CN118217236A

CN118217236A - 一种含重组iii型人源化胶原蛋白的润眼液及制备方法

Info

Publication number: CN118217236A
Application number: CN202410340763.4A
Authority: CN
Inventors: 杨霞; 何振瑞; 闫欣; 姚丽平; 段家印; 张国梁; 展梦瑶; 杨鑫
Original assignee: Shanxi Jinbo Bio Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Shanxi Jinbo Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2024-03-25
Filing date: 2024-03-25
Publication date: 2024-06-21
Anticipated expiration: 2044-03-25

Abstract

本申请涉及护眼液技术领域，具体提供了一种含重组III型人源化胶原蛋白的润眼液；按照组分的总质量计，所述润眼液的组分包括透明质酸钠0.02‑1％、缓冲盐0.01‑0.5％、渗透压调节剂0.5‑1.5％、重组III型人源化胶原蛋白0.001‑0.1％、溶剂补充余量为100％。通过优化透明质酸钠的分子量、体系pH等和重组III型人源化胶原蛋白共同作用，使本申请的润眼液具有长效保湿和舒缓效果，还能有效在眼球周围滞留，对眼球基本不产生刺激和不适感。

Description

一种含重组III型人源化胶原蛋白的润眼液及制备方法

技术领域

本发明涉及护眼液技术领域，A61K9/08，尤其涉及一种含重组III型人源化胶原蛋白的润眼液及制备方法。

背景技术

随着人们工作压力的增加，电子产品的日益更新，越来越长时间的使用电脑、手机等电子产品，导致眼部干涩、眼疲劳、眼部炎症等症在人们的日常生活中尤为常见。市场上针对以上眼部症状的大部分人工泪液成分包括透明质酸钠、维生素、牛磺酸、冰片、薄荷等中的几种，这种人工泪液可提供眼部舒缓和滋润、减少红血丝和疲劳感等效果。但是，这些人工泪液无法从根本上改变眼部细胞组织病状从而解决以上问题；此外，这些人工泪液容易被洗出，无法有效滞留在眼球周围而起到长效保湿、舒缓和治疗效果。

中国专利CN105214071A公开了一种纤连蛋白类滴眼液及其制备方法，该专利的主要成分为纤连蛋白、玻璃酸钠和助剂，纤连蛋白的含量为50μg/mL～500μg/mL，玻璃酸钠的含量为0.1％-0.3％，助剂为等渗调节剂、pH调节剂、注射水；该专利将将纤连蛋白和玻璃酸钠联合使用，借助协同作用延长药物作用时间，大大增强对眼角膜的修复、保护作用。中国专利CN107802597B公开了一种玻璃酸钠组合物，包括平均分子量在40-200万之间的高分子量玻璃酸钠、平均分子量在0.5-2万的低分子量玻璃酸钠、辅料和注射用水，通过低分子量玻璃酸钠与高分子量玻璃酸钠协同作用更有效治疗干眼。但是，以上专利对所述眼部症状的治疗效果仍然有限。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种含重组III型人源化胶原蛋白的润眼液；按照组分的总质量计，所述润眼液的组分包括透明质酸钠0.02-1％、缓冲盐0.01-0.5％、渗透压调节剂0.5-1.5％、重组III型人源化胶原蛋白0.001-0.1％、溶剂补充余量为100％。

进一步地，按照组分的总质量计，所述润眼液的组分包括透明质酸钠0.05-0.5％、缓冲盐0.02-0.1％、渗透压调节剂0.5-1.2％、重组III型人源化胶原蛋白0.005-0.05％、溶剂补充余量为100％。

在一种优选的实施方式中，按照组分的总质量计，所述润眼液的组分包括透明质酸钠0.07-0.12％、缓冲盐0.02-0.05％、渗透压调节剂0.5-1.0％、重组III型人源化胶原蛋白0.005-0.02％、溶剂补充余量为100％。

进一步地，所述缓冲盐包括但不限于磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硼酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐中的至少一种。

进一步地，所述磷酸盐包括但不限于磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的至少一种。

进一步地，所述碳酸盐包括但不限于碳酸钠、碳酸钾中的至少一种。

进一步地，所述碳酸氢盐包括但不限于碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵中的至少一种。

进一步地，所述缓冲盐包括磷酸盐；所述磷酸盐包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。

进一步地，按照组分的总质量计，所述磷酸盐包括0.01-0.05％的磷酸氢二钠和0.005-0.02％的磷酸二氢钠。

在一种优选的实施方式中，按照组分的总质量计，所述磷酸盐包括0.01-0.05％的无水磷酸氢二钠和0.005-0.02％的一水合磷酸二氢钠。

进一步地，所述渗透压调节剂包括但不限于硝酸钠、硝酸钾、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、甘油、丙二醇、甘露醇、山梨醇、葡萄糖中的至少一种。

进一步地，所述渗透压调节剂包括氯化钠。

进一步地，所述透明质酸钠的平均分子量为100-200万，优选为120-180万。

更优选地，所述透明质酸钠的平均分子量为140-160万，可选择的如140万、145万、150万、155万、160万等中的至少一种。

透明质酸钠具有高亲水性，每个透明质酸分子可以吸收自身体重500-1000倍水分，将其用于护眼液中可对眼部提供良好的润湿效果，但是不同分子量的透明质酸钠保水性存在明显差异，本申请规定透明质酸钠的平均分子量为140-160万时，不仅可以提高润眼液的保水性和在眼部的滞留，还能进一步使润眼液的渗透压保持在270～310mOsmol/kg的范围内；这是因为140-160万平均分子量的透明质酸钠分子链长度合适，分子间通过羟基、羧基、酰胺基团形成的氢键作用和静电作用等可以保证水分、药物可以被锁在其三维交联结构内，在眼球周围更长久的滞留，并起到持续保湿和治疗功效；更加特别的是，该平均分子量条件下可以保证透明质酸钠具有特定的分子数量，进一步和氯化钠共同作用保证润眼液的渗透压保持在270～310mOsmol/kg，使润眼液对于眼部基本无刺激性。一般而言，当透明质酸钠的平均分子量过高时，润眼液的黏度太大不容易操作使用，且润眼液储存过程中易出现沉淀或絮凝，平均分子量过低时，将导致润眼液的渗透压增高，可能造成眼组织干燥、不适的情况。

进一步地，所述润眼液的组分还包括0.002-0.1％的其他成分。

进一步地，所述其他成分包括但不限于维生素、依地酸二钠、红霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、溴芬酸钠中的至少一种。

优选地，所述其他成分包括维生素和依地酸二钠。

进一步优选地，按照组分的总质量计，所述其他成分包括0.005-0.03％的维生素和0.002-0.01％的依地酸二钠。

进一步地，所述维生素包括但不限于维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B6、维生素B9、维生素B12中的至少一种。

优选地，所述维生素包括维生素B12。

进一步地，所述溶剂为医学上可接受的水，包括但不限于纯化水、注射水等；优选为注射水。

其次，本申请还提供了所述含重组III型人源化胶原蛋白的润眼液的制备方法，包括以下步骤：

(1)将除重组III型人源化胶原蛋白外的组分置于灭菌后的容器中混合搅拌，灭菌处理，得到基质；

(2)对基质降温，调节基质pH为6-8；

(3)加入重组III型人源化胶原蛋白混合均匀即可。

进一步地，所述步骤(1)中灭菌采用加热灭菌，加热温度为121-134℃，加热时间为5-30min。

在一种优选的实施方式中，所述加热温度为121℃，加热时间为15-20min。

进一步地，所述步骤(2)中基质的pH值为6.5-7.5，可选择的如6.5、6.8、7.0、7.2、7.5等。透明质酸钠的分子间作用力受到pH的调控，当pH为6-8时，透明质酸钠水溶液的动力黏度相对平稳，但是在6.5-7.5的pH下，其分子的表面电荷产生的静电力可以和氢键等产生最优异的共同作用，稳定药物成分和重组III型人源化胶原蛋白进入交联网络并被稳定释放，提高润眼液中有效成分在眼部周围的滞留，增强润眼效果；当pH过高或过低时，均会引起透明质酸钠水溶液的粘度异常，不仅不利于润眼液的动力黏度，还不利于其治疗效果。

进一步地，所述重组III型人源化胶原蛋白的润眼液的渗透压为270-310mOsm/kg。

进一步地，所述重组III型人源化胶原蛋白的润眼液用于眼球的清洗、润滑保湿、干眼症日常护理、角膜损伤创面的修复过程中。

进一步地，所述润眼液可使用滴入法或注射法使用。

有益效果

1、本申请利用重组III型人源化胶原蛋白的全人源、水溶性强、高生物活性、、有效补充缺损的胶原蛋白、促进组织细胞再生等特点从根本上改善眼球环境，和透明质酸钠、其他成分共同作用实现了润眼液的长效保湿和舒缓效果；

2、本申请优化透明质酸钠的平均分子量为140-160万，提高润眼液的润湿、保湿和滞留效果，并使润眼液的渗透压保持在270～310mOsmol/kg，使本申请的润眼液对眼球基本不产生刺激和不适感；

3、本申请优化基质的pH为6.5-7.5，可进一步控制透明质酸钠的交联强度，提高润眼液中有效成分在眼部周围的滞留，增强润眼效果。

附图说明

附图1：实施例4润眼液稀释成不同的蛋白浓度后的细胞迁移实验结果；

附图2：实施例1润眼液稀释成不同的蛋白浓度后的细胞迁移实验结果；

附图3：实施例4润眼液稀释成不同的蛋白浓度后的细胞粘附性测试结果；

附图4：实施例1润眼液稀释成不同的蛋白浓度后的细胞粘附性测试结果。

具体实施方式

实施例

实施例1

本实施例提供了一种含重组III型人源化胶原蛋白的润眼液；按照组分的总质量计，所述润眼液的组分包括透明质酸钠0.1％、缓冲盐0.03％、渗透压调节剂0.85％、重组III型人源化胶原蛋白0.01％、维生素B12 0.015％、依地酸二钠0.005％、溶剂补充余量为100％。

所述透明质酸钠的平均分子量为150万，购自众山生物科技有限公司。

所述缓冲盐为无水磷酸氢二钠0.02％、一水合磷酸二氢钠0.01％。

所述渗透压调节剂为氯化钠。

所述重组III型人源化胶原蛋白为本公司自行生产并于2019年11月22日在申请号为ZL201811438582.6的中国专利上公开的重组III型人源化胶原蛋白。

所述溶剂为注射水。

一种含重组III型人源化胶原蛋白的润眼液的制备方法，包括以下步骤：

(1)将透明质酸钠、缓冲盐、渗透压调节剂、维生素B12、依地酸二钠和溶剂置于灭菌后的容器中混合搅拌均匀，在121℃下灭菌处理15min，得到基质；

(2)对基质降温，调节基质pH为7.2；

(3)加入重组III型人源化胶原蛋白混合均匀，检测pH和渗透压合格即可。

实施例2

本实施例提供了一种含重组III型人源化胶原蛋白的润眼液；按照组分的总质量计，所述润眼液的组分包括透明质酸钠0.07％、缓冲盐0.02％、渗透压调节剂0.5％、重组III型人源化胶原蛋白0.005％、维生素B12 0.005％、依地酸二钠0.002％、溶剂补充余量为100％。

所述透明质酸钠的平均分子量为160万，购自众山生物科技有限公司。

所述缓冲盐为无水磷酸氢二钠0.015％、一水合磷酸二氢钠0.005％。

所述渗透压调节剂为氯化钠。

所述重组III型人源化胶原蛋白为本公司自行生产并于2019年11月22日在申请号为ZL201811438582.6的中国专利上公开的重组III型人源化胶原蛋白。所述溶剂为注射水。

(2)对基质降温，调节基质pH为7.5；

实施例3

本实施例提供了一种含重组III型人源化胶原蛋白的润眼液；按照组分的总质量计，所述润眼液的组分包括透明质酸钠0.12％、缓冲盐0.05％、渗透压调节剂1.0％、重组III型人源化胶原蛋白0.02％、维生素B12 0.03％、依地酸二钠0.01％、溶剂补充余量为100％。

所述透明质酸钠的平均分子量为140万，购自众山生物科技有限公司。

所述缓冲盐为无水磷酸氢二钠0.04％、一水合磷酸二氢钠0.01％。

所述渗透压调节剂为氯化钠。

(2)对基质降温，调节基质pH为6.5；

实施例4

本实施例提供了一种含重组III型人源化胶原蛋白的润眼液；按照组分的总质量计，所述润眼液的组分包括透明质酸钠0.1％、缓冲盐0.03％、渗透压调节剂0.85％、重组III型人源化胶原蛋白0.01％、溶剂补充余量为100％。

所述渗透压调节剂为氯化钠。

(1)将透明质酸钠、缓冲盐、渗透压调节剂和溶剂置于灭菌后的容器中混合搅拌均匀，在121℃下灭菌处理15min，得到基质；

(2)对基质降温，调节基质pH为7.2；

性能测试方法：

1、理化性质检验项目：按照《中华人民共和国药典》(2020年版)四部通则进行，包括相对密度、渗透压、动力黏度(第三法旋转黏度计测定法)、pH值、微量元素、炽灼残渣、外源性DNA残留、无菌、细菌内毒素(凝胶法)、热原等；实施例的方案均符合表1指标。

表1

2、细胞迁移测试：(1)实验分组:基础培养基(或血清浓度不高于2％)为对照，重组III型人源化胶原蛋白含量0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL的润眼液为供试品。(2)记号定位:用Marker笔在24孔板背面每隔0.5cm划线，方便后续拍照定位。按每孔约(5～15)×104个播种细胞，具体播种数量可根据细胞不同而调整。每组3个复孔。(3)细胞划痕:细胞培养24小时后用牙签比着直尺垂直于横线(也可用划痕专用细胞培养皿)，向下轻推纵向划线形成划痕，用PBS漂洗细胞3次，去除划掉的细胞，加入500L无血清培养基配制的供试品和对照液。(4)细胞拍照:在37℃，5％CO₂培养箱培养，于0h、12、24h，以横向和纵向划线的交点为核心，在10倍显微镜下拍照。(5)数据处理:用ImageJ软件测量划痕面积并计算细胞每组的细胞迁移速率，或者用划痕宽度机选细胞迁移率。公式如下：

细胞迁移速率＝固定划痕区移行细胞的总面积/初始划痕区面积×100％；细胞迁移率＝(0h划痕宽度－培养后划痕宽度)/0h划痕宽度×100％；相对细胞迁移率＝实验组细胞迁移率/对照组细胞迁移率；(6)统计分析:使用双尾t-test统计分析目标重组人源化胶原蛋白与阴性对照牛的统计学差异，其中*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。测试结果见附图1和附图2。

结果：附图1为不同蛋白浓度下的实施例4润眼液作为供试品的细胞迁移实验结果，与阴性组相比，实施例4润眼液在其中重组III型人源化胶原蛋白0.5mg/mL与1mg/mL的实验浓度下的相对细胞迁移率分别为113.0％和119.9％；证明本申请实施例4的润眼液对细胞迁移有促进作用。附图2为不同蛋白浓度下的实施例1润眼液作为供试品的细胞迁移实验结果，与阴性组相比，润眼液在0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.5mg/mL与1mg/mL实验浓度下的相对细胞迁移率分别为107.8％，108.7％，123.6％，125.5％，证明本申请实施例1的润眼液对细胞迁移有更加明显的促进作用。

3、细胞粘附性：(1)样本准备：使用D-PBS将实施例的润眼液稀释到重组III型人源化胶原蛋白浓度为0.01mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL的浓度备用；将阳性对照含牛I型胶原蛋白的润眼液(PC)按照上述方法制备成1mg/mL备用；阴性对照为D-PBS缓冲液(NC)。(2)包被：在酶标板中分别加入不同浓度的胶原蛋白及阳性对照和阴性对照，每孔100μL,每组设置5个复孔，4℃孵育过夜。(3)封闭：弃去上清，加入100μL 1％BSA(56℃热灭活30min)，37℃孵育60min。弃去上清，用D-PBS溶液清洗3次。(4)细胞接种：每孔中加入105个D-PBS重悬的培养状态良好3T3/NIH细胞，37℃孵育120min。每孔用D-PBS溶液清洗3次。(5)检测：用CCK8检测试剂盒检测OD450nm的吸光度。根据如下公式，计算细胞的贴壁程度(细胞的贴壁率即可以反应胶原蛋白的细胞粘附能力；细胞粘附能力越高，越能在短时间给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁)：

式中：

P：相对细胞粘附性比值；

OD₁：测试胶原蛋白样品各复孔在450nm处的紫外吸光度平均值；OD₂：对照胶原蛋白样品各复孔在450nm处的紫外吸光度平均值；OD₀：空白对照组各复孔在450nm处的紫外吸光度平均值。

(6)统计分析：使用双尾t-test统计分析目标重组人源化胶原蛋白与阴性对照的统计学差异，其中*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001。结果见附图3-4。

结果：附图3和附图4分别为实施例4和实施例1的润眼液原液，和将其稀释到不同蛋白浓度后的细胞粘附性测试结果，由附图3-4可知，与阴性组相比，不同浓度的实施例1和实施例4的润眼液均对细胞粘附有促进作用。

Claims

1.一种含重组III型人源化胶原蛋白的润眼液，其特征在于，按照组分的总质量计，所述润眼液的组分包括透明质酸钠0.02-1％、缓冲盐0.01-0.5％、渗透压调节剂0.5-1.5％、重组III型人源化胶原蛋白0.001-0.1％、溶剂补充余量为100％。

2.根据权利要求1所述的润眼液，其特征在于，按照组分的总质量计，所述润眼液的组分包括透明质酸钠0.05-0.5％、缓冲盐0.02-0.1％、渗透压调节剂0.5-1.2％、重组III型人源化胶原蛋白0.005-0.05％、溶剂补充余量为100％。

3.根据权利要求1所述的润眼液，其特征在于，所述缓冲盐包括磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硼酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的润眼液，其特征在于，所述透明质酸钠的平均分子量为100-200万。

5.根据权利要求1所述的润眼液，其特征在于，所述透明质酸钠的平均分子量为120-180万。

6.根据权利要求1所述的润眼液，其特征在于，所述透明质酸钠的平均分子量为140-160万。

7.根据权利要求6所述的润眼液，其特征在于，所述渗透压调节剂包括硝酸钠、硝酸钾、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、甘油、丙二醇、甘露醇、山梨醇、葡萄糖中的至少一种。

8.根据权利要求1-7任一项所述的润眼液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)对基质降温，调节基质pH为6-8；

(3)加入重组III型人源化胶原蛋白混合均匀即可。

9.根据权利要求8所述的润眼液的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中灭菌采用加热灭菌，加热温度为121-134℃，加热时间为5-30min。

10.根据权利要求8所述的润眼液的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中基质的pH值为6.5-7.5。