CN118206657B

CN118206657B - 一种半乳糖凝集素-3的抗体及其应用

Info

Publication number: CN118206657B
Application number: CN202410273458.8A
Authority: CN
Inventors: 孙东旭
Original assignee: Kangxu Biotechnology Shenzhen Co ltd
Current assignee: Kangxu Biotechnology Shenzhen Co ltd
Priority date: 2023-12-29
Filing date: 2024-03-11
Publication date: 2025-03-07
Anticipated expiration: 2044-03-11
Also published as: CN118206657A

Abstract

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种半乳糖凝集素‑3的抗体及其应用。本申请提供的半乳糖凝集素‑3的抗体或其抗原结合片段能够与半乳糖凝集素‑3的抗原特异性结合，具有较高的亲和力，在制备预防或治疗与半乳糖凝集素‑3异常表达相关疾病的药物方面具有极高的应用价值。

Description

一种半乳糖凝集素-3的抗体及其应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种半乳糖凝集素-3的抗体及其应用。

背景技术

半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal-3)是半乳糖凝集素家族中的一员，主要由免疫细胞和心肌细胞产生，是一种可溶性的β-半乳糖苷结合蛋白，广泛分布在脑、心、肾、肝、肺及肠道等组织器官中，在无菌性炎症中发挥重要作用。Galectin-3具有多种生物学功能，其能和细胞表面及细胞外基质的多种配体结合，在一系列生理及病理过程中扮演重要角色，包括细胞凋亡、粘附、增殖、迁移、炎症应答、免疫应答和纤维化应答等。研究证实，Galectin-3可以促进过度的炎症反应，是多种神经类疾病、炎症类疾病、代谢类疾病、心血管病、肿瘤等疾病的关键致病因子。

因此，需要一种半乳糖凝集素-3的抗体，可以特异性结合半乳糖凝集素-3，以在疾病治疗中发挥作用。

发明内容

本申请的目的在于提供一种半乳糖凝集素-3的抗体及其应用，以在疾病治疗中发挥作用。

本申请的技术方案如下：

本申请的第一方面，提供一种半乳糖凝集素-3的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中

(i)所述重链可变区包含分别具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2和如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3，所述轻链可变区包含分别具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的LCDR1、如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的LCDR3；或

(ii)所述重链可变区包含分别具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的HCDR2和如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的HCDR3，所述轻链可变区包含分别具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR1、如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的LCDR3。

优选地，

(i)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或

(ii)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

优选地，氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的所述重链可变区的核酸序列如SEQ IDNO:17所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的所述轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:18所示。

优选地，氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的所述重链可变区的核酸序列如SEQ IDNO:19所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示的所述轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:20所示。

优选地，所述抗体选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD中的一种。

优选地，所述抗体选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体中的一种。

优选地，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv和ds-scFv中的一种。

本申请的第二方面，提供一种核酸，所述核酸包含编码本申请提供的的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

本申请的第三方面，提供一种载体，所述载体包含编码本申请提供的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

本申请的第四方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本申请提供的核酸或本申请提供的载体。

本申请的第五方面，提供一种本申请提供的抗体或其抗原结合片段在制备预防或治疗与半乳糖凝集素-3异常表达相关疾病的药物中的应用。

优选地，所述疾病为神经类疾病、炎症类疾病、代谢类疾病、心血管疾病或肿瘤类疾病。

本申请的第六方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括本申请提供的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本申请的有益效果：

本申请提供的半乳糖凝集素-3的抗体，可以特异性结合半乳糖凝集素-3，且具有较高的亲和力，在制备预防或治疗与半乳糖凝集素-3异常表达相关疾病的药物方面具有极高的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本申请实施例提供的Gal-3抗原表达载体示意图；

图2为本申请实施例提供的Gal-3抗体表达载体示意图；

图3为本申请实施例提供的编号为1104SBC1068-378的抗体蛋白的SDS-PAGE检测结果；

图4为本申请实施例提供的编号为1104SBC1068-356的抗体蛋白的SDS-PAGE检测结果；

图5为本申请实施例提供的编号为1104SBC1068-378的Gal-3抗体和编号为1104SBC1068-356的Gal-3抗体的ELISA检测结果；

图6为本申请实施例提供的编号为1104SBC1068-356的Gal-3抗体的免疫细胞炎症反应测试结果。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请附图和实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护范围。在不冲突的情况下，下述实施例及实施例中的特征可以相互组合。

为了更容易理解本申请，首先在下面定义某些术语。在整个说明书中阐述了对以下术语和其他术语的附加定义。除非另有限定，否则本文所使用的全部技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同。

1、抗体

抗体是指能够特异性结合特定抗原的免疫球蛋白分子。抗体通常包含重链和轻链，在每条重链和轻链中包含可变区和恒定区。抗体重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的组分。因此，大多数抗体具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，它们共同形成与抗原结合的抗体部分。

抗体可以包括单克隆抗体(包含全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体片段和包含至少两个抗原结合区的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。抗体可含有另外的修饰，例如非天然存在的氨基酸、Fc区中的突变、以及糖基化位点的突变。抗体还包括翻译后修饰的抗体、含有抗体的抗原决定簇的融合蛋白以及含有对抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体表现出预期的生物活性即可。

2、重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)

重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)由间插三个“互补决定区”或“CDR”的“框架”(FR)区组成。框架区用于调整CDR，以用于特异性结合抗原表位。CDR包含抗体中主要负责抗原结合的氨基酸残基。从氨基末端到羧基末端，VH和VL结构域都包含以下FR区和CDR区：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。VH结构域的CDR 1、2和3在本文中也分别称为HCDR1、HCDR2和HCDR3；VL结构域的CDR 1、2和3在本文中也分别称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。

3、抗原结合片段

抗原结合片段是指保持特异性结合抗原能力的一种或多种抗体片段。研究表明，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。抗原结合片段的实例包括(i)Fab片段，其为由VH、VL、CH1和CL结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其为二价片段，包含通过铰链区二硫键连接的两个Fab片段；(iii)Fab’片段，其基本上是Fab，但具有部分铰链区(参见，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Pauled.,3.sup.rd ed.1993))；(iv)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(v)Fd’片段，其具有VH和CH1结构域以及位于CH1结构域的C端的一个或多个半胱氨酸残基；(vi)Fv片段，其由抗体单臂的VH和VL结构域组成；(vii)dAb片段(Ward等人(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；(viii)单独的互补决定区(CDR)；和(ix)纳米抗体，其为包含单个可变域和两个恒定域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VH和VL通过独立的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接，该合成接头能够使它们形成单个蛋白质链，在该蛋白质链中，VH和VL区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人(1988)Science242,423-426；以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,5879-5883)。此类单链抗体也意在包含在术语抗体的“抗原结合片段”内。此外，该术语还包括含有一对串联Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，其与互补的轻链多肽以及保留抗原结合活性的任何前述片段的修饰版本共同形成抗原结合区。

4、结合或特异性结合

结合或特异性结合是指两种分子之间的非随机结合反应，例如在抗体和其靶抗原之间的非随机结合反应。抗体的结合特异性可以基于亲和力和/或亲合力来确定。亲和力通常由抗原与抗体解离的平衡常数(KD)表示，是抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间的结合强度的量度：KD值越小，抗原决定簇和抗体之间的结合强度越强。或者，亲和力也可以表示为亲和力常数(KA)，其为1/KD。KD可以从K_off/K_on的商数计算得到，KA可以从K_on/K_off的商数计算得到。K_on指例如抗体与抗原的结合速率常数，而K_off指例如抗体与抗原的解离速率常数。K_on和K_off可以通过本领域的普通技术人员已知的技术(诸如或KinExA)测定。通常，抗体将以10^-5至10^-12M或更小的解离常数(KD)结合，优选以10^-7至10^-12M或更小，更优选以10^-8至10^-12M的解离常数(KD)结合，和/或以至少10⁷M^-1，优选至少10⁸M^-1，更优选至少10⁹M^-1，例如至少10¹²M^-1的结合亲和力结合。

5、核酸

核酸是一种长度任意的寡聚物或聚合物，由核苷酸(脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸)组成。核酸可以包含嘌呤和/或嘧啶碱基和/或其他天然(例如黄嘌呤、肌苷、次黄嘌呤)，化学或生物化学修饰(例如甲基化)，非天然或衍生的核苷酸碱基。核酸的骨架可以包含通常存在于RNA或DNA中的糖和磷酸基团，和/或一种或多种经修饰或取代的糖和/或一种或多种经修饰或取代的磷酸基团。可以引入磷酸基团或糖的修饰以改善稳定性、对酶促降解的抗性，或一些其他有用的特性。核酸可以是例如双链的，部分双链的或单链的。当是单链时，核酸可以是有正义链或反义链。核酸可以是环形或线形的。核酸涵盖DNA和RNA，包括基因组、pre-mRNA、mRNA、cDNA、包含载体的重组或合成核酸。

6、载体

载体是指可以将核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能表达插入的核苷酸编码的蛋白时，该载体称为表达载体。载体可以通过转化、转导或者转染等方法导入宿主细胞，继而使其携带的遗传物质在宿主细胞内获得表达。载体中可以包含多种控制表达原件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件、报告基因和复制起始位点。重组表达载体包括但不限于用于增殖或用于表达或用于增殖和表达的载体。

7、宿主细胞

宿主细胞是指已引入表达载体的细胞。

8、序列同一性

序列同一性是指任何给定的查询序列和主题序列之间的同一性程度。本领域的技术人员将容易理解如何确定两个多肽(例如未经修饰的肽和肽变体)的同一性。例如，可以在对齐两条序列使它们的同一性达到最高水平之后再计算同一性，例如可以引入空位。计算同一性的另一个方法可以通过公开的算法实施。此类数学算法的非限制性实例包括Myers和Miller(1988)CABIOS4:11-17的算法、Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的用于搜索同源性的方法和Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264的算法的修改形式，记载于Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877的算法。通过使用基于此类数学算法的程序，可以实施用于测定序列同一性的序列比较(即比对)。程序可以由计算机适当执行。此类程序的实例包括但不限于PC/Gene程序的CLUSTAL、ALIGN程序(2.0版本)和Wisconsin遗传学软件包的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。可以例如通过使用初始参数实施使用这些程序的比对。

此外，在确定两条氨基酸序列之间的序列同一性的程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守性”氨基酸取代，其通常可以描述为氨基酸残基被替换为具有类似化学结构的另一种氨基酸残基的氨基酸取代，其对多肽的功能、活性或其他生物学性质几乎没有影响或基本上没有影响。这种保守性氨基酸取代在本领域中是众所周知的。

9、药学上可接受的载体

药学上可接受的载体是指载体或佐剂与组合物的其他成分相容并且对其接受者没有大量毒害，和/或这些载体或佐剂被批准或可用于包含在对人类肠胃外给药的药物组合物中。

半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal-3)具有多种生物学功能，能和细胞及细胞外基质的多种配体结合，在一系列生理及病理过程中扮演重要角色，包括细胞凋亡、粘附、增殖、迁移、炎症应答、免疫应答和纤维化应答等。近年来，Galectin-3抑制剂成为新的研究热点，其能够抑制Galectin-3的分泌，从而延缓心室重构的进展，延长心衰患者的生存周期。研究显示，Galectin-3在阿尔兹海默症(AD)患者的大脑中高表达。Galectin-3在AD病理学中起关键作用，Galectin-3可与Aβ肽、p-Tau和其他淀粉样蛋白结合，，使上述通常以单体形式存在的蛋白质聚集并形成有毒的低聚物。这些低聚物在大脑中形成斑块并沉积，阻碍神经元之间的交流，从而损害AD患者的认知功能。因此，需要一种能够与半乳糖凝集素-3特异性结合的抗体，以起到调控Gal-3异常表达的作用。

基于此，本申请实施例的第一方面，提供一种半乳糖凝集素-3的抗体或其抗原结合片段，其中

(i)重链可变区包含分别具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2和如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3；轻链可变区包含分别具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的LCDR1、如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的LCDR3；或

(ii)重链可变区包含分别具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQID NO:11所示的氨基酸序列的HCDR2和如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的HCDR3；轻链可变区包含分别具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR1、如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的LCDR3。

在一实施方式中，抗体或抗原结合片段可以为：

(i)重链可变区包含与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且轻链可变区包含与SEQID NO:14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或

(ii)重链可变区包含与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且轻链可变区包含与SEQID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本申请实施例中的Gal-3的抗体及其抗原结合片段包括变体，变体可以包含一种或多种氨基酸修饰。在单个变体中可以包含取代、缺失、插入、添加或其任何组合，只要变体可以特异性结合抗原。制备变体的方法和技术是本领域技术人员公知的。

在一实施方式中，氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:17所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区的核酸序列如SEQ IDNO:18所示。

在一实施方式中，氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:19所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区的核酸序列如SEQ IDNO:20所示。

在一实施方式中，本申请实施例中的Gal-3的抗体选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD中的一种，在一实施方式中，本申请实施例中的Gal-3的抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。

在一实施方式中，本申请实施例中的Gal-3的抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv和ds-scFv中的一种。

需要说明的是，抗原的结合片段可以施用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。

在一实施方式中，本申请实施例中的Gal-3抗体的制备方法包括步骤：

(1)制备Gal-3抗原；

(2)使用Gal-3抗原免疫小鼠，获得半乳糖凝集素-3抗原免疫的小鼠B细胞的氨基酸序列和/或核酸序列，筛选得到Gal-3抗体的氨基酸序列和/或核酸序列；

(3)根据Gal-3抗体的氨基酸序列合成Gal-3抗体；或者根据Gal-3抗体的核酸序列表达Gal-3抗体，并通过纯化的方式获得Gal-3抗体。

其中，步骤(1)中制备Gal-3抗原可以采用本领域熟知的基因工程技术。本领域熟知的基因工程技术包括但不限于基因合成、蛋白质合成、基因外源表达、表达载体构建等。

在一实施方式中，Gal-3抗体的制备方法还包括对制得的Gal-3抗体进行鉴定的步骤。Gal-3抗体的鉴定方法包括但不限于酶联免疫吸附测定法、基于SPR的亲和力测定法。上述鉴定方法为本领域技术人员已知，在此不做赘述。

本申请实施例的第二方面，提供一种核酸，包括编码上述实施例中的抗体或抗原结合片段的核苷酸序列。核酸通过转录和翻译得到对应的氨基酸。需要说明的是，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。另外，本领域技术人员也可以使用常规技术进行不影响本申请中多核苷酸编码的多肽(氨基酸)序列的核苷酸取代。

本申请实施例的第三方面，提供一种载体，包括编码上述实施例中的抗体或抗原结合片段的核苷酸序列。载体包括但不限于质粒、人工染色体、噬菌体、动物病毒等。

需要说明的是，载体也可以是重组表达载体。重组表达载体可以选自pUC系列、pET系列、pGEX系列等，也可以选自噬菌体载体，包括但不限于λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149，也可以选自植物表达载体，包括但不限于pBI系列、pCambia系列，另外可以选自组动物表达载体，包括但不限于pcDNA、pEUK-C1。

本申请实施例的第四方面，提供了宿主细胞，包含本申请实施例中的核酸或本申请实施例中的载体。宿主细胞可以是原核细胞、真核细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞等。在一实施方式中，宿主细胞选自大肠杆菌E.Coli、CHO-K1细胞、293细胞、vero细胞、NIH-3T3细胞、PC12细胞、Hela细胞、Sf9细胞、BHK21细胞或HepG2细胞。

本申请实施例的第五方面，本申请提供的抗体或其抗原结合片段在制备预防或治疗与半乳糖凝集素-3异常表达相关疾病的药物中的应用。

其中，与半乳糖凝集素-3异常表达相关疾病包括但不限于神经类疾病、炎症类疾病、代谢类疾病心血管疾病或肿瘤类疾病。

在一实施方式中，与半乳糖凝集素-3异常表达相关的神经类疾病包括但不限于阿尔茨海默症、渐冻症、帕金森、中风、癫痫。

本申请实施例的第六方面，提供一种药物组合物，包括上述实施例中的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体或赋形剂。赋形剂包括但不限于黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂。

在一实施方式中，药物组合物可以按照治疗有效量的剂量向受试者施用。施用是指将抗体或药物组合物引入到受试者中，包括并行或顺序引入。施用可以指如治疗、药代动力学、诊断、研究、安慰剂和实验方法。施用同时也包括体外或离体治疗。通过任何合适的途径将组合物或药剂引入到受试者中，用于施用本申请实施例中的抗体或药物组合物的合适方法的实例包括口服、皮内、皮下、肌肉内、骨内、腹膜内和静脉内注射，以及全身施用或局部施用至靶位点附近等。施用可以通过任何合适的途径进行施用，合适的施用途径允许组合物或药剂进行其预期功能。

在一实施方式中，本申请实施例提供一种施用装置，包括本申请实施例中的抗体或药物组合物与用于施用的工具，包括但不限于注射器、吸入器、抽吸器等。

下面将通过具体实施例做进一步说明。

实施例1：抗原的制备

将合成Gal-3抗原的核苷酸序列(如SEQ ID NO:21所示)，构建到pET30a载体(Kan+，His tag)中，得到Gal-3抗原表达载体，如图1所示。

抽取足量质粒(表达载体)，取100ng质粒加入到感受态细胞中转化，取100μl转化的菌液涂布至带有对应抗性的LB平板上培养16h，随后挑选长相均匀的菌落转移至4ml含对应抗性的液体培养基中得到菌液并培养，待菌液的OD₆₀₀值达到0.6时，加入终浓度1mM的IPTG进行诱导，诱导的条件为37℃，诱导的时间为2h。诱导结束后将取部分菌液使用细胞破碎仪进行破碎，取上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，对电泳胶进行观察，待确定电泳胶上的条带大小正确无误后，取前述菌液进行放大培养并诱导表达。

收集放大培养的菌液做破碎处理，收集上清，使用镍亲和磁珠对收集的上清进行纯化，得到蛋白，将蛋白透析到PBS+100mM乳糖溶液中，所得蛋白即为Gal-3抗原。其中，Gal-3抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。

实施例2：抗体的制备

(1)使用实施例1得到的Gal-3抗原免疫BALB/c小鼠，每两周用免疫佐剂completeFreund’s adjuvant(CFA)混合Gal-3抗原，在皮下多点注射进行免疫，免疫4次。免疫后，解剖免疫的小鼠获得脾脏B细胞，通过新一代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)进行测序，利用生物信息分析通过筛选获得Gal-3抗体的核酸序列和氨基酸序列。其中，生物信息分析是基于Kabat定义方案，通过在线分析工具https://novopro.cn/tools/cdr.html，获得Gal-3抗体氨基酸序列中的CDR区域等序列信息。

(2)将Gal-3抗体基因在哺乳动物细胞中表达。具体根据筛选得到的抗体的核酸序列，将核酸序列导入pcDNA3质粒构建表达载体，构建的表达载体如图2所示。通过瞬时转染至哺乳动物CHO K1细胞(中国仓鼠卵巢上皮细胞)中进行表达。

(3)抗体初筛

对CHO K1细胞培养基上清液使用ELISA检测，初筛阳性克隆。ELISA具体操作步骤可以参考实际使用的试剂盒的说明书，在此不做赘述。ELISA检测的结果如表1所示。

表1、ELISA检测不同的抗体基因的OD₄₅₀值统计结果

从表1中可知，编号为1104SBC1068-378的抗体和编号为1104SBC1068-356的抗体与Gal-3抗原的结合能力较好，为潜在的可使用的Gal-3抗体蛋白。

(4)序列信息获取

将步骤(3)中的Gal-3抗体基因进行测序分析，通过测序得到的编号为1104SBC1068-378和1104SBC1068-356的Gal-3抗体的CDR序列和氨基酸序列如表2所示。

表2、编号为1104SBC1068-378和1104SBC1068-356的Gal-3抗体的CDR序列和氨基酸序列信息

实施例3：抗体的纯化和检测

将实施例2中筛选得到的两个Gal-3抗体(编号为1104SBC1068-378和1104SBC1068-356)进一步纯化表达，具体的纯化表达步骤如下：上清液中的抗体先结合至protein A亲和柱，用0.1M的甘氨酸洗脱(pH值为3)，再加入2M Tris-HCl(pH 8)中和液。

纯化后的两个Gal-3抗体用SDS-PAGE电泳鉴定其纯度，结果如图3和图4所示，图3为编号为1104SBC1068-378的Gal-3抗体蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图，图4为编号为1104SBC1068-356的Gal-3抗体蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图。需要说明的是，图3和图4中，R为样品经还原处理，N-R为样品经非还原处理，M为蛋白大小的参考标记。

从图3和图4中可知，经过纯化后，两种Gal-3抗体的纯度均大于95％。可以用于免疫和效价的检测。

实施例4：抗原抗体结合ELISA效价分析

具体步骤包括：

(1)抗原包被：先将96孔板使用Gal-3抗原包被，使用浓度为2ug/ml，抗原添加量为每孔100ul，在4℃下过夜孵育。次日向每孔加入200ul 1XTBST手动洗板，重复4次，最后一次尽量拍干。

(2)封闭：加入2％BSA作为封闭液，每孔200ul，在25℃下孵育1小时。封闭结束后每孔加入200ul 1X TBST手动洗板，重复4次，最后一次尽量拍干。

(3)抗原抗体结合：加入实施例3中纯化后的编号为1104SBC1068-378与编号为1104SBC1068-356的Gal-3抗体，每种抗体第一个孔浓度为100nM，剩余孔均按3倍稀释，每孔加入100ul，在25℃下孵育1小时。

(4)加入二抗：使用HRP：Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-HumanIgG抗体孵育，将此抗体用封闭液按1:5000稀释，每孔加入100ul，在25℃下孵育1小时。孵育结束后每孔加入200ul 1X TBST手动洗板重复4次，最后一次尽量拍干。

(5)显色：向每孔加入100ul显色液，室温避光孵育4分钟，待颜色变化较深时加入终止液终止反应。

(6)终止：向每孔加入50ul终止液。

(7)读板：将96孔板放置在酶标仪中，使用酶标仪读取OD₄₅₀的数值。

根据读取的数值计算半数抑制浓度EC₅₀，结果如图5所示。从图5中可知，编号为1104SBC1068-378的Gal-3抗体的半数抑制浓度EC₅₀为0.09110nM，编号为1104SBC1068-356的Gal-3抗体的半数抑制浓度EC50为1.092e-069nM。说明两个Gal-3抗体为具有高结合效价的抗体。

实施例5：抗体亲和力检测

使用Biacore 8K(Ranking)-CM5 chip对实施例3中纯化后的两个Gal-3抗体进行亲和力检测，包括步骤：

(1)传感器芯片准备：安装CM5芯片到Biacore仪器中，使用特定的耗材和装置，清洗芯片表面，以确保表面没有任何污染。

(2)运行缓冲液：通过系统控制缓冲液(running buffer)开始流入系统，并流经芯片，以稳定基线并保持传感器芯片表面的稳定状态。

(3)运行样本：在流动缓冲液中运行待检测样本，冷洗掉芯片表面多余的物质。

(4)固定配体：固定配体到传感器芯片的表面(Capture Ligand：25μg/mL 10μL/min Anti-Human IgG(Fc)Ru值在9400)(Capture Ligand：Antibody 2/4μg/mL 10μL/minRu值在320-750)，确保固定过程是均匀和稳定的。

(5)运行缓冲液再平衡：再次运行缓冲液，以确保配体的固定是稳定的。

(6)注射样品：将分析物(Association Antigen,30μL/min,100s,200nM)注射到芯片表面，通常是在不同浓度或时间点。记录传感器芯片上的共振信号变化。

(7)洗脱：运行缓冲液，将未结合的分析物冲洗掉，参数设置为50/120s。

(8)传感器芯片再生：使用洗脱液(magnesium chloride,3M，30μL/min，100s)将分析物从芯片上去除，使芯片恢复到基线状态。

(9)数据分析。分析配体和分析物之间的互作用强度，结果如表3所示。

表3、两种Gal-3抗体的亲和力测定结果

从表3中可知，编号为1104SBC1068-378和1104SBC1068-356的Gal-3抗体均具有较好的亲和力。

实施例6：抗体对于免疫细胞炎症反应的作用测定

BV2细胞是小鼠脑组织的小胶质免疫细胞，通过内毒素LPS处理后，释放大量TNFa炎症因子，可用于鉴定细胞炎症反应。

BV2-TNFa检测具体操作步骤如下：

1)第一天，将BV2细胞种植到96孔板中，每孔5000个细胞，在37℃，5％的二氧化碳的条件下培养过夜使细胞贴壁。

2)第二天，取一块新的96孔板，LPS浓度为30ug/ml，96孔板第8排为对照，只含有完全培养基，无LPS。其余各孔均含有30ug/ml LPS，体积均为200ul。

3)取阴性对照抗体Anti-HEL(hen egg lysozyme)Human IgG4(S228P)(百英生物)和实施例3中纯化后的编号为1104SBC1068-356的Gal-3抗体，每支抗体设置3个副孔，第一排抗体浓度为100nM，第一排体积为300ul，将加入抗体的副孔充分混匀，取100ul加入第2排，混匀后，取100ul加入到第3排，以此类推加到第7排，即3倍稀释。

4)将液体混匀后，将原有培养BV2的96孔板中的完全培养基弃去，用完全培养基洗涤3次，每次100ul即可，将步骤3)中的液体全部转移至BV2细胞的孔板中，并转移至培养箱孵育15小时。

5)孵育结束后将各孔培养基取出20ul，使用碧云天Mouse TNF-αELISA Kit(High-sensitive)试剂盒中的样品稀释液将培养基稀释5倍使用，剩余放入4度保存。

6)提前将试剂盒中的试剂置于下室温下平衡30分钟。配制洗涤液：将20X洗涤液用灭菌水稀释至1X。

7)将样品按照100μl/孔加入相应孔中，用封板膜封住反应孔，室温孵育120分钟。孵育结束后手动洗涤孔板，每孔加洗涤液200ul，共洗5次。最后一次置于厚吸水纸上拍干。

8)每孔加入生物素化抗体100ul，用封板膜封住反应孔，室温孵育60分钟。孵育结束后每孔加洗涤液200ul洗涤孔板，重复5次。最后一次置于厚吸水纸上拍干。

9)每孔加入辣根过氧化物酶标记Streptavidin 100ul。用封板膜封住反应孔，室温避光孵育20分钟。室温偏低时(低于25℃)，需要适当延长孵育时间。孵育结束后手动洗涤孔板，每孔加洗涤液200ul，共洗5次。最后一次置于厚吸水纸上拍干。

10)每孔加入显色剂TMB溶液100ul，用封板膜封住反应孔，室温避光孵育5-10分钟。孵育至样品出现非常显著的颜色变化。每孔加入终止液50ul，混匀后立即测量A₄₅₀值。

测试结果如图6所示，从图6中可知，相对于阴性对照抗体HEL，编号为1104SBC1068-356的Gal-3抗体能显著降低内毒素LPS诱导免疫细胞释放的TNFa炎症因子的含量。因此，编号为1104SBC1068-356的Gal-3抗体在制备用于治疗炎症相关疾病，如炎症类疾病、代谢类疾病、心血管病、肿瘤的药物中具有极高的应用价值。

综上所述，本申请提供的两种半乳糖凝集素-3的抗体，能够与Gal-3的抗原特异性结合，具有较高的亲和力，在制备预防或治疗与半乳糖凝集素-3异常表达相关疾病的药物方面具有极高的应用价值。

应当理解的是，本申请的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本申请所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种半乳糖凝集素-3的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中

(i)所述重链可变区包含分别具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2和如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3，所述轻链可变区包含分别具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的LCDR1、如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的LCDR3；或

(ii)所述重链可变区包含分别具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQID NO:11所示的氨基酸序列的HCDR2和如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的HCDR3，所述轻链可变区包含分别具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR1、如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的LCDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其中

(i)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，并且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；或

(ii)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，并且所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO:13所示的所述重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:17所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的所述轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:18所示。

4.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO:15所示的所述重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:19所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示的所述轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:20所示。

5.根据权利要求1至4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD中的一种。

6.根据权利要求1至4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体中的一种。

7.根据权利要求1至4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv和ds-scFv中的一种。

8.核酸，其特征在于，所述核酸包含编码权利要求1至7任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

9.载体，其特征在于，所述载体包含编码权利要求1至7任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

10.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求8所述的核酸或权利要求9所述的载体。