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CN118215680A - 在治疗疾病中应用的多特异性抗体 - Google Patents

在治疗疾病中应用的多特异性抗体 Download PDF

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CN118215680A
CN118215680A CN202280061199.1A CN202280061199A CN118215680A CN 118215680 A CN118215680 A CN 118215680A CN 202280061199 A CN202280061199 A CN 202280061199A CN 118215680 A CN118215680 A CN 118215680A
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CN
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cancer
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multispecific antibody
cells
cell
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I·阿米特
R·达汉
Y·沙皮尔
O·巴伯伊
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Original Assignee
Yeda Research and Development Co Ltd
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Abstract

提供了多特异性抗体。所述抗体包含能特异性结合至肿瘤内T细胞上的免疫检查点蛋白的第一抗原结合部分和能特异性结合至常规树突细胞1(cDC1)的第二抗原结合部分。还提供了此类抗体在癌症治疗中的用途。

Description

在治疗疾病中应用的多特异性抗体
相关申请
本申请要求2021年9月14日提交的以色列专利申请第286430号的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。
序列表声明
与本申请同时提交的ASCII文件名为93949.xml，创建于2022年9月14日，包含52,075个字节，通过引用将其纳入本文。
发明领域和背景
在一些实施方式中，本发明涉及在治疗疾病中应用的多特异性抗体。
近年来，免疫疗法为多种癌症的治疗带来了革命性的变化。检查点抑制剂疗法是一种极具前景的免疫疗法。癌细胞通过“劫持”免疫检查点来躲避免疫系统，免疫检查点是抑制免疫系统活动的信号通路。检查点抑制剂疗法阻断免疫细胞的这种抑制性信号传导，从而允许免疫系统攻击恶性细胞。被批准的检查点抑制剂(诸如抗PD1单克隆抗体(mAb))已经成为许多癌症类型的一线治疗方法。然而，大多数患者对这些抑制剂没有反应，而另一些患者则会迅速产生耐药性。因此，寻找提高这种疗法疗效的方法是一项重要的研究目标。
肿瘤细胞会被具有细胞毒性的T细胞亚型摧毁。这些细胞通过识别并结合I类MHC分子来识别癌细胞，这种相互作用需要被称为CD8的糖蛋白的存在。因此，细胞毒性T细胞也被称为CD8+T细胞。然而，最近一项探索肿瘤微环境(TME)中抗PD-1药效学的研究表明，T细胞和树突细胞(DC)之间的相互作用对于抗PD-1疗法的成功至关重要。此外，研究还表明，1型常规树突细胞(cDC1)对于抗肿瘤免疫至关重要[1]。这种T细胞-DC串扰涉及抗PD-1活化的T细胞释放IFN-γ和肿瘤浸润的DC释放白细胞介素12(IL-12)，这两类细胞间的反式作用有效刺激抗肿瘤T细胞免疫。
背景技术包括美国专利申请第20210130438号。
发明内容
根据本发明一些实施方式的方面，提供了一种多特异性抗体，其包含能特异性结合至肿瘤内T细胞上的免疫检查点蛋白的第一抗原结合部分和能特异性结合至常规树突细胞1(cDC1)的第二抗原结合部分。
根据本发明一些实施方式的方面，提供了包含本文所述的多特异性抗体的药物组合物。
根据本发明一些实施方式的方面，提供了编码本文所述多特异性抗体的重链和/或轻链的核酸序列。
根据本发明一些实施方式的方面，提供了包含本文所述核酸的表达载体。
根据本发明一些实施方式的方面，提供了用本文所述的表达载体转化的细胞。
根据本发明一些实施方式的方面，提供了制备多特异性抗体的方法，其包括：
(a)在允许多特异性抗体表达的条件下培养本文所述的细胞；以及
(b)从细胞中分离多特异性抗体。
根据本发明一些实施方式的方面，提供了治疗有需要的对象中的癌症的方法，所述方法包括向对象给予治疗有效量的如权利要求20所述的药物组合物，从而治疗对象中的癌症。
根据本发明的一些实施方式，免疫检查点蛋白选自以下组：PD-1、CTLA-4、TIGIT、LAG-3、TIM-3、ICOS、BTLA、4-1BB、GITR和OX-40。
根据本发明的一些实施方式，第一抗原结合部分阻止T细胞的PD-1与PDL-1表达细胞的结合。
根据本发明的一些实施方式，第二抗原结合部分结合XCR1或C1ec9a。
根据本发明的一些实施方式，免疫检查点蛋白是PD-1。
根据本发明的一些实施方式，第一抗原结合部分在具有N到C方向的重链中包含如SEQ ID NO：1-3所示的互补决定区，在具有N至C方向的轻链中包含如SEQ ID NO：4-6所示的互补决定区。
根据本发明的一些实施方式，第一抗原结合部分在具有N到C方向的重链中包含如SEQ ID NO：11-13所示的互补决定区，在具有N至C方向的轻链中包含如SEQ ID NO：14-16所示的互补决定区。
根据本发明的一些实施方式，第二抗原结合部分在具有N到C方向的重链中包含如SEQ ID NO：21-23所示的互补决定区，在具有N至C方向的轻链中包含如SEQ ID NO：24-26所示的互补决定区。
根据本发明的一些实施方式，第二抗原结合部分在具有N到C方向的重链中包含如SEQ ID NO：31-33所示的互补决定区，在具有N至C方向的轻链中包含如SEQ ID NO：34-36所示的互补决定区。
根据本发明的一些实施方式，所述多特异性抗体的Fc区包含用于减少所述抗体与FcγR的结合的突变。
根据本发明的一些实施方式，多特异性抗体包含杵臼型突变。
根据本发明的一些实施方式，突变位于所述多特异性抗体中包含Y349C/T366S/L368A/Y407V的第一抗体的CH3结构域和所述多特异性抗体中包含S354C/T366W的第二抗体的CH3结构域中。
根据本发明的一些实施方式，所述第一部分包含如以下所示的氨基酸序列：SEQID NO：7和8；或SEQ ID NO：17和18。
根据本发明的一些实施方式，所述第一部分包含如以下所示的氨基酸序列：SEQID NO：27和28；或SEQ ID NO：37和38。
根据本发明的一些实施方式，多特异性抗体是双特异性抗体。
根据本发明的一些实施方式，多特异性抗体用于治疗癌症。
根据本发明的一些实施方式，癌症的特征在于具有高于预定水平的T细胞：树突细胞比率。
根据本发明的一些实施方式，癌症选自以下组：膀胱癌、乳腺癌、子宫/宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤和病毒相关癌症。
除非另外定义，本发明使用的所有技术和/或科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然在本发明实施方式的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但下文描述了示例性方法和/或材料。若有抵触，以包括定义在内的专利说明书为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意为必定具有限制性。
附图简要说明
本文通过仅示例性的方式，参考附图来描述本发明的一些实施方式。现在详细参考附图，要强调的是，所示细节是示例性的，并且用于对本发明实施方式进行说明性论述的目的。就此而言，结合附图的描述，如何实施本发明的实施方式对于本领域技术人员而言是显而易见的。
在附图中：
图1A-D显示有效的PD-1免疫疗法依赖于T/DC串扰。(A)经抗PD-1治疗后，肿瘤、脾脏和引流淋巴结的CD8+T细胞的全面性scRNA图谱。(B)对抗PD-1治疗有显著响应的细胞毒性T细胞亚群。(C)DC趋化配体XCL1在PD-1响应性CD8+细胞毒性T细胞亚群中高度且独特地表达。(D)使用XCR1-iDTR模型在αPD-1给予的活性阶段暂时耗尽cDC1，会消除MC38肿瘤模型中预期的抗肿瘤反应。皮下接种肿瘤细胞。接种后7天，当肿瘤达到约50mm3时开始治疗。治疗注射三次，间隔三天。从接种后第4天开始，每隔一天以20ng/g体重注射白喉毒素。(n＝20只小鼠/组，p＝0.0204，p＝0.0001，p＝0.0001和p＝＜0.0001，斯式t检验)。
图2A-C显示了双特异型抗体的生成和表征。(A)双特异性T细胞/DC接合剂的新型家族的设计说明。抗PD-1与靶向特异性DC标志物的抗体偶联。(B)不同构建体的SDS-PAGE分析。非还原样品的同质条带证实了单一异源二聚体的组装。样品的减少证实双特异性异源二聚体包含四条抗体链，每个伴侣抗体提供2条。(C)双特异性抗体的分析尺寸排阻色谱图；数字表示抗体的天然IgG结构形成分子量。
图3A-D显示双特异型接合剂的单一抗原结合和阻断特性。(A)ELISA证明了分别与mPD-1和mCLEC9A的结合。针对重组蛋白的单特异性和双特异性抗体的标准结合ELISA滴定试验。(B)FACS证明了与过表达mXCR1的HEK293细胞的结合。单特异性和双特异性抗体的标准结合滴定试验。(C)使用过表达PD-1的HEK293细胞进行FACS阻断试验。将细胞与BiSE或亲本mPD-1mAb一起孵育，然后与mPD-L1生物素一起孵育。用偶联的链霉亲和素检测PD-1/PD-L1相互作用(D)BiSE、对照PD-1/辛格斯(Synagis)和亲本PD-1mAb的剂量依赖性阻断能力。
图4A-B显示双特异性接合剂的体外双重抗原结合特性。(A)对表达各靶蛋白的HEK293细胞进行双联体接合试验。在CFSE或CellTrace中染色的BiSE与过表达细胞的1：1混合物的标准结合滴定试验。CFSE/CellTrace对的百分比是从活双联体中定量的，并且显示出剂量依赖性。(B)PD-1+T细胞和脾细胞的体外试验。从OT-1小鼠的脾脏中分离出CD8+细胞，在体外长期暴露于OVA后，PD-1+上调。然后以1：10的比率将细胞与原初脾细胞一起孵育，并使用PD-1/CLEC9ABiSE或PD-1/辛格斯进行标准滴定。通过FACS对双联体进行定量。
图5A-B显示双特异性接合剂的体内双重抗原结合特性。B16肿瘤模型中，BiSE治疗后肿瘤dLN中T/DC双联体形成的评估。用PD-1/CLEC9A BiSE、PD-1/辛格斯、PD-1mAb或PBS处理荷瘤小鼠，24小时后将dLN进行FACS分析。(A)在BiSE治疗的小鼠中，双联体形成(n＝5，p＝0.0012和p＝＜0.0001，单因素方差分析)和(B)cDC1渗透(n＝5，p＝0.0056，p＝0.0058，p＝0.0008，p＝0.0007，单因素方差分析)显著增加，但在用传统PD-1mAb治疗的小鼠中没有显著增加。(C)给予BiSE后24小时将dLN导入ImageStream，以评估双联体形成和BiSE定位。以总CD3+细胞计算BiSE+双联体的百分比(n＝2-3只小鼠，p＝0.0018，p＝0.001，p＝＜0.0001，单因素方差分析)。BiSE定位于T/DC免疫突触，如代表性图像所示。
图6A-C显示双特异性抗体的体内活性。(A)与传统的双特异性形式PD-1阻断相比，BiSE在B16黑色素瘤模型中的治疗抗肿瘤活性。皮下注射肿瘤细胞，治疗后评估肿瘤体积和总存活率。在治疗第10天，相对于对照组，PD-1/CLEC9A治疗小鼠的肿瘤体积显著减小(n＝10只小鼠/组，p＝0.01，(单因素方差分析)。治疗小鼠的总体存活率显著增加(p＝0.0134，对数秩(Mantle-Cox)检验)。(B)与双特异性形式的传统PD-1阻断相比，BiSE在MC38结肠腺癌模型中也具有抗肿瘤活性。相对于对照组，PD-1/XCR1和PD-1/CLEC9A BiSE治疗在治疗第6天导致肿瘤体积减小(n＝10只小鼠/组，p＝0.007和p＝0.0003，p＝0.0279和p＝0.0042，单因素方差分析)。(C)KP肺癌模型中BiSE活性的评估。将KP细胞静脉注射至尾静脉。抗体注射时间为第15、21、24和27天。第28天将右肺叶置于石蜡块中并制备H&E切片。使用全景查看器软件对肺病灶进行量化。4只接受PD-1/CLEC9ABiSE治疗的小鼠中，有3只无肿瘤。
图7A-C显示BiSE治疗后的T细胞区室。使用MC38腺癌或B16F10黑色素瘤肿瘤模型进行BiSE治疗后，肿瘤微环境中的T细胞区室化和活化。用指定的单特异性或双特异性抗体处理小鼠。治疗间隔三天，第三次治疗后5天对肿瘤进行FACS分析(n＝5只小鼠/组)。(A)在MC38肿瘤模型中，根据TME中CD45+免疫细胞的总百分比计算CD8+T细胞(左，p＝0.02)、调节性T细胞(中，p＝0.004)和CD4+FoxP3-细胞(右)的百分比。根据TME中CD8、CD4效应细胞和Treg细胞占CD45+细胞的百分比计算CD4+CD8 T细胞和Treg之间的比率(右，p＝0.0403和p＝0.0026)。(B)根据TME中CD45+免疫细胞的总百分比计算CD8+T细胞(左，p＝0.0167和p＝0.145)、调节性T细胞(中，p＝0.0189)和CD4+FoxP3-细胞(右，p＝0.0190，p＝0.0138)的百分比。计算了CD8+、CD4效应细胞和Treg之间的比率(p＝0.0313，p＝0.0384)。与未治疗的小鼠和PD-1mAb治疗小鼠相比，PD-1/CLEC9A BiSE显示出显著的抗肿瘤反应。(C)根据TME中CD45+免疫细胞的总百分比计算CD8+T细胞(左，p＝0.0116)、调节性T细胞(中，ns)和CD4+FoxP3-细胞(右，p＝0.0163，p＝0.0034)的百分比。计算了CD8+、CD4效应物和Treg之间的比率(p＝0.0027，p＝0.0076，p＝＜0.0001)。与未治疗的小鼠，PD-1/辛格斯治疗小鼠和PD-1/XCR1治疗小鼠相比，PD-1/CLEC9A BiSE显示出显著的抗肿瘤反应。
图8A-D.TME和dLN中的双联体和T细胞区室动力学。使用B16黑色素瘤肿瘤模型，以BiSE治疗一段时间后，在TME和dLN中评估T细胞区室化和双联体形成。用PD-1/XCR1、PD-1/CLEC9A、PD-1/辛格斯或PBS处理小鼠。BiSE治疗间隔三天，各次治疗后24小时以及最后一次治疗后5天对肿瘤/dLN进行FACS分析(n＝5只小鼠/组)。(A)实验布局。(B)与对照组相比，BiSE治疗后双联体形成在肿瘤和dLN中富集。(C)随着时间的推移评估CD8+T细胞(左，p＝0.008，p＝0.012)、CD4+FoxP3-细胞(中，p＝0.016，p＝0.003)调节性T细胞(右)的百分比。(D)根据TME中CD8+、CD4+和Treg占CD45+细胞的百分比计算出T效应细胞/调节性T细胞的比率(p＝＜0.0001，p＝0.0027，p＝0.0076)。与未治疗的BiSE对照小鼠和PD-1/XCR1治疗的小鼠相比，PD-1/CLEC9A治疗的小鼠随着时间的推移表现出显著的改善。
发明具体实施方式的详述
在一些实施方式中，本发明涉及在治疗疾病中应用的多特异性抗体。
在对本发明的至少一个实施方式进行详细解释之前，应理解本发明的应用并不必受限于以下描述中的细节或实施例中的示例。本发明可以具有其它实施方式或以各种方式予以实施和执行。
虽然免疫疗法已经彻底改变了癌症的治疗，但基于PD-1的检查点抑制疗法的成功率仍然有限。因此，为了从分子和细胞角度深入了解细胞毒性CD8+T细胞对抗PD-1治疗的反应，本发明人使用大规模并行单细胞RNA测序技术分析了肿瘤细胞。结果显示，这些肿瘤浸润细胞中只有一小部分对治疗有反应。这些响应细胞表达高水平XCL1，该XCL1结合至1型常规树突细胞(cDC1)上表达的XCR1-图1A-C。为了进一步评估这些发现，发明人使用XCR1-iDTR小鼠模型在PD-1免疫治疗的活性阶段有条件地耗竭cDC1，并发现没有cDC1，抗PD-1治疗的功效被完全消除(图1D)。因此，本发明人假设肿瘤微环境(TME)中cDC1的低频率是影响T细胞对PD-1抑制的有效反应的主要限制因素。
为了测试该假设并克服该限制，本发明人开发了一种新方法，本文称为“双特异性免疫突触接合剂(BiSE)”。他们通过将PD-1阻断单克隆抗体与cDC1特异性靶标相结合，生成了在PD-1+T细胞和cDC1之间形成物理连接的异源二聚体构建体(如图2A所示)。
本发明人表明，BiSE试剂同时且特异性地结合至它们指定的靶标(图3A-B)，导致T细胞-cDC1双联体形成(图4A-B)，尽管由于BiSE的单价形式，它们的PD-1阻断能力受到损害(图3C-D)。
在进一步将本发明付诸实践的同时，本发明人分析了该新方法的体内抗肿瘤活性，其表明BiSE治疗的肿瘤模型小鼠表现出由BiSE介导的双联体形成增加，以及双联体和cDC1短期迁移至引流淋巴结(图5A-C)。它们还以TME中的调节性T细胞为代价，表现出效应CD8+和CD4+T细胞的显著增加(图7A-C)。与未治疗的小鼠和用同种型对照治疗的小鼠相比，这些小鼠表现出总体存活率增加和肿瘤生长减少(图6A-C)。
因此，本发明人提出将BiSE作为一类新的免疫疗法，其具有通过充当双特异性T细胞-cDC1突触接合剂而彻底改变癌症免疫疗法的活性的潜力。
根据本发明的方面，提供了一种多特异性抗体，其包含能特异性结合至肿瘤内T细胞上的免疫检查点蛋白的第一抗原结合部分和能特异性结合至常规树突细胞1(cDC1)的第二抗原结合部分。
如本文所用，″免疫检查点″指调节T细胞受体识别抗原的幅度和质量的共刺激和抑制性信号。在某些实施方式中，免疫检查点是抑制性信号。在一些实施方式中，抑制性信号是程序性死亡受体-1(PD-1)和程序性死亡配体-1(PD-L1)之间的相互作用。
如本文所用，术语“免疫检查点蛋白”是指存在于T细胞表面上的能够调节针对癌细胞的免疫应答的受体或其同源配体。免疫检查点蛋白的实例包括但不限于PD-1、CTLA-4、TIGIT、LAG-3、TIM-3、ICOS、BTLA、4-1BB、GITR和OX-40。
根据具体的实施方式，免疫检查点蛋白是PD-1(例如，人PD-1)。“程序性死亡-1(PD-1)”受体指属于CD28家族的免疫抑制性受体。PD-1主要在体内先前活化的T细胞上表达，并且结合至PD-L1和PD-L2两个配体。本文所用的术语“PD-1”包括人PD-1(hPD-1)，hPD-1的变体，亚型和物种同系物，和与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hPD-1序列可见于GenBank登录号AAC51773。在一个实施方式中，PD-1具有GenBank登录号AAC51773中指定的序列。
可以理解的是，免疫检查点蛋白抗体可以结合人类检查点蛋白和/或小鼠检查点蛋白。结合人和小鼠的抗体通常被称为“泛特异性抗体”。
根据本发明的一些实施方式，可以在多特异性抗体中使用的第一部分互补决定序列(CDR)可以在下文列出的抗体中找到：
·来自克隆RMP1-14的抗PD-1CDR序列如SEQ ID NO：1-6所示；
·来自克隆J43的抗PD-1序列如SEQ ID NO：11-16所示；
·派姆单抗(Pembrolizumab)(也称为兰博利珠单抗(lambrolizumab)(MK-3475或SCH 900475)，一种针对PD-1的人源化单克隆IgG4抗体)；
·纳武单抗(nivolumab)(MDX 1106，BMS 936558，ONO 4538)，一种能结合至PD-1并阻断其配体PD-L1和PD-L2对PD-1的活化的完全人IgG4抗体；
·多塔利单抗(Dostarlimab)(Jemperli)是一种能结合至PD-1并阻断其配体对PD-1的活化的人源化IgG4抗体。
·CTLA-4-伊匹木单抗(ipilimumab)，特姆单抗(tremelimumab)；
·TIGIT-替瑞利尤单抗(Tiragolumab)，BMS-986207，COM-902，EOS-448；
·LAG-3-BMS-986016(瑞拉特利单抗(Relatlimab))，菲安利单抗(FIANLIMAB)，玛维泽利单抗(favezelimab)；
·TIM-3-BMS-986258，Sym023，INCAGN02390：
·ICOS-MEDI-570，BMS-986226，GSK3359609；
·BTLA-TAB004；
·4-1BB-乌托米鲁单抗(utomilumab)(PF-05082566)，乌鲁单抗(Urelumab)(BMS-663513)，GITR-TRX005M，REGN6569，MK-4166；
·OX-40-MEDI6469，PF-04518600，BMS 986178。
如所提到的，多特异性抗体包含能特异性结合特定树突细胞(DC)类型-常规树突细胞1(cDC1)的第二部分。
如本文所用，“树突细胞”(DC)或复数的“树突细胞”(DCs)是指属于被称为专职(professional)抗原递呈细胞(APC)的细胞。DC具有特征性形态，具有从树突细胞体向多个方向延伸的薄片(板状伪足)。一些表型标准也是典型的，但可能会依据树突细胞的来源而变化。其中包括高水平的MHC分子(例如I类和II类MHC)和共刺激分子(例如B7-1和B7-2)，以及缺乏特异于粒细胞、NK细胞、B细胞和T细胞的标志物。许多树突细胞表达某些标志物(诸如下文所列的)。树突细胞能够在体外和体内起始原代T细胞反应。这些反应是抗原特异性的。与外周血白细胞、脾细胞、B细胞和单核细胞相比，树突细胞会产生强烈的混合白细胞反应(MLR)。树突细胞任选地通过细胞的细胞因子表达模式来表征(Zhou和Tedder(1995)Blood 3295-3301)。根据具体的实施方式，多特异性抗体结合未成熟的DC并可能介导它们的成熟和活化。
如本文所用，“特异性”是指与其他DC类型(浆细胞样DC(pDC)和单核细胞衍生的DC(mDC))相比，对DC的结合偏好。
如本文所用，术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体结合至预定抗原上的表位，但不结合至其他抗原上的表位。通常，抗体(i)结合时的平衡解离常数(KD)大约小于10-7M(诸如大约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低)，当通过例如2000表面等离子共振仪中的表面等离子共振(SPR)技术，使用预定抗原(例如，重组DC标志物)作为分析物并且使用抗体作为配体，或抗体结合抗原阳性细胞的斯卡查德(Scatchard)分析来确定，并且(ii)以比其与除了预定抗原或密切相关的抗原之外的非特异性抗原(例如，BSA，酪蛋白)结合的亲和力大至少两倍的亲和力与预定抗原结合。因此，“特异性地结合至“免疫检查点蛋白”或cDC1标志物的抗体是指以10-6M或更小(诸如大约小于10-7M、10-8M、10-9M或10-10M甚至更低)的KD结合至细胞结合标志物的抗体。
根据具体的实施方式，树突细胞的特征在于选自以下组的标志物表达：Clec9a和XCR1。
根据具体的实施方式，cDC1是人cDC1。
因此，根据本发明的实施方式，提供了一种多特异性抗体，所述抗体包含的第二部分在具有N到C方向的重链中包含如SEQ ID NO：25-27所示的互补决定区，在具有N至C方向的轻链中包含如SEQ ID NO：28-30所示的互补决定区。
根据具体的实施方式，第二部分结合Clec9a。
因此，根据本发明的实施方式，提供了一种多特异性抗体，所述抗体包含的第二部分在具有N到C方向的重链中包含如SEQ ID NO：31-33所示的互补决定区，在具有N至C方向的轻链中包含如SEQ ID NO：34-36所示的互补决定区(10B4的CDR)。
根据具体的实施方式，第二部分结合XCR1。
因此，根据本发明的实施方式，提供了一种多特异性抗体，所述抗体包含的第二部分在具有N到C方向的重链中包含如SEQ ID NO：21-23所示的互补决定区，在具有N至C方向的轻链中包含如SEQ ID NO：24-26所示的互补决定区(MARX10的CDR)。
能够结合Clec9a的抗体是本领域公知的。10B4和其他描述于美国专利申请号US20130273150A[15](例如，1F6，397和7H11描述于[4])。其它的抗人Clec9a抗体，或其CDR描述于美国专利申请号20210024637和20190352406。
能够结合XCR1的抗体是本领域公知的。MARX10描述于EP EP2641915A1[5]。
根据具体的实施方式，多特异性抗体包含SEQ ID NO：7和8以及SEQ ID NO：27和28。
根据具体的实施方式，多特异性抗体包含SEQ ID NO：7和8以及SEQ ID NO：37和38。
根据具体的实施方式，多特异性抗体包含SEQ ID NO：17和18以及SEQ ID NO：27和28。
根据具体的实施方式，多特异性抗体包含SEQ ID NO：17和18以及SEQ ID NO：37和38。
如本发明所用的术语“抗体”包括完整的分子及其功能片段(能够结合抗原的表位)。
如本文所用，术语“表位”是指抗体互补位所结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定区通常由分子的化学活性表面基团(诸如氨基酸或碳水化合物侧链)组成且通常有特定的三维结构性质以及特定的电荷性质。
根据具体的实施方式，抗体片段包括但不限于单链、Fab、Fab′和F(ab′)2片段、Fd、Fcab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、微型抗体(minibodies)、纳米抗体、Fab表达文库或能够以HLA限制的方式结合至抗原表位的单结构域分子(诸如VH和VL)。
用于实践本发明的一些实施方式的合适的抗体片段包括免疫球蛋白轻链(本文称为“轻链”)的互补决定区(CDR)、免疫球蛋白重链(本文称为“重链”)的互补决定区、轻链可变区、重链可变区、轻链、重链、Fd片段以及包含轻链和重链的基本完全可变区的抗体片段，诸如Fv、单链Fv Fv(scFv)、二硫键稳定的Fv(dsFv)、Fab、Fab′和F(ab′)2或包含抗体Fc区的抗体片段。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”可互换使用，指在重链和轻链多肽的可变区内存在的抗原结合区。一般而言，抗体在各VH中包含三个CDR(CDR H1或HI；CDR H2或H2；和CDR H3或H3)，并且在各VL中包含三个CDR(CDR L1或L1；CDR L2或L2；和CDR L3或L3)。
构成可变区或CDR的特定抗体中的氨基酸残基的同一性可以使用本领域公知的方法来确定，并且包括以下方法：诸如Kabat等定义的序列变异性(参见，例如，Kabat等，1992，《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第5版，公共卫生局(Public Health Service)，NIH，华盛顿哥伦比亚特区)，Chothia等定义的结构环区域的位置(参见，例如，Chothia等，Nature 342：877-883，1989.)，Kabat和Chothia之间的折衷方案，使用牛津分子的AbM抗体造模软件(OxfordMolecular’s AbM antibody modeling software)(现为参见Martin等，1989，Proc.Natl Acad Sci USA.86：9268；以及万维网站www(dot)bioinf-org(dot)uk/abs)，如接触定义(参见MacCallum等，J.Mol.Biol.262：732-7451996)和“构象定义”(参见例如Makabe等，Journal of Biological Chemistry，283：1156-1162008)所定义的可用的复杂晶体结构。
如本文所用可变区”和“CDR”可以指通过本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义的可变区和CDR。
包含轻链和重链的完全或基本上完全可变区的功能性抗体片段定义如下：
(i)Fv，其被定义为由表达为两条链的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)组成的遗传工程改造的片段；
(ii)单链Fv(“scFv”)，包括轻链可变区和重链可变区的遗传工程改造的单链分子，通过合适的多肽接头连接作为遗传融合的单链分子。
(iii)二硫键稳定Fv(“dsFv”)，包括通过遗传工程改造的二硫键连接的轻链可变区和重链可变区的遗传工程改造的抗体。
(iv)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合部分的抗体分子片段，可通过用木瓜蛋白酶处理全抗体以获得完整的轻链和由可变结构域及其CH1结构域组成的重链的Fd片段；
(v)Fab’，含有抗体分子的单价抗原结合部分的抗体分子片段，可以通过用胃蛋白酶处理全抗体，然后还原来获得(每个抗体分子获得两个Fab’片段)；
(vi)F(ab’)2，含有抗体分子的单价抗原结合部分的抗体分子片段，可以通过用胃蛋白酶处理全抗体来获得(即通过两个二硫键连接在一起的Fab’片段的二聚体)。
(vii)单域抗体或纳米抗体由对抗原表现出足够亲和力的单一VH或VL结构域组成；以及
(viii)Fcab，含有抗体Fc部分的抗体分子片段，通过将抗原结合能力引入抗体的Fc区而被开发为抗原结合结构域。
产生多克隆和单克隆抗体及其片段的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow和Lane，《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室(ColdSpring Harbor Laboratory)，纽约，1988，其通过引用纳入本文)。
用于生成抗体的示例性方法采用诱导抗体分子的体内产生、筛选免疫球蛋白文库(Orlandi D.R.等，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：3833-3837；Winter G.等，1989，1991.Nature 349：293-299)或通过连续培养细胞系生成单克隆抗体分子。这些包括但不限于杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)杂交瘤技术(Kohler G.等，1975.Nature 256：495-497；Kozbor D.等，1985.J.Immunol.Methods 81：31-42；CoteRJ.等，1983.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：2026-2030；Cole SP.等，1984.Mol.Cell.Biol.62：109-120)。
如果靶抗原太小而无法在体内生成抗体时引发足够的免疫原性反应，则此类抗原(半抗原)可以与抗原中性运载体(诸如钥孔戚血蓝蛋白(KLH)或血清白蛋白[例如牛血清白蛋白(BSA)]运载体)偶联(参见，例如，美国专利号5,189,178和5,239,078]。半抗原与运载体的偶联可以使用本领域公知的方法来实现。例如，可以实现与氨基的直接偶联，并且任选地随后还原形成的亚氨基键。或者，可以使用缩合剂(诸如二环己基碳二亚胺或其它碳二亚胺脱水剂)来偶联运载体。接头化合物也可用于实现偶联；同双官能性和异双官能性接头均可从皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Company)(伊利诺伊州罗克福德)获得。然后可以将所得免疫原性复合物注射到合适的哺乳动物对象(诸如小鼠、兔等)中。合适的方案包括在佐剂存在下根据时间表重复注射免疫原，以促进血清中抗体的产生。免疫血清的效价可以容易地使用本领域公知的免疫试验程序来测量。
获得的抗血清可以直接使用，或者可以如上所述获得单克隆抗体。
根据本发明一些实施方式的抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养或其他蛋白表达系统)中表达编码该片段的DNA来制备。
抗体片段可以用常规方法通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全抗体来获得。例如，可以通过用胃蛋白酶酶促裂解抗体来产生抗体片段，以提供表示为F(ab′)2的5S片段。该片段可以使用硫醇还原剂和任选的由二硫键裂解产生的巯氢基的阻断基团进一步裂解，以产生3.5S Fab′单价片段。或者，使用胃蛋白酶的酶促裂解直接产生两个单价Fab′片段和Fc片段。这些方法描述于，例如，Goldenberg的美国专利号4,036,945和4,331,647及其包含的文献，这些专利的全部内容通过引用纳入本文。也参见Porter，R.R.[Biochem.J.73：119-126(1959)]。也可以使用裂解抗体的其它方法(诸如分离重链以形成单价轻-重链片段、进一步裂解片段、或其他酶促、化学或遗传技术)，只要片段能结合至由完整抗体识别的抗原即可。
如上所述，Fv片段包含VH和VL链的缔合(association)。这种缔合可能是非共价的，如Inbar等[Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 69：2659-62(19720]所述。或者，可变链可以通过分子间二硫键连接或通过化学物质(诸如戊二醛)交联。优选地，Fv片段包含通过肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)是通过构建结构基因制备的，该结构基因包含编码由寡核苷酸连接的VH和VL结构域的DNA序列。将结构基因插入表达载体，随后将其引入宿主细胞(诸如大肠杆菌)。重组宿主细胞合成单多肽链，其具有桥接2个V结构域的接头肽。产生sFv的方法描述于，例如[Whitlow和Filpula，Methods 2：97-105(1991)；Bird等，Science 242：423-426(1988)；Pack等，Bio/Technology 11：1271-77(1993)；和美国专利号4,946,778，其全部内容通过引用纳入本文。
抗体片段的另一种形式是编码单一互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单元”)可以通过构建编码感兴趣抗体的CDR的基因来获得。例如，通过使用聚合酶链式反应从抗体产生细胞的RNA合成可变区来制备此类基因。参见，例如，Larrick和Fry[Methods，2：106-10(1991)]。
如所提到的，抗体片段可以包含被称为“Fcab”的抗体的Fc区。此类抗体片段通常包含抗体的CH2-CH3结构域。将Fcab工程改造以使抗体的结构环区(即重链的CH3区)包含至少一个修饰。此类抗体片段可以由例如以下生成：提供编码包含至少一个结构环区(例如Fc区)的抗体的核酸，修饰该至少一个结构环区的至少一个核苷酸残基，将修饰的核酸引入表达系统中，表达修饰的抗体，将表达的修饰的抗体与表位接触，并确定修饰的抗体是否结合至表位。参见，例如，美国专利号9,045,528和9,133,274，通过引用其全文的方式纳入本文。
非人(例如，鼠)抗体的人源化形式是免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合型子序列)的嵌合分子，其包含最少的源自非人免疫球蛋白的序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受者抗体)，其中形成受者互补决定区(CDR)的残基被形成具有所需特异性、亲和性和性能的非人物种(供者抗体，诸如小鼠、大鼠或兔)CDR的残基取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基所替换。人源化抗体也可包含在受者抗体以及输入的CDR或构架序列中均未发现的残基。通常，人源化抗体将包含几乎所有的至少一个、通常两个可变区，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。优化的人源化抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白恒定区的该部分[Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)]。
人源化非人抗体的方法是本领域众所周知的。通常，人源化抗体具有从非人类来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常被称为输入残基，它们一般取自输入可变结构域。通过用啮齿动物的CDR或CDR序列代替人类抗体的相应序列，人源化可以基本上根据Winter及同事的方法进行(Jones等，Nature，321：522--525(1986)，Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)，Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))。因此，此类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中非人物种的相应序列取代了实质上少于完整人可变结构域。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
可以使用本领域所知的各种技术来产生人抗体，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter(1991)，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等(1991)，J.Mol.Biol.，222：581(1991))。Cole等和Boerner等的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)和Boerner等，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991))。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠)中来制备人抗体。受到攻击后，可以观察到人抗体的产生，这种抗体在包括基因重排、组装和抗体库等的各方面都与人非常相似。该方式描述于，例如美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和以下科学出版物：Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368，812：812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，NatureBiotechnology 14：826(1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。
除非另有说明，免疫球蛋白可以来自任何熟知的同种型，包括但不限于IgA、分泌性IgA、IgG和IgM。IgG同种型在某些物种中被分为亚类：在人类中为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，在小鼠中为IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。免疫球蛋白(例如人IgG1)存在多种同种异型，它们之间最多只有几个氨基酸不同。
根据具体的实施方式，该抗体是IgG1同种型。一旦获得抗体，就可以测试它们的活性，例如通过ELISA、蛋白质印迹、FACS、斑点印迹和用于抗体鉴定的任何其它方法。
如本文所用，“多特异性抗体”是这样的抗体，该抗体可以同时结合具有不同结构的至少两个靶标、两个不同抗原或两个不同表位，其一位于肿瘤内T细胞(在免疫检查点蛋白处)，且至少另一位于cDC1，如前所述。
特异性表示抗体能够结合多少个抗原或表位；即，双特异性、三特异性、四特异性。根据具体的实施方式，该抗体是双特异型抗体。
使用这些定义，天然抗体(例如IgG)是二价的，因为它有两个结合臂，但它是单特异性的，因为它与一个表位结合。
“双特异性抗体”是这样的抗体，该抗体可以同时结合具有不同结构的两个靶标，其一位于肿瘤内T细胞(在免疫检查点蛋白处)上，且另一位于cDC1。
效价表示抗体对单一抗原或表位有多少个结合臂或位点；即，单价、二价、三价或多价。抗体的多价性意味着它可以利用与抗原结合的多重相互作用，从而增加与抗原结合的亲合力。
多特异性、多价抗体是具有不同特异性的多于一个结合位点的构建体。例如，双抗体，其中一个结合位点与一种抗原反应，另一结合位点与另一种抗原反应。
如本文所用，“部分”是指能够结合指定靶标的多特异性(例如，双特异性)抗体的抗体组分。
为了产生本发明一些实施方式的多特异性抗体，可以在Fc区例如本领域公知的CH3结构域(根据kabat)处修饰本发明的部分。这种修饰确保多特异性抗体通过重链正确组装。
相应地，改变一条重链的CH3结构域，使得在多特异性抗体内的一条重链的CH3结构域与另一条重链的CH3结构域的原始界面相接的原始界面内的基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在一条重链的CH3结构域的界面内产生突起，该突起可定位在另一条重链的CH3结构域界面内的空腔中；改变另一条重链的CH3结构域，使得在三价双特异性抗体中的第二CH3结构域的原始界面与第一CH3结构域的原始界面相接的原始界面内的氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第二CH3结构域的界面内产生空腔，第一CH3结构域界面内的突起可在该空腔内定位(基因泰克公司(Genentech)也称之为“杵臼”法)。
根据具体的实施方式，具有较大侧链体积的氨基酸残基选自以下组：精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
根据具体的实施方式，具有较小侧链体积的氨基酸残基选自以下组：丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)。
根据具体的实施方式，通过在各CH3结构域的相应位置引入半胱氨酸(C)作为氨基酸来进一步改变两个CH3结构域，使得两个CH3结构域之间可以形成二硫桥。
在具体的实施方式中，双特异性包含“杵链(knobs chain)”CH3结构域中的T366W突变和“臼链(hole chain)”CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V突变。还可以使用CH3结构域之间的附加链间二硫桥(Merchant，A.M.等，Nature Biotech 16(1998)677-681)，例如通过将Y349C突变引入“杵链”的CH3结构域中并将E356C突变或S354C突变引入“臼链”的CH3结构域中。因此，在另一个优选的实施方式中，双特异性抗体在两个CH3结构域的一个中包含Y349C、T366W突变，并且在两个CH3结构域中的另一个中包含E356C、T366S、L368A、Y407V突变，或者双特异性抗体在两个CH3结构域的一个中包含Y349C、T366W突变，并且在两个CH3结构域中的另一个中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突变(一个CH3结构域中的附加Y349C突变和另一个CH3结构域中的附加E356C或S354C突变形成链间二硫桥)(始终根据Kabat中的EU索引进行编号)。但也可以替代地或附加地使用描述于EP 1 870 459A1的其它杵臼技术。双特异性抗体的具体实例是“杵链”CH3结构域中的R409D，K370E突变和“臼链”CH3结构域中的D399K，E357K突变(始终根据Kabat中的EU索引进行编号)。
在另一个实施方式中，双特异性抗体包含“杵链”的CH3结构域中的T366W突变和“臼链”的CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V突变以及附加的R409D；“杵链”CH3结构域中的K370E突变和“臼链”CH3结构域中的D399K；E357K突变。
在另一个实施方式中，双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C、T366W突变，并且在两个CH3结构域中的另一个中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突变，或者双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C、T366W突变，并且在两个CH3结构域中的另一个中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突变以及附加地，“杵链”CH3结构域中的R409D；K370E突变和“臼链”CH3结构域中的D399K；E357K突变。
根据具体的实施方式，将S354C/T366W突变引入第一mAb(例如，抗PD-1)，并且将Y349C/T366S/L368A/Y407V突变引入第二mAb(例如，抗cDC1)。
替代地或附加地，为了正确的重链-轻链配对，至少一个部分可以用CrossMab形式表达(CH1-CL交换)。
CrossMab技术的基础是双特异性IgG抗体的一个臂内抗体结构域的交叉，从而实现正确的链关联，而重链的正确异源二聚化可以通过如上所述的杵臼技术或电荷相互作用来实现。这可以通过交换Fab片段内的不同结构域来实现。为此目的，可以交换Fab片段内的Fab结构域(CrossMabFab形式)或仅交换VH-VL结构域(CrossMabVH-VL形式)或恒定CH1-CL结构域(CrossMabCH1-CL形式)。事实上，对于CrossMabCH1-CL形式，各自的原始轻链和新型VL-CH1轻链不会与各自的原始重链和含有VH-CL的重链发生不期望的相互作用，并且不会形成理论上的副产物。不同的是，在CrossMabFab格式中，可以形成无功能的单价抗体(MoAb)和无功能的Fab片段。这些副产物可以通过色谱技术除去。在CrossMabVH-VL形式的情况下，在含有VL-CH1的重链和原始未修饰的VL-CL轻链之间可能会出现与本斯-琼斯氏(Bence-Jones)蛋白已知的与VL-CH1/VL-CL结构域关联的不良副产物。基于野生型抗体框架中现有的保守电荷对，在野生型非交叉Fab片段的恒定CH1和CL结构域中引入排斥性电荷对，可以克服CrossMabVH-VL+/-格式中本斯-琼斯式样副产物的形成。有关CrossMab技术的更多详细信息，请参阅Klein等.Methods 154，2019年2月1日，第21-31c页。
或者，本文所述的多特异性，例如双特异性抗体可通过使用本领域已知的方法将部分偶联来制备。例如，多特异性抗体的各部分可以单独生成，然后彼此偶联。多种偶联剂或交联剂可用于共价偶联。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰-硫代乙酸酯(SATA)、5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二甲酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括描述于以下的那些方法：Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan等.(1985)Science229：81-83)，和Glennie等.(1987)J.Immunol.139：2367-2375)。优选的偶联剂是SATA和磺基-SMCC，两者均购自皮尔斯化学公司(伊利诺伊州罗克福德)。
替代地或附加地，多特异性抗体各部分的偶联可通过两条重链的C末端铰链区的巯基键合来完成。在具体的实施方式中，在偶联之前，将铰链区修饰为包含奇数个巯基残基，优选一个。
根据具体的实施方式，修饰多特异性抗体的Fc区以降低对FcγRIIb受体的结合特异性。
“Fc受体”或“FcR”是结合至免疫球蛋白Fc区的受体。结合至IgG抗体的FcR包含FcγR家族的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FcγR家族由三种激活性受体(小鼠的FcγRI、FcγRIII和FcγRIV；人类的FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA)和一种抑制性受体(FcγRIIb或等效的RcγRIIB)组成。US20170253659总结了人FcγR的各种特性。
大多数先天效应细胞类型共同表达一种或多种激活性FcγR和抑制性FcγRIIb，而自然杀伤(NK)细胞选择性表达一种激活性Fc受体(小鼠的FcγRIII和人类的FcγRIIIA)，但不表达小鼠和人类的抑制性FcγRIIb。人IgG1可结合至大多数人Fc受体，并且就其所结合的激活性Fc受体类型而言，其被认为与鼠IgG2a相当。
修饰的(突变体)Fc区具有与人IgG重链(SEQ ID NO：41)的一个或多个突变相对应的一个或多个突变，所述突变选自以下组：N297A、S267E(″SE″)、S267E/L382F(″SELF″)、G237D/P238D/P271G/A330R(″V9″)、或G237D/P238D/H268D/P271G/A330R(″V11″)(SEQ IDNO：2)，或(“V12”)。
本文描述的另一个方面涉及编码本文描述的抗体的核酸分子。核酸可以存在于全细胞、细胞裂解物中、或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当从其它细胞组分或其他污染物(例如，其它细胞核酸(例如，其它染色体DNA，例如，与分离的DNA连接的染色体DNA))中纯化出核酸时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”，通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl条带、柱层析、限制性内切酶、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他技术。参见，F.Ausubel等，编辑(1987)《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，格林出版公司和威利跨学科出版公司(Greene Publishing and Wiley Interscience)，纽约。本文描述的核酸可以是例如DNA或RNA并且可以含有或不含有内含子序列。在某些实施方式中，核酸是cDNA分子。
本文描述的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，从携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，如下文进一步描述的)表达的抗体，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码由杂交瘤产生的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可以从文库中回收编码该抗体的核酸。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，这些DNA片段可以通过标准重组DNA技术进一步操作，例如，以将可变区基因转变成全长抗体链基因，Fab片段基因，或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质(诸如抗体恒定区或柔性接头)的另一DNA片段操作性地连接。在上下文中使用的术语“操作性连接”旨在表示两个DNA片段连接以使由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在阅读框内。
编码VH区的分离的DNA可通过将编码VH的DNA操作性连接至编码重链恒定区(铰链，CHI，CH2和/或CH3)的另一DNA分子而被转换成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat，E.A.等.(1991)《热门免疫学蛋白质序列》(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，第五版，美国卫生与公共服务部，NIH公开号91-3242)，并且涵盖这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgM或IgD恒定区，例如，IgGl区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以操作性地连接到仅编码重链CHI恒定区的另一DNA分子。
编码VL区的分离的DNA可以通过将编码VL的DNA操作性地连接到编码轻链恒定区CL的另一DNA分子而被转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat，E.A.等.(1991)《热门免疫学蛋白质序列》(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，第五版，美国卫生与公共服务部，NIH公开号91-3242)，并且涵盖这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
多种原核或真核细胞可以用作宿主表达系统来表达本发明一些实施方式的抗体。这些包括但不限于微生物，诸如用含有编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统。哺乳动物表达系统也可用于表达本发明一些实施方式的抗体。培养物中的表达条件取决于所使用的表达系统。
在培养物中适当的时间后从培养物中回收抗体。短语“回收重组抗体”是指收集含有抗体的全发酵培养基并且不需要另外的分离或纯化步骤。尽管如上所述，本发明一些实施方式的抗体可以使用多种标准蛋白质纯化技术来纯化，诸如但不限于亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、反相色谱、伴刀豆球蛋白A色谱、色谱聚焦和差异溶解。
本文所述的抗体、抗体组合物和方法具有多种体外和体内用途，涉及例如在PD-1+T细胞和cDC1之间形成物理桥。在优选的实施方式中，本文描述的抗体是人或人源化抗体。例如，本文所述的多特异性抗体可在体外或离体给予至培养物中的细胞，或例如在体内给予人类对象，以增强多种疾病中的免疫力。
因此，本文提供了通过向有需要的对象给予治疗有效量的本文所述的多特异性抗体来治疗癌症的方法。
如本文所用，术语“对象”包括哺乳动物，诸如患有病症(例如癌症、慢性病毒感染)的任何年龄的人。根据具体的实施方式，该术语涵盖处于患有病症的风险的个体。
在优选的实施方式中，对象是携带肿瘤的对象并且针对肿瘤的免疫应答得到增强。肿瘤可以是实体肿瘤或液体肿瘤，例如血液恶性肿瘤。在某些实施方式中，肿瘤是免疫原性肿瘤。在某些实施方式中，肿瘤是非免疫原性的。在某些实施方式中，肿瘤是PD-L1阳性的。在某些实施方式中，肿瘤是PD-L1阴性的。对象还可以是携带病毒的对象，并且针对病毒的免疫应答得到增强。
还提供了用于抑制对象中肿瘤细胞生长的方法，包括向对象给予本文所述的多特异性抗体，使得对象中肿瘤的生长受到抑制。在某些实施方式中，将本文所述的多特异性抗体作为辅助疗法给予对象。相对于现有的护理标准，用本文所述的多特异性抗体治疗患有癌症的对象可能会导致长期持久的反应；至少1、2、3、4、5、10或更多年的长期存活，至少1、2、3、4、5或10或更多年的无复发存活。在某些实施方式中，用本文所述的多特异性抗体治疗患有癌症的对象能预防癌症复发或使癌症复发延迟例如1、2、3、4、5或10年或更多年。使用本发明的双特异性免疫突触接合剂的治疗可用作一线或二线治疗。
本文提供了治疗患有癌症的对象的方法，包括向对象给予本文所述的多特异性抗体，使得对象得到治疗，例如使得癌性肿瘤的生长被抑制或减少和/或肿瘤消退。本文描述的多特异性抗体可以单独使用以抑制癌性肿瘤的生长。或者，本文描述的多特异性抗体可以与另一种试剂(例如，其它免疫原性试剂)，标准癌症治疗或其他抗体联合使用，如下所述。
因此，本文提供了治疗对象癌症的方法，例如通过抑制肿瘤细胞的生长，其包括向对象给予治疗有效量的本文所述的多特异性抗体。
可以使用本发明的抗体抑制其生长的癌症包括通常对免疫治疗有反应的癌症和对免疫疗法具有抗性的癌症。可治疗的癌症的非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非NSCLC、神经胶质瘤、胃肠道癌、肾脏细胞癌症(renal cancer)(例如透明细胞癌)、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫体癌(endometrialcancer)、肾癌(kidney cancer)(例如肾细胞癌(RCC))、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤)、宫颈癌、胃癌(stomach cancer)、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和头颈癌(或上皮癌(carcinoma))、胃癌(gastric cancer)、生殖细胞肿瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤细胞、黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤，诸如皮肤或眼内恶性黑色素瘤))、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛门癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌(carcinoma of the endometrium)、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症)、病毒相关癌症(例如人乳头状瘤病毒(HPV)相关肿瘤)以及源自两种主要血细胞谱系的血液恶性肿瘤，即骨髓细胞系(产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞)或淋巴细胞系(产生B、T、NK和浆细胞)，诸如所有类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴细胞和/或骨髓性白血病，诸如急性白血病(ALL)、急性粒细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性粒细胞白血病(CML)、未分化AML(MO)、成粒细胞白血病(M1)、成粒细胞白血病(M2；细胞成熟)、早幼粒细胞白血病(M3或M3变异体[M3V])、粒单核细胞白血病(M4或M4变异体伴嗜酸性粒细胞增多[M4E])、单核细胞白血病(M5)、红白血病(M6)、巨核细胞白血病(M7)、分离性粒细胞肉瘤和绿色瘤；淋巴瘤，诸如霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、间变性(例如，Ki1+)大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、肠T细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、前体T淋巴细胞淋巴瘤、T淋巴母细胞淋巴瘤；淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、移植后淋巴增殖性疾病、真性组织细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤(LBL)、造血系统淋巴系肿瘤、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)(也称为蕈样肉芽肿或Sezary综合征)，以及淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)伴华氏巨球蛋白血症；骨髓瘤，诸如IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、冒烟性骨髓瘤(也称为惰性骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤和多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞淋巴瘤；骨髓系造血肿瘤、间质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；精原细胞瘤、畸胎癌、中枢和周围神经肿瘤，包括星形细胞瘤、神经鞘瘤；间质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括黑素瘤、色素性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌、淋巴系造血肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤，包括但不限于T细胞病症，诸如T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)，包括小细胞和脑样细胞类型；大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)，优选T细胞类型；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多形性和免疫母细胞亚型)；血管中心(鼻)T细胞淋巴瘤；头颈癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌；急性髓性淋巴瘤，以及所述癌症的任何组合。本文描述的方法还可以用于治疗转移性癌症、难治性癌症(例如，对先前的免疫疗法例如用阻断性CTLA-4或PD-1抗体难治的癌症)和复发性癌症。
根据具体的实施方式，癌症选自以下组：膀胱癌、乳腺癌、子宫/宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤和病毒相关癌症。
本文所述的多特异性抗体可作为单一疗法或唯一的免疫刺激疗法给予，也可与癌症疫苗策略中的免疫原剂结合使用，诸如激动性抗体、重组蛋白和配体、癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞(He等(2004)J.Immunol.173：4919-28)。
本文所述的多特异性抗体可用于通过将本文所述的多特异性抗体与感兴趣的抗原(例如疫苗)共同给予来增强抗原特异性免疫应答。因此，本文提供了增强对象对抗原的免疫应答的方法，包括向对象给予：(i)抗原；和(ii)本文所述的多特异性抗体，从而增强对象体内针对抗原的免疫应答。抗原可以是例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。
如先前所描述的，本文所述的多特异性抗体可以与一种或其他多种治疗剂(例如细胞毒性剂、放射毒性剂)共同给予。抗体可以与试剂连接(免疫复合物形式)或可以与试剂分开给予。在后一种情况下(分开给予)，抗体可以在药剂之前，之后或同时给药，或者可以与其它已知疗法(例如抗癌疗法，例如放射)共同给予。此类治疗剂包括抗肿瘤剂，诸如多柔比星(阿霉素)，顺铂硫酸博来霉素，卡莫司汀，苯丁酸氮芥、达卡巴嗪和环磷酰胺羟基脲，它们本身仅在对患者有毒或亚毒的水平下有效。顺铂以100mg/ml的剂量每4周静脉注射一次，阿霉素以60-75mg/ml的剂量每21天静脉注射一次。本文所述的多特异性抗体与化疗剂的共同给予提供了两种抗癌剂，其通过不同的机制起作用，对人肿瘤细胞产生细胞毒性作用。这种共同给予可以解决由于对药物产生抗药性或肿瘤细胞抗原性变化而引起的问题，所述抗原性改变将使它们不与抗体反应。
多特异性抗体(其复数形式称为“多个多特异性抗体(multispecificantibodies)”)可以自身或者以与合适的运载体或赋形剂混合的药物组合物的形式提供给对象。
如本文所用，“药物组合物”是指由本文所述的一种或多种活性成分与其他化学成分(诸如生理上适合的运载体和赋形剂)制备而成的制剂。药物组合物的目的是便于向生物体给予化合物。
本文的术语“活性成分”指负责生物效应的多特异性抗体。
在下文中，可以互换使用的短语“生理学上可接受的运载体”和“药学上可接受的运载体”是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所给予的化合物的生物活性和特性的运载体或稀释剂。佐剂包括在这些短语中。
本文的术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分给予的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
用于药物配制和给予的技术可以在“《雷明顿药物科学》(Remington’sPharmaceutical Sciences)”，麦克出版公司(Mack Publishing Co)(宾夕法尼亚州伊斯顿)的最新版中找到，其通过引用纳入本文。
合适的给予途径可以是，例如包括口服、直肠、经粘膜，尤其是经鼻、经肠或胃肠外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内(例如进入右心室或左心室腔)、进入冠状动脉、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
将药物递送至中枢神经系统(CNS)的常规方法包括：神经外科策略(例如脑内注射或脑室内输注)；对试剂进行分子操作(例如，生产包含对内皮细胞表面分子具有亲和力的转运肽的嵌合融合蛋白，与本身不能穿过BBB的试剂组合)，试图利用BBB的内源性转运途径之一；旨在增加试剂脂溶性的药理学策略(例如，将水溶性药物与脂质或胆固醇运载体偶联)；以及高渗破坏对血脑屏障完整性的短暂破坏(由于将甘露醇溶液输注到颈动脉中或使用生物活性剂(诸如血管紧张素肽))。然而，这些策略中的每一种都具有局限性，诸如与侵入性外科手术相关的固有风险、由内源性转运系统固有的限制所带来的尺寸限制、与全身给予由运载体基序组成的嵌合分子相关的潜在不良生物副作用，该载体基序可能在中枢神经系统之外活跃，并且BBB被破坏的大脑区域可能存在脑损伤的风险，这使其成为一种次优的递送方法。
或者，可以局部而非全身的方式给予药物组合物，例如，通过将药物组合物直接注射到患者的组织区域中。
本发明一些实施方式的药物组合物可以通过本领域熟知的方法来制造，例如通过常规的混合、溶解、造粒、糖衣丸制备、悬浮、乳化、包封、包埋或冻干法。
因此，根据本发明的一些实施方式应用的药物组合物可以使用一种或多种包含赋形剂和助剂的生理学上可接受的运载体以常规方式配制，其促进将活性成分加工成可药用的制剂。适当的制剂取决于所选的给予途径。
对于注射，药物组合物的活性成分可以配制在水性溶液中，优选在生理相容的缓冲液中(诸如汉克斯(Hank’s)溶液、林格(Ringer’s)溶液或生理盐缓冲液)。对于经粘膜给药，在适合于待渗透屏障的制剂中采用渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的。
对于口服给予，通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的运载体组合，可以容易地配制药物组合物。此类运载体使药物组合物能配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆剂、混悬剂等，用于患者口服摄取。口服用药理学制剂可以作为固体赋形剂获得，任选地将得到的混合物进行研磨，在添加合适助剂(如果需要)后对颗粒混合物进行加工，以获得片剂或糖锭芯。具体地，合适的赋形剂是填充剂(诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇)；纤维素制剂(诸如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠(carbomethylcellulose))；和/或生理学上可接受的聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP))。如果需要，可添加崩解剂(诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸，或其盐(诸如如海藻酸钠))。
糖锭芯具有合适的覆层。出于这种目的，可使用浓缩糖溶液，其中可任选地含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。片剂或糖锭芯覆层中可添加染料或颜料，用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
可口服使用的药物组合物包括明胶制成的推入配合(push-fit)胶囊，以及明胶和增塑剂(诸如甘油或山梨糖醇)制成的密封软胶囊。推入配合胶囊可含有活性成分，其能与填充剂(诸如乳糖)，粘合剂(诸如淀粉)，润滑剂(诸如滑石粉或硬脂酸镁)，以及任选的稳定剂混合。在软胶囊中，活性成分可溶解或悬浮于合适的液体中(诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇)。此外，可添加稳定剂。用于口服给予的所有制剂应具有适合所选给予途径的剂量。
对于含服给药，组合物可采用常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻腔吸入给予，使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，或二氧化碳)，由加压包装或喷雾器中以气溶胶喷雾形式常规递送根据本发明一些实施方式应用的活性成分。在增压式气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供阀以递送计量的量来确定。用于分配器中的胶囊或药筒(包含例如明胶)可配制成含有化合物与合适粉末基料(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
本文所述的药物组合物可以配制为用于胃肠外给予，例如通过推注注射或连续输注。用于注射的制剂可以任选地添加防腐剂的单位剂型存在，例如，于安瓿瓶或在多剂量容器中。该组合物可以是油性或水性载剂中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，并且可含有配方试剂(诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂)。
用于胃肠外给予的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水性溶液。此外，活性成分的悬浮液可以制备成合适的油性基或水基注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油(诸如芝麻油)或合成的脂肪酸酯(诸如油酸乙酯，甘油三酯，或脂质体)。水性注射悬浮液可含有能增加悬浮液粘度的物质(诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖)。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加活性成分溶解度的试剂，以允许高度浓缩溶液的制备。
或者，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合适的载剂(例如无菌，无致热原水基溶液)构建。
本发明一些实施方式的药物组合物还可以使用例如常规栓剂基料(诸如可可脂或其他甘油酯)，配制为直肠组合物(诸如栓剂或滞留灌肠剂)。
适合在本发明的一些实施方式的情形中使用的药物组合物包括其中活性成分的有效含量可达到预期目的组合物。更具体地，治疗有效量是指有效预防、减轻或改善病症(例如癌症)的症状或延长接受治疗对象的存活的活性成分(多特异性抗体)的量。
治疗有效量的测定在本领域技术范围内，由其是在本发明的详细公开内容的教导下。
对于本发明方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可以从体外和细胞培养试验中初步估计。例如，可以在动物模型中配制剂量以达到期望的浓度或效价。可利用这类信息更精确地确定人用剂量。
本文所述活性成分的毒性和疗效可以通过标准制药程序在体外，在细胞培养物或实验动物中确定。从体外和细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于制定用于人的剂量范围。取决于采用的剂型和使用的给予途径，该剂量可变化。确切制剂、给予途径和剂量可以由个体医师根据患者的状况来选择。(参见，例如，Fingl等，1975，在“《治疗的药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)》”，第1章第1页)。
可以单独调整剂量和间隔以提供足以诱导或抑制生物效应(最小有效浓度，MEC)的活性成分的组织水平。各制剂的MEC会有所不同，但可以根据体外数据进行估计。达到MEC所需的剂量将取决于个体特征和给予途径。检测试验可用于确定血浆浓度。
根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是0.1-100mg/kg。
根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是0.1-100mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是0.1-80mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是0.1-60mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是0.1-50mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是0.1-40mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是0.1-30mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是0.1-20mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是0.1-10mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是1-100mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是10-100mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是20-100mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是30-100mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是40-100mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是50-100mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是60-100mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是70-100mg/kg。
根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是1-20mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是1-15mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是1-10mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是1-5mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是2-20mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是4-20mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是6-20mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是8-20mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是10-20mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是12-20mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是15-20mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是18-20mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是1-5mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是2-10mg/kg。根据具体的实施方式，多特异性抗体的剂量可以是5-10mg/kg。
根据待治疗病况的严重性和反应性，给予可以是单次或多次给予，治疗过程持续数天至数周或直至实现治愈或实现疾病状态的减轻。
当然，待给予的组合物的量将取决于治疗的对象、疾病的严重程度、给予方式、处方医师的判断等。
如果需要，本发明一些实施方式的组合物可以存在于包装或分配器装置中(诸如FDA批准的试剂盒)，其可以包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。例如，该包装可包括金属或塑料薄片(诸如泡罩包装)。所述包装或分配装置可附有给予说明书。包装或分配器还可以采用与容器相关的通知，其形式由管理药品制造、用途或销售的政府机构规定，该通知反映了该机构对组合物或人或兽药给药形式的批准。例如，此类通知可能是美国食品和药物管理局批准的处方药标签或批准的产品说明书。还可以制备包含在相容药物运载体中配制的本发明制剂的组合物，将其置于适当的容器中，并标记为用于治疗指定病症，如上文进一步详述。
预计在本申请成熟的专利有效期内，将开发出许多针对免疫检查点蛋白的相关抗体，并且术语抗检查点抗体的范围意在先验地包括所有此类新技术。
如本文所用，术语“约”指±10％。
术语“包含”、“含”、“包括”、“含有”、“具有”及其词形变化形式是指“包括但不限于”。
术语“由……组成”是指“包括并限于”。
术语“基本由……组成”是指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但前提是另外的成分、步骤和/或部分不会实质性地改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征。
除非文中另有明确说明，否则如本文所用的单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代形式。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
在本申请全文中，本发明的各种实施方式可以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各数值。例如，应当认为诸如1至6的范围描述已具体公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各数字，例如1、2、3、4、5和6。这普遍适用，与范围广度无关。
每当在本文中标明数值范围时，其含义包括所标明范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语在第一指示数字和第二指示数字“之间的范围/范围内”和“从”第一指示数字“到”第二指示数字的“范围”在本文中可互换使用，并且意在包括第一和第二指示数字及其之间的所有分数和整数。
如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和过程，其包括但不限于：化学、药理、生物、生物化学和药学领域从业者已知的方式、手段、技术和过程或容易从已知方式、手段、技术和过程开发出的方式、手段、技术和过程。
如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展，基本上改善病症的临床或美学症状或基本上防止病症的临床或美学症状的出现。
当提及特定序列表时，此类提及应理解为也涵盖基本上对应于其互补序列的序列，包括由例如测序错误、克隆错误或导致碱基取代、碱基缺失或碱基添加的其他改变引起的微小序列变异，此类变异的频率应小于1/50核苷酸，或者，小于1/100核苷酸，或者，小于1/200核苷酸，或者，小于1/500核苷酸，或者，小于1/1000核苷酸，或者，小于1/5000核苷酸，或者，小于1/10000核苷酸。
应理解，为清楚起见，在单独实施方式的内容中描述的本发明的一些特征还可以合并在单个实施方式中提供。相反地，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合或以适合于本发明的任何其他所述实施方式的方式提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方式的必要特征，除非该实施方式在没有那些要素的情况下是不可操作的。
上文中所描述且如以下权利要求书所述的本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中得到实验支持。
实施例
现在参考以下实施例，这些实施例与上文的描述一起，以非限制性方式说明本发明的一些实施方式。
一般而言，本文中使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中已有充分描述。参见，例如，“《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A laboratory Manual)”Sambrook等，(1989)；“《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)”第I-III卷，Ausubel，R.M.(编).(1994)；Ausubel等，“《新编分子生物学实验指南》”，威利约翰父子公司(JohnWiley and Sons)，马里兰州巴尔的摩(1989)；Perbal，“《分子克隆实践指南》(A PracticalGuide to Molecular Cloning)”，威利约翰父子公司，纽约(1988)；Watson等，“重组DNA(Recombinant DNA)”，科学美国人(Scientific American Books)，纽约；Birren等(编)“《基因组分析实验手册系列》(Genome Analysis：A Laboratory Manual Series)”，第1-4卷，冷泉港实验室出版社，纽约(1998)；方法示于美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057；“《细胞生物学：实验室手册》(Cell Biology：A LaboratoryHandbook)”，第I-III卷Cellis，J.E.(编).(1994)；“《动物细胞培养，基础技术手册》(Culture of Animal Cells，A Manual of Basic Technique)”，Freshney，WL出版社(Wiley-Liss)，纽约(1994)，第三版；“《新编免疫学实验指南》(Current Protocols inImmunology)”第I-III卷Coligan J.E.(编)(1994)；Stites等(编)，”《基础和临床免疫学》(Basic and Clinical Immunology)″(第8版)，Appleton和Lange，康涅狄格诺沃克(1994)；Mishell和Shiigi(编)，“《细胞免疫学的选用方法》(Selected Methods in CellularImmunology)”，弗里曼公司(W.H.Freeman and Co.)，纽约(1980)；现有的免疫测定方法在专利和科学文献中有]+泛的描述，例如，参见美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)”Gait，M.J.(编).(1984)；“《核酸杂交》Nucleic AcidHybridization”Hames，B.D.，和Higgins S.J.(编).(1985)；“《转录和翻译》(Transcription and Translation)”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，(编).(1984)；“《动物细胞培养》(Animal Cell Culture)”Freshney，R.I.，(编).(1986)；“《固定的细胞和酶》(Immobilized Cells And Enzymes)”IRL出版社，(1986)；“《分子克隆实践指南》(APractical Guide To Molecular Cloning)”Perbal，B.，(1984)和“《酶学方法》(Methodsin Enzymology)”第1-317卷，学术出版社(Academic Press)；“《PCR方案：方法和应用指南》(PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications)”，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥(1990)；Marshak等，“《蛋白质纯化和表征策略--实验室课程手册》(Strategiesfor Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual)”CSHL出版社(1996)；所有这些内容均以引用方式纳入本文，如同在本文完整示出。本文中提供了其它的通用参考文献。其中的过程被认为是本领域公知的并且是为了方便读者而提供的。其中包含的所有信息均通过引用纳入本文。
材料和方法
小鼠：C57BL/6小鼠购自Envigo。通过将Rosa-lox-stop-lox-iDTR小鼠[Jung，S.等.Immunity 17，211-220(2002)]和Xcrl-Cre-mTFP[Buch，T.等.Nat.Methods 2，419-426(2005)]杂交生成Xcr1-iDTR小鼠。.所有体内实验均在无特定病原体的设施中进行。使用8-10周龄的雌鼠，将其随机分配到实验组。
BiSE和亲本mAb的生成和表征：对各抗体杂交瘤的抗小鼠PD-1抗体、克隆RMP1-14和J43的可变结构域进行了测序。抗小鼠CLEC9A抗体(克隆10B4)和抗小鼠XCR1抗体(克隆MARX10)的序列分别取自专利US20130273150A和EP2641915A1。抗PD-1(克隆RMP1-14或J43)、抗XCR1(克隆MARX10)和抗CLEC9A(克隆10B4)的可变重链和轻链区是根据其已发表的序列(Syntezza)合成的。将亲本抗体的可变区序列插入具有单人IgG1或人κFc主链的哺乳动物表达载体或双特异性载体中。为了正确的重链-轻链配对，亲本DC靶向臂以CrossMab形式表达(CH1-CL交换)，而对于PD-1靶向臂，则保持野生型结构域结构。为了实现重链异源二聚化，在CH3结构域中引入了点突变：DC靶向臂的Y349C/T366S/L368A/Y407V；PD-1靶向臂的S354C/T366W。为了生成人IgG1的Fc结构域变体(N297A)，根据制造商的说明，使用特异性引物通过PCR(安捷伦科技(Agilent Technologies))进行定点诱变。突变的质粒序列通过直接测序验证(生命科学核心设施(Life Science Core Facility)，魏茨曼科学研究院(Weizmann Institute of Science))。为了产生抗体，将抗体重链和轻链表达载体瞬时转染至Expi293细胞(赛默飞世尔(ThermoFisher))中。通过蛋白G Sepharose 4Fast Flow(GE医疗生命科学公司(GE Healthcare))纯化上清液中的分泌的抗体。在PBS中透析纯化的抗体并进行无菌过滤(0.22μm)。通过SDS-PAGE和考马斯染色评估纯度，估计>90％。使用Superose 6Increase 10/300GL色谱柱(GE医疗生命科学公司)在Pure 25FPLC系统上进行尺寸排阻色谱(SEC)。
结合ELISA：使用重组小鼠PD-1(义翘神州(Sino Biological))和小鼠CLEC9A(R&D系统公司(R&D Systems))通过ELISA确定单特异性和双特异性抗体的结合特异性和亲和力。ELISA板(Nunc)在4℃下用小鼠PD-1或小鼠Clec9a的重组胞外结构域(1μg/mL/孔)包被过夜。所有连续步骤均在室温下进行。洗涤后，将板用含有2％BSA的1xPBS封闭1小时，然后用系列稀释的IgG(在含有2％BSA的1xPBS中以1：5连续稀释)孵育1小时。对于双重结合ELISA试验，将板与1μg/mL生物素化的小鼠PD-1(义翘神州)一起孵育1小时。洗涤后，将板与辣根过氧化物酶偶联的抗人IgG(杰克逊免疫研究公司(Jackson Immuno Research))或与辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素(白乐津公司(BioLegend))一起孵育1小时。使用单组分底物溶液(TMB)进行检测，并通过添加0.18M硫酸终止反应。立即使用SpectraMax Plus分光光度计(分子装置公司(Molecular Devices))记录450nm处的吸光度，并减去阴性对照样品的背景吸光度。
表达mPD-1、mXCR1和mCLEC9A的稳定细胞系的转染和建立：使用Lipofectamine2000(英杰公司(Invitrogen)，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)，按照制造商推荐的程序，用3μg pcDNA3.1-PD-1、pcDNA3.1-XCR1或pcDNA-Clec9a表达载体(Genescript)或空载体(pcDNA 3.1)在6孔细胞培养板(康宁(Corning))中转染70％汇合度的HEK293细胞。转染后，经过G418选择(800μg/ml)14天，建立稳定细胞系。用添加10％FBS、800μg/ml G418和1％PenStrep(吉布可公司(Gibco))的DMEM培养稳定细胞系。将培养物在37℃和5％CO2的湿润培养箱中培养。
HEK293过表达细胞结合试验和双重结合试验：由上述HEK293过表达细胞制备单细胞悬浮液。对于表面染色，将细胞以100μl PBS中0.2-1x106个细胞的浓度铺板在U形96孔板(赛默飞世尔)中。首先用LIVE/DEADTM可固定蓝色死细胞染色剂(赛默飞世尔)对细胞进行染色，然后用PBS洗涤两次。mAb和BiSE的标准结合滴定试验在冰上进行，持续30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重悬于150μl FACS缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。对于双抗原接合FACS测定，对过表达XCR1或CLEC9A的HEK293细胞进行BiSE的标准滴定，并使用PD-L1生物素化重组蛋白(义翘神州)进行另外的孵育步骤。然后通过链霉亲和素(杰克逊免疫研究公司)检测双重结合。对于双结合FACS试验，评估表达各靶蛋白的HEK293细胞之间的双联体接合。根据制造商的方案(赛默飞世尔)，各细胞类型均以CFSE或CellTrace染色。将以CFSE或CellTrace染色的1：1过表达细胞的混合物用于BiSE的标准结合滴定试验，在冰上进行，持续30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重悬于150μl FACS缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。CFSE/CellTrace对的百分比量化自活双联体。
PD-1/PD-L1阻断试验：由上述HEK293-mPD-1过表达细胞制备单细胞悬浮液，浓度为100μl PBS中0.2-1x106个细胞。将细胞与标准滴定的BiSE或亲本mPD-1mAb在冰上孵育30分钟，洗涤两次，然后与mPD-L1生物素(义翘神州)一起在冰上再孵育1小时。将细胞洗涤两次，并在冰上重悬于偶联的链霉亲和素(杰克逊免疫研究公司)中1小时，以检测PD-1/PD-：1相互作用。然后将细胞洗涤两次，重悬于150μl FACS缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。
体外脾细胞双重结合试验：对于CD8+T细胞的PD-1上调，从OT-1CD45.1小鼠中收获脾脏，并制备单细胞悬浮液。用70μm尼龙细胞筛网剖开脾脏，然后用红细胞裂解缓冲液(西格玛奥里奇公司(Sigma-Aldrich))孵育5分钟以裂解红细胞，并用PBS冲洗。根据制造商的方案，使用EasySepTM小鼠CD8+T细胞分离试剂盒(干细胞技术公司(Stemcell))通过阴性选择分离CD8+细胞。然后将细胞以5x105的浓度接种在24孔板中，并在有IL-15(5ng/ml，派普泰克公司(Peprotech))、IL-7(5ng/ml，派普泰克公司)和10mg/ml OVA(257-264)肽(西格玛奥里奇公司)的完全培养基(RPMI 1640，25mM HEPES，1％L-谷氨酰胺，10％FBS，1％PenStrep，1％非必需氨基酸，1％丙酮酸和0.05mM β-巯基乙醇)中培养。24小时后，向各孔另外添加10mg/ml OVA。将细胞培养48小时。在含有细胞因子但不含OVA的完全培养基中培养未刺激的对照。通过FACS评估细胞的PD-1表达，48小时后，与未刺激的对照相比，100％的细胞为PD-1+。PD-1表达建立后，将PD-1+CD8+T细胞与从XCR1-cre-mTFP小鼠分离的脾细胞以1：10的比例在U形96孔板(赛默飞世尔)中孵育，约5x105个细胞/孔。将细胞用LIVE/DEADTM可固定蓝色死细胞染色剂(赛默飞世尔)染色，然后用PBS洗涤两次，接着用小鼠TruStain Fc封闭剂(白乐津公司)将其重悬于25μl FACS缓冲液中，并在室温下孵育15分钟。然后将细胞洗涤两次，并与BiSE或BiSE对照1：2系列稀释液在冰上避光孵育1小时。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并在冰上用FACS缓冲液对表面抗原染色30分钟。将细胞洗涤两次，重悬于150μlFACS缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。细胞群由以下标志物定义(白乐津公司)：CD8+T细胞：CD45.1+(A20)，CD8+(536.7)。cDC1：CD45.1-，CD11c+(N418)，MHC II+(M5/11415.2)，和来自XCR1-cre-mTFP小鼠的内源性mTFP。T细胞/DC双联体根据T细胞的百分比进行量化。BiSE是用R-藻红蛋白偶联的抗人IgG(杰克逊免疫研究公司)进行鉴定的。用于流式细胞术、ImageStream和单细胞RNA测序分析的组织处理：通过70μm尼龙细胞筛网解剖淋巴结，并用PBS洗涤。将肿瘤机械解剖成小碎片，并转移至含有以下的GentleMACSTM C管(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))：0.33mg/mL DNA酶I(罗氏(Roche))和0.27mg/mL Liberase TL(罗氏)，用于流式细胞术分析，或0.1mg/mL DNA酶I(罗氏))和1mg/mL胶原酶IV(沃新顿(Worthington))，用于单细胞RNA测序分析。在GentleMACSTM Octo Dissociator(美天旎生物技术公司)中将肿瘤解离两次，然后孵育细胞悬浮液(37℃，25rpm，40分钟-流式细胞术/37℃，25rpm，15分钟-单细胞RNA测序)。然后通过70μm尼龙细胞滤网将肿瘤分散并用PBS洗涤。
流式细胞术：单细胞悬浮液的制备方法如上所述。对于表面染色，将细胞以100μlPBS中0.2-1x106个细胞的浓度铺板在U形96孔板(赛默飞世尔)中。细胞首先用LIVE/DEADTM可固定蓝色死细胞染色剂(赛默飞世尔)染色，然后用PBS洗涤两次，接着用小鼠TruStainFc封闭剂(白乐津公司)将其重悬于25μl FACS缓冲液中，并在室温下孵育15分钟。表面抗原在冰上的FACS缓冲液中染色30分钟。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重悬于150μlFACS缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。对于细胞内FOXP3染色，根据制造商的说明，使用True-NuclearTM转录因子缓冲液套组试剂盒(白乐津公司)和抗FOXP3(白乐津公司)进行另外的染色步骤。所有样品均在CytoFLEX LX(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))和FlowJo软件上进行分析。除非另有说明，细胞群由以下标志物(白乐津公司)定义：cDC1：CD45+，MHC II+，CD11c+，CD19-，CD64-，F4/80-，Ly6C-，SIRPα-。cDC2：CD45+，MHC II+，CD11c+，CD19-，CD64-，F4/80-，Ly6C-，SIRPα+。CD8效应细胞：CD45+，CD11b-，CD3+，CD8+，CD4-。CD4效应细胞：CD45+，CD11b-，CD3+，CD8+，CD4+，FOXP3-。Treg：CD45+，CD11b-，CD3+，CD8+，CD4+，FOXP3+。T细胞/cDC1双联体由以下标志物定义：CD45+，MHC II+，CD11c+，CD19-，CD64-，F4/80-，Ly6C-，SIRPα-，CD3+。
ImageStream：如所述，给WT小鼠接种B16F10肿瘤。在第11天，500ug/小鼠的BiSE对小鼠进行腹腔注射。小鼠在第12天被处死，并切除肿瘤引流淋巴结。单细胞悬浮液的制备方法如上所述。细胞首先用LIVE/DEADTM可固定紫色死细胞染色剂(赛默飞世尔)染色，然后用PBS洗涤两次，接着用小鼠TruStain Fc封闭剂(白乐津公司)将其重悬于25μl FACS缓冲液中，并在室温下孵育15分钟。表面抗原在冰上的FACS缓冲液中染色30分钟。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重悬于30μl FACS缓冲液中，并通过ImageStream进行分析。细胞群由以下标志物定义(白乐津公司)：DC：MHC II+，CD11c+。T细胞：CD3+。用R-藻红蛋白偶联的抗人IgG(杰克逊免疫研究公司)鉴定BiSE，或在注射前使用SAIVI Alexa Fluor 647抗体标记试剂盒(赛默飞世尔)进行标记。使用多光谱成像细胞仪(ImageStreamX mark II成像流式细胞仪；Amnis，EMD Millipore的部分)对细胞进行成像。每个样品至少收集5×103个细胞，并使用制造商的图像分析软件(IDEAS 6.2；Amnis)分析数据。
肿瘤挑战和治疗：将肿瘤细胞系维持在37℃和5％CO2的潮湿培养箱中，并在含有25mM HEPES、1％L-谷氨酰胺、10％FBS、1％Pen Strep、1％非必需氨基酸和1％丙酮酸盐的完全RPMI培养基中培养。将MC38(2×106)和B16-F10(4x105)皮下植入小鼠右侧胁腹，每2-3天用电子卡尺盲法测量肿瘤体积。使用公式(L2 2*L1)/2报告体积，其中L1是最长直径，L2是最短直径。肿瘤接种后7至10天，当肿瘤长度和宽度之和达到约50mm3时，根据肿瘤大小(第0天)对小鼠进行随机分组，并如各实验所述接受腹膜内注射治疗。在第0、3和6天，用500μgBiSE或对照PBS处理WT小鼠。治疗开始后对小鼠进行8-20天的监测，或者直到由于魏茨曼科学研究院IACUC对肿瘤大小的限制而不得不处死大部分未经治疗的对照组小鼠为止。对于KP模型，小鼠静脉注射5×105个KP细胞，并接受腹腔注射治疗，并在第15、18、21、24和27天分别接受200μg自制抗小鼠PD-1IgG1-N297A mAb(克隆RMP1-14)、500μg BiSE或对照PBS治疗。
H&E染色：如前所述，WT KP负荷小鼠在肿瘤接种后腹腔注射500ug/小鼠的BiSE或单特异性抗体。28天后，收获经处理的动物的肺，将其放入4％多聚甲醛(PFA)中过夜，然后在魏兹曼科学研究院组织学与病理学部门进行石蜡处理并用苏木精和伊红(H&E)染色。使用Pannoramic scan II扫描仪(3DHISTECH)对切片进行扫描，并使用CaseViewer软件获取和分析图像。
细胞耗竭研究：在肿瘤接种后4天开始XCR1+cDC1耗竭，并在整个治疗期间每隔一天以20ng/g的剂量进行，直至治疗完成后4天。通过流式细胞术分析或血小板计数评估耗竭效率。
数据与统计学分析：使用FlowJo v.10.6.2进行流式细胞术数据分析；所有其它数据分析均使用GraphPad Prism(GraphPad软件)进行。除非另有说明，定量数据以平均值±s.e.m表示。如果展示的是几何平均强度，则显示MFI；如果数值是根据同种型对照推导的抗体荧光强度，则展示Δ几何平均强度(ΔMFI)。虽然没有使用统计学方法预先确定样品量，但在体内研究中考虑了小鼠数量，以确保检测到生物效应，并能够进行组间比较，这些都是根据初步实验结果确定的。如上所述，所有体内实验的组别分配都是随机的。肿瘤测量是在盲法下进行的；在其他体内和体外研究中，研究人员在进行实验时对治疗组不设盲法。对于各数据集，均采用Shapiro-Wilk和/或D′Agostino-Pearson检验法确认总体和/或总体残差(高斯分布)的正态性。对于正态分布，使用事后Tukey检验的单因素方差分析(ANOVA)来比较具有三种或更多种治疗的所有组。当比较两组时，使用不配对的双尾斯氏t检验(双尾，不等方差)来确定统计显著性。当数据不呈正态分布时，使用非参数检验——Kruskal-Wallis与事后Dunn检验进行多重比较，或在比较两组时使用曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验。在所有统计学检验中，P＜0.05被认为是显著的，并以如下数字表示：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。
实施例1
肿瘤特异性CD8+T细胞亚群对抗PD-1治疗有反应
大多数癌症患者对抗PD-1检查点抑制治疗没有反应。为了全面表征抗PD-1治疗后CD8+T细胞反应的细胞和分子途径，对肿瘤、脾脏和引流淋巴结(dLN)的样品进行了大规模并行单细胞RNA测序。scRNA-seq数据显示，对TME内PD-1阻断反应最强烈的细胞毒性T细胞是独特的肿瘤特异性细胞亚群。这些细胞表达高水平的DC趋化剂XCL1，这是一种仅在cDC1上表达的XCR1受体的特异性配体，已被证明对于抗肿瘤免疫至关重要。不同的是，功能失调的T细胞表达高水平的PD-1，但没有任何XCL1表达(图1A-C)。这些结果表明，抗PD-1治疗的有效性可能取决于CD8+T细胞和cDC1之间的相互作用。
为了测试这些结果，在MC38结肠腺癌肿瘤模型中，使用XCR1-cre-iDTR小鼠系在抗PD-1免疫治疗的活性阶段，有条件地耗竭cDC1。cDC1耗竭后，抗PD-1的显著抗肿瘤作用被完全消除(图1D)，强调了抗PD-1免疫治疗期间TME中T/DC串扰的重要性。
实施例2
T细胞/树突细胞BiSE的生成
基于TME治疗后的scRNA-seq谱析以及cDC1诱导性耗竭遗传模型的结果，假设CD8+T细胞和cDC1之间形成免疫突触将提高抗PD-1治疗的效力。为了检验这一假设，生成了多个PD-1/cDC1 BiSE(即与PD-1和cDC1二者形成物理连接的试剂)。对于cDC1臂，cDC1限制性表面标志物XCR1或CLEC9A分别与MARX-10克隆或10B-4克隆的可变区一起使用。这两个靶标在小鼠和人类中都有类似的保守性。对于PD-1靶向臂，使用了充分表征的抗PD-1 mAb克隆RPM1-14的可变区。研究了BiSE的生化特性及其对所需靶标的双重特异性。作为对照，生成了包含各BiSE的亲本mAb的单体免疫球蛋白G(IgG)版本，以及PD-1/辛格斯构建体，这是一种双特异性形式的同种型对照，仅用抗体的一个臂靶向PD-1，无需与DC接合。
为了产生所需的双特异性抗体组合，需要正确组装现有抗体的四个重链和轻链。使用杵臼技术[2]，该技术可识别重链CH3结构域中的点突变，从而实现所需重链的异源二聚化。CrossMab技术[3]，即组成双特异性抗体的两种抗体之一的重链CH1和轻链CL1结构域进行交换，以确保轻链与其同源重链的正确缔合。BiSE的Fc发生突变(N297A)以消除FcγR结合。将各BiSE的四个构建体共转染到HEK293细胞中进行生产，并通过固定化蛋白G亲和柱从细胞培养基中纯化。通过SDS-PAGE和分析尺寸排阻色谱(SEC)对双特异性抗体的纯度和同质性进行了表征(图2A-C)。结果表明，该构建体被正确组装成包含来自各抗体的两条链的所需异源二聚体，以及所获得的构建体的纯度。
实施例3
BiSE的结合和阻断能力的检验
接着，使用表达PD-1、XCR1或CLEC9A和重组蛋白的转染HEK293细胞，通过ELISA或FACS评估各臂的结合能力。结果显示，任何单特异性或双特异性抗体都能与所有三个靶标结合，并具有相关特异性(图3A，B)。使用基于FACS的PD-1阻断试验检测了BiSE阻断PD-1与其配体PD-L1之间相互作用的能力(图3C，D)。如图4B所示，XCR1-和CLEC9A-BiSE都减少了PD-1/PD-L1的相互作用。
实施例4
BiSE的双重结合能力的检验
然后通过双结合FACS检测(图4A)评估BiSE同时与两个靶标结合的能力，从而加强PD-1+细胞与XCR1+或CLEC9A+细胞之间的串联，进而建立T细胞/DC的相互作用模型，量化CFSE/Ce1lTrace染色对的百分比。结果表明，它能以剂量依赖的方式同时有效结合至PD-1和XCR1以及PD-1和CLEC9A。这些结果表明，BiSE可以反式(即在两个不同的细胞上)与PD-1和cDC1表面标志物同时结合。在体外试验中，还对脾细胞的双重结合进行了评估。从OT-1CD45.1小鼠体内分离出CD8+T细胞，反复暴露于OVA后，这些细胞在培养过程中上调PD-1。然后用标准的BiSE滴定法将它们与原初脾细胞孵育，并通过FACS分析T/DC双联体。BiSE介导了剂量依赖性的脾细胞双联体形成，显示出与小鼠靶细胞上的PD-1和XCR1/CLEC9A的有效结合(图4B)。
实施例5
BiSE体内双重结合活性的检验
为了测试BiSE在体内形成T/DC免疫突触的能力，给小鼠接种了B16F10肿瘤，以诱导T细胞耗竭，增加CD8+T细胞上的PD-1表达，并建立TME模型。肿瘤形成后，用BiSE治疗小鼠，一天后评估T/DC突触的形成。经BiSE处理的小鼠显示，dLN中双联体形成增加(图5A)，dLN中总免疫细胞中cDC1的百分比也增加了，这表明BiSE可在给予后诱导cDC1迁移到dLN(图5B)。为了评估BiSE是否介导了免疫突触形成的增加，用荧光团标记的BiSE对荷瘤小鼠进行了处理。一天后，通过ImageStream评估双联体形成。BiSE位于PD-1/CLEC9A治疗小鼠的免疫突触内，与PD-1/辛格斯治疗小鼠相比，突触形成显著增加(图5C)。
实施例6
BiSE体内抗体活性的检验
为了测试BiSE对免疫突触的体内接合，使用了对传统抗PD-1单一疗法具有抗性的B16F10肿瘤小鼠模型以及MC38结肠腺癌模型。在B16F10肿瘤模型中，与未治疗的小鼠和用PD-1/辛格斯同种型对照治疗的小鼠相比，用PD-1/CLEC9A BiSE治疗可显著提高总体生存率并减少肿瘤生长(图6A)。在MC38肿瘤模型中，以PD-1/XCR1 BiSE治疗在治疗6天时产生了中等的抗肿瘤效果(图6B)。在KP肺肿瘤模型中，以PD-1/CLEC9A BiSE治疗导致4只小鼠中的3只完全消除了KP肺肿瘤病灶(图6C)。
实施例7
BiSE体内TME T细胞调节活性的检验
最后，使用MC38结肠腺癌肿瘤模型和B16F10黑色素瘤模型评估BiSE治疗后TME和dLN中T细胞的区室化和活化。第三次BiSE治疗后5天对小鼠进行分析。与未经治疗的小鼠相比，BiSE治疗导致细胞毒性CD8+和效应CD4+T细胞显著增加，调节性T细胞(Treg)显著减少，CD8/Treg比率显著增加(图7A，B，C)。与PD-1/辛格斯治疗的对照小鼠(图7A，C)以及PD-1mAb治疗的小鼠(图7B)相比，CD4效应物/Treg比率和CD8/CD4效应物/Treg比率在BiSE治疗后也显著增加，显示TME中免疫突触形成的增加效应。
实施例8
BiSE时间线的检验
最后，使用B16肿瘤模型，在BiSE治疗和缩放四个时间点后评估TME和dLN中的双联体形成以及TME中的T细胞区室化和活化。在第一次、第二次和第三次BiSE注射后24小时以及第三次BiSE注射后5天收获小鼠。与未经治疗和同种型对照组相比，BiSE治疗改善了肿瘤和dLN中的T细胞/cDC1双联体形成，细胞毒性CD8+T细胞、CD4+细胞显著增加，T效应物/Treg比率显著增加，再次强调TME中免疫突触形成的增加益处(图8A-D)。
实施例9
验证结合人细胞的抗体合格
双重结合/PD-1阻断试验--使用转染人类抗原靶标的HEK293细胞。
PD-1/PD-L1阻断生物试验-使用预制试剂盒以BiSE或对照Ab评估PD-1阻断和MOA。
双联体、DC/T活化和细胞因子分泌共培养试验
从人类献血者中分离出PBMC。使用针对CD8和CD14的专用抗体富集T细胞和DC，分别使用GM-CSF和IL-4等试剂分化未成熟的DC，并与BiSE或对照抗体一起孵育。通过细胞因子ELISA检测IFN γ/IL-12细胞因子的释放，通过FACS检测DC/T活化标志物，以及双联体形成来确定效果。
DC：T相互作用的体外成像
将富含种子的DC(来自人PBMC)接种到包被的盖玻片上，并在BiSE或对照抗体存在下与预刺激的T细胞共培养。通过免疫荧光分析。
T细胞增殖试验
富集PBMC中的T细胞并使用CFSE/CellTrace进行标记。用抗CD3抗体刺激并在DC和BiSE/对照抗体存在下培养数天。通过FACS分析CFSE/CT稀释度。培养开始后48小时收获上清液用于细胞因子分析。
尽管已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是显然许多替代、修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，其目的是涵盖落入所附权利要求书的精神和广泛范围内的所有此类替代、修改和变化。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用其全文纳入本文，就好像将各篇单独的出版物、专利或专利申请专门和单独地通过引用纳入本文那样。此外，该申请文件中任何文献的引用或鉴定不应被解释为承认这类文献可作为本发明的现有技术。就所使用的章节标题而言，它们不应被解释为必定具有限制性。此外，本申请的优先权文件的全部内容以引用其全文的方式纳入本文。
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Claims (24)

1.一种多特异性抗体，其包含能特异性结合至肿瘤内T细胞上的免疫检查点蛋白的第一抗原结合部分和能特异性结合至常规树突细胞1(cDC1)的第二抗原结合部分。
2.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述免疫检查点蛋白选自以下组：PD-1、CTLA-4、TIGIT、LAG-3、TIM-3、ICOS、BTLA、4-1BB、GITR和OX-40。
3.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合部分阻止T细胞的PD-1与PDL-1表达细胞的结合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原结合部分结合Clec9a。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫检查点蛋白是PD-1。
6.根据权利要求5所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合部分在具有N到C方向的重链中包含如SEQ ID NO：1-3所示的互补决定区，在具有N至C方向的轻链中包含如SEQID NO：4-6所示的互补决定区。
7.根据权利要求5所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合部分在具有N到C方向的重链中包含如SEQ ID NO：11-13所示的互补决定区，在具有N至C方向的轻链中包含如SEQID NO：14-16所示的互补决定区。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原结合部分在具有N到C方向的重链中包含如SEQ ID NO：21-23所示的互补决定区，在具有N至C方向的轻链中包含如SEQ ID NO：24-26所示的互补决定区。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原结合部分在具有N到C方向的重链中包含如SEQ ID NO：31-33所示的互补决定区，在具有N至C方向的轻链中包含如SEQ ID NO：34-36所示的互补决定区。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体的Fc区包含用于减少所述抗体与FcγR的结合的突变。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的多特异性抗体，其包含杵臼型突变。
12.根据权利要求11所述的多特异性抗体，其中所述突变位于所述多特异性抗体中包含Y349C/T366S/L368A/Y407V的第一抗体的CH3结构域和所述多特异性抗体中包含S354C/T366W的第二抗体的CH3结构域中。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一部分包含如以下所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：7和8；或SEQ ID NO：17和18。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一部分包含如以下所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：27和28；或SEQ ID NO：37和38。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的多特异性抗体，其为双特异性抗体。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的多特异性抗体，其用于治疗癌症。
17.一种药物组合物，其包含如权利要求1-15中任一项所述的多特异性抗体。
18.一种核酸，其编码如权利要求1-15中任一项所述的多特异性抗体的重链和/或轻链。
19.一种表达载体，其包含如权利要求18所述的核酸。
20.一种细胞，其用如权利要求19所述的表达载体转化。
21.一种制备多特异性抗体的方法，其包括：
(a)在允许多特异性抗体表达的条件下培养如权利要求20所述的细胞；以及
(b)从细胞中分离多特异性抗体。
22.一种治疗有需要的对象中的癌症的方法，所述方法包括向所述对象给予治疗有效量的如权利要求17所述的药物组合物，从而治疗所述对象中的癌症。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述癌症的肿瘤的特征在于具有高于预定水平的T细胞：树突细胞比率。
24.根据权利要求16所述的多特异性抗体或权利要求22所述的方法，其中所述癌症选自以下组：膀胱癌、乳腺癌、子宫/宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤和病毒相关癌症。
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