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CN118215671A - 一种促红细胞生成刺激蛋白的制备方法 - Google Patents

一种促红细胞生成刺激蛋白的制备方法 Download PDF

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CN118215671A
CN118215671A CN202280059408.9A CN202280059408A CN118215671A CN 118215671 A CN118215671 A CN 118215671A CN 202280059408 A CN202280059408 A CN 202280059408A CN 118215671 A CN118215671 A CN 118215671A
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CN
China
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protein
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exchanger
fine
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Application number
CN202280059408.9A
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朱建伟
江华
谢跃庆
王振玉
范宝庆
韩雷
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Jecho Laboratories Inc
Jieku Shanghai Biomedical Research Co ltd
Jecho Biopharmaceuticals Co ltd
Original Assignee
Jecho Laboratories Inc
Jieku Shanghai Biomedical Research Co ltd
Jecho Biopharmaceuticals Co ltd
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Abstract

一种促红细胞生成刺激蛋白的制备方法，具体涉及一种蛋白分离方法，使所述蛋白与两种或以上的阳离子交换剂接触，其中一种所述阳离子交换剂为精细阳离子交换剂。

Description

一种促红细胞生成刺激蛋白的制备方法 技术领域
本申请涉及生物医学领域，具体的涉及一种促红细胞生成刺激蛋白的制备方法。
背景技术
制约长效促红细胞生成刺激蛋白(Erythropoietin，EPO)能否应用于临床的关键瓶颈是生产工艺，特别是纯化工艺。现有的EPO生产工艺一方面可能使用大量的有机试剂进行反相层析，需要建设防爆工作环境，存在安全性重大风险；另一方面可能层析步骤不完善，仅仅获得了部分指标达标的产品。本领域急需开发一种安全、高效的层析技术纯化，得到质量合格的促红细胞生成刺激蛋白类似物或功能衍生物。
而现有的促红细胞生成刺激蛋白生产工艺中都有两个重大的质量指标风险，很难得到固定糖型的目的蛋白且批间一致性差和宿主蛋白超标，为此本申请可以在摒弃到反相层析工艺的基础上，开发出一种包括多种层析技术的顺序组合和过滤方法纯化蛋白质的步骤，获得固定糖型的促红细胞生成刺激蛋白类似物或功能衍生物，特别是长效促红细胞生成刺激蛋白，可产生纯度≥98％，HCP小于100ppm，糖型和唾液酸比例合格的药物。
发明内容
本申请提供了一种蛋白分离方法，例如可以是促红细胞生成刺激蛋白类似物或其衍生物的纯化和/或制备方法。本申请的蛋白分离方法可以降低杂质，例如宿主蛋白(HCP)、宿主DNA(HCD)、聚集体、内毒素、高等电点(PI)电荷异构体、低PI电荷异构体、低分子量杂质、和/或病毒等。本申请的方法可以得到荷质比、唾液酸含量、和/或糖型合格的产品。
一方面，本申请提供了一种蛋白分离方法，使所述蛋白与两种或以上的阳离子交换剂接触，其中一种所述阳离子交换剂为精细阳离子交换剂。
在一些实施方式中，所述蛋白包含促红细胞生成刺激蛋白、其变体或上述的功能活性片段。
在一些实施方式中，所述蛋白包含糖基化修饰。
在一些实施方式中，所述蛋白包含结合到N-糖基化位点的聚糖结构。
在一些实施方式中，所述聚糖结构包含FA4G4L2S4。
在一些实施方式中，所述FA4G4L2S4结构的比率为15％以上。
在一些实施方式中，所述聚糖结构还包含FA4G4L1S4。
在一些实施方式中，其中所述FA4G4L1S4的比率为20％以上。
在一些实施方式中，所述聚糖结构还包含FA4G4S4。
在一些实施方式中，其中所述FA4G4S4的比率为10％以上。
在一些实施方式中，所述聚糖结构包含Neu5Gc，其所述Neu5Gc的摩尔比率为0.5％以下。
在一些实施方式中，所述蛋白包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或其功能活性片段。
在一些实施方式中，所述蛋白包含选自以下组的N-糖基化位点：N24、N30、N38、N83和N88。
在一些实施方式中，所述蛋白通过CHO细胞表达。
在一些实施方式中，所述CHO细胞包含CHO-S细胞。
在一些实施方式中，所述精细阳离子交换剂包含粒径为约30微米或更小的阳离子交换剂。
在一些实施方式中，所述精细阳离子交换剂包含分散度为约3％或更小的阳离子交换剂。
在一些实施方式中，所述分散度为粒径标准偏差与粒径平均值的比值。
在一些实施方式中，所述精细阳离子交换剂包含Source 30s。
在一些实施方式中，所述精细阳离子交换剂以外的其它阳离子交换剂包含Capto S impact。
在一些实施方式中，所述蛋白先与所述其它阳离子交换剂接触，后与所述精细阳离子交换剂接触。
在一些实施方式中，所述方法还包含使所述蛋白与混合模式交换剂接触。
在一些实施方式中，所述蛋白先与所述精细阳离子交换剂接触，后与所述混合模式交换剂接触。
在一些实施方式中，所述方法还包含使所述蛋白与两种或以上的所述混合模式交换剂接触。
在一些实施方式中，所述蛋白先与所述精细阳离子交换剂接触，后与两种或以上所述混合模式交换剂接触。
在一些实施方式中，所述混合模式交换剂包含以下组：羟基磷灰石Ⅱ型和CaptoMMC Impres。
在一些实施方式中，所述方法还包含使所述蛋白与阴离子交换剂接触。
在一些实施方式中，所述蛋白先与所述阴离子交换剂接触，后与所述阳离子交换剂接触。
在一些实施方式中，所述阴离子交换剂包含以下组：Capto Q和Q.sepharose.HP。
在一些实施方式中，其中所述蛋白与所述交换剂接触时同时接触选自以下组的缓冲液：Tris缓冲液、精氨酸溶液、磷酸盐溶液、柠檬酸盐溶液和NaCl溶液。
在一些实施方式中，包含(1)使所述蛋白与所述阴离子交换剂接触；(2)使上述步骤获得的所述蛋白与所述其它阳离子交换剂接触，(3)使上述步骤获得的所述蛋白与所述精细阳离子交换剂接触，(4)使上述步骤获得的所述蛋白与所述混合模式交换剂接触。
在一些实施方式中，包含(1)使所述蛋白与所述阴离子交换剂接触；(2)使上述步骤获得的所述蛋白与所述其它阳离子交换剂接触，(3)使上述步骤获得的所述蛋白与所述精细阳离子交换剂接触，(4)使上述步骤获得的所述蛋白与两种以上所述混合模式交换剂接触。
另一方面，本申请提供了一种分离的蛋白，其经过如本申请所述的蛋白分离方法分离得到。
在一些实施方式中，本申请的分离的蛋白中宿主蛋白含量约为500ng/mg或更低。
在一些实施方式中，本申请的分离的蛋白中宿主蛋白含量约为100ng/mg或更低。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含本申请所述的蛋白和药学上可接受的佐剂。
另一方面，本申请提供了本申请所述的蛋白和/或本申请所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗贫血。
在一些实施方式中，本申请所述的蛋白和/或本申请所述的药物组合物在制备药物中的用途中所述贫血包括肾性贫血、多发性骨髓瘤贫血和/或癌性贫血。
另一方面，本申请提供了延长促红细胞生成刺激蛋白半衰期的方法，其包括以下的步骤：向有需要的受试者施用本申请所述的蛋白和/或本申请所述的药物组合物。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“聚糖结构”，通常是指多糖或寡糖，即在酸水解之后产生多个单糖的多聚化合物。糖基化修饰的蛋白可以包含经由天冬酰胺或精氨酸(“N-连接的糖基化”)或经由丝氨酸或苏氨酸(“O-连接的糖基化”)共价偶联至多肽链的侧基的一个或多个聚糖结构。例如，可以是FA4G4L2S4聚糖结构连接到促红细胞生成刺激蛋白的N-糖基化位点，可以是FA4G4L1S4聚糖结构连接到促红细胞生成刺激蛋白的N-糖基化位点，可以是FA4G4S4聚糖结构连接到促红细胞生成刺激蛋白的N-糖基化位点，可以是聚糖结构Neu5Gc连接到促红细胞生成刺激蛋白的N-糖基化位点。聚糖结构根据其支化(天线)数目分为二天线、三天线和四天线结构。聚糖结构由各种单糖组成，按照Oxford命名法则，包括岩藻糖(Fucose，简称Fuc或F)、N-乙酰葡糖胺(N-Acetylglucosamine，简称GlcNAc、Gn或A)、半乳糖(Galactose，简称Gal或G)、乳糖(Lactose，简称Lac或L)、甘露糖(Mannose，简称Man或M)、N-乙酰神经氨酸(唾液酸、N-Acetylneuraminic，简称NANA、Neu5Ac或S)和/或N-羟乙酰神经氨酸(N-Glycolylneuraminic，简称NGNA、Neu5Glc或Neu5Gc)。例如，术语“FA4G4L2S4”是指含有岩藻糖化、4个N-乙酰葡糖胺、4个半乳糖、2个乳糖、4个唾液酸的四天线结构聚糖结构，其中F代表含有岩藻糖修饰，A代表N-乙酰葡糖胺，G代表半乳糖，L代表乳糖，S代表唾液酸，A后的数字代表一个聚糖结构上所述N-乙酰葡糖胺的个数，G后的数字代表一个聚糖结构上所述半乳糖的个数，L后的数字代表一个聚糖结构上所述乳糖的个数，S后的数字代表一个聚糖结构上所述唾液酸的个数；术语“FA4G4L1S4”是指含有岩藻糖化、4个N-乙酰葡糖胺、4个半乳糖、1个乳糖、4个唾液酸的四天线结构聚糖结构，其中F代表含有岩藻糖修饰，A代表N-乙酰葡糖胺，G代表半乳糖，L代表乳糖，S代表唾液酸，A后的数字代表一个聚糖结构上所述N-乙酰葡糖胺的个数，G后的数字代表一个聚糖结构上所述半乳糖的个数，L后的数字代表一个聚糖结构上所述乳糖的个数，S后的数字代表一个聚糖结构上所述唾液酸的个数；术语“FA4G4S4”是指含有岩藻糖化、4个N-乙酰葡糖胺、4个半乳糖、4个唾液酸的四天线结构聚糖结构，其中F代表含有岩藻糖修饰，A代表N-乙酰葡糖胺，G代表半乳糖，S代表唾液酸，A后的数字代表一个聚糖结构上所述N-乙酰葡糖胺的个数，G 后的数字代表一个聚糖结构上所述半乳糖的个数，S后的数字代表一个聚糖结构上所述唾液酸的个数；术语“Neu5Gc”是指N-羟乙酰神经氨酸。
在本申请中，术语“N-糖基化位点”，通常是指糖基化修饰的蛋白上包含天冬酰胺或精氨酸用以共价连接聚糖结构的位点，例如N-糖基化位点可以是用以共价连接聚糖结构至糖基化修饰的蛋白的天冬酰胺残基。例如，N-糖基化位点可以是所述的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白上第24位、第30位、第38位、第83位和第88位上的天冬酰胺(Asparagines，简称Asn或N)残基。
在本申请中，所述聚糖结构与所述N-糖基化位点的术语“结合”，通常是指聚糖结构与糖基化修饰的蛋白上N-糖基化位点之间的物理或化学相互作用。例如，结合可以是直接的或间接的连接或附着，间接的可以是通过另一生物分子或化合物的连接或附着，直接的可以是共价的(例如通过化学偶联)或非共价的(例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等)结合或附着。例如，结合可以是聚糖结构与糖基化修饰的蛋白上N-糖基化位点之间共价连接，结合也可以是聚糖结构的单糖与N-糖基化位点的天冬酰胺残基的的自由-NH2基通过共价连接。
在本申请中，所述聚糖结构在所述糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白的所述“比率”，通常是指所述聚糖结构在所述糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白中所占的摩尔比率，所述比率可以通过将所述糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白酶解后并由质谱进行分析，示例性质谱分析方法可以包括与HPLC联用的质谱分析法。例如，所述的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白中，所述FA4G4L2S4结构的比率可以为15％以上，所述FA4G4L1S4的比率可以为20％以上，所述FA4G4S4的比率可以为10％以上，所述Neu5Gc的摩尔比率可以为0.5％以下。
在本申请中，术语“摩尔比率”通常作为所述糖蛋白经过糖苷酶酶解之后，释放所有聚糖结构，其中特定聚糖结构的摩尔比率＝其摩尔数目/蛋白质中所有聚糖结构摩尔数目进行计算且给出。例如摩尔比率，可以是FA4G4L2S4结构的摩尔数目/糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白中所有聚糖结构的摩尔数目，可以是FA4G4L1S4的摩尔数目/糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白中所有聚糖结构的摩尔数目，可以是FA4G4S4的摩尔数目/糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白中所有聚糖结构的摩尔数目，可以是Neu5Gc的摩尔数目/糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白中所有聚糖结构的摩尔数目。
在本申请中，术语“蛋白”通常是指不限于最小长度的氨基酸残基的聚合物。多肽、肽、寡肽、二聚体、多聚体和类似物均包括在该定义中。完整蛋白及其片段也都包括在此定义中。该术语也包括蛋白的表达后修饰形式，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化等。例如，本申请中，蛋白可以指糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白及其片段。
在本申请中，细胞“CHO-S细胞”，通常是指可以通过例如转染导入如编码异源多肽的核酸的CHO-S中国仓鼠卵巢细胞。所述CHO-S细胞包括原始转染细胞中筛选出来的功能或生物活性具有相同的功能或生物活性的变体后代。
在本申请中，术语“促红细胞生成刺激蛋白”和它的缩写“EPO”，通常是指任何促红细胞生成刺激蛋白的多肽，包括但不限于，重组产生的促红细胞生成刺激蛋白的多肽，合成产生的促红细胞生成刺激蛋白的多肽，天然EPO多肽，从细胞以及组织提取的促红细胞生成刺激蛋白的多肽，所述组织包括但不限于肾、肝、尿和血液。例如，促红细胞生成刺激蛋白可以是具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的促红细胞生成刺激蛋白。术语“促红细胞生成刺激蛋白”还指SEQ ID NO:1的蛋白质的变体，其中一个或多个氨基酸残基被改变、删除或插入，并且其具有与未修饰的蛋白质相同的生物活性，例如在EP 1 064 951或US 6,583,272中报道的。促红细胞生成刺激蛋白与EPO受体结合后产生的所述生物活性可以包括：与未注射组或对照组个体相比，通过注射将促红细胞生成刺激蛋白给药至受试者致使骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞的产生。
在本申请中，所述“糖基化修饰”通常是指，蛋白或多肽中可以在一个或多个氨基位置连接碳水化合物部分。通常糖基化修饰的蛋白或多肽含有一或多个氨基酸残基，例如精氨酸或天冬酰胺，以连接碳水化合物部分。例如，糖基化修饰可以是N-联的糖蛋白。N-联糖蛋白可以包含结合到N-糖基化位点的聚糖结构，例如连接至蛋白质中天冬酰胺残基N-糖基化位点的聚糖结构。在糖基化修饰的蛋白(糖蛋白)上发现的糖包括以下组：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和/或唾液酸。例如，促红细胞生成刺激蛋白的糖基化修饰，可以是含FA4G4L2S4聚糖结构连接到促红细胞生成刺激蛋白的N-糖基化位点，可以是含FA4G4L1S4聚糖结构连接到促红细胞生成刺激蛋白的N-糖基化位点，可以是含FA4G4S4聚糖结构连接到促红细胞生成刺激蛋白的N-糖基化位点，可以是含Neu5Gc的糖结构连接到促红细胞生成刺激蛋白的N-糖基化位点。
在本申请中，所述FA4G4L2S4结构的比率为15％“以上”，通常是指包含FA4G4L2S4聚糖结构的比率可以为至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、 至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白。例如，可以包含FA4G4L2S4聚糖结构的比率为至少18.17％的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白。
在本申请中，所述FA4G4L12S4结构的比率为20％“以上”，通常是指包含FA4G4L1S4聚糖结构的比率可以为至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白。例如，可以包含FA4G4L1S4聚糖结构的比率为至少21.58％的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白。
在本申请中，所述FA4G4S4结构的比率为10％“以上”，通常是指包含FA4G4S4聚糖结构的比率可以为至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白。例如，可以包含FA4G4S4聚糖结构的比率为至少14.02％的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白。
在本申请中所述Neu5Gc的摩尔比率为0.5％“以下”，通常是指Neu5Gc的摩尔比率可以为至多0.5％、至多0.4％、至多0.3％、至多0.2％、至多0.1％、至多0.05％、至多0.02％、至多0.01％或0％的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白。例如，可以是聚糖结构不包含Neu5Gc的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白。
在本申请中，“延长”促红细胞生成刺激蛋白半衰期，通常是指本申请的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白对蛋白酶抗性增加，可以导致所述糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白与不具有糖基化形式的EPO或具有其它聚糖结构的糖基化EPO相比在体外(例如在产生、纯化和储存期间)或者在体内(例如给予受试者之后)的半衰期增加。在本申请中，术语“半衰期”或其缩写“T 1/2”，通常是指用于量化药物的一半剂量被受试者排泄所花费的时间。例如，在给予受试者本申请的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白之后，呈现出半衰期增加，在与未修饰的EPO或具有其它聚糖结构的糖基化EPO相比，本申请的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白增加的半衰期可以增加至少大约或者至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。例如，在与未修饰的EPO或具有其它聚糖结构的糖基化EPO相比，本申请的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白增加的半衰期可以增加至少大约或者至少6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或者更多倍。
在本申请中，术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，通常是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。例如，宿主细胞可以包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代可以与亲本细胞的核酸含量不完全相同，例如可能含有突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代。
在本申请中，术语“杂质”通常是指与所需多肽产物不同的物质。例如，杂质可以，包括但不限于：宿主细胞材料，例如宿主细胞蛋白(HCP)；核酸；另一种多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基组分等。在一些实例中，杂质可以是来自例如但不限于细菌细胞的HCP。在一些实例中，杂质可以是来自哺乳动物细胞的HCP，例如CHO细胞。
在本申请中，术语“顺序”通常是指特定序列中的层析步骤。例如，第一层析步骤，然后是第二层析步骤，然后是第三层析步骤等。例如，在顺序层析步骤之间可以包括额外的步骤。
在本申请中，术语“负载量”通常是指与一定体积(例如，毫升)的层析材料接触的组合物的量(例如，毫克)。在一些实例中，负载量可以以mg/mL表示。例如，负载量可以通过一定体积的层析材料接触的溶菌酶的量表示。
发明详述
一方面，本申请提供一种目的蛋白分离方法。另一方面，本申请提供了一种从包含目的蛋白和杂质的组合物中纯化所述目的蛋白的方法。例如，所述目的蛋白可以包含促红细胞生成刺激蛋白、其变体或上述的功能活性片段。
例如，本申请的蛋白可以包含糖基化修饰。例如，本申请糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白可以包含聚糖结构，所述聚糖结构可以包含一个或多个FA4G4L2S4聚糖结构，所述FA4G4L2S4结构的比率可以为15％以上。所述聚糖结构可以包含一个或多个FA4G4L1S4结构，所述FA4G4L1S4的比率可以为20％以上。所述聚糖结构可以包含一个或多个FA4G4S4结构，所述FA4G4S4的比率可以为10％以上。所述聚糖结构可以包含Neu5Gc，其所述Neu5Gc 的摩尔比率可以为0.5％以下。
例如，所述聚糖结构可以包含一个或多个FA4G4L2S4结构和一个或多个FA4G4L1S4结构，所述FA4G4L2S4结构的比率可以为15％以上和所述FA4G4L1S4的比率可以为20％以上。所述聚糖结构可以包含一个或多个FA4G4L2S4结构和一个或多个FA4G4S4结构，所述FA4G4L2S4结构的比率可以为15％以上和所述FA4G4S4的比率可以为10％以上。所述聚糖结构可以包含一个或多个FA4G4L1S4结构和一个或多个FA4G4S4结构，所述FA4G4L1S4的比率可以为20％以上和所述FA4G4S4的比率可以为10％以上。所述聚糖结构可以包含一个或多个FA4G4L2S4结构和一个或多个Neu5Gc，所述FA4G4L2S4的比率可以为15％以上和所述Neu5Gc的摩尔比率可以为0.5％以下。所述聚糖结构可以包含一个或多个FA4G4L1S4结构和一个或多个Neu5Gc，所述FA4G4L1S4的比率可以为20％以上和所述Neu5Gc的摩尔比率可以为0.5％以下。所述聚糖结构可以包含一个或多个FA4G4L2S4结构、一个或多个FA4G4L1S4结构、一个或多个FA4G4S4结构和一个或多个Neu5Gc，所述FA4G4L2S4结构的比率可以为15％以上、和所述FA4G4L1S4的比率可以为20％以上、所述FA4G4S4的比率可以为10％以上和所述Neu5Gc的摩尔比率可以为0.5％以下。
在另一方面，本申请提供一种糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白的聚糖结构。所述FA4G4L2S4结构可以结合到所述糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白的N-糖基化位点：N24、N30、N38、N83和N88上。
在另一方面，将本申请的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白与Darbepoetin施用于人血液白血病细胞TF-1观察细胞增殖效果，本申请的促红细胞生成刺激蛋白的亲和力可以低于Darbepoetin。将本申请的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白与Darbepoetin施用于免疫缺陷小鼠CD-1，本申请的促红细胞生成刺激蛋白对于小鼠的小鼠血红蛋白含量、红细胞水平、红细胞比容、和/或网织红细胞水平升高作用可以强于Darbepoetin。同时，本申请的促红细胞生成刺激蛋白的体内消除半衰期可以比Darbepoetin长约30％。
在另一方面，本申请提供一种制备糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白的方法，包括在表达所述的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白条件下，培养包含编码所述的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白的核酸分子的CHO-S细胞。采用标准技术利用适合保持在哺乳动物宿主细胞中的载体将编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1的促红细胞生成刺激蛋白插入表达载体中。所述载体通常含有以下适用于哺乳动物宿主细胞的元件：启动子和其它“上游”调节元件、复制起点、核糖体结合位点、转录终止位点、多接头位点和选择标记。载体还可以含有 同样允许在原核宿主细胞增殖和维持的元件。例如，合适的细胞或细胞系包括哺乳动物来源(包括人类来源)的任何细胞或细胞系，包括中国仓鼠卵巢细胞CHO-S细胞。用标准转化或转染技术将包含编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1的促红细胞生成刺激蛋白的序列的核酸分子导入宿主细胞中。
例如，本申请的方法可以包含使所述蛋白与两种或以上的阳离子交换剂接触，其中一种所述阳离子交换剂可以为精细阳离子交换剂。例如，本申请的方法可以包含两种或以上的阳离子交换层析步骤，其中一种阳离子交换层析步骤可以包含精细阳离子交换层析步骤。例如，本申请的精细阳离子交换层析步骤可以包括，使包含目的蛋白和杂质的混合物与精细阳离子交换剂接触。
例如，本申请的阳离子交换剂可以包含带负电的固相的层析材料，并且具有游离离子，用于与水溶液(例如包含目的蛋白和杂质的组合物)中的阳离子交换，所述水溶液通过(over)或穿过(through)固相。例如，阳离子交换剂可以是膜、整料或树脂。例如，阳离子交换剂可以是树脂。例如，阳离子交换剂可包含羧酸官能团或磺酸官能团，如磺酸盐，羧酸，羧甲基磺酸，磺基异丁基，磺乙基，羧基，磺基丙基，磺酰基，磺基氧基乙基或正磷酸盐等。例如，阳离子交换剂可以是阳离子交换层析柱。例如，阳离子交换剂可以是阳离子交换层析膜。本领域已知的阳离子交换剂的实例可以包括但不限于Capto S impact。例如，阳离子交换层析可以以“结合和洗脱”模式进行。例如，阳离子交换层析可以以“流穿”模式进行。例如，阳离子交换剂可以在柱中。例如，阳离子交换剂可以在膜中。
例如，本申请的精细阳离子交换剂可以包含粒径为约30微米或更小的阳离子交换剂。例如，本申请的精细阳离子交换剂可以包含粒径为约30微米或更小、约25微米或更小、约20微米或更小、约15微米或更小、约10微米或更小、约5微米或更小、约2微米或更小、或约1微米或更小的阳离子交换剂。
例如，本申请的精细阳离子交换剂可以包含分散度为约3％或更小的阳离子交换剂。例如，所述分散度可以为粒径标准偏差与粒径平均值的比值(CV)。例如，本申请的精细阳离子交换剂可以包含分散度为约3％或更小、约2％或更小、约1％或更小、约0.5％或更小、或约0.1％或更小的阳离子交换剂。例如，本申请的精细阳离子交换剂可以包含每毫升所述精细阳离子交换剂包含负载量为约80mg溶菌酶或更高的阳离子交换剂。例如，本申请的精细阳离子交换剂可以包含每毫升所述精细阳离子交换剂包含负载量为约80mg溶菌酶或更高、约90mg溶菌酶或更高、约100mg溶菌酶或更高、约200mg溶菌酶或更高、约300mg溶菌酶或更高、 或约500mg溶菌酶或更高的阳离子交换剂。例如，本申请的精细阳离子交换剂可以包含在1800cm/h的流速下压力为约1MPa或更低的阳离子交换剂。例如，本申请的精细阳离子交换剂可以包含在1800cm/h的流速下压力为约1MPa或更低、约0.5MPa或更低、约0.2MPa或更低、或约0.1MPa或更低的阳离子交换剂。例如，本申请的精细阳离子交换剂的基质可以为多孔交联聚苯乙烯微球。本领域已知的精细阳离子交换剂的实例可以包括但不限于Source 30s。
例如，所述蛋白或包含目的蛋白的混合物与精细阳离子交换剂以外的其它阳离子交换剂接触之后，可以直接与精细阳离子交换剂接触。例如，所述蛋白或包含目的蛋白的混合物与精细阳离子交换剂以外的其它阳离子交换剂接触之后，且在与精细阳离子交换剂接触之前可以经历一个或多个另外的层析步骤。本领域已知的层析步骤可以包含疏水相互作用(HIC)层析，阴离子交换层析，阳离子交换层析，尺寸排阻层析，亲和层析，陶瓷羟基磷灰石(CHT)层析，亲水相互作用液相层析(HILIC)等。
例如，疏水相互作用层析可以是根据疏水性分离生物分子。在某些实施方案中，HIC层析可以以“结合和洗脱”模式进行。在一些实施方案中，HIC层析可以以“流穿”模式进行。在上述的一些实施方案中，HIC层析材料可以在柱中。在上述的一些实施方案中，HIC层析材料可以在膜中。
例如，羟基磷灰石(Ca 10(PO 4) 6(OH) 2)层析材料的官能团可以包括带正电荷的晶体钙离子对(C-位点)和与晶体磷酸三联体相关的六个带负电荷的氧原子簇(P-位点)。蛋白质可以以低浓度(例如10-25mM)的磷酸盐缓冲液吸附到羟基磷灰石上。蛋白质可以通过增加磷酸盐梯度洗脱用于选择性洗脱。在一些实施方案中，羟基磷灰石层析材料可以是树脂。在上述的一些实施方案中，羟基磷灰石层析材料可以是柱。本领域已知的羟基磷灰石层析材料的实例包括但不限于CHT陶瓷羟基磷灰石I型载体，CHT陶瓷羟基磷灰石II型载体。在一些实施方案中，羟基磷灰石层析可以以“结合和洗脱”模式进行。在一些实施方案中，羟基磷灰石层析可以以“流穿”模式进行。
例如，本申请方法还可以包含使所述蛋白与混合模式交换剂接触。例如，混合模式材料可以包含能够具有以下一种或多种功能性的官能团：阴离子交换，阳离子交换，氢键，π-π键相互作用，亲水相互作用和疏水相互作用。在某些实施方案中，混合模式材料可以包含能够进行阴离子交换和疏水相互作用的官能团。在某些实施方案中，混合模式材料可以包含能够进行阳离子交换和疏水相互作用的官能团。在某些实施方案中，混合模式材料可以包含以下组：羟基磷灰石Ⅱ型和CaptoMMC Impres。在某些实施方案中，第一混合模式层析可以以“结 合和洗脱”模式进行。在某些实施方案中，洗脱可以是梯度洗脱。在某些实施方案中，第一混合模式层析可以以“流穿”模式进行。在上述的某些实施方案中，第一混合模式材料可以在柱中。在上述的某些实施方案中，第一混合模式材料可以在膜中。
例如，所述蛋白或包含目的蛋白的混合物与精细阳离子交换剂接触之后，可以直接与混合模式交换剂接触。例如，所述蛋白或包含目的蛋白的混合物与精细阳离子交换剂接触之前，可以直接与混合模式交换剂接触。例如，所述蛋白或包含目的蛋白的混合物与精细阳离子交换剂接触之后，且在与混合模式交换剂接触之前可以经历一个或多个另外的层析步骤。本领域已知的层析步骤可以包含疏水相互作用(HIC)层析，阴离子交换层析，阳离子交换层析，尺寸排阻层析，亲和层析，陶瓷羟基磷灰石(CHT)层析，亲水相互作用液相层析(HILIC)等。
例如，本申请方法还可以包含使所述蛋白与阴离子交换剂接触。例如，阴离子交换剂可以是带正电荷的固相的交换材料，并且具有游离离子，用于与水溶液(例如包含目的蛋白和杂质的组合物)中的阴离子交换，所述水溶液可以通过(over)或穿过(through)固相。在本文所述任何方法的一些实施方案中，阴离子交换材料可以是膜、整料或树脂。在一个实施方案中，阴离子交换材料可以是树脂。在一些实施方案中，阴离子交换材料可以包含伯胺、仲胺、叔胺或季铵离子官能团，多胺官能团或二乙氨基乙基官能团。阴离子交换材料的实例是本领域已知的，包括但不限于Capto Q和Q.sepharose.HP。在一些实施方案中，阴离子交换层析可以以“结合和洗脱”模式进行。在一些实施方案中，阴离子交换层析可以以“流穿”模式进行。在上述的一些实施方案中，阴离子交换层析材料可以在柱中。在上述的一些实施方案中，阴离子交换层析材料可以是膜。
例如，所述蛋白或包含目的蛋白的混合物与阴离子交换剂接触之后，可以直接与阳离子交换剂接触。例如，所述蛋白或包含目的蛋白的混合物与阴离子交换剂接触之前，可以直接与阳离子交换剂接触。例如，所述蛋白或包含目的蛋白的混合物与阴离子交换剂接触之后，且在与阳离子交换剂接触之前可以经历一个或多个另外的层析步骤。本领域已知的层析步骤可以包含疏水相互作用(HIC)层析，阴离子交换层析，阳离子交换层析，尺寸排阻层析，亲和层析，陶瓷羟基磷灰石(CHT)层析，亲水相互作用液相层析(HILIC)等。
例如，本申请的方法包括使用缓冲液。在蛋白的纯化过程中可以使用各种缓冲液，这取决于例如缓冲液的所需pH、缓冲液的所需电导率、待纯化的蛋白的特征和纯化方法。例如，缓冲液可以是上样缓冲液、平衡缓冲液或洗脱缓冲液。例如，上样缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种可以是相同的。例如，上样缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液 可以是不同的。例如，缓冲液可以包含盐。在某些实施方案中，缓冲液可以包含氯化钠，乙酸钠，Tris HCl，Tris乙酸盐，磷酸钠，磷酸钾，柠檬酸钠，柠檬酸钾，精氨酸，精氨酸HCl或其混合物。在某些实施方案中，缓冲液是氯化钠缓冲液。例如，缓冲液可以选自以下组：Tris缓冲液、精氨酸溶液、磷酸盐溶液、柠檬酸盐溶液和NaCl溶液。电导率通常是指水溶液在两个电极之间传导电流的能力，可以通过改变溶液中离子的浓度来改变溶液的电导率。
例如，本申请提供的方法可以从包含目的蛋白的混合物中去除杂质，例如宿主蛋白(HCP)、宿主DNA(HCD)、聚集体、内毒素、高等电点(PI)电荷异构体、低PI电荷异构体、低分子量杂质、和/或病毒等。例如，可以通过比较从纯化步骤回收的混合物中的杂质的量与在纯化步骤之前混合物中的杂质的量来确定杂质的存在或水平的降低。
例如，从本申请的一个或多个纯化步骤中回收的组合物中宿主蛋白(HCP)的量可以减少超过约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或99％中的任何一种，包括这些值之间的任何范围。
例如，从本申请的一个或多个纯化步骤中回收的组合物中宿主DNA(HCD)的量可以减少超过约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或99％中的任何一种，包括这些值之间的任何范围。
例如，从本申请的一个或多个纯化步骤中回收的组合物中聚集体的量可以减少超过约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或99％中的任何一种，包括这些值之间的任何范围。
例如，从本申请的一个或多个纯化步骤中回收的组合物中内毒素的量可以减少超过约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或99％中的任何一种，包括这些值之间的任何范围。
例如，从本申请的一个或多个纯化步骤中回收的组合物中高等电点(PI)电荷异构体的量可以减少超过约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或99％中的任何一种，包括这些值之间的任何范围。
例如，从本申请的一个或多个纯化步骤中回收的组合物中低PI电荷异构体的量可以减少超过约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或99％中的任何一种，包括这些值之间的任何范围。
例如，从本申请的一个或多个纯化步骤中回收的组合物中低分子量杂质的量可以减少超 过约5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或99％中的任何一种，包括这些值之间的任何范围。
在另一方面，本申请的方法可以包含：(1)使包含目的蛋白和杂质的混合物与阳离子交换剂接触，(2)使上述步骤获得的所述混合物与精细阳离子交换剂接触。
在另一方面，本申请的方法可以包含：(1)使包含目的蛋白和杂质的混合物与阳离子交换剂接触，(2)使上述步骤获得的混合物与精细阳离子交换剂接触，(3)使上述步骤获得的混合物与所述混合模式交换剂接触。
在另一方面，本申请的方法可以包含：(1)使包含目的蛋白和杂质的混合物与阴离子交换剂接触；(2)使上述步骤获得的混合物与阳离子交换剂接触，(3)使上述步骤获得的混合物与精细阳离子交换剂接触。
在另一方面，本申请的方法可以包含：(1)使包含目的蛋白和杂质的混合物与阴离子交换剂接触；(2)使上述步骤获得的混合物与阳离子交换剂接触，(3)使上述步骤获得的混合物与精细阳离子交换剂接触，(4)使上述步骤获得的混合物与混合模式交换剂接触。
在另一方面，本申请的方法可以包含：(1)使包含目的蛋白和杂质的混合物与阴离子交换剂接触；(2)使上述步骤获得的混合物与阳离子交换剂接触，(3)使上述步骤获得的混合物与精细阳离子交换剂接触，(4)使上述步骤获得的混合物与两种以上混合模式交换剂接触。
在另一方面，本申请的方法可以包含：(1)使包含目的蛋白和杂质的混合物与两种以上阴离子交换剂接触；(2)使上述步骤获得的混合物与阳离子交换剂接触，(3)使上述步骤获得的混合物与精细阳离子交换剂接触，(4)使上述步骤获得的混合物与混合模式交换剂接触。
在另一方面，本申请的方法可以包含：(1)使包含目的蛋白和杂质的混合物与两种以上阴离子交换剂接触；(2)使上述步骤获得的混合物与阳离子交换剂接触，(3)使上述步骤获得的混合物与精细阳离子交换剂接触，(4)使上述步骤获得的混合物与两种以上混合模式交换剂接触。
在另一方面，本申请的方法可以包含：(1)使上述步骤获得的混合物与Q.Sepharose.HP接触；(2)使上述步骤获得的混合物与CaptoS impact接触；(3)使上述步骤获得的混合物与Source30S接触；(4)使上述步骤获得的混合物与填料CHT(羟基磷灰石，Ⅱ)接触；(5)使上述步骤获得的混合物与CaptoMMC接触。
在另一方面，本申请的方法可以包含：(1)使上述步骤获得的混合物与Q.Sepharose.HP接触；(2)使上述步骤获得的混合物与CaptoS impact接触；(3)使上述步骤获得的混合物与 Source30S接触；(4)使上述步骤获得的混合物与CaptoMMC接触；(5)使上述步骤获得的混合物与填料CHT(羟基磷灰石，Ⅱ)接触。
在另一方面，本申请的方法可以包含：(1)使包含目的蛋白和杂质的混合物与CaptoQ接触；(2)使上述步骤获得的混合物与Q.Sepharose.HP接触；(3)使上述步骤获得的混合物与CaptoS impact接触；(4)使上述步骤获得的混合物与Source30S接触；(5)使上述步骤获得的混合物与填料CHT(羟基磷灰石，Ⅱ)接触。
在另一方面，本申请的方法可以包含：(1)使包含目的蛋白和杂质的混合物与CaptoQ接触；(2)使上述步骤获得的混合物与Q.Sepharose.HP接触；(3)使上述步骤获得的混合物与CaptoS impact接触；(4)使上述步骤获得的混合物与Source30S接触；(5)使上述步骤获得的混合物与CaptoMMC接触。
在另一方面，本申请的方法可以包含：(1)使包含目的蛋白和杂质的混合物与CaptoQ接触；(2)使上述步骤获得的混合物与Q.Sepharose.HP接触；(3)使上述步骤获得的混合物与CaptoS impact接触；(4)使上述步骤获得的混合物与Source30S接触；(5)使上述步骤获得的混合物与填料CHT(羟基磷灰石，Ⅱ)接触；(6)使上述步骤获得的混合物与CaptoMMC接触。
在一些实施方案中，还可以通过病毒过滤进一步纯化目的蛋白。病毒过滤可以是去除多肽纯化进料流中的病毒污染物。病毒过滤的实例可以包括例如超滤和微滤。在一些实施方案中，可以使用细小病毒过滤器纯化多肽。
在一些实施方案中，目的蛋白还可以在层析后浓缩。浓缩方法的实例是本领域已知的，可以包括但不限于例如超滤和渗滤。在一些实施方案中，浓缩后目的蛋白的浓度可以为约0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、或0.5mg/mL中的任何一种。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，所述方法还可以包括将纯化方法的纯化目的蛋白与药学上可接受的载体组合。在一些实施方案中，可以通过超滤/渗滤将目的蛋白配制成药物制剂。
在某些实施方案中，本文提供的方法可以产生包含目的蛋白的组合物，所述目的蛋白纯度可以大于约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％中的任何一种。在某些实施方案中，组合物中的目的蛋白纯度可以大于约96％，97％，98％、99％、99.5％或99.9％中的任何一种。
例如，本申请提供的组合物杂质的量可以降低，例如宿主蛋白(HCP)、宿主DNA(HCD)、 聚集体、内毒素、高等电点(PI)电荷异构体、低PI电荷异构体、低分子量杂质、和/或病毒等。例如，可以通过比较从纯化步骤回收的混合物中的杂质的量与在纯化步骤之前混合物中的杂质的量来确定杂质的存在或水平的降低。
在某些实施方案中，提供了包含根据本申请所述任一方法纯化的目的蛋白的组合物。
在某些实施方案中，组合物中的目的蛋白可以超过约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％纯度中的任何一种。在某些实施方案中，组合物中的目的蛋纯度可以大于约96％，97％，98％、99％、99.5％或99.9％中的任何一种。
一方面，本申请提供一种药用组合物，它包括治疗有效量所述糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白和药学上可接受的佐剂如稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或辅助剂。所述药物组合物适用于每周低于三次的给药方案。所述组合物可以为液体或冻干形式，它含有具有不同pH值和离子强度的稀释剂(Tris、柠檬酸盐、乙酸盐或磷酸盐缓冲剂)、增溶剂如吐温或聚山梨酸酯、载体如人血清白蛋白或明胶、防腐剂如硫汞撒、对羟基苯甲酸酯类或苄醇、抗氧化剂如抗坏血酸或偏亚硫酸氢钠以及其它成分如赖氨酸或甘氨酸。对具体组合物的选择取决于许多因素，包括所治疗的病症、给药途径和需要的药代动力学参数。对适用于药用组合物的成分的更广泛的综述见Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro编辑，Mack，Easton，PA(1980)。例如，用含有人白蛋白和任选含有防腐剂苄醇的等渗氯化钠/柠檬酸钠缓冲液将本申请所述糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白配制成液体形式。所述组合物可以含有具有1、2、3、4或更多个额外糖链的类似物。例如，可以通过皮下或静脉内注射给予本申请的药物组合物。最终选定的给药途径取决于许多因素，而本领域技术人员可确定最终给药途径。
一方面，本申请提供一种治疗贫血的应用。本申请提供的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白具有独特的糖基化形式，与EPO受体结合时，可引起EPO受体构象发生改变，从而激活多个下游信号通路，引起红细胞系统的增殖和分化将所述糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白给予需要治疗的受试者以刺激红细胞生成，提高血红蛋白含量、红细胞水平、红细胞比容、网织红细胞水平，而减轻贫血，例如肾性贫血、多发性骨髓瘤贫血和/或癌性贫血，例如由慢性肾病和尿毒症导致的肾性贫血、多发性骨髓瘤贫血和化疗等引发的癌性贫血。
一方面，本申请提供一种糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白和/或药物组合物，其用于治疗贫血的疾病。将所述糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白给予需要治疗的受试者以刺激红细胞生成，提高血红蛋白含量、红细胞水平、红细胞比容、网织红细胞水平，而减轻贫血， 例如肾性贫血、多发性骨髓瘤贫血和/或癌性贫血。
一方面，本申请提供一种糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白和/或药物组合物，其在制备治疗贫血的药物中的应用。将所述糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白给予需要治疗的受试者以刺激红细胞生成，提高血红蛋白含量、红细胞水平、红细胞比容、网织红细胞水平，而减轻贫血，例如肾性贫血、多发性骨髓瘤贫血和/或癌性贫血。
一方面，本申请提供一种延长促红细胞生成刺激蛋白半衰期的方法，当向需要治疗的受试者施用本申请所述糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白后，所述糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白在受试者体内清除速度明显降低，体内半衰期延长。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1
长效促红细胞生成刺激蛋白的表达方法分为以下步骤：工作细胞库细胞进行摇瓶培养，通过一系列的接种、培养以及扩大培养物体积，直到足够的生物量用来接种生物反应器。通过补加补料培养基以及葡萄糖促进产物表达。
将糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白，例如含有165个氨基酸，且含有5个N糖基化位点(N24，N30，N38，N83，N88)的如SEQ ID NO:1所示的糖蛋白：
将相应的核酸序列通过表达质粒转染亲代CHO-S细胞。通过加压筛选，筛选获得高产量的克隆。通过培养和纯化，得到了本申请的糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白培养物。
实施例2
本申请提供了一种多种层析技术的顺序组合，最终得到了荷质比、唾液酸含量、和/或糖型合格等质量合格的蛋白原液。本申请的层析工艺可以包括下列层析步骤：
Q.Sepharose.HP(阴离子交换)纯化参数：灭菌:0.5～1.0M NaOH,2CV,浸泡30～60mins；再生：1M NaCl，2CV；平衡:20mM～100mM Tris,pH 7.0～8.5,5CV；上样:来源post CaptoQ 超滤换液后样品，pH为7.0～8.50，电导小于10ms/cm；冲洗1:20mM～100mM Tris,pH7.0～8.5,5CV；冲洗2：2～5CV线性洗脱从20mM～100mM Tris,pH7.0～8.5到10m～20mM Arginine,5～20mM NaPO 4,5～20mM citrate,pH3.0～4.0；冲洗3：10m～20mM Arginine,5～20mM NaPO 4,5～20mM citrate,pH3.0～4.0,5～10CV；冲洗4：2～5CV线性预洗从10m～20mM Arginine,5～20mM NaPO 4,5～20mM citrate,pH3.0～4.0到20mM～100mM Tris,pH 7.0～8.5；冲洗5：20mM～100mM Tris,pH 7.0～8.5，5CV；洗脱:200～500mM NaCl,20mM～100mM Tris,pH 7.0～8.5，一步洗脱，3CV；峰收集原则：起峰后5mAu开始收集，峰后5mAu停止收集，合并收集液，洗脱下来的目的蛋白溶液添加5％Tween-80母液至终浓度为0.01％～1％Tween-80；此步骤纯化缓冲液温度在2～8℃,洗脱下来的目的蛋白溶液添加5％Tween-80母液至终浓度为0.01％～1％Tween-80。
超滤换液：10～30KDa,0.1～0.5m 2，样品来源：post Q.HP；浓缩2～6倍，连续换液5倍体积；取出浓缩液，洗膜1～2次，合并洗膜液与浓缩液；最终缓冲体系：10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 6.0～7.0,最终浓度：0.4～0.6mg/ml,最终体积复原至初始体积。
CaptoS impact纯化(阳离子交换):灭菌:0.5～1.0M NaOH,2CV,浸泡30～60mins；再生：1M NaCl，2CV；平衡:5CV,10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～4.5；上样:post Q.HP洗脱液低pH灭活后样品；冲洗1:10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～4.5,7CV；冲洗2：50mM M～100mM NaCl,10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～4.5，7CV；洗脱:10～20CV从：50mM M～100mM NaCl,10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～4.5到50mM M～100mM NaCl,10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 6.5～7.5；峰收集原则：起峰后5mAu开始收集，峰后5mAu停止收集，分管收集，根据IEF以及SDS-PAGE结果合并各组分。
超滤换液：超滤膜10～30KDa,0.1～0.5m 2，样品来源：post CaptoS impact样品；浓缩8～10倍，连续换液5倍体积；取出浓缩液，洗1-2次，合并洗膜液与浓缩液；最终缓冲体系：10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 6.0～7.0；最终浓度：0.08～0.15mg/ml。
Source30S(精细阳离子交换)纯化:上样量:小于3mg/ml resin；灭菌:1.0M NaOH,2CV,浸泡30～60mins；再生：1M NaCl，2CV；平衡:5CV,10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～5.0；上样:超滤换液后post CaptoS impact样品,pH用0.5M HCl调节至3.5～5.0；冲洗1:10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～5.010CV；冲洗2：50～100mM NaCl,10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～5.0 3CV；洗脱:10～30CV从50～100mM NaCl,10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～5.0到150～300mM NaCl,10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～5.0；峰收集原则：起峰后2mAu开始收集，峰后10mAu停止收集，分管收集，根据CZE检测结果进行样品的合并。
超滤换液：超滤膜：10～30KDa,0.1～0.5m 2样品来源：post Source30S样品；浓缩2～4倍，连续换液5倍体积；取出浓缩液，洗膜1-2次，合并洗膜液与浓缩液；最终缓冲体系：：10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 6.0～7.0；最终浓度控制在0.07-0.10mg/ml左右；0.22um过滤。
填料CHT(羟基磷灰石，Ⅱ)(混合模式)流穿：载量:小于0.5mg/ml resin；灭菌:1.0M NaOH,2CV,浸泡30mins；再生：500mM sodium phosphate，2CV；平衡:10mM～100sodium phosphate,pH 6.0～7.0，5CV；上样:样品来源：post Source30S组份合并换液后样品，上样前样品浓度控制在0.05-0.30mg/ml之间，pH6.0-7.0；预洗/洗脱:10mM～100sodium phosphate,pH 6.0～7.0，10CV；峰收集原则：收集流穿液，起峰后5mAu开始收集，峰后5mAu停止收集，合并收集液；清洗：500mM sodium phosphate，2CV。
CaptoMMC(混合模式)流穿:灭菌:0.5～1.0M NaOH,2CV,浸泡30～60mins；再生：1M NaCl，2CV；平衡:10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 6.0～7.0，5CV；上样:样品来源为CHT流穿液，上样前样品浓度控制在0.005mg/ml-0.10mg/ml之间，pH为6.0-7.0；预洗/洗脱:10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 6.0～7.0，5CV，峰收集原则：收集流穿液，起峰后5mAu开始收集，峰后5mAu停止收集，合并收集液。
除病毒纳滤：样品来源：#post Capto MMC流穿液预滤膜：0.2/0.1um Sartorius预过滤膜,采用串联模式过滤；收集透过液,过滤推动力为2Mpa。
DS原液制备：超滤膜：10～30KDa,0.1～0.5m 2；样品来源：post Virus filtration；最终缓冲体系：20mM-100mM sodium phosphate,100-300mM NaCl,0.005％-0.01％Tween-80，pH6.0-7.0；浓缩约8-10倍，连续换液5～10倍体积；最终浓度：0.1-0.5mg/ml；0.22um除菌过滤。
通过上述步骤，可以得到分子量、纯度、N端唾液酸含量、糖型及含量、HCD(宿主DNA)、 内毒素、生物学活性等均合格的目的蛋白原液，其中HCP(宿主蛋白)含量约在100-50～0ug/mg之间，具有显著较低的水平。各批次蛋白的肽谱图与糖谱图与参比一致，具体试验数据如下：
实施例3
本申请提供了一种多种层析技术的顺序组合，最终得到了荷质比、唾液酸含量、和/或糖型合格等质量合格的蛋白原液。本申请的层析工艺可以包括下列层析步骤：
Q.Sepharose.HP(阴离子交换)纯化参数以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
CaptoS impact纯化(阳离子交换)以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
Source30S(精细阳离子交换)纯化以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
CaptoMMC(混合模式)流穿，步骤与上述实施例步骤基本相同；
填料CHT(Ⅱ)(混合模式)流穿，步骤与上述实施例步骤基本相同；
除病毒纳滤以及DS原液制备上述实施例步骤基本相同。
改变混合模式之间的顺序，可以得到分子量、纯度、N端唾液酸含量、糖型及含量、HCD(宿主DNA)、内毒素、生物学活性等均合格的目的蛋白原液，其中HCP(宿主蛋白)含量约在100～500ug/mg之间，具有显著较低的水平。各批次蛋白的肽谱图与糖谱图与参比一致，具体试验数据如下：
实施例4
本申请提供了一种多种层析技术的顺序组合，最终得到了荷质比、唾液酸含量、和/或糖型合格等质量合格的蛋白原液。本申请的层析工艺可以包括下列层析步骤：
CaptoQ捕获(阴离子交换):灭菌：1.0M NaOH,2CV,浸泡30～60mins；再生：1M NaCl，2CV；平衡:20～100mM Tris,pH 7.0～8.5,5CV；上样:浓缩换液后发酵液pH为7.0～8.5,电导值小于10ms/cm；预洗:20～100mM Tris,pH 7.0～8.5,5～10CV；洗脱:200～500mM NaCl,20～100mM Tris,pH7.0～8.5，一步洗脱，3～5CV；峰收集原则：起峰后10mAu开始收集，峰后10mAu停止收集，合并收集液；此步骤纯化缓冲液温度在2～15℃，洗脱下来的目的蛋白溶液添加5％Tween-80母液至终浓度为0.01％～1％Tween-80。
超滤换液：超滤膜：10～30KDa,0.1～0.5m 2，样品来源：post Capt Q；浓缩5～10倍，连续换液5～7倍体积；取出浓缩液，洗膜1～2次，合并洗膜液与浓缩液；最终缓冲体系：20mM～100mM Tris,0.01％～1％Tween-80，pH 7.0～8.5；最终浓度：0.4～0.8mg/ml；0.22um除菌过滤。
Q.Sepharose.HP(阴离子交换)纯化参数以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
CaptoS impact纯化(阳离子交换)以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
Source30S(精细阳离子交换)纯化以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
填料CHT(羟基磷灰石，Ⅱ)(混合模式)流穿，步骤与上述实施例步骤基本相同；
除病毒纳滤以及DS原液制备上述实施例步骤基本相同。
通过上述步骤，可以得到分子量、纯度、N端唾液酸含量、糖型及含量、HCD(宿主DNA)、内毒素、生物学活性等均合格的目的蛋白原液，其中HCP(宿主蛋白)含量约在100～500ug/mg之间，具有显著较低的水平。各批次蛋白的肽谱图与糖谱图与参比一致，具体试验数据如下：
实施例5
本申请提供了一种多种层析技术的顺序组合，最终得到了荷质比、唾液酸含量、和/或糖 型合格等质量合格的蛋白原液。本申请的层析工艺可以包括下列层析步骤：
CaptoQ捕获(阴离子交换)以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
Q.Sepharose.HP(阴离子交换)纯化参数以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
CaptoS impact纯化(阳离子交换)以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
Source30S(精细阳离子交换)纯化以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
CaptoMMC(混合模式)流穿，步骤与上述实施例步骤基本相同；
除病毒纳滤以及DS原液制备上述实施例步骤基本相同。
改变混合模式的组成，可以得到分子量、纯度、N端唾液酸含量、糖型及含量、HCD(宿主DNA)、内毒素、生物学活性等均合格的目的蛋白原液，其中HCP(宿主蛋白)含量约在100～500ug/mg之间，具有显著较低的水平。各批次蛋白的肽谱图与糖谱图与参比一致，具体试验数据如下：
实施例6
本申请提供了一种多种层析技术的顺序组合，最终得到了荷质比、唾液酸含量、和/或糖型合格等质量合格的蛋白原液。本申请的层析工艺可以包括下列层析步骤：
CaptoQ捕获:灭菌：1.0M NaOH,2CV,浸泡30～60mins；再生：1M NaCl，2CV；平衡:20～100mM Tris,pH 7.0～8.5,5CV；上样:浓缩换液后发酵液pH为7.0～8.5,电导值小于10ms/cm；预洗:20～100mM Tris,pH 7.0～8.5,5～10CV；洗脱:200～500mM NaCl,20～100mM Tris,pH7.0～8.5，一步洗脱，3～5CV；峰收集原则：起峰后10mAu开始收集，峰后10mAu停止收集，合并收集液；此步骤纯化缓冲液温度在2～15℃，洗脱下来的目的蛋白溶液添加5％Tween-80母液至终浓度为0.01％～1％Tween-80。
超滤换液1：超滤膜：：10～30KDa,0.1～0.5m 2，样品来源：post Capt Q；浓缩5～10倍，连续换液5～7倍体积；取出浓缩液，洗膜1～2次，合并洗膜液与浓缩液；最终缓冲体系：20mM～100mM Tris,0.01％～1％Tween-80，pH 7.0～8.5；最终浓度：0.4～0.8mg/ml；0.22um 除菌过滤(Sartorius)。
Q.Sepharose.HP纯化参数：灭菌:1.0M NaOH,2CV,浸泡30mins；再生：1M NaCl，2CV；平衡:20mM～100mM Tris,pH 7.0～8.5,5CV；上样:来源post CaptoQ超滤换液后样品，pH为7.0～8.50，电导小于10ms/cm；冲洗1:20mM～100mM Tris,pH7.0～8.5,5CV；冲洗2：2～5CV线性洗脱从20mM～100mM Tris,pH7.0～8.5到10m～20mM Arginine(精氨酸),5～20mM NaPO 4,5～20mM citrate(柠檬酸盐),pH3.0～4.0；冲洗3：10m～20mM Arginine,5～20mM NaPO 4,5～20mM citrate,pH3.0～4.0,5～10CV；冲洗4：2～5CV线性预洗从10m～20mM Arginine,5～20mM NaPO 4,5～20mM citrate,pH3.0～4.0到20mM～100mM Tris,pH 7.0～8.5；冲洗5：20mM～100mM Tris,pH 7.0～8.5，5CV；洗脱:200～500mM NaCl,20mM～100mM Tris,pH 7.0～8.5，一步洗脱，3CV；峰收集原则：起峰后5mAu开始收集，峰后5mAu停止收集，合并收集液，洗脱下来的目的蛋白溶液添加5％Tween-80母液至终浓度为0.01％～1％Tween-80；此步骤纯化缓冲液温度在2～8℃,洗脱下来的目的蛋白溶液添加5％Tween-80母液至终浓度为0.01％～1％Tween-80。
超滤换液2：：10～30KDa,0.1～0.5m 2，样品来源：post Q.HP；浓缩2～6倍，连续换液5倍体积；取出浓缩液，洗膜1～2次，合并洗膜液与浓缩液；最终缓冲体系：10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate(磷酸钠),pH 6.0～7.0,最终浓度：0.4～0.6mg/ml,最终体积复原至初始体积。
CaptoS impact纯化:灭菌:1.0M NaOH,2CV,浸泡30mins；再生：1M NaCl，2CV；平衡:5CV,10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～4.5；上样:post Q.HP洗脱液低pH灭活后样品；冲洗1:10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～4.5,7CV；冲洗2：50mM M～100mM NaCl,10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～4.5，7CV；洗脱:10～20CV从：50mM M～100mM NaCl,10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～4.5到50mM M～100mM NaCl,10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 6.5～7.5；峰收集原则：起峰后5mAu开始收集，峰后5mAu停止收集，分瓶收集，收集体积待定，峰尖之前10L/瓶，峰尖之后2.5L/瓶；合样原则：待IEF以及SDS-PAGE结果后合并各组分。
超滤换液3：超滤膜：：10～30KDa,0.1～0.5m 2，样品来源：post CaptoS impact样品；浓缩8～10倍，连续换液5倍体积；取出浓缩液，洗1-2次，合并洗膜液与浓缩液；最终缓冲体系：10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 6.0～7.0；最终浓度：0.08～ 0.15mg/ml。
Source30S纯化:上样量:小于3mg/ml resin；灭菌:1.0M NaOH,2CV,浸泡30mins；再生：1M NaCl，2CV；平衡:5CV,10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～5.0；上样:超滤换液后post CaptoS impact样品,pH用0.5M HCl调节至3.5～5.0；冲洗1:10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～5.0 10CV；冲洗2：50～100mM NaCl,10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～5.0 3CV；洗脱:10～30CV从50～100mM NaCl,10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～5.0到150～300mM NaCl,10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 3.5～5.0；峰收集原则：起峰后2mAu开始收集，峰后10mAu停止收集，分瓶收集，收集体积待定，1.25L/瓶，约20瓶。
超滤换液4：超滤膜：：10～30KDa,0.1～0.5m 2样品来源：post Source30S样品；浓缩2～4倍，连续换液5倍体积；取出浓缩液，洗膜1-2次，合并洗膜液与浓缩液；最终缓冲体系：：10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 6.0～7.0；最终浓度控制在0.07-0.10mg/ml左右；0.22um过滤(Sartorius)。
填料CHT(羟基磷灰石，Ⅱ型)流穿：载量:小于0.5mg/ml resin；灭菌:1.0M NaOH,2CV,浸泡30mins；再生：500mM sodium phosphate，2CV；平衡:10mM～100sodium phosphate,pH 6.0～7.0，5CV；上样:样品来源：post Source30S组份合并换液后样品，上样前样品浓度控制在0.05-0.30mg/ml之间，pH6.0-7.0；预洗/洗脱:10mM～100sodium phosphate,pH 6.0～7.0，10CV；峰收集原则：收集流穿液，起峰后5mAu开始收集，峰后5mAu停止收集，合并收集液；清洗：500mM sodium phosphate，2CV。
Capto MMC Impres流穿:灭菌:1.0M NaOH,2CV,浸泡30mins；再生：1M NaCl，2CV；平衡:10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 6.0～7.0，5CV；上样:样品来源为CHT流穿液，上样前样品浓度控制在0.005mg/ml-0.10mg/ml之间，pH为6.0-7.0；预洗/洗脱:10mM～50mM citrate,10mM～50mM sodium phosphate,pH 6.0～7.0，5CV，峰收集原则：收集流穿液，起峰后5mAu开始收集，峰后5mAu停止收集，合并收集液。
除病毒纳滤(Virus filtration)：样品来源：#post Capto MMC流穿液预滤膜：0.2/0.1um Sartorius预过滤膜,采用串联模式过滤；收集透过液,过滤推动力为2Mpa。
DS原液制备：超滤膜：10～30KDa,0.1～0.5m 2.样品来源：post Virus filtration；最终缓冲体系：20mM-100mM sodium phosphate,100-300mM NaCl,0.005％-0.01％Tween-80，pH6.0- 7.0；浓缩约8-10倍，连续换液10倍体积；最终浓度：0.1-0.5mg/ml；0.22um除菌过滤。
通过上述步骤，可以得到蛋白原液，产率分别为0.2-100mg/L；SEC-HPLC纯度为98-100％；内毒素，HCD含量等均在质量要求范围之内。糖型及各组分含量，唾液酸含量，肽谱图，糖谱图与参比品基本一致。HCP含量范围在10ng/mg～500ng/mg，且可继续降低HCP维持在10～100ng/mg以下的合格样品。各批次蛋白的肽谱图与糖谱图与参比一致，具体试验数据如下：
实施例7
层析工艺可以包括下列层析步骤：
Q.Sepharose.HP(阴离子交换)纯化参数以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
CaptoS impact纯化(阳离子交换)以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
填料CHT(Ⅱ)(混合模式)流穿，步骤与上述实施例步骤基本相同；
CaptoMMC(混合模式)流穿，步骤与上述实施例步骤基本相同；
除病毒纳滤以及DS原液制备上述实施例步骤基本相同。
通过上述步骤，无法获得与糖基化修饰的促红细胞生成刺激蛋白标准品一致的电荷异构体组分的蛋白，且高PI的电荷异构体杂质相对较多。同时，糖型与标准品一致，但是含量和比例不同。内毒素小于2Eu/mg，HCD小于10pg/mg工艺相关杂质在质量要求范围之内。HCP的含量在500ng/mg左右，与100ng/mg的差别较大。
层析工艺可以包括下列层析步骤：
Q.Sepharose.HP(阴离子交换)纯化参数以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
Source30S(精细阳离子交换)纯化以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
填料CHT(Ⅱ)(混合模式)流穿，步骤与上述实施例步骤基本相同。
CaptoMMC(混合模式)流穿，步骤与上述实施例步骤基本相同；
除病毒纳滤以及DS原液制备上述实施例步骤基本相同。
通过上述步骤，可以得到内毒素，HCD含量等均合格的目的蛋白原液，该蛋白原液糖型及各组分含量，肽图，唾液酸含量与标准品基本一致。但HCP的含量为600.52ng/mg。制备所得蛋白的肽谱图与糖谱图与参比一致，具体试验数据如下：
实施例8
层析工艺可以包括下列层析步骤：
Q.Sepharose.HP(阴离子交换)纯化参数以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
CaptoS impact纯化(阳离子交换)以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
CaptoMMC(混合模式)流穿，步骤与上述实施例步骤基本相同；
填料CHT(Ⅱ)(混合模式)流穿，步骤与上述实施例步骤基本相同；
Source30S(精细阳离子交换)纯化以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
除病毒纳滤以及DS原液制备上述实施例步骤基本相同。
通过上述步骤，可以得到蛋白原液，产率分别为0.2～100mg/L；SEC-HPLC纯度为98～100％；内毒素，HCD含量等均在质量要求范围之内。糖型及各组分含量，肽图，唾液酸含量与标准品基本一致。HCP含量范围在50ng/mg～500ng/mg。
层析工艺可以包括下列层析步骤：
Q.Sepharose.HP(阴离子交换)纯化参数以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
CaptoMMC(混合模式)流穿，步骤与上述实施例步骤基本相同；
填料CHT(Ⅱ)(混合模式)流穿，步骤与上述实施例步骤基本相同；
CaptoS impact纯化(阳离子交换)以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
Source30S(精细阳离子交换)纯化以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
除病毒纳滤以及DS原液制备上述实施例步骤基本相同。
通过上述步骤，得到产率为0.2～100mg/L，SEC-HPLC纯度为98～100％，内毒素，HCD含量等均在质量要求范围之内的蛋白原液。糖型及各组分含量，肽图，唾液酸含量与标准品 基本一致。HCP的含量为50ng/mg～500ng/mg。各批次蛋白的肽谱图与糖谱图与参比一致，具体试验数据如下：
实施例9
层析工艺可以包括下列层析步骤：
Q.Sepharose.HP(阴离子交换)纯化参数以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
CaptoMMC(混合模式)流穿，步骤与上述实施例步骤基本相同；
CaptoS impact纯化(阳离子交换)以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
Source30S(精细阳离子交换)纯化以及超滤换液与上述实施例步骤基本相同；
填料CHT(Ⅱ)(混合模式)流穿，步骤与上述实施例步骤基本相同；
除病毒纳滤以及DS原液制备上述实施例步骤基本相同。
通过上述步骤，得到产率为0.2～100mg/L；SEC-HPLC纯度为98～100％，内毒素，HCD含量等均在质量要求范围之内的蛋白原液。糖型及各组分含量，肽图，唾液酸含量与标准品基本一致。HCP的含量为5ng/mg～200ng/mg左右。制备所得蛋白的肽谱图与糖谱图与参比一致，具体试验数据如下：
实施例10
本申请还提供了用于对比的对比例
例如，选用普通的阳离子交换填料进行纯化，如选用SP.Sepharoe.FF和Capto S Impact。
10-1纯化路线：Capto Q捕获—Q.Sepharose.HP纯化—SP.Sepharoe.FF纯化—Capto S Impact纯化精细纯化—CHT流穿—Capto MMC流穿-原液。其中结果如下所示：
批次 料液体积(L) 产率(mg/L) SEC-HPLC(％) HCP(ng/mg)
Lot#20190802 4L 0.10mg/L 99.68％ 150ng/mg
采用此工艺，由于缺少对本申请蛋白不同唾液酸含量的促红细胞生成刺激蛋白有效的分型手段，导致该工艺产品的产率大幅度降低，相对精细化填料Source 30S，该对比方案产率损失了70％左右。同时，也不能有效地去除HCP残留，导致残留量较高。
10-2纯化路线：Capto Q捕获—Q.Sepharose.HP纯化—Capto S Impact纯化—Capto S Impact精细纯化—CHT流穿—Capto MMC流穿-原液。其中结果如下所示：
批次 料液体积(L) 产率(mg/L) SEC-HPLC(％) HCP(ng/mg)
Lot#20190901 4L 0.12mg/L 99.54％ 120ng/mg
其中该对比方案产率以及HCP残留结果与10-1类似。
本申请同时提供其它用于对比的对比例
其中方案10-3至10-6结果总结如下所示：
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

Claims (39)

  1. 一种蛋白分离方法，使所述蛋白与两种或以上的阳离子交换剂接触，其中一种所述阳离子交换剂为精细阳离子交换剂。
  2. 如权利要求1所述的方法，所述蛋白包含促红细胞生成刺激蛋白、其变体或上述的功能活性片段。
  3. 如权利要求1-2中任一项所述的方法，所述蛋白包含糖基化修饰。
  4. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述蛋白包含结合到N-糖基化位点的聚糖结构。
  5. 如权利要求4所述的方法，所述聚糖结构包含FA4G4L2S4。
  6. 如权利要求5所述的方法，所述FA4G4L2S4结构的比率为15％以上。
  7. 如权利要求4-6中任一项所述的方法，所述聚糖结构还包含FA4G4L1S4。
  8. 如权利要求7所述的方法，其中所述FA4G4L1S4的比率为20％以上。
  9. 如权利要求4-8中任一项所述的方法，所述聚糖结构还包含FA4G4S4。
  10. 如权利要求9所述的方法，其中所述FA4G4S4的比率为10％以上。
  11. 如权利要求4-10中任一项所述的方法，所述聚糖结构包含Neu5Gc，其所述Neu5Gc的摩尔比率为0.5％以下。
  12. 如权利要求1-11中任一项所述的方法，所述蛋白包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或其功能活性片段。
  13. 如权利要求1-12中任一项所述的方法，所述蛋白包含选自以下组的N-糖基化位点：N24、N30、N38、N83和N88。
  14. 如权利要求1-13中任一项所述的方法，所述蛋白通过CHO细胞表达。
  15. 如权利要求14所述的方法，所述CHO细胞包含CHO-S细胞。
  16. 如权利要求1-15中任一项所述的方法，所述精细阳离子交换剂包含粒径为约30微米或更小的阳离子交换剂。
  17. 如权利要求1-16中任一项所述的方法，所述精细阳离子交换剂包含分散度为约3％或更小的阳离子交换剂。
  18. 如权利要求17所述的方法，所述分散度为粒径标准偏差与粒径平均值的比值。
  19. 如权利要求1-18中任一项所述的方法，所述精细阳离子交换剂包含Source 30s。
  20. 如权利要求1-19中任一项所述的方法，所述精细阳离子交换剂以外的其它阳离子交换剂包含Capto S impact。
  21. 如权利要求20所述的方法，所述蛋白先与所述其它阳离子交换剂接触，后与所述精细阳离子交换剂接触。
  22. 如权利要求1-21中任一项所述的方法，所述方法还包含使所述蛋白与混合模式交换剂接 触。
  23. 如权利要求22所述的方法，所述蛋白先与所述精细阳离子交换剂接触，后与所述混合模式交换剂接触。
  24. 如权利要求22-23中任一项所述的方法，所述方法还包含使所述蛋白与两种或以上的所述混合模式交换剂接触。
  25. 如权利要求22-24中任一项所述的方法，所述蛋白先与所述精细阳离子交换剂接触，后与两种或以上所述混合模式交换剂接触。
  26. 如权利要求22-25中任一项所述的方法，所述混合模式交换剂包含以下组：羟基磷灰石Ⅱ型和CaptoMMC Impres。
  27. 如权利要求1-26中任一项所述的方法，所述方法还包含使所述蛋白与阴离子交换剂接触。
  28. 如权利要求27所述的方法，所述蛋白先与所述阴离子交换剂接触，后与所述阳离子交换剂接触。
  29. 如权利要求27-28中任一项所述的方法，所述阴离子交换剂包含以下组：Capto Q和Q.sepharose.HP。
  30. 如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中缓冲液选自以下组：Tris缓冲液、精氨酸溶液、磷酸盐溶液、柠檬酸盐溶液和NaCl溶液。
  31. 如权利要求27-30中任一项所述的方法，包含(1)使所述蛋白与所述阴离子交换剂接触；(2)使上述步骤获得的所述蛋白与所述其它阳离子交换剂接触，(3)使上述步骤获得的所述蛋白与所述精细阳离子交换剂接触，(4)使上述步骤获得的所述蛋白与所述混合模式交换剂接触。
  32. 如权利要求27-31中任一项所述的方法，包含(1)使所述蛋白与所述阴离子交换剂接触；(2)使上述步骤获得的所述蛋白与所述其它阳离子交换剂接触，(3)使上述步骤获得的所述蛋白与所述精细阳离子交换剂接触，(4)使上述步骤获得的所述蛋白与两种以上所述混合模式交换剂接触。
  33. 一种分离的蛋白，其经过如权利要求1-32中任一项所述的方法分离得到。
  34. 如权利要求33所述的蛋白，其中宿主蛋白含量约为500ng/mg或更低。
  35. 如权利要求33-34中任一项所述的蛋白，其中宿主蛋白含量约为100ng/mg或更低。
  36. 药物组合物，其包含权利要求33-35中任一项所述的蛋白和药学上可接受的佐剂。
  37. 权利要求33-35中任一项所述的蛋白和/或权利要求36所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗贫血。
  38. 根据权利要求37所述的用途，其中所述贫血包括肾性贫血、多发性骨髓瘤贫血和/或癌性贫血。
  39. 延长促红细胞生成刺激蛋白半衰期的方法，其包括以下的步骤：向有需要的受试者施用权利要求33-35中任一项所述的蛋白和/或权利要求36所述的药物组合物。
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