CN118226631A - 用于显微成像的等波长周期光栅纵向深度结构光照明发生器 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于显微成像的等波长周期光栅纵向深度结构光照明发生器，该照明发生器可用于结构光照明显微成像。结构光照明发生器包括玻璃衬底和等波长周期的金属光栅。金属光栅用于被入射光直接照射，在光栅的狭缝两侧，分别出现了垂直于光栅表面传播的结构光。该结构光沿着垂直于光栅表面的方向向上直线传播，其强度会在传播过程中逐渐减小。且产生的结构光是一排平行的条纹，条纹的横向周期是光栅周期的一半。本发明利用等波长周期光栅激发了周期结构光，可用于结构光照明显微成像。对多次采用结构光照明探测的结果进行图像重建处理，可以实现突破衍射极限的超分辨成像。本发明结构光具有高空间频率、长距离稳定传播的特点，提高了在生物医学等领域结构光照明显微成像的分辨率与探测深度。

Description

用于显微成像的等波长周期光栅纵向深度结构光照明发生器

技术领域

本发明属于微纳光学和超分辨显微成像领域，特别是一种用于显微成像的等波长周期光栅纵向深度结构光照明发生器。

背景技术

结构光照明显微成像技术采用不同模式的结构化光束照明样品，并采集多幅图像。通过将这些采集的图像进行重建，可以获得目标的超分辨图像。光栅是一种常用的产生结构光的工具，利用光栅的衍射和干涉特性能产生各种不同模式的结构光。2000年，Gustafsson首次在实验中验证了结构光照明显微成像技术的超分辨结果，其使用的正弦条纹结构光就是基于光栅产生的。在该实验中，一个线性透射相位光栅被多模光纤发射的线偏光照射，产生的+1和-1阶衍射光发生干涉，形成了正弦条纹结构光。2008年，Gustafsson使用多模光纤激发线偏光照射光栅，利用产生的0阶和±1阶衍射光的干涉形成了三维的结构光，首次实现了三维的结构光照明显微成像技术。此外，一种基于光栅泰伯效应的结构光照明显微成像技术也被人们提出。在泰伯效应中，光栅激发的各阶衍射光相互干涉，在远场产生周期性的结构光场。然而，无论是否使用光栅激发结构光，常规结构光照明显微成像技术的分辨率至多达到衍射极限的2倍，需要产生更高空间频率的结构光才能更进一步地提升分辨率。

等离子体结构光照明显微成像技术是一种使用表面等离激元作为结构光照明的显微成像技术。由于表面等离激元具有亚波长的特点，能产生超过衍射极限的结构光分布模式，因此等离子体结构光照明显微成像技术具备比常规SIM更高的分辨能力。金属光栅是一种高效激发表面等离激元的工具。2012年，一种采用金属光栅激发表面等离激元作为结构光的等离子体结构光照明显微成像方法被提出。该方法通过光栅激发表面等离激元，并使这些表面等离激元发生干涉，形成驻波条纹结构光。这种驻波条纹结构光的周期仅有表面等离激元波长的一半，用于照明可以将成像分辨率提升至衍射极限的3倍多。等离子体结构光照明显微成像技术可以获得比常规结构光照明显微成像技术更高的分辨率，但由于表面等离激元结构光局限在金属表面，因此其探测深度往往只有一两百纳米，不能对位于一定深度的样品(如细胞器)进行探测成像。

在维持等离子体结构光照明显微成像的分辨率的同时，提升其探测深度是一个值得研究的问题。利用等离子体泰伯效应是一种潜在的提升探测深度的方法。和光束的泰伯效应是基于衍射光的干涉不同，等离子体泰伯效应是由一种和表面等离激元具有相同波长的散射电磁波干涉而形成，可以在金属结构的透射面产生干涉光场。等离子体泰伯效应为解决等离子体结构光照明探测深度问题提供了一个思路，即通过金属光栅产生表面等离激元，并在透射面产生受到表面等离激元影响的干涉结构光场。

发明内容

本发明的目的在于针对等离子体结构光照明显微成像技术存在的探测距离受限的问题，提供一种能产生高空间频率、长纵向深度的结构光照明器。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种用于显微成像的等波长周期光栅纵向深度结构光照明发生器，所述结构光照明发生器包括玻璃衬底和沉积在所述玻璃衬底上的金属光栅；

一束入射光从下向上照射到金属光栅底部，并产生高空间频率、具有纵向深度的结构光，所述金属光栅的周期Λ满足Λ＝λ；其中，λ为入射光的波长；

所述入射光为线偏振平面波，垂直入射到所述金属光栅上，偏振方向垂直于所述金属光栅的狭缝。

进一步地，所述结构光的横向条纹分布周期为半波长大小；所述结构光用于照明探测成像，实现对在一定深度处的目标样品的超分辨探测成像。

进一步地，在进行超分辨探测成像过程中，待探测的目标样品放置在载玻片上，所述载玻片与金属光栅上表面保持平行放置，载玻片到金属光栅的距离在结构光的纵向传播范围内。

进一步地，所述待探测的目标样品使用荧光染料进行处理，荧光染料的激发波长对应于入射光波长λ。

进一步地，在进行超分辨探测成像过程中，需在多个方向使用结构光进行照明，从而获得各个方向上的超分辨图像。

进一步地，在每个方向，需对结构光进行横向位移，以采集多组不同相位结构光照明探测的图像，根据这些图像能求解所述结构光中不同频率分量探测到的信号。

进一步地，在傅里叶空间中将不同频率分量探测到的信号移动到对应的位置，并进行逆傅里叶变换，获得一幅目标样品的重建超分辨图像。

本发明与现有技术相比，其显著优点为：

1)本发明的结构光照明器产生的结构光横向周期为入射光波长的一半，即该结构具有常规正弦结构光2倍的空间频率，能提取目标更多高频的信息，可获得更高分辨率的图像。

2)和已有的等离子体结构光照明器相比，本发明的结构光照明器产生的结构光具有更长的传播距离，可以对具有一定深度的目标进行探测。

3)在传播过程中，结构光不会随着传播距离的增加而发散，可以在长探测深度下维持稳定的结构光照明模式。

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1为本发明等波长周期光栅纵向深度结构光照明发生器的结构示意图。

图2(a)为一个实施例中等波长周期金光栅产生的纵向深度条纹结构光场x-z平面强度分布图，图2(b)、图2(c)和图2(d)分别为结构光在x、y和z方向上的电场分量。

图3为一个实施例中产生的纵向深度条纹结构光的强度和纵向传播距离之间的关系图。

图4(a)为一个实施例中在距离金光栅表面5微米处的电场强度分布图，图4(b)为该电场强度分布对应的横向电场强度分布曲线，图4(c)为该电场强度分布对应的傅里叶频谱。

图5为一个实施例中等波长周期光栅产生的纵向深度结构光被用于超分辨成像后的光学传递函数变化示意图。

图6为一个实施例中模拟的量子点探测成像结果，其中图6中的(a)为衍射受限显微镜探测结果，图6中的(b)为本发明等波长周期光栅产生的纵向深度条纹结构光被用于照明成像后的重建的结果图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

需要说明，若本发明实施例中有涉及方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。

等离子体泰伯效应是一种表面等离激元的自成像现象，其可以在透射面产生具有一定传播距离的结构光场。在研究该效应时，发现当金属光栅的周期Λ满足Λ＝λ时，能产生一种周期为入射光波长一半，稳定传播距离能达到十微米量级的条纹结构光。依据这种现象，本发明提出了等波长周期光栅纵向深度结构光照明发生器。使用该照明发生器产生的结构光的横向分布特点和等离子体结构光照明显微成像技术中使用的结构光类似，尽管本发明并不是使用等离子体结构光进行照明，但使用该结构光照明发生器可以获得接近于离子体结构光照明显微成像技术的分辨能力。此外，本发明产生的结构光具有一定的纵向传播深度，能用于对在一定深度处的样品进行探测成像。

具体地，在一个实施例中，本发明提供了一种用于显微成像的等波长周期光栅纵向深度结构光照明发生器，所述结构光照明发生器包括玻璃衬底和沉积在所述玻璃衬底上的金属光栅；

一束入射光从下向上照射到金属光栅底部，并产生高空间频率、具有纵向深度的结构光，所述金属光栅的周期Λ满足Λ＝λ；其中，λ为入射光的波长；

所述入射光为线偏振平面波，偏振方向垂直于所述金属光栅的狭缝。

进一步地，在其中一个实施例中，所述入射光垂直入射到所述金属光栅上。

进一步地，在其中一个实施例中，所述结构光的横向条纹分布周期为半波长大小。即，结构光的横向条纹分布具有入射光的波长一半的周期，在纵向传播过程中能维持稳定的照明强度。

进一步地，在其中一个实施例中，所述结构光用于照明探测成像，实现对在一定深度处的目标样品的超分辨探测成像。

这里，在进行超分辨探测成像过程中，待探测的目标样品放置在载玻片上，所述载玻片与金属光栅上表面保持平行放置，载玻片到金属光栅的距离在结构光的纵向传播范围内。

所述待探测的目标样品使用荧光染料进行处理，荧光染料的激发波长对应于入射光波长λ。

在进行超分辨探测成像过程中，需在多个方向使用结构光进行照明，从而获得各个方向上的超分辨图像。例如，在3个方向照明，每次照明后需要旋转60°切换照明方向；最终在旋转角θ为0°、60°和120°这三个方向进行照明。

在每个方向，需对结构光进行横向位移，以采集多组不同相位结构光照明探测的图像，根据这些图像能求解所述结构光中不同频率分量探测到的信号。例如，每个方向，采集3组不同相位结构光照明探测的图像，所述具有纵向深度的条纹结构光被用于进行9次照明，并采集到9幅子图像。

在傅里叶空间中将不同频率分量探测到的信号移动到对应的位置，并进行逆傅里叶变换，能获得一幅目标样品的重建超分辨图像。

作为一种具体示例，在其中一个实施例中，对本发明进行进一步验证说明。

本发明提供了一种等波长周期光栅纵向深度结构光照明发生器，所述结构光照明发生器包括作为衬底的玻璃(SiO₂)和沉积在衬底上的等波长周期金(Au)光栅，如图1所示。待探测的目标样品放置在载玻片上，并用荧光染料染色，荧光染料的激发波长为532nm。

所述的结构光照明器的衬底为玻璃，厚度为500nm。衬底上的金光栅周期Λ为532nm，狭缝宽度为100nm，金光栅厚度为200nm。本实施例中使用Lumerical FDTDSolutionos仿真软件进行模拟仿真。

仿真中在x和y方向使用周期型边界条件，在z方向使用理想匹配层吸收边界条件。仿真区域在x轴、y轴和z轴方向的范围分别为3.724μm×1μm×10μm，对应的仿真网格精度为2nm×10nm×10nm。入射光是波长λ为532nm的线偏振平面波，偏振方向垂直于光栅的狭缝。在y＝0处，放置了波段为532nm的监视器，用于分析x-z平面上透射光的传播电场。

图2(a)为本发明等波长周期光栅产生的纵向深度结构光电场强度在x-z平面的分布图，可以看出在光栅的狭缝两侧，分别出现了垂直于光栅表面传播的结构光。该结构光沿着垂直于光栅表面的方向向上直线传播，其强度会在传播过程中逐渐减小。产生的结构光是一排平行的条纹，条纹的横向周期是光栅周期的一半。这些条纹在z方向传播时并不会随着传播距离的增加而发散，本发明中产生的条纹光束具备在传播路径中维持稳定的条纹对比度的特性，这有利于在一定的深度下进行稳定的超分辨成像。图2(b)至2(d)为本发明等波长周期光栅产生的纵向深度结构光电场在x-z平面上的电场分量。其中，x方向的电场分量展现出在传播方向上周期变化的特点，y方向的分量强度可以忽略不计，z方向的电场强度最高，其电场分量的分布特性和总场一致，说明结构光由z方向的电场主导。

图3为条纹结构光的条纹强度和纵向传播距离的关系，其强度进行了归一化处理。在金光栅出射面到其上方100nm左右，有一段强度的迅速衰减，这反映的是金属表面激发的局域表面等离激元在纵向上的强度迅速衰减。在z＝100nm到z＝10μm的纵向传输过程中，条纹结构光的强度呈现出逐渐减小的趋势。在z＝10μm处，条纹结构光的强度约为金光栅出射面的强度的35％。该强度足以支持条纹结构光探测10μm深度的目标样品。

下面选取距离金光栅表面z＝5μm处的条纹结构光进行展示并分析，该条纹结构光如图4(a)所示，可以看出该结构光在传播了5μm后仍然保持着清晰的周期条纹分布图案，这意味着本发明能对深度的目标进行结构化的照明。进一步地，对该条纹结构光的横向强度分布特性进行分析，对应的强度分布曲线如图4(b)所示。本发明产生的结构光的横向周期约为266nm，恰好为光栅周期的一半，同时也是入射光波长的一半。常规正弦条纹结构光的周期等于入射光的波长，这说明本发明使用的条纹结构光具有2倍于常规正弦条纹结构光的空间频率。进一步地，对图4(b)中的结构光的横向强度分布进行傅里叶变换，得到了图4(c)中所示的结构光频谱。其中，除了入射光的基频外，还存在着两个2倍频的频率分量。即本发明产生的条纹结构光可以看作532nm的正弦条纹结构光和2倍频的条纹结构光的线性叠加。这些结构光中的高频成分可以提取目标物体的高频信息，从而可以获得更高分辨率的目标图像。

本发明中产生的结构光是一种横向周期分布的条纹光场，在单一的方向上，要提高分辨率需要使用3组不同横向相位分布的结构光分别进行照明，并收集多幅子图像，根据相移求解方法可以求解出图4(c)中各个结构光频率分量探测到的信号。将不同频率分量探测到的信号在傅里叶空间上移动到其对应的位置，即可在一个方向上获得分辨的提升。为了获得各个方向均匀的分辨率提升效果，需要在3个方向(0°、60°和120°)，的每个方向使用3组相位的结构光分别进行照明，即共需要使用结构光照明9次，通过收集9幅子图像来重建出1幅完整的超分辨图像。

图5是本发明结构光照明发生器用于超分辨成像的光学传递函数示意图。中心灰色的小圆代表衍射受限信息的范围，其截止频率为k_cutoff，即超过该频率的信号受到衍射极限的限制，在传输过程中会损失掉。外围6个小圆代表在3个方向上分别探测得到的高频信号，大的虚线圆代表使用本发明的结构光照明发生器近似可以探测的频率范围。和衍射受限的灰色区域相比，虚线圆区域的半径是其3倍，即理论上本发明的结构光照明发生器可以实现衍射极限3倍的超分辨成像。图中7个小圆之间存在间隙，即有部分区域的信号会遗失，这会造成最终的图像分辨率轻微的下降或出现一些伪影。这些间隙可以通过增加照明方向来填补，但考虑到增加照明方向会增加成像的时间成本，且缺失的间隙较小，对超分辨图像的影响较小，因此优选地设计为在3个方向照明，这样可以最高效地探测高频信号。

图6是使用模拟量子点图案对本发明的结构光照明发生器的分辨率提升效果进行测试。其中，图6中的(a)是对应的量子点的衍射受限图像，由于衍射效应的存在，一些临近的量子点难以被区分出来，单一量子点图案的强度半高宽尺寸达到了252nm。图6中的(b)是使用本发明的条纹结构光进行照明成像的结果，可以看到一些邻近的量子点可以被清晰地区分出来。单一量子点图案的强度半高宽尺寸减小为92nm，这表示分辨率提升到了接近衍射极限的2.74倍。考虑到图5中存在的频域间隙，这个分辨率提升效果是合理的。

本发明使用等波长周期光栅产生具有纵向深度结构光，可用于超分辨探测成像。本发明产生的结构光具有高空间频率和较长的纵向探测深度，提高了在生物医学等领域观察微观结构时的分辨率与探测深度。

以上显示和描述了本发明的现象、特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的现象，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (7)

1.一种用于显微成像的等波长周期光栅纵向深度结构光照明发生器，其特征在于，所述结构光照明发生器包括玻璃衬底和沉积在所述玻璃衬底上的金属光栅；

一束入射光从下向上照射到金属光栅底部，并产生高空间频率、具有纵向深度的结构光，所述金属光栅的周期Λ满足Λ＝λ；其中，λ为入射光的波长；

所述入射光为线偏振平面波，垂直入射到所述金属光栅上，偏振方向垂直于所述金属光栅的狭缝。

2.根据权利要求1所述的用于显微成像的等波长周期光栅纵向深度结构光照明发生器，其特征在于，所述结构光的横向条纹分布周期为半波长大小；所述结构光用于照明探测成像，实现对在一定深度处的目标样品的超分辨探测成像。

3.根据权利要求2所述的用于显微成像的等波长周期光栅纵向深度结构光照明发生器，其特征在于，在进行超分辨探测成像过程中，待探测的目标样品放置在载玻片上，所述载玻片与金属光栅上表面保持平行放置，载玻片到金属光栅的距离在结构光的纵向传播范围内。

4.根据权利要求3所述的用于显微成像的等波长周期光栅纵向深度结构光照明发生器，其特征在于，所述待探测的目标样品使用荧光染料进行处理，荧光染料的激发波长对应于入射光波长λ。

5.根据权利要求2所述的用于显微成像的等波长周期光栅纵向深度结构光照明发生器，其特征在于，在进行超分辨探测成像过程中，需在多个方向使用结构光进行照明，从而获得各个方向上的超分辨图像。

6.根据权利要求5所述的用于显微成像的等波长周期光栅纵向深度结构光照明发生器，其特征在于，在每个方向，需对结构光进行横向位移，以采集多组不同相位结构光照明探测的图像，根据这些图像能求解所述结构光中不同频率分量探测到的信号。

7.根据权利要求6所述的用于显微成像的等波长周期光栅纵向深度结构光照明发生器，其特征在于，在傅里叶空间中将不同频率分量探测到的信号移动到对应的位置，并进行逆傅里叶变换，获得一幅目标样品的重建超分辨图像。