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CN118222603A - 高产l-赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

高产l-赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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CN118222603A
CN118222603A CN202211643806.3A CN202211643806A CN118222603A CN 118222603 A CN118222603 A CN 118222603A CN 202211643806 A CN202211643806 A CN 202211643806A CN 118222603 A CN118222603 A CN 118222603A
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China
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lysine
cgl2072
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CN202211643806.3A
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王亚迪
胡丹
冯帆
赵津津
李岩
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Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Original Assignee
Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
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Abstract

本发明提供一种高产L‑赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用。本发明通过对棒杆菌属微生物中编码阳离子跨膜转运蛋白的基因进行修饰，使其表达的阳离子跨膜转运蛋白增强，和/或通过对阳离子跨膜转运蛋白进行突变(含G130*突变位点)，使得与未改造的微生物相比，具有增强的L‑赖氨酸生产能力。

Description

高产L-赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种高产L-赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
L-赖氨酸是碱性必需氨基酸，分子式为C6H14N2O2，外观为白色或近乎于白色结晶粉末。在162℃变暗，在224.5℃下分解，易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。广泛应用于动物饲料、医药和食品工业，其中L-赖氨酸约90％用于饲料工业，10％用于食品和医药行业。用于动物饲料添加剂，L-赖氨酸可帮助机体吸收其他氨基酸，从而提高饲料质量。因此，生产赖氨酸具有广阔的前景。
目前，L-赖氨酸最常用的生产方法为微生物发酵法。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是革兰氏阳性微生物，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物降解能力弱的特性。作为传统工业微生物，谷氨酸棒杆菌广泛用于生产多种氨基酸、核苷酸及其他有机酸。
从生物化学角度分类，赖氨酸属于天冬氨酸家族氨基酸。谷氨酸棒杆菌经过多步酶催化反应得到赖氨酸，代谢途径涉及多个基因的调控。同时离子(例如Zn、Co、Cd)作为一种重要的微量元素参与了生物体内广泛的生理和生化过程,离子跨膜转运蛋白负责将离子跨膜转运进细胞内，以完成细胞内多种生理生化反应。然而，超过正常生理水平的微量金属浓度对细胞是有毒的，转运蛋白将过量的离子跨膜运出细胞。离子跨膜转运蛋白的相互协调使得阳离子在细胞和有机体水平上维持着稳态,进而为细胞内各种生理生化反应的进行提供一种保障机制。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产L-赖氨酸的工程菌及其构建方法与应用。
本发明构思如下：研究发现，阳离子跨膜转运蛋白表达增强，有利于棒杆菌产赖氨酸；另外，对谷氨酸棒杆菌中阳离子跨膜转运蛋白特定位置的氨基酸置换可以增强阳离子跨膜转运蛋白的表达，赖氨酸产量得到提高。阳离子跨膜转运蛋白在NCBI上的参考序列编号为Cgl2072。经进一步拓展，发现其他方式的强化也能起到类似的效果，从而完成了本发明。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种高产L-赖氨酸工程菌的构建方法，利用基因工程手段，增强棒杆菌属(Corynebacterium)微生物中编码阳离子跨膜转运蛋白的基因，使其与未改造的微生物相比，具有增强的L-赖氨酸生产能力；和/或，
利用基因工程手段，在棒杆菌属微生物基因组中引入突变，使其编码的阳离子跨膜转运蛋白包含G130*突变位点；其中，*表示除G之外的氨基酸(如D、I、E或K，优选I)。
本发明中，所述棒杆菌属微生物优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
进一步地，所述高产L-赖氨酸工程菌的构建方法还包括：
A、弱化原始菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因，获得基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因的表达；或者，
B、增强原始菌株中与L-赖氨酸生物合成途径相关的基因和/或反馈抑制脱敏相关的基因，或者增强步骤A基因弱化菌株中与L-赖氨酸生物合成途径相关的基因和/或反馈抑制脱敏相关的基因，获得基因增强菌株。
基因增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；
2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；
3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；
4)通过将强启动子(如Ptuf)与所述基因可操作地连接而增强；
5)通过导入增强子而增强；
6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强。
第二方面，本发明提供按照所述方法构建得到的高产L-赖氨酸工程菌。
第三方面，本发明提供所述工程菌在L-赖氨酸发酵生产中的应用。
第四方面，本发明提供一种提高L-赖氨酸发酵产量的方法，包括如下步骤：
1)培养所述工程菌，以获得微生物的培养物；
2)从步骤1)中获得的所述培养物中收集L-赖氨酸。
第五方面，本发明提供阳离子跨膜转运蛋白突变体，所述突变体包含阳离子跨膜转运蛋白第130位氨基酸由G到除G之外的其它氨基酸(如D、I、E或K，优选I)的突变。
第六方面，本发明提供编码所述突变体的核酸分子。
第七方面，本发明提供含有编码所述突变体的核酸分子的生物材料。
所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
第八方面，本发明提供编码所述突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料的以下任一应用：
(1)用于L-赖氨酸的发酵生产；
(2)用于提高L-赖氨酸的发酵产量；
(3)用于构建产L-赖氨酸的基因工程菌。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明通过对棒杆菌属微生物中编码阳离子跨膜转运蛋白的基因进行修饰，使其表达的阳离子跨膜转运蛋白增强，和/或通过对阳离子跨膜转运蛋白进行突变(含G130*突变位点)，使得与未改造的微生物相比，具有增强的L-赖氨酸生产能力。
分别以2株谷氨酸棒杆菌模式株ATCC 13032和ATCC 14067为基因改造对象，通过基因工程方法将模式菌的野生型的阳离子跨膜转运蛋白的编码序列进行突变，使其蛋白序列的第130位发生突变，由甘氨酸突变为天冬氨酸，或突变为异亮氨酸，或突变为谷氨酸，或突变为赖氨酸。携带以上突变体的模式菌进行摇瓶发酵，其赖氨酸产率具有提升效果。谷氨酸棒杆菌ATCC 13032和ATCC 14067是谷氨酸棒杆菌模式菌株，属于本领域公知，以上菌株可从公开渠道购买获得，或从相关研究院所惠取。相关菌株的基因组序列已被公开，相关信息可从NCBI网站进行查询。
以产赖棒杆菌CGMCC No.13407(谷氨酸棒杆菌，参见CN106635944A)和CGMCCNo.11942(谷氨酸棒杆菌，参见CN105734004B)为基因改造对象，阳离子跨膜转运蛋白突变体应用于棒杆菌发酵生产赖氨酸，改造后的菌株具有显著的转化率提升效果。
具体实施方式
本发明提供一种重组菌株，其阳离子跨膜转运蛋白的表达增强，可使赖氨酸产量得到提高。增强方式可以采用代谢工程领域内常规技术手段，如启动子调控区的改变，或增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数，或氨基酸序列的改变。氨基酸序列的改变优选其第130位氨基酸发生突变，由甘氨酸突变为其他氨基酸，优选天冬氨酸、异亮氨酸、谷氨酸或赖氨酸，赖氨酸产量均得到提升。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中涉及的引物名称及序列如表1所示。
表1引物信息
Cgl2072、Cgl2072G130D、Cgl2072G130I、Cgl2072G130E、Cgl2072G130K的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-5所示，编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6-10所示。
实施例1在模式菌ATCC 13032中引入突变基因Cgl2072G130D
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，以Cgl2072-1f/Cgl2072-1r引物对进行PCR扩增，得到上游同源臂片段13032-Cgl2072-up；以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，以Cgl2072G130D-2f/Cgl2072-2r引物对进行PCR扩增，得到下游同源臂片段13032-Cgl2072-dn。以13032-Cgl2072-up和13032-Cgl2072-dn两片段混合物为模板，以Cgl2072-1f/Cgl2072-2r引物对进行PCR扩增，得到片段13032-up-dn，将13032-up-dn用BamHI、NheI进行双酶切，载体pK18mobsacB(GenBank:FJ437239.1；由中国科学院上海生命科学院杨晟老师惠赠，也可以从公开渠道购买获得)用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-13032-Cgl2072G130D。
按照谷氨酸棒杆菌手册(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备ATCC 13032的感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-13032-Cgl2072G130D以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。将筛得的转化子过夜培养于普通BHI液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固体培养基上，33℃静置培养48h。长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列和核苷酸测序分析，获得带有突变基因Cgl2072G130D的菌株，命名为13032-Cgl2072G130D。
实施例2在模式菌ATCC 13032中引入突变基因Cgl2072G130I
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-13032-Cgl2072G130I转入模式菌ATCC 13032中，获得阳离子跨膜转运蛋白130位氨基酸突变为异亮氨酸的重组菌株，菌株命名为13032-Cgl2072G130I。
实施例3在模式菌ATCC 13032中引入突变基因Cgl2072G130E
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-13032-Cgl2072G130E转入模式菌ATCC 13032中，获得阳离子跨膜转运蛋白130位氨基酸突变为谷氨酸的重组菌株，菌株命名为13032-Cgl2072G130E。
实施例4在模式菌ATCC 13032中引入突变基因Cgl2072G130K
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-13032-Cgl2072G130K转入模式菌ATCC 13032中，获得阳离子跨膜转运蛋白130位氨基酸突变为赖氨酸的重组菌株，菌株命名为13032-Cgl2072G130K。
实施例5在模式菌ATCC 14067中引入突变基因Cgl2072G130D
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-14067-Cgl2072G130D转入模式菌ATCC 14067中，获得阳离子跨膜转运蛋白130位氨基酸突变为天冬氨酸的重组菌株，菌株命名为14067-Cgl2072G130D。
实施例6在模式菌ATCC14067中引入突变基因Cgl2072G130I
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-14067-Cgl2072G130I转入模式菌ATCC 14067中，获得阳离子跨膜转运蛋白130位氨基酸突变为异亮氨酸的重组菌株，菌株命名为14067-Cgl2072G130I。
实施例7在模式菌ATCC 14067中引入突变基因Cgl2072G130E
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-14067-Cgl2072G130E转入模式菌ATCC 13032中，获得阳离子跨膜转运蛋白130位氨基酸突变为谷氨酸的重组菌株，菌株命名为14067-Cgl2072G130E。
实施例8在模式菌ATCC 14067中引入突变基因Cgl2072G130K
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-14067-Cgl2072G130K转入模式菌ATCC 13032中，获得阳离子跨膜转运蛋白130位氨基酸突变为谷氨酸的重组菌株，菌株命名为14067-Cgl2072G130K。
实施例9摇瓶测试2株模式菌引入阳离子跨膜转运蛋白突变体后的发酵性能
赖氨酸发酵实验使用的培养基如下：
种子活化培养基：BHI 37g/L，18g/L琼脂粉。
种子培养基：蔗糖20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，尿素5g/L，七水硫酸镁0.4g/L，调节pH至7.0。
发酵培养基：葡萄糖60g/L，硫酸铵25g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，七水硫酸镁1.0g/L，豆粕水解液10g/L，碳酸钙30g/L，调节pH至7.0。
赖氨酸发酵方法如下：
1、种子活化：从冻存管中取待验证菌株，在种子活化培养基上划线活化，33℃培养24h；
2、种子培养：挑取平板活化种子1环接至装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，33℃，220r/min振荡培养6h；
3、发酵培养：将2mL种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养14-15h，每株菌做三个平行。
4、OD562测定：取100μl发酵液稀释适当倍数，使用分光光度计在波长562处检测OD，每株菌做三个平行，计算平均值，检测到的OD562如表2所示。
5、赖氨酸浓度测定：取2mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测重组菌与对照菌发酵液中的L-赖氨酸含量，每株菌做三个平行，计算平均值，检测到的赖氨酸浓度如表2所示。
表2重组菌株的赖氨酸产量和生长检测
菌株 L-赖氨酸(g/L) 糖酸转化率％ OD562
ATCC 13032 0.5 0.83％ 40.0
13032-Cgl2072G130D 0.68 1.13％ 40.4
13032-Cgl2072G130I 0.71 1.18％ 40.6
13032-Cgl2072G130E 0.70 1.17％ 40.2
13032-Cgl2072G130K 0.69 1.15％ 40.5
ATCC 14067 0.42 0.70％ 37.8
14067-Cgl2072G130D 0.66 1.10％ 37.6
14067-Cgl2072G130I 0.78 1.30％ 37.9
14067-Cgl2072G130E 0.72 1.20％ 37.7
14067-Cgl2072G130K 0.70 1.17％ 37.6
检测发酵液中的赖氨酸含量，发现携带有阳离子跨膜转运蛋白突变体的谷氨酸棒杆菌的培养液中的赖氨酸浓度更高。
前述实施例证明突变的阳离子跨膜转运蛋白对模式菌株的赖氨酸合成具有促进作用，进一步在赖氨酸生产菌上进行突变效果的验证。使用2株实验室保藏的赖氨酸生产菌CGMCC No.13407和CGMCC No.11942进行验证。CGMCC No.13407和CGMCC No.11942由模式菌ATCC13032经过基因改造获得，其赖氨酸合成相关基因得到了强化改造。
实施例10在CGMCC No.13407中引入突变基因Cgl2072G130D
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-13032-Cgl2072G130D转入CGMCC No.13407中，获得阳离子跨膜转运蛋白130位氨基酸突变为天冬氨酸氨酸的重组菌株，菌株命名为13407-Cgl2072G130D。
实施例11在CGMCC No.13407中引入突变基因Cgl2072G130I
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-13032-Cgl2072G130I转入CGMCC No.13407中获得阳离子跨膜转运蛋白130位氨基酸突变为异亮氨酸的重组菌株，菌株命名为13407-Cgl2072G130I。
实施例12在CGMCC No.13407中引入突变基因Cgl2072G130E
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-13032-Cgl2072G130E转入CGMCC No.13407中获得阳离子跨膜转运蛋白130位氨基酸突变为谷氨酸的重组菌株，菌株命名为13407-Cgl2072G130E。
实施例13在CGMCC No.13407中引入突变基因Cgl2072G130K
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-13032-Cgl2072G130K转入CGMCC No.13407中获得阳离子跨膜转运蛋白130位氨基酸突变为赖氨酸的重组菌株，菌株命名为13407-Cgl2072G130K。
实施例14赖氨酸发酵实验
参照实施例9的方法对CGMCC No.13407及其改造后的重组菌13407-Cgl2072G130D、13407-Cgl2072G130I、13407-Cgl2072G130E、13407-Cgl2072G130K进行发酵验证。赖氨酸发酵实验结果如表3所示。
表3重组菌株的赖氨酸产量和生长检测
菌株 L-赖氨酸(g/L) 糖酸转化率％ OD562
CGMCC No.13407 15.3 25.5％ 47.8
13407-Cgl2072G130D 16.2 27.0％ 46.5
13407-Cgl2072G130I 18.9 31.5％ 46.4
13407-Cgl2072G130E 18.6 31.0％ 46.6
13407-Cgl2072G130K 18.1 30.2％ 46.8
发酵结果表明，Cgl2072第130位氨基酸由甘氨酸(G)分别突变为天冬氨酸(D)、异亮氨酸(I)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)后，最终OD与出发菌株相当，但是赖氨酸产量均有提升，且突变为异亮氨酸(I)后效果更好，13407-Cgl2072G130I重组菌株L-赖氨酸产量较出发菌株提高3.6g/L，转化率较出发菌株提高6.0％。
基于上述突变体的检测结果，推测Cgl2072的其他增强方式也可能具有提高赖氨酸产量和转化率的作用，因此进一步进行了Cgl2072的其他强化改造方式。
实施例15在CGMCC No.13407中引入启动子增强的Cgl2072基因
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，以Cgl2072-tuf-1f/Cgl2072-tuf-1r引物对进行PCR扩增，得到上游同源臂片段13032-Cgl2072-tuf-up；以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，以Cgl2072-tuf-2f/Cgl2072-tuf-2r引物对进行PCR扩增，得到下游同源臂片段13032-Cgl2072-tuf–dn；以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，以Cgl2072-tuf-f/Cgl2072-tuf-r引物对进行PCR扩增，得到tuf启动子片段Ptuf。以13032-Cgl2072-up、13032-Cgl2072-dn和Ptuf三片段混合物为模板，以Cgl2072-tuf-1f/Cgl2072-tuf-2r引物对进行PCR扩增，得到片段13032-Ptuf，将13032-Ptuf用BamHI、NheI进行双酶切，载体pK18mobsacB(GenBank:FJ437239.1；由中国科学院上海生命科学院杨晟老师惠赠，也可以从公开渠道购买获得)用同样的酶双切。两酶切产物以T4 DNA Ligase进行连接，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-13032-Ptuf-Cgl2072。
按照谷氨酸棒杆菌手册(C.glutamicum Handbook，Charpter 23)制备ATCC 13407的感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-13032-Cgl2072G130D以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的BHI选择培养基上筛选转化子。将筛得的转化子过夜培养于普通BHI液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通BHI固体培养基上，33℃静置培养48h。长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列和核苷酸测序分析，获得Cgl2072带有启动子Ptuf的菌株，命名为13407-Ptuf-Cgl2072。
实施例16启动子增强的Cgl2072重组菌株性能测试
参照实施例9的方法对实施例15构建的重组菌株的性能进行测试，检测得到的赖氨酸产量和生长如表4所示。
表4重组菌株的赖氨酸产量和生长检测
菌株 L-赖氨酸(g/L) 糖酸转化率％ OD562
CGMCC No.13407 15.3 25.5％ 47.5
13407-Ptuf-Cgl2072 18.7 31.2％ 46.8
发酵结果表明，Cgl2072的启动子由强启动子Ptuf替换后，赖氨酸产量得到提升，重组菌株L-赖氨酸产量比出发菌株高3.4g/L，转化率提高5.7％。该实施例进一步说明通过增强阳离子跨膜转运蛋白的表达可以促进谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸。
为进一步验证阳离子跨膜转运蛋白表达增强对赖氨酸产量提升的效果，发明人进一步将该手段引入另一株赖氨酸生产菌CGMCC No.11942，考察对谷氨酸棒杆菌合成赖氨酸的影响。
实施例17在CGMCC No.11942中引入突变基因Cgl2072G130D
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-11942-Cgl2072G130D转入CGMCC No.11942中，获得阳离子跨膜转运蛋白130位氨基酸突变为天冬氨酸氨酸的重组菌株，菌株命名为11942-Cgl2072G130D。
实施例18在CGMCC No.11942中引入突变基因Cgl2072G130I
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-11942-Cgl2072G130I转入CGMCC No.11942中获得阳离子跨膜转运蛋白130位氨基酸突变为异亮氨酸的重组菌株，菌株命名为11942-Cgl2072G130I。
实施例19在CGMCC No.11942中引入突变基因Cgl2072G130E
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-11942-Cgl2072G130E转入CGMCC No.11942中获得阳离子跨膜转运蛋白130位氨基酸突变为谷氨酸的重组菌株，菌株命名为11942-Cgl2072G130E。
实施例20在CGMCC No.11942中引入突变基因Cgl2072G130K
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pK18mobsacB-11942-Cgl2072G130K转入CGMCC No.11942中获得阳离子跨膜转运蛋白130位氨基酸突变为赖氨酸的重组菌株，菌株命名为11942-Cgl2072G130K。
实施例21在CGMCC No.11942中引入启动子增强的Cgl2072基因
参照实施例15的方法，获得阳离子跨膜转运蛋白基因Cgl2072的启动子由强启动子Ptuf替换的重组菌株，菌株命名为11942-Ptuf-Cgl2072。
实施例22赖氨酸发酵实验
参照实施例9的方法对CGMCC No.11942及其改造后的重组菌11942-Cgl2072G130D、11942-Cgl2072G130I、11942-Cgl2072G130E、11942-Cgl2072G130K、11942-Ptuf-Cgl2072进行发酵验证。赖氨酸发酵实验结果如表5所示。
表5重组菌株的赖氨酸产量和生长检测
菌株 L-赖氨酸(g/L) 糖酸转化率％ OD562
CGMCC No.11942 18.2 30.3％ 39.3
11942-Cgl2072G130D 20.0 33.3％ 38.6
11942-Cgl2072G130I 21.9 36.5％ 38.5
11942-Cgl2072G130E 21.3 35.5％ 38.2
11942-Cgl2072G130K 21.0 35.0％ 38.6
11942-Ptuf-Cgl2072 21.7 36.2％ 38.9
发酵结果表明，同批次测试2种赖氨酸生产菌及携带有阳离子跨膜转运蛋白突变体的改造菌，携带有阳离子跨膜转运蛋白突变体的改造菌，其赖氨酸产量和糖酸转化率均有显著提高，且Cgl2072第130位氨基酸由甘氨酸(G)突变为异亮氨酸(I)后效果更好。
以上结果表明，本发明所提供的阳离子跨膜转运蛋白突变体对棒杆菌的赖氨酸产量和糖酸转化率均有促进作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.高产L-赖氨酸工程菌的构建方法，其特征在于，利用基因工程手段，增强棒杆菌属(Corynebacterium)微生物中编码阳离子跨膜转运蛋白的基因，使其与未改造的微生物相比，具有增强的L-赖氨酸生产能力；和/或，
利用基因工程手段，在棒杆菌属微生物基因组中引入突变，使其编码的阳离子跨膜转运蛋白包含G130*突变位点；其中，*表示除G之外的氨基酸；
所述阳离子跨膜转运蛋白在NCBI上的参考序列编号为Cgl2072。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，*为D、I、E或K，优选I。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述棒杆菌属微生物为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
A、弱化原始菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因，获得基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因的表达；或者，
B、增强原始菌株中与L-赖氨酸生物合成途径相关的基因和/或反馈抑制脱敏相关的基因，或者增强步骤A基因弱化菌株中与L-赖氨酸生物合成途径相关的基因和/或反馈抑制脱敏相关的基因，获得基因增强菌株；
基因增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；
2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；
3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；
4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；
5)通过导入增强子而增强；
6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述强启动子为Ptuf。
6.按照权利要求1-5所述方法构建得到的高产L-赖氨酸工程菌。
7.权利要求6所述工程菌在L-赖氨酸发酵生产中的应用。
8.提高L-赖氨酸发酵产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)培养权利要求6所述工程菌，以获得微生物的培养物；
2)从步骤1)中获得的所述培养物中收集L-赖氨酸。
9.阳离子跨膜转运蛋白突变体，其特征在于，所述突变体包含阳离子跨膜转运蛋白第130位氨基酸由G到除G之外的其它氨基酸的突变；
优选地，所述突变体包含阳离子跨膜转运蛋白第130位氨基酸由G到D、I、E或K的突变，更优选由G到I的突变；
所述阳离子跨膜转运蛋白在NCBI上的参考序列编号为Cgl2072。
10.编码权利要求9所述突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料的以下任一应用：
(1)用于L-赖氨酸的发酵生产；
(2)用于提高L-赖氨酸的发酵产量；
(3)用于构建产L-赖氨酸的基因工程菌；
其中，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
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CN119101136A (zh) * 2024-11-08 2024-12-10 山东寿光巨能金玉米开发有限公司 一种甘氨酸甜菜碱转运蛋白突变体及其应用

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