中继透镜、四分之一波片)、至少一对扫描镜及一个扫描透镜。或者，数位微镜装置(DMD)或空间光调变器(SLM)可用作图案照明装置117。
在此实施例中，处理模组13a耦接至显微镜10、成像组件12以及照明组件11。处理模组13a可为电脑、工作站或电脑的CPU，其能够执行为操作此系统而设计的程序。
处理模组13a控制成像组件12以使得相机121获取第一视野的样品S的至少一个影像，且一或多个影像传输至处理模组13a且由处理模组13a基于预定义标准自动即时处理，从而确定影像S中的所关注区域且从而获得关于所关注区域的坐标信息。随后，处理模组13a可根据接收到的关于所关注区域的坐标信息控制照明组件11的图案照明装置117照明样品S的所关注区域。此外，在所关注区域完全照明之后，处理模组13a控制显微镜10的载物台101移动至第一视野之后的第二视野。
在此实施例中，成像光源122经由成像光路提供成像光以在对样品S成像期间照明所述样品。第一快门124沿成像光路置于成像光源122与显微镜10之间。可控相机121置于显微镜10上或成像光路上。
此外，照明光源111经由照明光路提供照明光以照明样品S。图案照明装置117沿照明光路置于照明光源111与显微镜10之间。
本发明提供了另一实施例，所述实施例亦为用于影像引导显微照明的基于显微镜的系统。此系统包括一个额外的处理模组以提高照明效能，且将进行详细描述。请参见图14A及14B。图14A是根据本发明的一实施例的影像引导系统的示意图，且图14B描绘了图14A的影像引导系统的光路。
如图14A及14B中所示，用于影像引导显微照明的基于显微镜的系统1包含显微镜10、照明组件11、成像组件12、第一处理模组13及第二处理模组14。基于显微镜的系统1经设计以用于拍摄样品的一或多个显微镜影像，且使用此影像或这些影像来确定且照射样品上的照明图案，快速完成一个影像的所有步骤(例如在300毫秒内)，且在短时间(例如10小时)内完成蛋白质组学研究的整个照明过程。
显微镜10包含载物台101、物镜102及主体103。载物台101是用以负载样品S。显微镜10的载物台101可为高精度显微镜载物台。
成像组件12可包括相机121、成像光源122、聚焦装置123及第一快门124。相机121安装于显微镜10上。详细地，相机121经由显微镜10的主体103耦合至显微镜10。聚焦装置耦合至相机121且经控制以在样品S成像期间促进自动聚焦过程。成像光源122经由成像光路(如图14A中描绘成像光的阴影区域中的空心箭头指示的路径所示)提供成像光(如图14A中自成像组件12至物镜102的阴影区域所示)，以照明样品S。第一快门124沿成像光路置于成像光源122与显微镜10之间。成像光源122可为卤钨灯、弧光灯、金属卤化物灯、LED灯、镭射，或其中的多者。第一快门的快门时间可随成像光源121的类型而不同。以LED光源为例，第一快门124的快门时间为20微秒。
若要进行双色成像，则第一处理模组13关闭第一色光的快门且打开第二色光的快门。此可能需要另外40微秒。相机121接着以另外20毫秒的曝光时间拍摄另一影像。接着第一处理模组13关闭第二色光的快门。
在此实施例中，请进一步参见图14B，照明组件11包含照明光源111，及图案照明装置117，所述装置包括第二快门、透镜模组(例如中继透镜、四分之一波片)、至少一对扫描镜及扫描透镜。或者，DMD或SLM可用作图案照明装置117。照明光源111经由照明光路提供照明光(如图14A中自照明组件11至物镜102的空心箭头所示)，以照明样品S。第二快门112沿照明光路置于照明光源111与显微镜10之间。所述对扫描镜115沿照明光路置于第二快门112与显微镜10之间。相机121可为高端科学相机，例如具有高量子效率的sCMOS或EMCCD相机，以使得短曝光时间是可能的。为了获得足够的光子进行影像处理，曝光时间例如为20毫秒。
第一处理模组13耦合至显微镜10及成像组件12。详细地，第一处理模组13耦合且因此控制相机121、成像光源122、第一快门、聚焦装置123及显微镜10的载物台101，用于成像、焦点保持及视野改变。第一处理模组13可为电脑、工作站或电脑的CPU，其能够执行为操作此系统而设计的程序。第一处理模组13接着触发相机121对特定视野(FOV)的样品S的影像进行拍摄。此外，相机121可经由USB接口或其上的Camera Link与第一处理模组13连接。此系统的控制及影像处理程序将在以下段落中更详细地论述。
在此实施例中，第二处理模组14耦合至照明组件11及第一处理模组13。详细地，第二处理模组14耦合至且因此控制图案照明装置117，包括第二快门112，以及所述对扫描镜，用于照明第一处理模组13确定的所关注区域中的目标点。第二处理模组可为FPGA、ASIC板、另一CPU或另一电脑。此系统的控制及影像处理程序将在以下段落中更详细地论述。
简言之，基于显微镜的系统1如下操作。第一处理模组13控制成像组件12，使得相机121获取第一视野的样品S的至少一个影像。接着将一或多个影像传输至第一处理模组13，且由第一处理模组13基于预定义标准自动即时处理，从而确定影像中的所关注区域且从而获得关于所关注区域的坐标信息。影像处理算法是事先使用例如阈值、侵蚀、过滤或人工智能训练的语义分割方法等影像处理技术独立开发。随后，将关于所关注区域的坐标信息传输至第二处理模组14。第二处理模组14根据接收到的关于所关注区域的坐标信息控制照明组件12照明样品S的所关注区域(或者，亦即照射所关注区域中的那些目标点)。另外，在所关注区域完全照明(或所关注区域中的所有目标点均被照射)后，第一处理模组13控制显微镜10的载物台101移动至第一视野之后的下一(亦即第二)视野。在移动至后续视野之后，所述方法进一步重复成像-影像处理-照明步骤，直至所有指定视野的所关注区域均照明。
此外，本发明亦提供了另一实施例，其为用于影像引导显微照明的基于显微镜的方法。基于显微镜的方法使用上述基于显微镜的系统且包含以下步骤(a)至(e)：(a)由第一处理模组13触发成像组件12的相机121以获取第一视野的样品S的至少一个影像，且将样品S负载于显微镜10的载物台101上；(b)将样品S的影像自动传输至第一处理模组13；(c)基于预定义标准，第一处理模组13自动即时对样品S进行影像处理，以确定影像中的所关注区域，且获得所关注区域的坐标信息；(d)将关于所关注区域的坐标信息自动传输至第二处理模组14；(e)第二处理模组14根据接收到的坐标信息控制照明组件11对样品S中的所关注区域进行照明。另外，在此实施例中，所关注区域完全照明后，所述方法亦可包括以下步骤：通过第一处理模组13控制显微镜10的载物台101移动至第一视野之后的下一(即第二)视野。
此处所用的基于显微镜的系统1与上述基本相同，且在此不再赘述组合元件的组成及变化。
此外，如图13A及13B中所示，照明光路自照明光源111开始。此照明光源111需要第二快门112。为了达到点照明的高切换速度，机械快门可能不够快。可使用声光调变器(AOM)或电光调变器(EOM)来达成高速。例如，AOM可达到25纳秒的上升/下降时间，足以用于此实施例中的方法及系统。在第二快门112之后，可通过一对中继透镜113a及113b来调整光束大小。在中继透镜113a及113b之后，四分之一波片113c可促进产生圆偏振。接着光到达成对的扫描镜(即XY扫描镜)115以将照明光一次一个地导引至所需点。接着光穿过扫描透镜116及管透镜(包括于显微镜中，此处未示出)及显微镜10的物镜102以照明样品S的目标点。具有高数值孔径(NA)的物镜102需要有足够的光强度以进行光化学反应或光转换。
此外，本发明亦提供了另一实施例，其为另一用于影像引导显微照明的基于显微镜的系统。用于影像引导显微照明的基于显微镜的系统与上述基本相同。请参见图15A及15B。在此实施例中，基于显微镜的系统1包括显微镜10、照明组件11、成像组件12、第一处理模组13及第二处理模组14。显微镜10包含载物台101、物镜102及主体103，且载物台101是用以负载样品S。请进一步参见图15B，照明组件11包括照明光源111，及图案照明装置117，所述装置包括第二快门、至少一个中继透镜(例如中继透镜)、四分之一波片、至少一对扫描镜及扫描透镜。或者，DMD或SLM亦可用作图案照明装置117。成像组件12可包括相机121、成像光源122、聚焦装置123及第一快门124。相机121安装于显微镜10上。
前述实施例与此处描述的系统之间的主要区别在于，此处的第一处理模组13耦合至显微镜10的载物台101以及成像组件12的成像光源122及第一快门124。然而，此处的第二处理模组14包含记忆单元141，且耦接至相机121、照明组件11及第一处理模组13。换言之，在此实施例中，相机121由第二处理模组14而非第一处理模组(亦即电脑)13控制。若需要高速影像资料传输及处理，则相机121可经由Camera Link连接至第二处理模组14。记忆单元141可为随机存取记忆体(RAM)、快闪ROM或硬碟，且随机存取记忆体可为动态随机存取记忆体(DRAM)、静态随机存取记忆体(SRAM)或零电容随机存取记忆体(Z-RAM)。
因此，在此处实施的系统1中，其操作如下。第一处理模组13控制成像组件12且第二处理模组14控制相机121，使得相机121获取第一视野的样品S的至少一个影像。接着将影像自动传输至第二处理模组14的记忆单元141。接着由第二处理模组14基于预定义标准自动即时进行影像处理，从而确定影像中的所关注区域且从而获得关于所关注区域的坐标信息。随后，第二处理模组14根据接收到的关于所关注区域的坐标信息控制照明组件11照明样品S的所关注区域。
由于基于显微镜的系统1的各细节元件的组成、变化或与其他元件的连接关系可参考先前实施例，因此在此不再赘述。
此外，本发明亦提供了另一实施例，其为用于影像引导显微照明的另一基于显微镜的方法。用于影像引导显微照明的基于显微镜的方法与上述基本相同。请亦参见图15A及15B，用于影像引导显微照明的基于显微镜的方法包含以下(a)至(d)的步骤：(a)由第一处理模组13控制成像组件12且由第二处理模组14触发成像组件12的相机121获取第一视野的样品S的至少一个影像，且将样品S负载于显微镜10的载物台101上；(b)将样品S的影像自动传输至第二处理模组14的记忆单元141；(c)基于预定义标准，第二处理模组14自动即时对样品S进行影像处理，以确定影像中的所关注区域，且获得关于所关注区域的坐标信息；及(d)由第二处理模组14根据接收到的坐标信息控制照明组件11照明样品S中的所关注区域。
在一些实施例中，用于进行弹头活化或光选择性标注及标记的光的波长范围为约200nm至约800nm，例如约200nm至约250nm、约250nm至约300nm、约300nm至约350nm、约350nm至约400nm、约400nm至约450nm、约450nm至约500nm、约500nm至约550nm、约550nm至约600nm、约600nm至约650nm、约650nm至约700nm、约700nm至约750nm、或约750nm至约800nm。在一些实施例中，用于进行光选择性标注及标记的光的波长为短波UV光(例如254nm；265-275nm)；长UV光(例如365nm；300-460nm)。在一些实施例中，用于进行弹头活化或光选择性标注及标记的光的波长范围为约800nm至约2000nm，例如约800nm至约900nm、约900nm至约1000nm、约1000nm至约1100nm、约1100nm至约1200nm、约1200nm至约1300nm、约1300nm至约1400nm、约1400nm至约1500nm、约1500nm至约1600nm、约1600nm至约1700nm、约1700nm至约1800nm、约1800nm至约1900nm、或约1900nm至约2000nm。在一些实施例中，用于进行光选择性标注及标记的光的波长为短波UV光(例如254nm；265-275nm)；长UV光(例如365nm；300-460nm)。用于光活化弹头的波长不同于用于成像的波长。在一些实施例中，光活化弹头活化利用约300-450nm、550nm的光辐射(光)进行单光子活化或利用>720nm的光辐射(光)进行多光子活化。特定波长取决于特定弹头。裂解可由酶或化学品(例如用于裂解偶氮苯的连二亚硫酸钠)驱动。
在一些实施例中，探针的多价核心(例如核心部分)可为约70Da至约500Da。多价核心可包括或可为单个氨基酸或单个核苷酸。在一些实施例中，核心的最大宽度可小于1nm。
方法
本文亦揭示了光选择性标注及标记生物分子的方法及分析方法。所述方法可用于单独或组合地标注和/或标记碳水化合物、脂质、核酸、蛋白质。所述方法可包括用诱饵分子及光反应性及可温和裂解探针处理生物样品及将诱饵分子与生物样品中的猎物结合的步骤。在一些实施例中，探针包括光活化弹头及标签且经由可裂解连接子与诱饵分子结合。一些实施例包括用影像引导显微镜系统的成像光源照明生物样品的步骤。一些实施例包括用可控相机对照明样品进行成像的步骤。一些实施例包括用相机在第一视野中获取样品的亚细胞形态的至少一个影像的步骤。一些实施例包括处理至少一个影像且基于经处理的影像确定样品中的所关注区域的步骤。一些实施例包括获得所关注区域的坐标信息的步骤。
一些实施例包括基于获得的坐标信息用交联光选择性地照明所关注区域，从而使探针及诱饵双重交联的步骤。一些实施例包括进一步包含使用标签产生可检测标记且用可检测标记来标记接近猎物的蛋白质的步骤。一些实施例包括其中可检测标记包含酪胺标记的步骤。一些实施例包括其中生物样品包含多个细胞的步骤。一些实施例包括其中生物样品包含多个活细胞的步骤。一些实施例包括其中生物样品包含细胞提取物的步骤。一些实施例包括其中选择性照明包含照明直径小于300nm、小于200nm或小于100nm的区域的步骤。一些实施例包括进一步包含自显微镜载物台移除至少所关注区域的步骤。
一些实施例包括进一步包含对样品进行质谱分析或测序分析的步骤。一些实施例包括其中标签包含生物素衍生物、点击化学标签、HaloTag、SNAP-标签、CLIP-标签、地高辛或肽标签。一些实施例包括其中点击化学标签包含基于炔烃或基于叠氮化物的基团。一些实施例包括其中可裂解连接子为偶氮苯衍生物、Dde衍生物、DNA寡聚体、肽或硼酸酯。一些实施例包括其中诱饵分子包含抗体、蛋白A、蛋白G、蛋白L、SNAP-标签、CLIP-标签或小分子。一些实施例包括其中光活化弹头包含芳基叠氮化物、二氮丙啶或二苯甲酮。
本文亦描述了光选择性标注、标记及分析方法。所述方法可包括将光反应性及可裂解探针递送至生物样品的步骤，其中所述探针包含可裂解连接子、光活化弹头及标签且附接至探针的核心。所述方法可包括将诱饵分子与生物样品中的目标生物分子结合的步骤，其中诱饵分子与探针结合。所述方法可包括用影像引导显微镜系统的成像光源照明生物样品的步骤。
所述方法可包括用可控相机对照明样品进行成像的步骤。所述方法可包括用相机在第一视野中获取生物样品的亚细胞形态的至少一个影像的步骤。所述方法可包括处理至少一个影像且基于经处理的影像确定样品中的所关注区域的步骤。所述方法可包括获得所关注区域的坐标信息的步骤。所述方法可包括用光辐射选择性地照明所关注区域以活化光活化弹头且将弹头附接至目标生物分子或目标生物分子附近，从而使探针与目标分子双重交联的步骤。所述方法可包括裂解探针的可裂解连接子的步骤。所述方法可包括移除经裂解及未结合的探针的步骤。
一些实施例包括标记直径小于300nm、小于200nm或小于100nm的区域。在一些实施例中，生物样品包括至少一个、至少100个、至少1000个或至少10,000个活细胞。
一些方法包括使具有目标生物分子的生物样品与本文所述的探针接触、使用光辐射空间选择性地光交联探针与目标生物分子、裂解探针、洗去未结合的探针或经裂解探针、用标记来标记生物分子/探针复合物及选择性地邻近标记生物分子相邻分子。
亦描述了用于光活化标记的方法，所述方法包括以下步骤：将任何光反应性及可裂解探针(包括任何核酸探针)结合至生物样品中的生物分子；将诱饵分子结合至生物样品中的目标生物分子以交联探针及目标生物分子；递送光辐射以活化光活化弹头且将锚定链共价键合至探测链；裂解探针双链区域中的可裂解位点以自探针的其余部分移除一部分锚定链及探测链；自生物样品中移除经裂解及未结合的探针。在本文的这些及其他方法中，裂解可裂解位点之前的双链结构的解链温度Tm为52℃至60℃。在本文的这些及其他方法中，(i)探针在裂解步骤之后包括双链结构，(ii)探针在替换步骤之后包括双链结构，及(iii)裂解可裂解位点之后的第二区域中的双链结构的解链温度Tm低于第二区域中的替换步骤之后的第二区域中的双链结构的解链温度Tm。
在本文的这些及其他方法中，裂解可裂解位点之后的第二区域中的双链结构的解链温度Tm为26℃至34℃。在本文的这些及其他方法中，第二区域中的替换步骤之后的第二区域中的双链结构的解链温度Tm为44℃至53℃。在本文的这些及其他方法中，替换步骤在高于裂解可裂解位点之后的第二区域中的双链结构的解链温度Tm且低于替换步骤之后的第二区域中的双链结构的解链温度Tm的温度下进行。
亦描述一种分析方法，其包括：将光反应性及可裂解探针递送至生物样品，所述探针包括核酸锚定链及核酸探测链，其中探测链与锚定链沿着互补序列形成双链结构；选择性地照明生物样品的第一区域，从而活化位于探针中的光活化弹头且将探测链共价键合至第一区域中的锚定链，且不照明生物样品的第二部分，以使探测链及锚定链在第二区域中不共价键合；裂解探针双链区域中的可裂解位点以自第一及第二区域中的探针的其余部分移除一部分锚定链及探测链；将竞争核酸链递送至第一及第二区域，其中竞争核酸链是用以与探测链竞争结合至锚定链；用所述竞争核酸链替代在第二区域中的探针中的探测链，但不替代在第一区域中的探针中的探测链，其中第一区域中的探测链与锚定链之间的共价键合，以防止竞争链替代第一区域中的探测链。
这些方法可进一步包括结合至探测链的标签，其中标签是用以结合至可检测标记。这些方法可进一步包括将可检测标记与标签结合，且通过可检测标记活性，可检测地邻近标记邻近目标生物分子的相邻分子。在一些方法中，可检测地邻近标记包括光选择性邻近标记直径小于300nm、小于200nm或小于100nm的区域。
在一些方法中，其中裂解可裂解位点之前的双链结构的解链温度Tm为至少50℃。在一些方法中，其中裂解可裂解位点之前的双链结构的解链温度Tm为52℃至60℃。在一些方法中，其中探针在裂解步骤之后包括双链结构，其中裂解可裂解位点之后的第二区域中的双链结构的解链温度Tm为52℃至60℃。在一些方法中，其中探针在替换步骤之后包括双链结构，其中第二区域中的替换步骤之后的第二区域中的双链结构的解链温度Tm为44℃至53℃。在一些方法中，其中锚定链的一级序列、探测链的一级序列和/或竞争链的一级序列与生物样品中天然存在的核酸生物正交。在一些方法中，裂解可裂解位点包括用限制性核酸内切酶和/或限制酶切割可裂解位点。在一些方法中，选择性地照明以活化光活化弹头，包括活化核碱基弹头。在一些方法中，选择性地照明以活化光活化弹头，包括活化胸腺嘧啶特异性弹头。
在一些方法中，其中选择性照明生物样品包括自影像引导显微镜系统的成像光源照明，所述方法进一步包括用可控相机对照明样品进行成像；用相机获取第一视野中的生物样品的亚细胞形态的至少一个影像；处理至少一个影像且基于经处理的影像确定样品中的所关注区域；获得所关注区域的坐标信息；这些及其他方法进一步包括自第一及第二区域移除经裂解及未结合的探针。在这些及其他方法中，选择性照明包括以25微秒/像素至400微秒/像素、50微秒/像素至300微秒/像素或75微秒/像素至200微秒/像素来照明区域。在这些及其他方法中，选择性照明包括以100mW至300mW的功率强度照明。在这些及其他方法中，可检测标记包括催化标记。在这些及其他方法中，生物样品包括至少一个、至少100个、至少1000个或至少10,000个活细胞或固定细胞。在这些及其他方法中，生物样品包括固定细胞、组织或细胞或组织提取物。在这些及其他方法中，选择性照明包括照明由点扩散函数定义的区域。在这些及其他方法中，将生物样品置于显微镜载物台上，所述方法进一步包括自载物台移除生物样品的照明区域的至少一部分。这些及其他方法包括对样品进行质谱分析或测序分析。在这些及其他方法中，标签包括生物素衍生物、CLIP-标签、点击化学标签、地高辛、HaloTag、肽标签或SNAP-标签。
试剂盒
本文亦提供了用于实施本文所述的方法的试剂盒及系统，例如用于生成探针以及分析、标注及标记生物分子。试剂盒通常包括至少一种如本文所述的光反应性及可裂解探针或其组分。在一些实施例中，至少一种光反应性及可裂解探针是用以可温和裂解(例如生物正交可裂解)。
另外，试剂盒通常将包括说明材料，其揭示了用于产生或修饰一或多种探针的方法，例如将诱饵部分附接至探针、将探针应用于样品、将诱饵部分结合至猎物分子(在样品中)、经由光活化弹头将探针光交联至所关注分子、经由可裂解连接子键光反应性裂解可裂解连接子、移除(洗掉)非光反应性探针。
试剂盒亦可包括额外组件以促进试剂盒设计的特定应用。因此，例如，当试剂盒含有一种或多种用于标注及标记生物分子的光反应性及可裂解探针时，所述试剂盒可另外含有一种或多种裂解分子(例如化学品、核酸内切酶、蛋白酶)。所述试剂盒可另外含有一种或多种诱饵分子，例如本文所述的那些中的任一者(例如抗体、功能性蛋白质(例如蛋白A、蛋白G、蛋白质药物等)、自标记蛋白质(例如CLIP-标签、Halo-Tag、SNAP-标签)、小分子或药物。
试剂盒可另外含有检测样品和/或检测标记的工具(例如用于酶标记的酶底物、用于检测荧光标记的过滤器组、酶或相关检测试剂，包括用于进行催化报导子沉积(CARD)或信号放大的试剂(例如抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、辣根过氧化物酶(HRP)、酪胺、过氧化氢等)。试剂盒可另外包括用于一个或多个步骤(例如在样品经固定后、在探针裂解后等)的洗涤溶液，例如阻断剂、清洁剂、盐(例如氯化钠、氯化钾、磷酸盐缓冲盐水(PBS))。试剂盒可包括洗涤溶液的变化形式，例如用以在使用前稀释的洗涤缓冲液浓缩物或用于制备一种或多种洗涤溶液的组分)及其他常规用于特定方法实践的试剂。试剂盒可包括固定剂及其他样品制备材料(例如乙醇、甲醇、福马林、石蜡等)。
试剂盒可视情况包括教示使用探针、裂解分子、将诱饵分子添加至探针及洗涤溶液及其类似物的说明材料。
用于标记生物分子的试剂盒可包括本文所述的任何光反应性及可裂解核酸探针于第一容器中。试剂盒可另外包括竞争链(例如链380)于第二容器中，其中竞争链与锚定链互补。试剂盒可包括竞争链(例如链380)，其中当试剂盒的竞争链及锚定链形成双链结构时，所述结构的解链温度Tm为44℃至53℃等，如本文他处所述。
试剂盒亦可包括用于移除探针的酶，例如核酸内切酶、核酸外切酶或解旋酶。试剂盒亦可包括一种或多种解链因子，例如解旋酶、小分子(例如甲酰胺、尿素)或盐或碱溶液。
本文亦提供了用于探针生成的试剂盒，例如用于生成核酸探针，例如用于自各种所关注诱饵(例如抗体等)生成探针-诱饵复合物。用于探针生成的试剂盒可包括核酸锚定链，其中锚定链包含诱饵附接位点；核酸探测链，其中探测链与锚定链沿着互补序列形成双链结构；双可裂解位点位于双链结构中，其中锚定链及探测链是用于裂解子的施加而在可裂解位点断裂；光活化弹头，其中光活化弹头是用以在施加光能时将锚定链共价键合至探测链；及结合至探测链的标签，其中标签是用以结合至可检测标记。
实验及方法
实施例1-使用偶氮探针成功地对核仁素进行局部光选择性标注的示范。图12A显示了核仁素的光选择性标注的示意图。核仁素是一种存在于真核细胞核仁中且参与核糖体合成的蛋白质。偶氮-探针1通过使用BCN-NHS(CAS#1516551-46-4)作为偶氮-探针1与二级抗体之间的额外连接子而结合至二级抗体。U2OS细胞样品在玻璃底室载玻片上生长，且用2.4％ PFA固定。将与偶氮-探针1结合的抗体应用于用抗核仁素抗体染色的样品。将样品暴露于780nm双光子照射(200mW，200微秒/像素)以将光活化弹头光交联至抗体，且随后与1M连二亚硫酸钠在室温下孵育超过16小时，以移除未交联的探针。添加结合至Alexa Fluor647染料的中性抗生物素蛋白，且对样品进行Alexa Fluor 647分析。Alexa Fluor 647是一种明亮的远红荧光染料，其非常适合以594nm或633nm雷射线激发。结果显示于图12B的上图中。近视图显示于图12B的右上角。观测到特征性的核仁形状。侧视图显示于图12B的右下角。图12B的下图显示了与上图中相同处理的对照区域，不同之处在于下图中所示的样品未暴露于光活化光。未观测到明显染色。
实施例2-BCN-抗体的制备：
1.制备用于100μl反应的70μl抗体(1.2-1.5μg/μl)溶液。2.添加10μl1M碳酸氢钠(或1M硼酸盐缓冲液，最终50-100mM)及BCN-NHS(Sigma-Aldrich#744867，最终浓度：200μM)。用ddH2O将最终体积调节至100μl。3.通过倒置试管数次轻轻混合且轻轻旋转。4.在室温下在振荡器/混合器上孵育1小时。必要时避光。5.通过添加10μl 1M甘氨酸停止反应，且在室温下再反应30至60分钟。6.使用去盐管柱通过树脂过滤移除未结合的小分子。
探针3-抗体结合物的制备：7.将0.5-1μg/μl抗体与探针3混合(最终浓度：100μM)，在4℃下反应隔夜。8.使用去盐管柱通过树脂过滤移除未结合的小分子。
光选择性标记：9.在添加0.1％triton的PBS溶液中用探针3-抗体及DRAQ5(细胞核标记)处理核仁素染色的细胞60分钟。10.用添加0.1％Triton的PBS溶液洗涤样品，且以2.4％ PFA固定样品。11.定义所需区域且以780nm的160-200mW脉冲雷射在选定区域内标记探针3-抗体染色的核仁素。12.PBS洗涤经标记的样品，且在室温下以1M连二亚硫酸钠孵育隔夜。13.通过NeutrAvidin-Dy550结合物(1:200)染色来检查标记。
实施例3-探针IV N-TEV的制备
将预结合的肽N-TEV溶解于DMSO/水(1/1)中直至1mM。将4-苯甲酰基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(TCI#S0863)溶解于纯的无水DMSO中直至2mM。将10μL N-TEV储备液与10μL 4-苯甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯储备液、10μL 1M硼酸钠缓冲液(pH＝8.5)、70μL DMSO/水(1/1)混合，且在室温下反应2小时。通过添加10μL 1M甘氨酸溶液淬灭反应，且使用MALDI-MS进行验证。
实施例4-核酸探针的制备
DNA-抗体结合
1.抗体购自商业供应商(Jackson Immunoresearch，#111-005-003，山羊抗兔)，且最初使用Amicon Ultra Centrifugal Filters(10kDa MWCO)浓缩至约2.5mg/ml。可选择性：移除叠氮化物或任何其他防腐剂，且使用Zeba离心管柱(7000MWCO)将抗体缓冲液交换为磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)。对于Jackson的抗体，此储存缓冲液已不含叠氮化物/胺。2.将200μg抗体(80μL)与15μL 1X PBS及5μL 2.5mM SM(PEG)2(聚乙二醇化SMCC)交联剂(Thermo，#22102)在二甲基甲酰胺(DMF)中混合。SM(PEG)2与抗体的摩尔比等于9.375。接着将溶液在4℃下孵育3小时。3.过量的聚乙二醇化SM(PEG)2交联剂是通过G-25管柱移除，且使用Amicon Ultra Centrifugal Filters(10kDa MWCO)浓缩至>2mg/ml。4.并行地，将130μL硫醇修饰的DNA寡核苷酸(100μM，13nmol，MW：约11kDa)与30μL 0.5M二硫苏糖醇(DTT)及40μL 5X PBS(添加5mM EDTA，pH 8.0)在室温下混合2小时。使用NAP-5无核酸酶管柱(Cytiva/GE Healthcare)纯化还原的DNA寡核苷酸。去离子水用作溶离剂。5.使用Amicon UltraCentrifugal Filters(3kDa MWCO)将还原的DNA寡核苷酸浓缩至约2μg/μL。6.将68μg(2.72mg/mL，25μL)SM(PEG)2交联的(顺丁烯二酰亚胺活化)抗体与约136μg(1.5μg/μL，91)还原形式的硫醇DNA寡核苷酸(约30eq，Ref：15eq)在1X PBS溶液中混合(最终体积：125μL)。使反应在4℃进行12小时。使用Microcon Centrifugal Filters(30kDa MWCO)纯化及浓缩DNA-抗体结合物。
样品制备程序
带有4个孔的分室盖玻片(80427，Ibidi)上的细胞在室温下用2.4％多聚甲醛/PBS固定10分钟，且在室温下用含0.5％ Triton X-100的PBS孵育10分钟来通透化。接着用3％BSA/0.1％ PBST将细胞阻断1小时，接着在室温下以含0.002％抗生蛋白链菌素的0.1％PBST处理30分钟以阻断内源性生物素。用0.1％PBST洗涤三次后，向孔中加入40μM生物素以阻断残留的抗生蛋白链菌素。
免疫化学及原位杂交
室温下在3％ BSA/0.1％ PBST中用适当浓度(通常为1-10μg/mL)的所需靶标的一级抗体对细胞染色1小时。在3％ BSA/0.1％ PBST或杂交缓冲液(2×盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液、10％硫酸葡聚糖、1mg/mL酵母tRNA、5％正常驴血清或BSA)中制备10μg/mL的DNA结合的二级抗体血清且与样品一起在室温下孵育1小时或在4℃下隔夜孵育，以结合一级抗体。制备0.5-1μg/mL生物素标注/弹头结合寡核苷酸探针于0.1％ PBST或杂交缓冲液中，且在室温下与样品一起孵育1小时或在4℃下孵育隔夜，以与DNA-抗体结合物杂交。
杂交dsDNA-抗体结合物的光交联
另一种二级抗体或带有荧光团的寡核苷酸探针用于可视化目标蛋白(若需要)，以选择ROI及共价光交联杂交链。
移除探测寡核苷酸
将样品与含有序列特异性限制酶及竞争链的消化缓冲液(例如：缓冲液)一起孵育，以替代消化的DNA-抗体结合物。在37℃下反应60分钟至隔夜。用0.1％ PBST洗涤三次。(其他具有特定反应性的核酸酶亦适用，例如5’->3’核酸外切酶或3’->5’核酸外切酶，其取决于锚定DNA与抗体的附接位点)。
光驱动标签捕获的验证
在照明后，使用中性抗生物素蛋白-荧光团结合物(1μg/mL于3％BSA/PBST中，1小时)探测生物素标记的区域。
实例5-NHS-(PEG)2-顺丁烯二酰亚胺-Ab结合物的制备
1.抗体购自商业供应商(Jackson Immunoresearch，Dk anti Ms)，且先使用30kDa过滤器浓缩至2.5至3mg/ml。2.将适量浓缩抗体与溶解于DMF中的2.50mM NHS-(PEG)2-顺丁烯二酰亚胺交联剂(Thermofisher，#22102)混合，且在-20℃下储存约30天(约4周半)，NHS-(PEG)2-顺丁烯二酰亚胺与抗体的摩尔比在PBS中等于12(pH＝7.2～7.4)。用PBS调节抗体浓度直至等于2至3mg/ml。3.接着将反应物在4℃下孵育3小时。4.过量的NHS-(PEG)2-顺丁烯二酰亚胺交联剂是通过G-25管柱移除且使用Amicon Ultra Centrifugal Filters(30kDa MWCO)浓缩至大于2mg/ml。
NHS-PEG2-顺丁烯二酰亚胺
琥珀酰亚按基-[(N-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基)-二乙二醇]酯)
NHS-(PEG)2-顺丁烯二酰亚胺结合抗体与还原的硫醇-DNA反应
1.通过将抗体溶液添加至含有冻干DNA的试管中，将适当体积的NHS-(PEG)2-顺丁烯二酰亚胺结合抗体(2.5～3mg/mL于1X PBS中)与干燥的硫醇-DNA寡核苷酸(还原形式)混合，摩尔比等于1:25(抗体:DNA)。2.涡旋混合反应物几分钟，且在大于10,000RCF下离心。3.使反应在4℃下进行大于12小时。4.使用离心式过滤器(MicroconCentrifugal Filters)(100kDa MWCO)纯化及浓缩DNA-抗体结合物。
定量及验证：1.对于加入初始100μg抗体，用PBS将抗体结合物的体积调节至150μL。2.50μL抗体结合物用于BCA分析。定量后，将结合物的浓度调节至0.5mg/mL。3.若使用经b-ME处理的IgG，则可使用10％聚丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE检查结合效率。使用15孔梳制备聚丙烯酰胺凝胶，且向各孔中装载5μg抗体。
杂交
细胞制备：1.用PFA或PFA/GA固定细胞。2.通透化：经固定细胞通过与0.1至0.5％PBST一起培育10分钟进行通透化。3.用0.1％ PBST洗涤3次。4.孵育：将细胞用阻断缓冲液(3％ BSA)培育1小时，同时轻轻摇动。5.用0.1％ PBST洗涤两次。6.用0.002％抗生蛋白链菌素(在0.1％ PBST中)培育30分钟。7.用0.1％ PBST洗涤两次。8.细胞用40μM生物素(在0.1％PBST中)培育15分钟。9.用0.1％ PBST洗涤3次。
以Ab-DNA进行免疫荧光
1.使用通用免疫荧光(IF)准则直至第1次抗体处理，且接着用PBST洗涤三次。2.与杂交阻断缓冲液一起在室温下孵育60分钟，各盖玻片30μL且2孔盘各孔250μL。若细胞核背景较高，则使用的硫酸葡聚糖最终浓度可为0.02％至0.5％。(储备液：含5％硫酸葡聚糖的DEPC H2O)
3.在室温下用含10～12μg/mL Ab-DNA的杂交阻断缓冲液孵育60分钟。用PBST洗涤三次。若细胞核背景较高，则使用的硫酸葡聚糖的最终浓度可为0.02％至0.5％。(储备液：含5％硫酸葡聚糖的DEPC H2O)
4.与1μM生物素标记的DNA探针(带或不带弹头)及第3Ab(对于Dk Ab，使用1:100)一起在室温下以添加3％ BSA的PBST中孵育60分钟。
5.用PBST洗涤三次，且再用PBS洗涤三次。
去杂化
1.以湿纸巾覆盖加热盘表面。2.将加热盘及加热的PBS及ddH2O设定为70至75度。用热ddH2O以保持纸巾湿润。3.在室温下以预热的PBS洗涤样品四次(各洗涤3分钟)，且用PBST再洗涤2次。4.继续进行中性抗生物素蛋白染色(通常为1:500)。
扩增
1.以1/1000生物素-HRP(含3％ BSA的PBST或PBS)培育细胞30分钟。2.以PBS洗涤且立即移除。接着再次用PBS洗涤，更换5次，每10～12分钟更换一次洗涤缓冲液。3.将BP及H2O2混合至500μM BP及0.012％H2O2中且培育细胞3分钟。4.制备2X及1X amp淬灭剂。2X amp淬灭剂：含0.04％ NaN3、20mM抗坏血酸钠(SA)及10mM Trolox(Tx)的PBS。1X amp淬灭剂：含0.02％ NaN3、10mM抗坏血酸钠(SA)及5mM Trolox(Tx)的PBST。5.直接添加等量的2X amp淬灭剂且接着移除。6.用1Xamp淬灭剂洗涤3次。7.用PBS洗涤3次。
当一个特征或元件在本文中称为“在”另一特征或元件“上”时，其可直接在另一特征或元件上，或亦可存在介于中间的特征和/或元件。相比的下，当一个特征或元件称为“直接在”另一特征或元件“上”时，则不存在介于中间的特征或元件。亦应理解，当一个特征或元件称为“连接”、“附接”或“耦合”至另一特征或元件时，其可直接连接、附着或耦合至另一特征或元件或可存在介于中间的特征或元件。相比的下，当一个特征或元件称为“直接连接”、“直接附接”或“直接耦合”至另一特征或元件时，则不存在介于中间的特征或元件。尽管关于一个实施例进行描述或显示，但如此描述或显示的特征及元件可应用于其他实施例。熟习此项技术者亦应理解，对与另一特征“相邻”安置的结构或特征的参考可具有与相邻特征重叠或位于其下方的部分。
本文所用的术语仅用于描述特定实施例的目的，且不旨在限制本发明。例如，如本文所用，单数形式“一”及“所述”旨在亦包括复数形式，除非上下文另有明确指示。亦应理解，当在本说明书中使用时，术语“包含”和/或“含有”指定了所陈述特征、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但并不排除一或多个其他特征、步骤、操作、元件、组件和/或其组的存在或添加。如本文所用，术语“和/或”包括一或多个相关联列出的项目的任何及所有组合，且可缩写为“/”。
为了便于描述，在本文中可使用空间相对术语，例如“在......的下”、“下方”、“以下”、“在......的上”、“上方”等，以便于描述一个元件或特征与另一元件或特征的关系，如图式中所说明。应理解，除了图式中所描绘的方向之外，空间相对术语亦旨在涵盖装置在使用或操作中的不同方向。例如，若图式中的装置是倒置的，则描述为在其他元件或特征“的下”或“下方”的元件将定向为在其他元件或特征“的上”。因此，例示性术语“在......的下”可涵盖上方及下方两个方向。可以其他方式定向装置(旋转90度或其他方向)，且据此解释本文使用的空间相对描述符。类似地，除非另有明确说明，否则术语“向上”、“向下”、“垂直”、“水平”等在本文中仅用于解释目的。
尽管本文可使用术语“第一”及“第二”来描述各种特征/元件(包括步骤)，但除非上下文另有说明，否则这些特征/元件不应受这些术语限制。这些术语可用于将一个特征/元件与另一特征/元件区别开来。因此，在不脱离本发明的的教示的情况下，下文论述的第一特征/元件可称为第二特征/元件，且类似地，下文论述的第二特征/元件可称为第一特征/元件。
在整个本说明书及随后的申请专利范围中，除非上下文另有要求，否则字语“包含”及变化形式，例如“包括”及“具有”意谓可在方法及物品中共同使用各种组分(例如组成物及设备，包括装置及方法)。例如，术语“包含”将理解为暗示包括任何所陈述元件或步骤，但不排除任何其他元件或步骤。
一般而言，本文所述的任何设备及方法应理解为包容性的，但组件和/或步骤的全部或子集可替代地为排他性的，且可表示为“由”各种组件、步骤、子组件或子步骤“组成”或者“基本上由”其“组成”。
如在说明书及申请专利范围本文中所用，包括在实例中所用，且除非另有明确规定，否则所有数字均可理解为如同由字语“约”或“大约”开头，即使所述术语未明确出现亦如此。当描述幅度和/或位置时，可使用字语“约”或“大约”来指示所述值和/或位置在值和/或位置的合理预期范围内。例如，数值可具有规定值(或值范围)的+/-0.1％、规定值(或值范围)的+/-1％、规定值(或值范围)的+/-2％、规定值(或值范围)的+/-5％、规定值(或值范围)的+/-10％等。除非上下文另有说明，否则本文给出的任何数值亦应理解为包括约或近似所述值。例如，若揭示值“10”，则亦揭示“约10”。本文中引用的任何数值范围旨在包括其中包含的所有子范围。亦应理解，当揭示“小于或等于”所述值的值时，亦揭示“大于或等于所述值”以及值之间的可能范围，如熟习此项技术者所适当理解。例如，若揭示值“X”，则亦揭示“小于或等于X”以及“大于或等于X”(例如，其中X为数值)。亦应理解，在整个本申请中，资料是以多种不同格式提供，且此资料表示终点及起点，以及资料点的任何组合的范围。例如，若揭示特定资料点“10”及特定资料点“15”，则应理解，认为揭示了大于、大于或等于、小于、小于或等于、及等于10及15，以及在10与15之间。亦应理解，亦揭示两个特定单元之间的各单元。例如，若揭示10及15，则亦揭示11、12、13及14。
尽管上文描述了各种说明性实施例，但可对各种实施例作出多种改变中的任一者而不脱离如申请专利范围所述的本发明的范畴。例如，在替代实施例中，可经常改变执行各种所述方法步骤的顺序，且在其他替代实施例中，可完全跳过一个或多个方法步骤。各种装置及系统实施例的视情况选用的特征可包括于一些实施例中且不包括于其他实施例中。因此，提供前述描述主要是为了示例性目的，且不应解释为限制阐述于申请专利范围中的本发明的范畴。
本文包括的实例及说明是通过说明而非限制的方式显示可实施主题的特定实施例。如所提及，可利用其他实施例且由此衍生出其他实施例，从而可在不背离本发明的范畴的情况下进行结构及逻辑替换及改变。本发明主题的此类实施例可在本文中单独地或共同地由术语“发明”来指代，仅为方便起见，且若实际上揭示超过一个发明或发明概念，则无意将本申请的范畴自愿限制于任何单个发明或发明概念。因此，尽管本文已说明及描述了特定实施例，但任何经计算以达成相同目的的布置均可替代所示的特定实施例。本发明意图涵盖各种实施例的任何及所有修改或变化。上述实施例及本文未具体描述的其他实施例的组合在熟习此项技术者回顾以上描述后将为显而易见的。

Claims (110)

1.一种光反应性及可裂解探针，其包含：
一核酸的锚定链，其中所述锚定链包含一诱饵附接位点；
一核酸的探测链，其中所述探测链与所述锚定链沿一互补序列形成一双链结构；
一可裂解位点位于所述双链结构中，其中所述锚定链及所述探测链于一裂解子的施加而在所述可裂解位点处断裂；
一光活化弹头，位于所述探针中，其中所述光活化弹头于施加光能时将所述锚定链共价键合至所述探测链；及
一标签，结合至所述探测链，其中所述标签是用以结合至一可检测标记。
2.根据权利要求1所述的光反应性及可裂解探针，其中所述锚定链及所述探测链包含DNA、RNA或DNA和RNA的组合。
3.根据权利要求1或2所述的光反应性及可裂解探针，其中所述锚定链及所述探测链具有至少6个呈连续一排的互补核苷酸及总共至少20个互补核苷酸。
4.根据权利要求1至2任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述双链结构的长度为至少10个核苷酸。
5.根据权利要求1至4任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述双链结构的解链温度Tm为52℃至60℃。
6.根据权利要求1至4任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述双链结构的解链温度Tm为至少50℃。
7.根据权利要求1至6任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述锚定链及所述探测链的长度为至少10个核苷酸、至少20个核苷酸或至少30个核苷酸。
8.根据权利要求1至7任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述锚定链及所述探测链的长度为不超过40个核苷酸、不超过50个核苷酸或不超过60个核苷酸。
9.根据权利要求1、2或4至6中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述锚定链及所述探测链的长度分别在15个核苷酸至40个核苷酸之间。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述锚定链包含一级序列，且相对于所述可裂解位点，所述标签与所述诱饵附接位点位于所述一级序列的同一侧上。
11.根据权利要求1至12中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述探针在所述诱饵附接位点处附接至一诱饵分子。
12.根据权利要求11所述的光反应性及可裂解探针，其中所述探针共价附接至所述诱饵分子。
13.根据权利要求11或12所述的光反应性及可裂解探针，其中所述诱饵分子包含抗体、CLIP-标签、HaloTag、蛋白A、蛋白G、蛋白L、RNA分子、小分子或SNAP-标签。
14.根据权利要求11或12所述的光反应性及可裂解探针，其中所述诱饵分子包含抗体。
15.根据权利要求11或12所述的光反应性及可裂解探针，其中诱饵分子包含二级抗体。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述标签包含生物素衍生物、CLIP-标签、点击化学标签、地高辛、HaloTag、肽标签或SNAP-标签。
17.根据权利要求16所述的光反应性及可裂解探针，其中所述生物素衍生物包括以下的基团：
18.根据权利要求1至17中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述标签包含生物素衍生物、CLIP-标签、点击化学标签、地高辛、HaloTag、肽标签或SNAP-标签。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述可裂解位点包含一限制酶位点。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基。
21.根据权利要求1至19中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述光活化弹头包含一胸腺嘧啶特异性弹头。
22.根据权利要求1至19中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基特异性补骨脂素，包括的基团或一核碱基特异性叠氮化物。
23.根据权利要求1至19中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基特异性3-氰基乙烯基咔唑核苷(CNVK)，包括的基团。
24.根据权利要求1至19中任一项所述的光反应性及可裂解探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基特异性三氧沙林，包括的基团。
25.根据以上任一项权利要求所述的光反应性及可裂解探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基特异性二氮丙啶，包括的基团。
26.一种光活化标记的方法，其包含：
将如权利要求1至25中任一项的光反应性及可裂解探针结合至一生物样品中的一生物分子；
将一诱饵分子结合至所述生物样品中的一目标生物分子以交联所述探针及所述目标生物分子；
递送光辐射以活化所述光活化弹头且将所述锚定链共价键合至所述探测链；
裂解所述探针双链区域中的所述可裂解位点，以自所述探针的其余部分移除一部分所述锚定链及所述探测链；及
自所述生物样品中移除经裂解及未结合的探针。
27.一种分析方法，其包含：
将一光反应性及可裂解探针递送至一生物样品，所述探针包含一核酸的锚定链及一核酸的探测链，其中所述探测链与所述锚定链沿一互补序列形成一双链结构；
选择性地照明所述生物样品的一第一区域，从而活化位于所述探针中的光活化弹头且将所述探测链共价键合至所述第一区域中的所述锚定链，且不照明所述生物样品的一第二区域，以使所述探测链及所述锚定链在所述第二区域中不共价键合；
裂解所述第一区域及所述第二区域中的所述探针的所述双链区域中的一可裂解位点，以自所述探针的其余部分移除所述锚定链的经裂解部分及所述探测链的经裂解部分；
将一竞争核酸链递送至所述第一区域及所述第二区域，其中所述竞争核酸链是用以与所述探测链竞争结合至所述锚定链；及
用所述竞争核酸链替代在所述第二区域中的探针中的所述探测链，但不替代在所述第一区域中的探针中的所述探测链，其中所述第一区域中的所述探测链与所述锚定链之间的所述共价键合，以防止所述竞争核酸链替代所述第一区域中的所述探测链。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述探针进一步包含结合至所述探测链的一标签，其中所述标签是用以结合至可检测标记。
29.根据权利要求28所述的方法，其进一步包含将一可检测标记与所述标签结合，且通过可检测标记活性，可检测地邻近标记邻近目标生物分子的相邻分子。
30.根据权利要求29所述的方法，其中可检测地邻近标记包含光选择性邻近标记直径或最长尺寸小于300nm、小于200nm或小于100nm的区域。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中在裂解所述可裂解位点之前，所述双链结构的解链温度Tm为至少50℃。
32.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中在裂解所述可裂解位点之前，所述双链结构的解链温度Tm为52℃至60℃。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的方法，其中(i)所述探针在裂解步骤之后包含双链结构，(ii)所述探针在替代步骤之后包含双链结构，以及(iii)裂解所述可裂解位点之后的所述第二区域中的双链结构的解链温度Tm低于所述第二区域中的替代步骤之后的所述第二区域中的双链结构的解链温度Tm。
34.根据权利要求33所述的方法，其中裂解所述可裂解位点之后的所述第二区域中的双链结构的解链温度Tm为26℃至34℃。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述第二区域中的所述替换步骤之后的所述第二区域中的双链结构的解链温度Tm为44℃至53℃。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述替换步骤是在高于裂解所述可裂解位点之后的所述第二区域中的双链结构的解链温度Tm且低于所述替换步骤之后的所述第二区域中的双链结构的解链温度Tm的温度下进行。
37.根据权利要求27至36中任一项所述的方法，其中所述锚定链的一级序列、所述探测链的一级序列和/或所述竞争核酸链的一级序列与所述生物样品中天然存在的核酸链是生物正交的，使得序列在内源性序列与所述探测链或所述锚定链之间匹配不超过10个核苷酸。
38.根据权利要求27至37中任一项所述的方法，其中裂解所述可裂解位点包含用一核酸内切酶和/或一限制酶切割所述可裂解位点。
39.根据权利要求27至38中任一项所述的方法，其中选择性地照明以活化光活化弹头包含活化一核碱基弹头。
40.根据权利要求27至39中任一项所述的方法，其中选择性地照明以活化光活化弹头包含活化一胸腺嘧啶特异性弹头。
41.根据权利要求27至40中任一项所述的方法，其中选择性地照明所述生物样品包含自影像引导显微镜系统的成像光源照明，所述方法进一步包含：
用可控相机对照明样品进行成像；
用所述相机在一第一视野中获取所述生物样品的亚细胞形态的至少一个影像；
处理所述至少一个影像且基于经处理的影像确定所述样品中的所关注区域；及
获得所述所关注区域的坐标信息。
42.根据权利要求27至41中任一项所述的方法，其进一步包含自所述第一区域及所述第二区域移除经裂解及未结合的探针。
43.根据权利要求27至42中任一项所述的方法，其中选择性地照明包含以25微秒/像素至400微秒/像素、50微秒/像素至300微秒/像素或75微秒/像素至200微秒/像素来照明一区域。
44.根据权利要求27至43中任一项所述的方法，其中选择性地照明包含以100mW至300mW的功率强度照明。
45.如权利要求29所述的方法，其中所述可检测标记包含一催化标记。
46.根据权利要求27至45中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含至少一个、至少100个、至少1000个或至少10,000个活细胞或固定细胞。
47.根据权利要求27至45中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括固定细胞、组织、细胞提取物或组织提取物。
48.根据权利要求27至47中任一项所述的方法，其中选择性地照明包括照明由点扩散函数定义的一区域。
49.根据权利要求27至48中任一项所述的方法，其中所述生物样品是置于一显微镜载物台上，所述方法进一步包含自所述载物台移除所述生物样品的照明区域的至少一部分。
50.根据权利要求27至49中任一项所述的方法，其进一步包含对所述样品进行质谱分析或测序分析。
51.根据权利要求28至50中任一项所述的方法，其中所述标签包含生物素衍生物、CLIP-标签、点击化学标签、地高辛、HaloTag、肽标签或SNAP-标签。
52.一种标记生物分子的试剂盒，其包含：
如权利要求1至25中任一项所述的光反应性及可裂解探针于一第一容器中；以及
一说明材料。
53.根据权利要求52所述的试剂盒，其进一步包含竞争链，其中所述竞争链与锚定链互补。
54.根据权利要求53所述的试剂盒，其中当所述竞争链及所述锚定链形成一双链结构时，所述结构的解链温度Tm为44℃至53℃。
55.一种用于探针生成的试剂盒，其包含：
一核酸的锚定链，其中所述锚定链包含一诱饵附接位点；
一核酸的探测链，其中所述探测链与所述锚定链沿一互补序列形成一双链结构；
一可裂解位点位于所述双链结构，其中所述锚定链及所述探测链是用于一裂解子的施加而在所述可裂解位点处断裂；
一光活化弹头，其中所述光活化弹头是用以在施加光能时将所述锚定链共价键合至所述探测链；及
一标签，结合至所述探测链，其中所述标签是用以结合至一可检测标记。
56.一种光反应性探针，其包含：
一核酸的锚定链，其中所述锚定链包含一诱饵附接位点；
一核酸的探测链，其中所述探测链与所述锚定链沿一互补序列形成一双链结构；
一光活化弹头，位于所述探针中，其中所述光活化弹头是用以在施加光能时将所述锚定链共价键合至所述探测链；及
一标签，结合至所述探测链，其中所述标签是用以结合至一可检测标记。
57.根据权利要求56所述的光反应性探针，其中所述锚定链及所述探测链包含DNA、RNA或DNA和RNA的组合。
58.根据权利要求56或57所述的光反应性探针，其中所述锚定链比所述探测链长。
59.根据权利要求56或57所述的光反应性探针，其中所述锚定链及所述探测链具有至少6个呈连续一排的互补核苷酸及总共至少20个互补核苷酸。
60.根据权利要求56至59中任一项所述的光反应性探针，其中所述双链结构的长度为至少10个核苷酸。
61.根据权利要求56至60中任一项所述的光反应性探针，其中所述双链结构的解链温度Tm为52℃至60℃。
62.根据权利要求56至60中任一项所述的光反应性探针，其中所述双链结构的解链温度Tm为至少50℃。
63.根据权利要求56至62中任一项所述的光反应性探针，其中所述锚定链及所述探测链的长度为至少10个核苷酸、至少20个核苷酸或至少30个核苷酸。
64.根据权利要求56至63中任一项所述的光反应性探针，其中所述锚定链及所述探测链的长度为不超过40个核苷酸、不超过50个核苷酸或不超过60个核苷酸。
65.根据权利要求56至62中任一项所述的光反应性探针，其中所述锚定链及所述探测链的长度分别在15个核苷酸与40个核苷酸之间。
66.根据权利要求56至65中任一项所述的光反应性探针，其中所述锚定链包含一级序列，且相对于可裂解位点，所述标签与所述诱饵附接位点位于所述一级序列的同一侧上。
67.根据权利要求56至66中任一项所述的光反应性探针，其中所述探针在所述诱饵附接位点处附接至诱饵分子。
68.根据权利要求67所述的光反应性探针，其中所述探针共价附接至所述诱饵分子。
69.根据权利要求67或68所述的光反应性探针，其中所述诱饵分子包含抗体、CLIP-标签、HaloTag、蛋白A、蛋白G、蛋白L、RNA分子、小分子或SNAP-标签。
70.根据权利要求67至69中任一项所述的光反应性探针，其中所述诱饵分子包含抗体。
71.根据权利要求67至69中任一项所述的光反应性探针，其中诱饵分子包含二级抗体。
72.根据权利要求56至71中任一项所述的光反应性探针，其中所述标签包含生物素衍生物、CLIP-标签、点击化学标签、地高辛、HaloTag、肽标签或SNAP-标签。
73.根据权利要求72所述的光反应性探针，其中所述生物素衍生物包括以下的基团：
74.根据权利要求56至73中任一项所述的光反应性探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基。
75.根据权利要求56至73中任一项所述的光反应性探针，其中所述光活化弹头包含一胸腺嘧啶特异性弹头。
76.根据权利要求56至73中任一项所述的光反应性探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基特异性补骨脂素，包括的基团或一核碱基特异性叠氮化物。
77.根据权利要求56至73中任一项所述的光反应性探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基特异性3-氰基乙烯基咔唑核苷(CNVK)，包括的基团。
78.根据权利要求56至73中任一项所述的光反应性探针，其中所述光活化弹头包含一核碱基特异性三氧沙林，包括的基团。
79.一种光活化标记的方法，其包含：
将如权利要求1至25中任一项所述的光反应性探针结合至一生物样品中的一生物分子；
将一诱饵分子结合至所述生物样品中的一目标生物分子以交联所述探针及所述目标生物分子；
将光辐射递送至所述生物样品的第一区域以活化所述光活化弹头且将所述锚定链共价键合至所述探测链，
将所述探测链自所述探针的其余部分移除且使一竞争链与所述生物样品的未用光辐射处理的第二区域中的所述锚定链杂交；及
自所述生物样品中移除经裂解及未结合的探针。
80.一种分析方法，其包含：
将一光反应性探针递送至一生物样品，所述探针包含一核酸的锚定链及一核酸的探测链，其中所述探测链与所述锚定链沿互补序列形成双链结构；
选择性地照明所述生物样品的一第一区域，从而活化位于所述探针中的光活化弹头且将所述探测链共价键合至所述第一区域中的所述锚定链，且不照明所述生物样品的一第二区域，以使所述探测链及所述锚定链在所述第二区域中不共价键合；
在所述第二区域中将所述探测链自所述探针的其余部分解链；
将一竞争核酸链递送至所述第一区域及所述第二区域，其中所述竞争核酸链是用以与所述探测链竞争结合至所述锚定链；及
用所述竞争核酸链替代在所述第二区域中的探针中的所述探测链，但不替代所述第一区域中的探针中的所述探测链，其中所述第一区域中的所述探测链与所述锚定链之间的所述共价键合，以防止所述竞争核酸链替代所述第一区域中的所述探测链。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述探针进一步包含结合至所述探测链的一标签，其中所述标签是用以结合至可检测标记。
82.根据权利要求81所述的方法，其进一步包含将一可检测标记与所述标签结合，且通过可检测标记活性，可检测地邻近标记邻近目标生物分子的相邻分子。
83.根据权利要求82所述的方法，其中可检测地邻近标记包含光选择性邻近标记直径或最长尺寸小于300nm、小于200nm或小于100nm的区域。
84.根据权利要求80至83中任一项所述的方法，其中在裂解可裂解位点之前所述双链结构的解链温度Tm为至少50℃。
85.根据权利要求80至83中任一项所述的方法，其中在裂解可裂解位点之前所述双链结构的解链温度Tm为52℃至60℃。
86.根据权利要求80至85中任一项所述的方法，其中(i)所述探针在裂解步骤之后包含双链结构，(ii)所述探针在替代步骤之后包含双链结构，以及(iii)裂解可裂解位点之后的所述第二区域中的所述双链结构的解链温度Tm低于所述第二区域中的替代步骤之后的所述第二区域中的所述双链结构的解链温度Tm。
87.根据权利要求86所述的方法，其中裂解所述可裂解位点之后的所述第二区域中的所述双链结构的所述解链温度Tm为26℃至34℃。
88.根据权利要求86或87所述的方法，其中所述第二区域中的所述替换步骤之后的所述第二区域中的所述双链结构的所述解链温度Tm为44℃至53℃。
89.根据权利要求86至88中任一项所述的方法，其中所述替换步骤在高于裂解所述可裂解位点之后的所述第二区域中的双链结构的所述解链温度Tm且低于所述替换步骤之后的所述第二区域中的双链结构的所述解链温度Tm的温度下进行。
90.根据权利要求80至89中任一项所述的方法，其中所述锚定链的一级序列、所述探测链的一级序列和/或所述竞争核酸链的一级序列与所述生物样品中天然存在的核酸链是生物正交的，使得序列在内源性序列与所述探测链或所述锚定链之间匹配不超过10个核苷酸。
91.根据权利要求80至90中任一项所述的方法，其中将所述探测链自所述第二区域中的所述探针的其余部分移除，包含用一核酸外切酶消化所述探测链。
92.根据权利要求80至90中任一项所述的方法，其中将所述探测链自所述第二区域中的所述探针的其余部分移除，包含用一解链因子处理所述样品。
93.根据权利要求80至90中任一项所述的方法，其中将所述探测链自所述第二区域中的所述探针的其余部分移除包含使用包含一解旋酶、一小分子或升高的温度的解链因子处理所述样品。
94.根据权利要求80至91中任一项所述的方法，其中选择性地照明以活化光活化弹头包含活化一核碱基弹头。
95.根据权利要求80至94中任一项所述的方法，其中选择性地照明以活化光活化弹头包含活化一胸腺嘧啶特异性弹头。
96.根据权利要求82至95中任一项所述的方法，其中选择性地照明所述生物样品包含自影像引导显微镜系统的成像光源照明，所述方法进一步包含：
用可控相机对照明样品进行成像；
用所述相机在第一视野中获取所述生物样品的亚细胞形态的至少一个影像；
处理所述至少一个影像且基于经处理的影像确定所述样品中的所关注区域；
获得所述所关注区域的坐标信息。
97.根据权利要求82至96中任一项所述的方法，其进一步包含自所述第一区域及所述第二区域移除未结合的探针。
98.根据权利要求82至97中任一项所述的方法，其中选择性地照明包含以25微秒/像素至400微秒/像素、50微秒/像素至300微秒/像素或75微秒/像素至200微秒/像素来照明一区域。
99.根据权利要求82至98中任一项所述的方法，其中选择性地照明包含以100mW至300mW的功率强度照明。
100.根据权利要求82所述的方法，其中所述可检测标记包含催化标记。
101.根据权利要求82至100中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含至少一个、至少100个、至少1000个或至少10,000个活细胞或固定细胞。
102.根据权利要求82至100中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括固定细胞、组织、细胞提取物或组织提取物。
103.根据权利要求82至102中任一项所述的方法，其中选择性地照明包括照明由点扩散函数定义的一区域。
104.根据权利要求82至103中任一项所述的方法，其中所述生物样品是置于显微镜载物台上，所述方法进一步包含自所述载物台移除所述生物样品的照明区域的至少一部分。
105.根据权利要求82至104中任一项所述的方法，其进一步包含对所述样品进行质谱分析或测序分析。
106.根据权利要求83至105中任一项所述的方法，其中所述标签包含生物素衍生物、CLIP-标签、点击化学标签、地高辛、HaloTag、肽标签或SNAP-标签。
107.一种标记生物分子的试剂盒，其包含：
如权利要求56至80中任一项的光反应性探针于一第一容器中；及
一说明材料。
108.根据权利要求107所述的试剂盒，其进一步包含竞争链，其中所述竞争链与锚定链互补。
109.根据权利要求108所述的试剂盒，其中当所述竞争链及所述锚定链形成一双链结构时，其中所述结构的解链温度Tm为44℃至53℃。
110.一种用于探针生成的试剂盒，其包含：
一核酸的锚定链，其中所述锚定链包含一诱饵附接位点；
一核酸的探测链，其中所述探测链与所述锚定链沿一互补序列形成一双链结构；
一光活化弹头，其中所述光活化弹头是用以在施加光能时将所述锚定链共价键合至所述探测链；及
一标签，结合至所述探测链，其中所述标签是用以结合至一可检测标记。
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