CN118202069A

CN118202069A - 用于检测疟疾的组合物和方法

Info

Publication number: CN118202069A
Application number: CN202280073962.2A
Authority: CN
Inventors: S·H-C·邱; Y·吉切鲁; M·黑尔; M·K·李; C·马诺哈尔; E·奥迪纳里奥; J·拉贾马尼; 孙惊涛
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2021-11-05
Filing date: 2022-11-03
Publication date: 2024-06-14
Also published as: WO2023079032A1; JP2024542104A; EP4426865A1; US20250003013A1

Abstract

本公开描述了用于快速检测生物学或非生物学样品中疟疾寄生虫(包括疟原虫)的存在或不存在的方法。所述方法可以包括执行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，测定可以是多重测定，以同时扩增和检测多个疟原虫靶标，这提供了优于单重测定的优势。此外，还提供了靶向疟疾寄生虫(包括疟原虫)的引物和探针以及试剂盒，其设计用于检测疟原虫，所述疟原虫包括但不限于恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫和三日疟原虫的疟原虫物种。还描述了用于扩增和检测疟疾寄生虫(包括疟原虫)的试剂盒、反应混合物和寡核苷酸(例如，引物和探针)。

Description

用于检测疟疾的组合物和方法

序列表

本申请含有序列表，该序列表已经以XML格式以电子方式提交并且据此全文以引用方式并入本文。所述XML副本创建于2022年11月1日，命名为“P36987-WO序列表”，并且大小为65,548个字节。

技术领域

本公开涉及体外诊断领域。在该领域内，本发明涉及使用引物和探针对可能存在于样品中的靶核酸的扩增和检测，并且特别是对疟疾寄生虫的包括序列变异和/或个体突变的靶核酸的扩增、检测和定量。本发明进一步提供了含有用于疟疾的扩增和检测的引物和探针的反应混合物和试剂盒。

背景技术

疟疾是一种通过蚊子传播的传染性疾病，其会影响人类和其他动物。疟疾是一种由单细胞微生物疟原虫(Plasmodium)寄生虫引起的疾病，其在被受感染的雌性按蚊(Anopheles mosquitoe)叮咬后传播给人类。疟疾的最初症状包括发热、头痛和寒战，并且可以使用现有的抗疟疾药物进行治疗。如果不加以治疗，可能会发展成严重的疟疾，其症状包括贫血、脑型疟疾和呼吸窘迫，此可能最终导致死亡。

根据2018年世界卫生组织(WHO)报告，在87个国家/地区中大约有32亿人处于患有疟疾的风险，这些国家主要位于热带和亚热带地区。每年大约有2.19亿例疟疾病例，其中这些病例中有92％来自非洲，5％位于东南亚，并且2％位于东地中海国家。美国每年出现约1,700例病例。疟疾每年还导致435,000人死亡，其中这些死亡人数中有266,000人为五岁以下的儿童。正在努力根除和预防疟疾，其包括经杀虫剂处理的蚊帐、增加患者获得医疗保健服务的机会、药物开发疫苗和转基因蚊子(GMO)。尽管美国不被视为疟疾的流行国家，但往返美国的全球旅行可能导致输入性疟疾病例的增加。

已知有至少五种疟原虫物种会感染人类：恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)、三日疟原虫(P.malariae)和诺氏疟原虫(P.knowlesi)。取决于疟原虫的物种，临床表现可能会有所不同。恶性疟原虫是最致命的物种，已知其会导致受感染的红细胞快速细胞分裂，此会导致贫血并阻塞通向脑部的血管。疟原虫的生命周期较复杂，该寄生虫在两种状态之间交替变化，即在蚊子体内进行有性繁殖和在人类宿主体内进行无性繁殖。症状由寄生虫在红内期(blood stage)期间引起，并且可在蚊虫叮咬后7-30天之间呈现。间日疟原虫和卵形疟原虫可以在红外期(liver stage)时保持休眠状态，几个月或甚至几年后重新活化。

在供血和献血方面，在美国南部和东部严重短缺的情况下，维持充足的供血已经存在重大挑战。疟疾给供血和献血带来了额外的问题。例如，虽然美国被认为是非流行国家，但全球旅行可能导致输入性疟疾病例的增加，从而影响美国内的供血情况。在全球范围内，目前对于疟疾采取的维持供血安全的策略包括：(1)选择性检测，和(2)献血者延期，其中美国遵循献血者延期政策。通常，基于对筛查问卷(基于个人经历、居住地和旅行)的回答使献血者延期。在美国，有估计191,000名献血者被暂时延期(1-3年)，其中大部分延期归因于前往流行地区旅行。此外，延期捐献会对供血产生负面影响，这是因为大约仅有1/4的被暂时延期的献血者在延期时段结束后实际返回进行后续献血。由于无论疟疾状况如何而基于问卷回答排除捐献，献血者延期对供血产生负面影响。另一方面，与献血者延期相比，选择性检测减少了对供血库存的影响。献血的选择性检测也基于问卷回答，但选择性检测政策允许根据献血者的疟疾状况缩短延期时间和使献血者恢复献血。在有选择性检测政策的国家，检测通过酶免疫测定法来完成。至少三个国家已在献血中实施了疟疾检测：法国、英国和澳大利亚。在法国，在一年的3百万次捐献中，有约180,000次捐献被检测，而在这180,000次所检测的捐献中，有约3,300次(或1.8％)呈阳性。

存在多种针对疟疾的诊断和筛查方法。通过对吉姆萨(Giemsa)染色的血涂片进行显微镜检查来检测疟疾允许进行物种鉴别，价格低廉，并且仍然是金标准。然而，显微镜检查不能够进行高通量筛查/检测。采用免疫层析方法检测疟疾抗原的快速诊断测试(RDT)速度快且价格低廉，但表现出低灵敏度(200-5,000p/μL)，并且仍需要通过显微镜检查进行确认。检测血清中抗疟原虫抗体的酶免疫测定法(EIA)被广泛使用，但也表现出低灵敏度。相比之下，核酸测试(NAT)适用于高通量筛查/检测，并且高度灵敏(<1p/μL)。因此，由于其高灵敏度和高通量能力，核酸测试代表了用以针对疟疾检测和筛查血液样品的最佳方法。然而，目前还没有可用于筛查献血的体外诊断核酸测试。由此，本领域需要一种快速、可靠、特异性且灵敏的方法以检测和定量生物学样品(如血液)中疟疾的存在情况。

在分子诊断领域，核酸的扩增和检测具有相当重要的意义。此类方法可用于检测任何数量的微生物，例如病毒和细菌。最突出和广泛使用的扩增技术是聚合酶链式反应(PCR)。其他扩增技术包括连接酶链反应、聚合酶连接酶链反应、Gap-LCR、修复链反应、3SR、NASBA、链置换扩增(SDA)、转录介导扩增(TMA)和Qβ-扩增。用于基于PCR的分析的自动化系统通常应用在同一反应容器中的PCR过程中实时检测产物扩增。这种方法的关键是使用带有报告基团或标记的修饰寡核苷酸。

缺乏用于检测疟疾的可靠、快速、价格低廉且灵敏的方法威胁着献血者供应的安全。因此，本领域需要一种快速、可靠、特异性且灵敏的方法以检测和定量生物学样品(如血液)中疟疾的存在情况。本公开涉及一种基于聚合酶链式反应(PCR)的测定法，其用于检测和筛选血液样品和捐献物中的所有疟原虫属(恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫和三日疟原虫)。

发明内容

本公开中的某些实施方案涉及用于例如通过单个试管或容器中的实时聚合酶链式反应(PCR)进行疟疾寄生虫(诸如疟原虫)的多重检测和定量来快速检测生物学样品或非生物学样品中疟疾寄生虫(诸如疟原虫)的存在或不存在的方法。实施方案包括检测疟疾寄生虫(诸如疟原虫)的方法，其包括执行至少一个循环步骤，该至少一个循环步骤可以包括扩增步骤和杂交步骤。此外，实施方案包括经设计用于检测单个试管或容器中的疟疾寄生虫(诸如疟原虫)的引物、探针和试剂盒。

一个实施方案涉及一种用于检测样品中的一种或多种疟疾寄生虫物种的方法，该方法包括：(a)执行扩增步骤，该扩增步骤包括使该样品与一组或多组寡核苷酸引物接触以产生扩增产物，如果该一种或多种疟疾寄生虫物种的靶核酸存在于该样品的话；(b)执行杂交步骤，该杂交步骤包括使一种或多种寡核苷酸探针与该扩增产物接触，如果该一种或多种疟疾寄生虫物种的靶核酸存在于该样品的话；以及(c)检测该扩增产物的存在或不存在，其中该扩增产物的存在指示该样品中该一种或多种疟疾寄生虫物种的存在，并且其中该扩增产物的不存在指示该样品中该一种或多种疟疾寄生虫物种的不存在；并且其中该一组或多组寡核苷酸引物和该一种或多种寡核苷酸探针包括：(1)一组寡核苷酸引物，该一组寡核苷酸引物包括含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸引物：SEQ ID NO:1和2的核酸序列或其互补序列；以及含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸探针：SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列；和/或(2)一组寡核苷酸引物，该一组寡核苷酸引物包括含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸引物：SEQ ID NO:13和14的核酸序列或其互补序列；以及含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸探针：SEQ ID NO:15的核酸序列或其互补序列。在另一个实施方案中，一种或多种疟疾寄生虫物种属于疟原虫属。在另一个实施方案中，属于疟原虫属的一种或多种疟疾寄生虫物种为恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和/或诺氏疟原虫。在另一个实施方案中，样品是生物学样品。在另一个实施方案中，生物学样品为全血、呼吸道样本、尿液、粪便样本、血液样本、血浆、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤、或软组织感染。在另一个实施方案中，生物学样品为全血。在另一个实施方案中，一种或多种寡核苷酸探针中的至少一者是经标记的。在另一个实施方案中，一种或多种寡核苷酸探针中的至少一者用供体荧光部分和对应的受体部分进行标记。在另一个实施方案中，步骤(c)进一步包括检测一种或多种寡核苷酸探针的供体荧光部分与受体部分之间荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在指示样品中一种或多种疟疾寄生虫物种的存在或不存在。

另一实施方案涉及一种用于检测样品中一种或多种疟疾寄生虫物种的第一靶核酸和/或第二靶核酸的方法，该方法包括：(a)执行扩增步骤，该扩增步骤包括使该样品与一组或多组寡核苷酸引物接触以产生扩增产物，如果该一种或多种疟疾寄生虫物种的该第一靶核酸和/或该第二靶核酸存在于该样品的话；(b)执行杂交步骤，该杂交步骤包括使一种或多种寡核苷酸探针与该扩增产物接触，如果该一种或多种疟疾寄生虫物种的该第一靶核酸和/或该第二靶核酸存在于该样品的话；以及(c)检测该扩增产物的存在或不存在，其中该扩增产物的存在指示该样品中该一种或多种疟疾寄生虫物种的存在，并且其中该扩增产物的不存在指示该样品中该一种或多种疟疾寄生虫物种的不存在；并且其中该一组或多组寡核苷酸引物和该一种或多种寡核苷酸探针包括：(1)用于该一种或多种疟疾寄生虫物种的第一靶核酸的一组寡核苷酸引物以及寡核苷酸探针，其中该一组寡核苷酸引物包括含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸引物：SEQ ID NO:1和2的核酸序列或其互补序列；并且其中该寡核苷酸探针含有以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列；以及(2)用于该一种或多种疟疾寄生虫物种的该第二靶核酸的一组寡核苷酸引物以及寡核苷酸探针，其中该一组寡核苷酸引物包括含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸引物：SEQID NO:13和14的核酸序列或其互补序列；并且其中该寡核苷酸探针含有以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:15的核酸序列或其互补序列。另一实施方案涉及一种用于检测样品中一种或多种疟疾寄生虫物种的方法，该方法包括：(a)执行扩增步骤，该扩增步骤包括使该样品与一组或多组寡核苷酸引物接触以产生扩增产物，如果该一种或多种疟疾寄生虫物种的靶核酸存在于该样品的话；(b)执行杂交步骤，该杂交步骤包括使一种或多种寡核苷酸探针与该扩增产物接触，如果该一种或多种疟疾寄生虫物种的该靶核酸存在于该样品的话；以及(c)检测该扩增产物的存在或不存在，其中该扩增产物的存在指示该样品中该一种或多种疟疾寄生虫物种的存在，并且其中该扩增产物的不存在指示该样品中该一种或多种疟疾寄生虫物种的不存在；并且其中该一组或多组寡核苷酸引物和该一种或多种寡核苷酸探针包括：一组寡核苷酸引物，该一组寡核苷酸引物包括含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸引物：SEQ ID NO:1和2的核酸序列或其互补序列；以及含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸探针：SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列。另一相关实施方案涉及一种用于检测样品中一种或多种疟疾寄生虫物种的方法，该方法包括：(a)执行扩增步骤，该扩增步骤包括使该样品与一组或多组寡核苷酸引物接触以产生扩增产物，如果该一种或多种疟疾寄生虫物种的靶核酸存在于该样品的话；(b)执行杂交步骤，该杂交步骤包括使一种或多种寡核苷酸探针与该扩增产物接触，如果该一种或多种疟疾寄生虫物种的该靶核酸存在于该样品的话；以及(c)检测该扩增产物的存在或不存在，其中该扩增产物的存在指示该样品中该一种或多种疟疾寄生虫物种的存在，并且其中该扩增产物的不存在指示该样品中该一种或多种疟疾寄生虫物种的不存在；并且其中该一组或多组寡核苷酸引物和该一种或多种寡核苷酸探针包括：一组寡核苷酸引物，该一组寡核苷酸引物包括含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸引物：SEQ ID NO:13和14的核酸序列或其互补序列；以及含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸探针：SEQ ID NO:15的核酸序列或其互补序列。在另一个实施方案中，一种或多种疟疾寄生虫物种属于疟原虫属。在另一个实施方案中，属于疟原虫属的一种或多种疟疾寄生虫物种为恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和/或诺氏疟原虫。在另一个实施方案中，样品是生物学样品。在另一个实施方案中，生物学样品为全血、呼吸道样本、尿液、粪便样本、血液样本、血浆、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤、或软组织感染。在另一个实施方案中，生物学样品为全血。在另一个实施方案中，一种或多种寡核苷酸探针中的至少一者是经标记的。在另一个实施方案中，一种或多种寡核苷酸探针中的至少一者用供体荧光部分和对应的受体部分进行标记。

另一实施方案涉及一种用于检测可能存在于样品中的一种或多种疟疾寄生虫物种的试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂，该扩增试剂包含DNA聚合酶和核苷酸单体中的至少一者，以及一组或多组寡核苷酸引物和一种或多种寡核苷酸探针，其中该一组或多组寡核苷酸引物和该一种或多种寡核苷酸探针包括：(1)一组寡核苷酸引物，该一组寡核苷酸引物包括含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸引物：SEQ ID NO:1和2的核酸序列或其互补序列；以及含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸探针：SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列；和/或(2)一组寡核苷酸引物，该一组寡核苷酸引物包括含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸引物：SEQ ID NO:13和14的核酸序列或其互补序列；以及含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸探针：SEQ ID NO:15的核酸序列或其互补序列。在另一个实施方案中，该一组或多组寡核苷酸引物和该一种或多种寡核苷酸探针包括：(1)一组寡核苷酸引物，该一组寡核苷酸引物包括含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸引物：SEQ ID NO:1和2的核酸序列或其互补序列；以及含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸探针：SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列；以及(2)一组寡核苷酸引物，该一组寡核苷酸引物包括含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸引物：SEQ ID NO:13和14的核酸序列或其互补序列；以及含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸探针：SEQ ID NO:15的核酸序列或其互补序列。在另一个实施方案中，一种或多种疟疾寄生虫物种属于疟原虫属。在另一个实施方案中，属于疟原虫属的一种或多种疟疾寄生虫物种为恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和/或诺氏疟原虫。在另一个实施方案中，样品是生物学样品。在另一个实施方案中，生物学样品为全血、呼吸道样本、尿液、粪便样本、血液样本、血浆、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤、或软组织感染。在另一个实施方案中，生物学样品为全血。在另一个实施方案中，一种或多种寡核苷酸探针中的至少一者是经标记的。在另一个实施方案中，至少一种或多种寡核苷酸探针用供体荧光部分和对应的受体部分进行标记。

另一实施方案涉及一种用于检测可能存在于样品中的一种或多种疟疾寄生虫物种的第一靶核酸和/或第二靶核酸的试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂，该扩增试剂包含DNA聚合酶和核苷酸单体中的至少一者，以及一组或多组寡核苷酸引物和一种或多种寡核苷酸探针，其中该一组或多组寡核苷酸引物和该一种或多种寡核苷酸探针包括：(1)用于该一种或多种疟疾寄生虫物种的第一靶核酸的一组寡核苷酸引物以及寡核苷酸探针，其中该一组寡核苷酸引物包括含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸引物：SEQ ID NO:1和2的核酸序列或其互补序列；并且其中该寡核苷酸探针含有以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列；以及(2)用于该一种或多种疟疾寄生虫物种的该第二靶核酸的一组寡核苷酸引物以及寡核苷酸探针，其中该一组寡核苷酸引物包括含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸引物：SEQ ID NO:13和14的核酸序列或其互补序列；并且其中该寡核苷酸探针含有SEQ ID NO:15的核酸序列或其互补序列。另一实施方案涉及一种用于检测可能存在于样品中的一种或多种疟疾寄生虫物种的试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂，该扩增试剂包含DNA聚合酶和核苷酸单体中的至少一者，以及一组或多组寡核苷酸引物和一种或多种寡核苷酸探针，其中该一组或多组寡核苷酸引物和该一种或多种寡核苷酸探针包括：一组寡核苷酸引物，该一组寡核苷酸引物包括含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸引物：SEQID NO:1和2的核酸序列或其互补序列；以及含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸探针：SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列。另一实施方案涉及一种用于检测可能存在于样品中的一种或多种疟疾寄生虫物种的试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂，该扩增试剂包含DNA聚合酶和核苷酸单体中的至少一者，以及一组或多组寡核苷酸引物和一种或多种寡核苷酸探针，其中该一组或多组寡核苷酸引物和该一种或多种寡核苷酸探针包括：一组寡核苷酸引物，该一组寡核苷酸引物包括含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸引物：SEQ ID NO:13和14的核酸序列或其互补序列；以及含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸探针：SEQ IDNO:15的核酸序列或其互补序列。在另一个实施方案中，一种或多种疟疾寄生虫物种属于疟原虫属。在另一个实施方案中，属于疟原虫属的一种或多种疟疾寄生虫物种为恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和/或诺氏疟原虫。在另一个实施方案中，样品是生物学样品。在另一个实施方案中，生物学样品为全血、呼吸道样本、尿液、粪便样本、血液样本、血浆、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤、或软组织感染。在另一个实施方案中，生物学样品为全血。在另一个实施方案中，一种或多种寡核苷酸探针中的至少一者是经标记的。在另一个实施方案中，一种或多种寡核苷酸探针中的至少一者用供体荧光部分和对应的受体部分进行标记。

进一步提供了含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸：选自SEQ ID NO:1-39的核苷酸序列，特别是含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸：SEQ ID NO:1至3和13至15的核酸序列或其互补序列，该寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。本公开还提供了一种寡核苷酸，其包括与SEQ ID NO:1-39中的一者具有至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％或95％等)序列同一性的核酸，特别是含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸：SEQ ID NO:1至3和13至15的核酸序列或其互补序列，该寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。一般来讲，本文公开的这些寡核苷酸可以为寡核苷酸引物核酸、寡核苷酸探针核酸等。在某些方面，寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸(例如，35个或更少的核苷酸、30个或更少的核苷酸、25个或更少的核苷酸、20个或更少的核苷酸、15个或更少的核苷酸等)。在一些方面，寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷酸，例如以相对于未修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。任选地，寡核苷酸包含至少一个标记和任选地至少一个猝灭剂部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包括至少一种保守修饰的变异。特定核酸序列的“保守修饰的变异”或简称为“保守变异”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的序列。本领域技术人员将认识到，在编码的序列中改变、添加或缺失单个核苷酸或小百分比的核苷酸(通常小于5％，更通常小于4％、2％或1％)的各个取代、缺失或添加是“保守修饰的变异”，其中所述改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。

一方面，扩增可以使用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。因此，供体荧光部分和受体部分，例如猝灭剂，沿着寡核苷酸探针的长度可以彼此相距不超过5至20个核苷酸(例如，在7或10个核苷酸内)。在另一方面，寡核苷酸探针包括允许形成二级结构的核酸序列。这种二级结构的形成可使得第一和第二荧光部分之间的空间临近。根据该方法，寡核苷酸探针上的第二荧光部分可以是猝灭剂。

本公开还提供了用于检测来自个体的生物学样品中疟疾寄生虫(诸如疟原虫)或疟疾寄生虫(诸如疟原虫)核酸的存在或不存在的方法。这些方法可用于检测血浆中疟疾寄生虫(诸如疟原虫)核酸的存在或不存在，用于血液筛查和诊断测试。此外，本领域技术人员可使用相同的测试来评定尿液和其他样品类型，以检测疟疾寄生虫(诸如疟原虫)核酸和/或对其进行定量。此类方法通常包括进行至少一个循环步骤，该循环步骤包括扩增步骤和染料结合步骤。通常，扩增步骤包括使样品与多对寡核苷酸引物接触以产生一种或多种扩增产物，如果核酸分子存在于样品的话，并且染料结合步骤包括使扩增产物与双链DNA结合染料接触。此类方法还包括检测存在或不存在双链DNA结合染料结合到扩增产物中，其中存在结合指示样品中存在疟疾寄生虫(诸如疟原虫)核酸，并且其中不存在结合指示样品中不存在疟疾寄生虫核酸。代表性的双链DNA结合染料是溴化乙锭。其他核酸结合染料包括DAPI、Hoechst染料、和花青染料，例如和Green。此外，此类方法还可包括确定扩增产物和双链DNA结合染料之间的解链温度，其中解链温度确认疟疾寄生虫(包括疟原虫)核酸的存在或不存在。

还提供了一种用于对疟疾寄生虫(诸如疟原虫)的一种或多种核酸进行检测和/或定量的试剂盒。该试剂盒可包括：对扩增基因靶标具有特异性的一组或多组寡核苷酸引物；和对检测扩增产物具有特异性的一种或多种可检测寡核苷酸探针。

在一个方面，该试剂盒可以包括已经用供体和相应的受体部分(例如，另一种荧光部分或黑暗猝灭剂)标记的寡核苷酸探针，或者可以包括用于标记探针的荧光部分。该试剂盒还可包括核苷三磷酸、核酸聚合酶、和核酸聚合酶功能所需的缓冲液。该试剂盒还可以包括使用寡核苷酸引物、寡核苷酸探针和荧光部分来检测样品中疟疾寄生虫(诸如疟原虫)核酸的存在或不存在的包装插页和说明。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本主题的实践或测试中，可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文合并于本文。如有歧义，以本专利说明书(包括定义)为准。

本发明的一个或多个实施方案的细节在附图和下面的说明书中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将从附图和详细描述以及权利要求中显而易见。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在提出请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有一幅或多幅彩色图式的本专利或专利申请公布的副本。

图1显示了针对来自恶性疟原虫的染色体5的18S rRNA靶标的初始候选物测定，如实例1中所讨论的。测试了18S rRNA基因组的四个不同区域，由映射的引物和探针指示。

图2A显示了针对对疟原虫物种以及巴贝虫(Babesia)的18S rRNA靶标的初始候选引物/探针的比对图，如实例1中所述的。图2A显示了取自已发表的PanDDT测定(Seilie等人，“Beyond Blood Smears:Qualification of Plasmodium 18S rRNA as a Biomarkerfor Controlled Human Malaria Infections,”Am.J.Trop.Med.Hyg.100(6):1466-1476(2019)(以下为“Seilie等人(2019)”)的引物和探针结合位点的位置，以及与巴贝虫和五种疟原虫物种比对的重新设计的正向引物区域和反向引物(PanDDT1238R/1262R)。在具有与巴贝虫的额外错配的区域中重新设计引物(参见图2B中的表)以消除交叉反应性。

图3显示了用重新设计的正向和反向引物与Seilie等人(2019)中的相同探针的不同组合测试的恶性疟原虫培养物洗脱物的实时PCR生长曲线。还测试了Seilie等人(2019)中的正向和反向引物与重新设计的引物的组合对18S rRNA靶标的检测，如实例1中所述的并如图1中所描绘的。一些特定的组合表现出与巴贝虫的交叉反应性(由星号表示)，并且其他组合显示出延迟的Ct值。这些组合被排除在未来的研究之外。这些研究证明，许多针对18S rRNA靶标的引物/探针设计有效检测和扩增来自全血洗脱物背景中恶性疟原虫培养物洗脱物中的18S rRNA靶标。

图4显示了针对恶性疟原虫的染色体5上的28S rRNA靶标映射的初始候选物测定，如实例2中所讨论的。测试了靶向28S rRNA的三种不同正向引物候选物、两种不同反向引物候选物和一种探针的组合。

图5显示了用引物/探针的候选物的组合针对检测28S rRNA靶标测试的恶性疟原虫培养物洗脱物的实时PCR生长曲线，如实例2中所述的并如图4中所描绘的。引物/探针组合中的两者表现出与巴贝虫的交叉反应性(由星号指示)。这些研究证明，许多靶向28SrRNA的引物/探针设计有效检测和扩增来自全血洗脱物背景中恶性疟原虫样品的28S rRNA靶标。

图6A显示了针对改善的RFI测试性能最佳的18S和28S候选引物/探针的修饰引物的结果，如实例3中所述的。所有引物/探针(未修饰或经修饰)的组合均显示出检测和扩增来自全血背景中恶性疟原虫培养物洗脱物的18S和28S rRNA靶标的能力。表现出最佳RFI的经修饰的18S和28S单靶标测定由星号表示。图6B显示了疟原虫18S/28S双靶标测定设计配置，如实例3中所述的。使18S和28S rRNA引物/探针在FAM通道中，并且使内部对照在Cy5.5通道中。特别地，理想的18S rRNA靶引物/探针对应于SEQ ID NO:1-3的核酸序列，并且理想的28S rRNA靶引物/探针对应于SEQ ID NO:13-15的核酸序列。值得注意的是，用于检测18SrRNA靶标的探针(即，具有SEQ ID NO:3的序列)源自用于与来自2019年出版物(Seilie等人,“Beyond Blood Smears:Qualification ofPlasmodium 18SrRNA as a Biomarker forControlled Human Malaria Infections,”Am.J.Trop.Med.Hyg.100(6):1466-1476(2019))的18S rRNA靶标进行杂交的探针。

总之，图7A和7B显示了用于映射到五种疟原虫物种(即，恶性疟原虫(AL844504.2)、间日疟原虫(18S XR_003001206.1和28SXR_003001202.1)、三日疟原虫(18SXR_003751948.1和28SXR_003751946.1)、卵形疟原虫wallikeri(18S和28S LT594514.1)(卵形疟原虫curtisi 18S和28S FLQU01002140.1)和诺氏疟原虫(LR701163.1))中每一者的18S和28S测定的引物和探针结合位点的位置。对于这两种测定，寡核苷酸下的区域是保守的并且使得能够检测所有五种疟原虫物种，如实例4中所述的。特别地，图7A显示了靶向疟原虫18S rRNA区域的候选寡核苷酸的比对，证明了对所有疟原虫物种的包容性。图7B显示了靶向疟原虫28S rRNA区域的候选寡核苷酸的比对，显示了对所有疟原虫物种的包容性。如图7A和图7B中可以看到的，其显示了候选双靶标测定引物/探针与靶标的比对，与单靶标测定相比，18S/28SrRNA双靶标测定提供了增加的包容性。

图8显示了用于如实例4中所述的18S/28S双靶标疟原虫测定以及另一现有的疟疾测定(此处标记为“cobas疟疾”)的引物和探针的映射，并且18S/28S双靶标疟原虫测定如实例4中所述。现有的cobas疟疾测定是一种非常不同的测定。现有的cobas疟疾测定是双靶标测定，其中两个靶标均在18S rRNA区域内。相比之下，18S/28S双靶标疟原虫测定是一种双靶标测定，其中第一靶标在18S rRNA区域中，并且第二靶标在28SrRNA区域中。

图9A、9B、9C、9D、9E和9F显示，与cobas疟疾测定相似，18S/28S双靶标测定可以在含有18S和28S rRNA靶标的小基因中检测所有五种疟原虫物种(其中针对18S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:1-3，并且针对28S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ IDNO:13-15)，如实例4中所述的。cobas疟疾测定检测18S rRNA中的两个靶标，而18S/28S双靶标测定检测18S和28S rRNA二者中的靶标。特别地，图9A显示了用于cobas疟疾测定以1E5拷贝测试的小基因和用于18S/28S双靶标测定以1E5至1E3拷贝测试的小基因的CT和RFI值(其中针对18SrRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:1-3，并且针对28S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:13-15)检测并扩增所有疟原虫物种(包括恶性疟原虫(由“Pf”标签表示)、间日疟原虫(由“Pv”标签表示)、卵形疟原虫(由“Po”标签表示)、诺氏疟原虫(由“Pk”标签表示)和三日疟原虫(由“Pm”标签表示))(所有拷贝数均使用NanoDrop微量分光光度计(ThermoFisher Scientific)来估计)。特别地，图9B显示了通过cobas疟疾(浅色)和18S/28S双靶标(深色)测定扩增的恶性疟原虫小基因的实时PCR生长曲线结果；图9C显示了通过cobas疟疾(浅色)和18S/28S双靶标(深色)测定扩增的间日疟原虫小基因的实时PCR生长曲线结果；图9D显示了通过cobas疟疾(浅色)和18S/28S双靶标(深色)测定扩增的三日疟原虫小基因的实时PCR生长曲线结果；图9E显示了通过cobas疟疾(浅色)和18S/28S双靶标(深色)测定扩增的卵形疟原虫小基因的实时PCR生长曲线结果；图9F显示了通过cobas疟疾(浅色)和18S/28S双靶标(深色)测定扩增的诺氏疟原虫小基因的实时PCR生长曲线结果。这些研究明确地证明，18S/28S rRNA双靶标疟原虫测定(其中针对18S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:1-3，并且针对28S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:13-15)能够检测五种疟原虫物种。

图10显示了来自使用人DNA、样品缓冲液和一些潜在交叉反应物质进行的18S/28SrRNA双靶标测定的特异性测试的结果，如实例5中所述的。这些研究显示，18S/28S rRNA双靶标测定不与测试的非疟原虫样品中的任一者反应(数据未显示)。也就是说，这些研究显示18S/28S rRNA双靶标测定对疟原虫具有特异性。因此，这些研究证明，18S/28S rRNA双靶标疟原虫测定(其中针对18S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:1-3，并且针对28SrRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:13-15)对疟原虫物种具有特异性，并且不会与巴贝虫、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、白色念珠菌(Candida albicans)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、HIV、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和西尼罗河病毒交叉反应。

图11A、11B和11C显示了来自使用恶性疟原虫和间日疟原虫培养物洗脱物进行的18S/28S rRNA双靶标疟原虫测定的灵敏度分析的结果，如实例6中所述的。图11A以表格形式描绘了数据，显示18S/28S rRNA双靶标测定足够灵敏以检测0.00224个寄生虫/ml(针对恶性疟原虫)(图11B)，和0.000536个寄生虫/ml(针对间日疟原虫)。(图11C)是有效的。图11B和图11C分别显示恶性疟原虫和间日疟原虫培养物洗脱物的实时PCR生长曲线。这些研究证明，18S/28S rRNA双靶标测定(其中针对18S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ IDNO:1-3，并且针对28S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:13-15)是一种非常灵敏的测定，其可以检测到测试样品中低至一个裂解的疟原虫寄生虫。

图12显示了来自用18S/28S rRNA双靶标疟原虫测定测试的两个疟原虫阳性临床样品的结果，如实例7中所述的。图12显示了18S/28S rRNA双靶标疟原虫测定能够从阳性临床样品中检测到恶性疟原虫和间日疟原虫核酸。因此，这些研究证明，18S/28S rRNA双靶标测定(其中针对18SrRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:1-3，并且针对28S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:13-15)能够从临床样品中检测到疟原虫。

具体实施方式

通过核酸扩增诊断疟疾寄生虫(诸如疟原虫)感染提供了一种用于快速、准确、可靠、特异性和灵敏地检测和/或定量疟疾寄生虫(诸如疟原虫)感染的方法。本文描述了用于检测和/或定量非生物学样品或生物学样品中的疟疾寄生虫核酸(包括DNA和/或RNA)的实时PCR测定。提供了用于检测和/或定量疟疾寄生虫(诸如疟原虫)的引物和探针，以及含有此类引物和探针的制品或试剂盒。与其他方法相比，实时PCR检测疟疾寄生虫(诸如疟原虫)的特异性和灵敏度提高，而且实时PCR具有改进的特征，包括样品容纳以及扩增产物的实时检测和定量，使该技术在临床实验室中用于疟疾寄生虫(诸如疟原虫)感染的常规诊断的实施变得可行。此外，该技术还可用于血液筛查和预后。该疟疾寄生虫(诸如疟原虫)检测测定也可与其他测定并行地多重使用以检测其他核酸，例如，其他细菌和/或病毒。

因此，开发了作为基于qPCR的测定的用于检测疟疾寄生虫的测定来检测以下疟原虫物种：血液样品中导致疟疾的恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫和三日疟原虫。该qPCR测定是为cobas6800/8800平台设计的。尽管美国被认为是非流行国家，但全球旅行可能导致输入性疟疾病例增加，从而影响血液供应。存在两种针对疟疾的策略可用于维持血液供应的安全：(1)选择性检测，以及(2)献血者延期。目前，美国对献血实行献血者延期政策，其中献血者根据其有关疟疾感染史、以前居住过流行国家以及去过流行国家的调查问卷回答而被延期。由于无论疟疾状况如何而基于问卷回答排除捐献，献血者延期对供血产生负面影响。另一方面，与献血者延期相比，选择性检测减少了对供血库存的影响。献血的选择性检测也基于问卷；然而，选择性检测政策允许根据献血者的疟疾状况缩短延期时间和使献血者恢复献血。在有选择性检测政策的国家，检测通过酶免疫测定法来完成。目前尚无可用于筛选献血的IVD核酸测试。与酶免疫测定相比，核酸测试在检测血液中的疟疾寄生虫方面更加灵敏。基于qPCR的测试的该测定的设计策略是靶向细胞内存在多个拷贝的基因。该测试靶向28S和18S核糖体RNA。并行检测多拷贝DNA和RNA靶标允许提高灵敏度。医院和血液中心可以使用这种qPCR测定来筛选所收集的献血中的疟疾。

本公开包括寡核苷酸引物和荧光标记的水解探针，它们与疟疾寄生虫(诸如疟原虫)基因组杂交以使用例如扩增和检测技术特异性鉴定疟疾寄生虫(诸如疟原虫)。

所公开的方法可包括进行至少一个循环步骤，该循环步骤包括使用一对或多对引物从样品扩增核酸分子基因靶标的一个或多个部分。如本文所用的“(一种或多种)疟原虫引物”是指与在疟疾寄生虫(诸如疟原虫)基因组中发现的核酸序列特异性退火并在适当条件下从其启动DNA合成从而产生相应扩增产物的寡核苷酸引物。在疟原虫物种和基因组中发现的核酸序列的实例包括靶标，诸如线粒体DNA靶区域(MT-1和MT-2)内的核酸、RNA重复序列R125以及18S核糖体RNA(18S rRNA)和28S核糖体RNA(28S rRNA)。所论述的疟原虫引物中的每个与靶标退火，使得每个扩增产物的至少一部分含有对应于靶标的核酸序列。如果样品中存在一种或多种核酸，则产生一种或多种扩增产物，因此一种或多种扩增产物的存在指示样品中存在疟原虫。扩增产物应含有与疟原虫的一种或多种可检测探针互补的核酸序列。如本文所用的“(一种或多种)疟原虫探针”是指与在疟原虫基因组中发现的核酸序列特异性退火的寡核苷酸探针。每个循环步骤包括扩增步骤、杂交步骤和检测步骤，其中使样品与一种或多种可检测疟原虫探针接触以检测样品中疟原虫的存在或不存在。

如本文所用，术语“扩增”是指合成与模板核酸分子(例如，来自疟原虫基因组的核酸分子)的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性，在低于引物解链温度的温度将引物与模板核酸退火，以及从引物酶促延伸以产生扩增产物。扩增通常需要存在脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶(例如，Taq)和适当的缓冲液和/或聚合酶最佳活性的辅助因子(例如，MgCl₂和/或KCl)。

本文所用术语“引物”为本领域的熟练专家所知，且指能够引发通过模板依赖性DNA聚合酶的DNA合成的寡聚化合物，主要指寡核苷酸，但也指经修饰的寡核苷酸，即例如引物的3'末端提供游离的3'-OH基团，其中另外“核苷酸”可以通过模板依赖性DNA聚合酶建立3'至5'磷酸二酯键合与其附接，由此使用脱氧核苷三磷酸且由此释放焦磷酸盐。

术语“杂交”是指一种或多种探针与扩增产物的退火。“杂交条件”通常包括低于探针的解链温度但避免探针的非特异性杂交的温度。

术语“5'到3'核酸酶活性”是指核酸聚合酶的活性，通常与核酸链合成相关，由此从核酸链的5'末端去除核苷酸。

术语“热稳定的聚合酶”是指热稳定的聚合酶，即为催化与模板互补的引物延伸产物的形成并且当处于升高的温度经历实现双链模板核酸变性所需的时间时没有不可逆地变性的酶。通常，合成在每个引物的3'末端处起始，并且沿着模板链以5'至3'方向前进。已从黄栖热菌(Thermus flavus)、红栖热菌(T.ruber)、嗜热栖热菌(T.thermophilus)、水生栖热菌(T.aquaticus)、乳栖热菌(T.lacteus)、红色栖热菌(T.rubens)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)分离出热稳定的聚合酶。然而，非热稳定的聚合酶也可用于PCR测定中，条件是补充该酶(如果必要)。

术语“其互补序列”是指与给定核酸具有相同长度并且与其完全互补的核酸。

当用于核酸时，术语“延伸”或“伸长”是指额外的核苷酸(或其他类似分子)掺入核酸时。例如，核酸任选地被掺入核苷酸的生物催化剂延伸，例如通常在核酸的3'末端添加核苷酸的聚合酶。

如本文所用，术语“相同”或百分比“同一性”指在两个或更多核酸序列的背景下，当对最大对应性比较和对准(例如，使用熟练人员可用的序列比较算法或通过目测来测量)时，两个或更多序列或子序列是相同的或具有特定百分比的相同核苷酸。适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的示例性算法是BLAST程序，其在例如以下中有描述：Altschul等人(1990)“Basic local alignment search tool”J.Mol.Biol.215:403-410，Gish等人(1993)“Identification of protein coding regions by database similaritysearch”Nature Genet.3:266-272，Madden等人(1996)“Applications of network BLASTserver”Meth.Enzymol.266:131-141，Altschul等人(1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation ofprotein database search programs”Nucleic AcidsRes.25:3389-3402和Zhang等人(1997)“PowerBLAST:A new network BLAST applicationfor interactive or automated sequence analysis and annotation”Genome Res.7:649-656，这些文献各自通过引用并入本文。

寡核苷酸上下文中的“修饰的核苷酸”是指这样的改变，其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸被不同的核苷酸替换，为寡核苷酸提供所需的特性。可在本文所述的寡核苷酸中被取代的示例性经修饰的核苷酸包括例如叔丁基苄基、C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2,6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基-dA、C7-炔丙基氨基-dG、7-脱氮-2-脱氧-黄苷、吡唑并嘧啶类似物、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2'-0-甲基核糖-U、2'-0-甲基核糖-C、N4-乙基-dC、N6-甲基-dA、5-丙炔基dU、5-丙炔基dC、7-脱氮-脱氧鸟苷(脱氮G(u-脱氮))等。可以在寡核苷酸中取代的许多其他修饰的核苷酸在本文中提及或在本领域中另外已知。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸取代相对于对应的未经修饰的寡核苷酸的解链温度修饰寡核苷酸的解链温度(Tm)。为了进一步说明，在一些实施方案中，某些修饰的核苷酸取代可以减少非特异性核酸扩增(例如，最小化引物二聚体的形成等)、增加预期靶标扩增子的产率等。这些类型的核酸修饰的实例描述于例如美国专利号6,001,611，其通过引用并入本文。其他修饰的核苷酸取代可以改变寡核苷酸的稳定性，或提供其他所需的特征。

疟疾寄生虫(包括疟原虫)靶核酸的检测/定量

本公开提供了通过扩增例如疟疾寄生虫(包括疟原虫)核酸序列的一部分来检测疟原虫的方法。具体地，通过本公开的实施方案提供了用于扩增和检测和/或定量疟原虫核酸分子靶标的引物和探针。

为了检测和/或定量疟疾寄生虫(包括疟原虫)，提供了用于扩增和检测/定量疟原虫的引物和探针。除了本文例举的那些核酸之外的疟原虫核酸也可用于检测样品中的疟原虫。例如，本领域技术人员可使用常规方法来评价功能性变体的特异性和/或灵敏度。代表性的功能变体可以包括例如本文公开的疟原虫核酸中的一个或多个缺失、插入和/或取代。

更具体地，寡核苷酸的实施方案各自包括具有选自SEQ ID NO:1-39、其基本上相同的变体的序列的核酸，特别是含有以下项或由以下项组成的寡核苷酸：SEQ ID NO:1至3和13至15的核酸序列，其中该变体与SEQ ID NO:1-39中的一者或SEQ ID NO:1-39和变体的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性。下表1显示了针对18S rRNA靶标的疟原虫测定中使用的寡核苷酸(引物和探针)。

表1：疟原虫测定(18S rRNA靶标)中使用的寡核苷酸(引物和探针)

下表2显示了针对28S rRNA靶标的疟原虫测定中使用的寡核苷酸(引物和探针)。

表2：疟原虫测定(28S rRNA靶标)中使用的寡核苷酸(引物和探针)

在一个实施方案中，使用上述疟原虫引物和探针组以便提供疑似含有疟原虫的生物学样品中的疟疾寄生虫(包括疟原虫)的靶向18S rRNA的检测(表1)。在一个实施方案中，使用上述疟原虫引物和探针组以便提供疑似含有疟原虫的生物学样品中的疟疾寄生虫(包括疟原虫)的靶向28S rRNA的检测(表2)。

在一个实施方案中，测定是双靶标测定，其中第一靶标是18S rRNA(使用来自表1的寡核苷酸)，并且第二靶标是28S rRNA(使用来自表2的寡核苷酸)。在此类双靶标测定中，在同一样品中同时检测两个靶标(18S rRNA和28S rRNA)。选择核糖体RNA靶标是因为它们以多个拷贝存在。此外，不同染色体上的rRNA序列虽然不相同但却是保守的。一般而言，靶向多于一个靶标的测定(诸如双靶标(或双重测定))比仅靶向单一靶标的测定(或单重测定)有利。特别地，并行检测多个拷贝靶标允许提高灵敏度。此外，并行检测多个拷贝靶标还降低任何一种单重测定因覆盖多个靶标而失败的风险。因此，本文提供的双靶标测定代表了对本领域、特别是单靶标测定领域的改进。

引物和探针组可以包含对疟疾寄生虫(包括疟原虫)的核酸序列具有特异性的引物和探针或者由这些引物和探针组成，这些引物和探针包含SEQ ID NO:1-39的核酸序列或者由这些核酸序列组成，特别是包含SEQ ID NO:1至3和13至15的核酸序列或由这些核酸序列组成。在另一个实施方案中，针对疟原虫靶标的引物和探针包含SEQ ID NO:1-39的引物和探针中的任一者的功能活性变体或者由该功能活性变体组成，特别是包含SEQ ID NO:1至3和13至15的核酸序列或由这些核酸序列组成。

可通过在所公开的方法中使用引物和/或探针来鉴定SEQ ID NO:1-39的任何引物和/或探针的功能活性变体。SEQ ID NO:1-39中任一者的引物和/或探针的功能活性变体涉及与SEQ ID NO:1-39的相应序列相比在所描述的方法或试剂盒中提供相似或更高特异性和灵敏度的引物和/或探针。

变体可例如由于一个或多个核苷酸添加、缺失或取代(诸如SEQ ID NO:1-39的相应序列的5’端和/或3’端的一个或多个核苷酸添加、缺失或取代)而与SEQ ID NO:1-39的序列不同。如上所述，引物和/或探针可以是经化学修饰的，即引物和/或探针可包括经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。探针(或引物)则是经修饰的寡核苷酸。“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)与天然“核苷酸”的不同之处在于一些修饰，但仍由碱基或碱基样化合物、戊呋喃糖基糖或戊呋喃糖基糖样化合物、磷酸部分或磷酸样部分或它们的组合组成。例如，可将“标记”附接到“核苷酸”的碱基部分，由此获得“经修饰的核苷酸”。“核苷酸”中的天然碱基也可被例如7-去氮杂嘌呤替换，由此也获得“经修饰的核苷酸”。术语“经修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换使用。“经修饰的核苷”(或“核苷类似物”)与天然核苷的不同之处在于以如上文针对“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)概述的方式进行的一些修饰。

可使用例如计算机程序诸如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.,Cascade,Colo.)来设计扩增编码疟原虫靶标的核酸分子(例如编码疟原虫替代部分的核酸)的寡核苷酸，包括经修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物。当设计用作扩增引物的寡核苷酸时，重要特征包括但不限于适当大小的扩增产物以便于检测(例如，通过电泳)、一对引物的成员的相似解链温度以及每个引物的长度(即，引物需要足够长以与序列特异性退火并启动合成，但不能太长以至于在寡核苷酸合成过程中保真度降低)。通常，寡核苷酸引物的长度为8至50个核苷酸(例如，长度为8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48个或50个核苷酸)。所公开的用于检测和扩增疟疾寄生虫(包括疟原虫)的引物包括SEQ ID NO:1、2、4-23、27、29和30-36。

除了一组引物之外，这些方法还可使用一个或多个探针以便检测疟原虫的存在或不存在。术语“探针”是指合成或生物产生的核酸(DNA或RNA)，其通过设计或选择而含有特定核苷酸序列，允许它们在定义的预定严格性下特异性(即优先性地)杂交到“靶核酸”，在本例中为疟原虫(靶)核酸。“探针”可以称为“检测探针”，意思是它检测靶核酸。

在一些实施方案中，所描述疟原虫探针可用至少一种荧光标记物进行标记。在一个实施方案中，疟原虫探针可用供体荧光部分(例如，荧光染料)和对应的受体部分(例如，猝灭剂)进行标记。在一个实施方案中，探针包括荧光部分或由其组成，并且核酸序列含有SEQ ID NO:3、24-26、28和37-39或由其组成。所公开的用于经由例如与扩增子杂交/退火来检测疟疾寄生虫(包括疟原虫)的探针包括SEQ ID NO:3、24-26、28和37-39。

设计用作探针的寡核苷酸可以以类似于设计引物的方式进行。实施方案可以使用单个探针或一对探针来检测扩增产物。根据实施方案，使用的探针可包含至少一种标记和/或至少一种猝灭剂部分。与引物一样，探针通常具有相似的解链温度，并且每个探针的长度必须足以发生序列特异性杂交，但不能太长以至于在合成过程中保真度降低。寡核苷酸探针的长度通常为15至40(例如，15、16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、39或40)个核苷酸。

构建体可包括载体，每个载体含有疟原虫引物和探针核酸分子(例如，SEQ ID NO:1-39)中的一者。构建体可用作例如对照模板核酸分子。适用的载体是市售的和/或通过本领域常规的重组核酸技术方法产生的。疟原虫核酸分子可以通过例如化学合成、从疟原虫直接克隆或通过核酸扩增获得。

除了疟原虫核酸分子以及/或者用于扩增和/或检测疟原虫的引物/探针(例如，含有SEQ ID NO:1-39中的一个或多个序列的核酸分子)之外，适用于这些方法的构建体通常还包括编码用于选择所需构建体和/或转化体的可选择标志物(例如，抗生素抗性基因)的序列以及复制起点。载体系统的选择通常取决于若干因素，包括但不限于宿主细胞的选择、复制效率、选择性、诱导性和回收的容易性。

含有疟原虫核酸分子以及/或者用于扩增和/或检测疟原虫的引物/探针的构建体可以在宿主细胞中繁殖。如本文所用，术语宿主细胞意在包括原核生物和真核生物，诸如酵母、植物和动物细胞。原核宿主可包括大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。真核宿主包括酵母(诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、毕赤酵母(Pichiapastoris))、哺乳动物细胞(诸如COS细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)、昆虫细胞和植物细胞(诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum))。可使用本领域普通技术人员公知的任何技术将构建体引入宿主细胞中。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热激、脂质转染、显微注射和病毒介导的核酸转移是将核酸引入宿主细胞中的常用方法。另外，可以将裸DNA直接递送至细胞(参见例如美国专利号5,580,859和5,589,466)。

聚合酶链式反应(PCR)

美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规的PCR技术。PCR通常采用两个寡核苷酸引物，其与所选核酸模板(例如DNA或RNA)结合。在一些实施方案中有用的引物包括能够充当所述疟原虫核酸序列(例如，SEQ ID NO:1、2、4-23、27、29和30-36)内的核酸合成起始点的寡核苷酸。引物可以通过常规方法从限制性消化物中纯化，或它可以合成产生。为了扩增中的最大效率，引物优先为单链的，但引物可以是双链的。首先将双链引物变性即处理以分离链。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。

如果模板核酸是双链的，则必须在它可以用作PCR中的模板前分离两条链。链分离可以通过任何合适的变性方法完成，包括物理、化学或酶促方法。分离核酸链的一种方法涉及加热核酸直至其多数变性(例如，变性大于50％、60％、70％、80％、90％或95％)。用于使模板核酸变性必需的加热条件将取决于例如缓冲液盐浓度以及变性核酸的长度和核苷酸组成，但通常范围在约90℃至约105℃范围内持续一段时间，这取决于反应特征，例如温度和核酸长度。变性通常进行约30秒至4分钟(例如，1分钟至2分钟30秒、或1.5分钟)。

如果双链模板核酸通过加热变性，则允许反应混合物冷却至促进每个引物退火至其靶序列的温度。退火温度通常为约35℃至约65℃(例如，约40℃至约60℃；约45℃至约50℃)。退火时间可为约10秒至约1分钟(例如，约20秒至约50秒；约30秒至约40秒)。然后将反应混合物调整至聚合酶的活性得到促进或最佳化的温度，即足以使延伸从退火引物发生，以生成与模板核酸互补的产物的温度。温度应足以从与核酸模板退火的每个引物合成延伸产物，但不应高到使延伸产物从其互补模板中变性(例如用于延伸的温度通常范围为约40℃至约80℃(例如约50℃至约70℃；约60℃)。延伸时间可为约10秒至约5分钟(例如，约30秒至约4分钟；约1分钟至约3分钟；约1分钟30秒至约2分钟)。

逆转录病毒或RNA病毒的基因组由核糖核酸即RNA组成。在这种情况下，模板核酸RNA必须首先通过逆转录酶的作用转录成互补DNA(cDNA)。逆转录酶使用RNA模板和与RNA3'末端互补的短引物来指导第一链cDNA的合成，其然后可以直接用作聚合酶链式反应的模板。

PCR测定可以采用疟原虫核酸，以及/或者扩增和/或检测疟原虫的引物/探针，诸如RNA或DNA(cDNA)。模板核酸不需要纯化；其可以是复杂混合物的一小部分，诸如人类细胞中含有的疟原虫核酸。疟原虫核酸分子和/或扩增和/或检测疟原虫的引物/探针可以通过常规技术从生物学样品中提取，诸如以下中描述的那些常规技术：Diagnostic MolecularMicrobiology:Principles andApplications(Persing等人(eds),1993,AmericanSociety for Microbiology,Washington D.C.)。核酸可以从许多来源获得，例如质粒，或天然来源，包括细菌、酵母、病毒、细胞器或高等生物，例如植物或动物。

寡核苷酸引物(例如，SEQ ID NO:1、2、4-23、27、29和30-36)在诱导引物延伸的反应条件下与PCR试剂组合。例如，链延伸反应通常包括50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3)、15mM MgCl₂、0.001％(w/v)明胶、0.5-1.0μg变性模板DNA、每个寡核苷酸引物50pmol、2.5UTaq聚合酶和10％DMSO)。反应通常包含150至320μM dATP、dCTP、dTTP、dGTP中的每一种或者其一种或多种类似物。

新合成的链形成双链分子，可用于反应的后续步骤。可根据需要重复多次链分离、退火和延长的步骤，以产生所需数量的对应于疟疾寄生虫(包括疟原虫)的靶核酸分子的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和核苷三磷酸的量。循环步骤(即变性、退火和延伸)优先重复至少一次。对于在检测中的使用，循环步骤的数目将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多循环步骤以扩增足以检测的靶序列。通常，循环步骤重复至少约20次，但可以重复多达40、60或甚至100次。

荧光共振能量转移(FRET)

FRET技术(例如，参见美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)基于这样一个概念：当供体荧光部分和相应的受体荧光部分位于彼此相距一定距离内时，能量转移发生在两个荧光部分之间，这可以可视化或以其他方式检测和/或定量。当供体被具有合适波长的光辐射激发时，供体通常将能量转移至受体。受体通常以具有不同的波长的光辐射的形式重新发射转移的能量。在某些系统中，非荧光能量可以通过包括基本上非荧光供体部分的生物分子在供体和受体部分之间转移(参见，例如，美国专利第7,741,467号)。

在一个实例中，寡核苷酸探针可以包含供体荧光部分或染料(例如，HEX或FAM)和相应的猝灭剂(例如，BlackHole Quencher^TM(BHQ)(例如BHQ-2))，其可以是也可以不是荧光的，并以光以外的形式耗散传递的能量。当探针完整时，能量转移通常发生在供体和受体部分之间，使得来自供体荧光部分的荧光发射被受体部分猝灭。在聚合酶链式反应的延伸步骤期间，结合至扩增产物的探针由例如Taq聚合酶的5'至3'核酸酶活性切割，使得供体荧光部分的荧光发射不再猝灭。为此目的的示例性探针在例如美国专利号5,210,015、5,994,056和6,171,785中有所描述。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的暗猝灭剂包括BlackHole Quenchers^TM(BHQ)(例如BHQ2)(BiosearchTechnologies,Inc.,Novato,Cal.)、Iowa Black^TM(Integrated DNA Tech.,Inc.,Coralville,Iowa)和BlackBerry^TMQuencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.,Dexter,Mich.)。

在另一个实例中，两个寡核苷酸探针(各自含有荧光部分)可在由寡核苷酸探针与疟原虫靶核酸序列的互补性决定的特定位置处与扩增产物杂交。在寡核苷酸探针在适当位置与扩增产物核酸杂交后，产生FRET信号。杂交温度可在从约35℃至约65℃的范围内，持续约10秒至约1分钟。

荧光分析可以使用例如光子计数落射荧光显微镜系统(包含适当的二向色镜和用于监测特定范围的荧光发射的滤光片)、光子计数光电倍增管系统或荧光计来进行。可以使用氩离子激光器、高强度汞(Hg)弧光灯、氙气灯、光纤光源或其他适当过滤以在所需范围内激发的高强度光源进行激发，以启动能量转移或允许直接检测荧光团。

如本文所用的关于供体和相应受体部分的“对应”是指受体荧光部分或暗猝灭剂，其吸收光谱与供体荧光部分的发射光谱重叠。受体荧光部分的发射光谱的最大波长应比供体荧光部分的激发光谱的最大波长至少大100nm。因此，可以在它们之间产生有效的非辐射能量传递。

通常选择荧光供体和相应的受体部分用于(a)高效Foerster能量转移；(b)大的最终斯托克斯位移(>100nm)；(c)将发射尽可能迁移到可见光谱的红色部分(>600nm)中；(d)将发射迁移至比在供体激发波长激发产生的拉曼水荧光发射更高的波长。例如，可以选择在激光线附近具有最大激发(例如，氦-镉442nm或氩气488nm)、高消光系数、高量子产率和其荧光发射与相应受体荧光部分的激发光谱的良好重叠的供体荧光部分。可选择具有高消光系数、高量子产率、其激发与供体荧光部分的发射的良好重叠以及在可见光谱的红色部分(>600nm)中的发射的对应的受体荧光部分。

可在FRET技术中与各种受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、荧光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、荧光黄VS、4-乙酰氨基-4'-异硫基-氰酸茋-2,2'-二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚氨基1-芘丁酸酯和4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸茋-2,2'-二磺酸衍生物。代表性受体荧光部分，取决于所用的供体荧光部分，包括LC Red 640、LC Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明x异硫氰酸酯、异硫氰酸赤藓红、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸盐或其他镧系离子的螯合物(例如铕或铽)。供体和受体荧光部分可以从例如MolecularProbes(Junction City,Oreg.)或Sigma Chemical Co.(St.Louis,Mo.)获得。

供体和受体荧光部分可以通过接头臂附接到合适的探针寡核苷酸上。每个接头臂的长度很重要，因为接头臂会影响供体和受体荧光部分之间的距离。接头臂的长度是以埃为单位的从核苷酸碱基到荧光部分的距离。通常，接头臂为约至约接头臂可以属于国际专利公开号WO 84/03285中所描述的种类。WO 84/03285还公开用于将接头臂附接至特定核苷酸碱基，以及用于将荧光部分连接至接头臂的方法。

受体荧光部分，例如LC Red 640，可以与包含氨基接头的寡核苷酸(例如，可从ABI(Foster City,Calif.)或Glen Research(Sterling,VA)获得的C6-氨基亚磷酰胺)组合以生产，例如LC Red 640标记的寡核苷酸。经常使用的将供体荧光部分(诸如荧光素)偶联至寡核苷酸的接头包括硫脲接头(FITC-衍生的，例如来自Glen Research或ChemGene(Ashland,Mass.)的荧光素-CPG's)、酰胺接头(荧光素-NHS-酯衍生的，诸如来自BioGenex(San Ramon,Calif.)的CX-荧光素-CPG)、或需要在寡核苷酸合成后偶联荧光素-NHS-酯的3'-氨基-CPGs。

疟原虫扩增产物(扩增子)的检测

本公开提供了用于检测生物学样品或非生物学样品中疟疾寄生虫(包括疟原虫)的存在或不存在的方法。提供的方法避免了样品污染、假阴性和假阳性的问题。这些方法包括执行至少一个循环步骤和FRET检测步骤，该至少一个循环步骤包括使用一对或多对疟原虫引物从样品扩增疟原虫靶核酸分子的一部分。进行多个循环步骤，优选在热循环仪中。这些方法可使用检测疟原虫的存在的疟原虫引物和探针来执行，并且检测到疟原虫指示样品中存在疟原虫。

如本文所述，可以使用利用FRET技术的标记杂交探针检测扩增产物。一种FRET形式利用技术来检测扩增产物的存在或不存在，并因此检测疟疾寄生虫(包括疟原虫)的存在或不存在。技术使用一种单链杂交探针，其标记有例如一种荧光部分或染料(例如HEX或FAM)和一种猝灭剂(例如BHQ-2)，其可以是也可以不是荧光的。当第一荧光部分用合适波长的光激发时，吸收的能量根据FRET原理转移至第二荧光部分或暗猝灭剂。第二荧光部分通常是猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤中，标记的杂交探针与靶标DNA(即扩增产物)结合，并在随后的延伸阶段被例如Taq聚合酶的5'至3'核酸酶活性降解。因此，荧光部分和猝灭剂部分变得彼此空间上分离。因此，在不存在猝灭剂的情况下的第一荧光部分激发后，可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。举例来说，7700Sequence Detection System(Applied Biosystems)使用技术，并且适用于执行本文所述的用于检测样品中疟疾寄生虫(包括疟原虫)的存在或不存在的方法。

也可以使用与FRET缀合的分子信标来检测使用实时PCR方法的扩增产物的存在。分子信标技术使用被第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分通常是猝灭剂，且荧光标记一般位于探针的每个末端处。分子信标技术使用具有允许二级结构形成(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。作为在探针内的二级结构形成的结果，当探针在溶液中时，两个荧光部分空间临近。在与靶核酸(即扩增产物)杂交以后，探针的二级结构被破坏，并且荧光部分变得彼此分离，从而使得在用合适波长的光激发后，可以检测第一荧光部分的发射。

FRET技术的另一种常见形式是使用两个杂交探针。每个探针都可以用不同的荧光部分标记，并且通常设计为在靶标DNA分子(例如，扩增产物)中彼此非常临近地杂交。供体荧光部分，例如荧光素，在470nm处被仪器的光源激发。在FRET期间，荧光素将其能量转移到受体荧光部分，例如-Red 640(LC Red 640)或-Red 705(LC Red 705)。然后受体荧光部分发出更长波长的光，由仪器的光学检测系统检测。只有当荧光部分直接局部临近，并且当供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时，有效的FRET才发生。发射信号的强度可与原始靶DNA分子的数量(例如，疟原虫基因组的数量)相关。如果疟原虫靶核酸发生扩增并产生扩增产物，则杂交步骤产生基于探针对成员之间的FRET的可检测信号。

通常，FRET的存在指示样品中存在疟原虫，并且FRET的不存在指示样品中不存在疟原虫。然而，样本采集不足、运输延迟、运输条件不当或使用某些采集拭子(海藻酸钙或铝轴)都是会影响测试结果的成功和/或准确性的条件。

可用于实施该方法的代表性生物学样品包括但不限于全血、呼吸道样本、尿液、粪便样本、血液样本、血浆、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤、和软组织感染。生物学样品的收集和储存方法是本领域技术人员已知的。可对生物学样品进行处理(例如，通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒)以释放疟原虫核酸，或者在一些情况下，可使生物学样品直接与PCR反应组分和适当的寡核苷酸接触。在一些例子中，生物学样品是全血。通常收集全血时，经常将其收集在含有抗凝剂(例如肝素、柠檬酸盐或EDTA)的容器中，这样可以将全血储存在合适的温度。然而，在这种情况下，全血中的核酸会发生大量降解。因此，将血液收集在将溶解、变性和稳定全血组分(包括核酸)的试剂中可能是有利的，例如核酸稳定溶液。在这种情况下，可以更好地保存和稳定核酸以用于后续的分离和分析，例如通过核酸测试，例如PCR。此类核酸稳定溶液是本领域众所周知的，包括但不限于，cobas PCR培养基，其包含4.2M胍盐(GuHCl)和50mM Tris，pH为7.5。

样品可以通过任何设计用于在分析前充分保持和储存样品的方法或设备来收集。此类方法和设备在本技术领域中是众所周知的。在样品是生物学样品例如全血的情况下，该方法或装置可以包括血液收集容器。这种血液收集容器在本领域中是众所周知的，并且可以包括例如血液收集管。在许多情况下，使用这样的血液收集管可能是有利的，其中血液收集管在用于样品摄取的空间中处于压力之下，例如具有真空室的血液容器，例如真空血液收集管。这种具有真空室的血液收集管，例如真空血液收集管在本领域中是众所周知的。将血液收集在具有或不具有真空室的血液收集容器中可能是进一步有利的，该容器包含将溶解、变性和稳定全血组分(包括核酸)的溶液，例如核酸-稳定溶液，使得被抽取的全血立即接触血液收集容器中的核酸稳定溶液。

解链曲线分析是可包含在循环曲线中的附加步骤。解链曲线分析基于DNA在称为解链温度(Tm)的特征温度下解链的事实，该解链温度被定义为一半DNA双链体分离成单链时的温度。DNA的解链温度主要取决于其核苷酸组成。因此，富含G和C核苷酸的DNA分子比具有丰富的A和T核苷酸的DNA分子具有更高的Tm。通过检测信号丢失的温度，可以确定探针的解链温度。类似地，通过检测产生信号的温度，可以确定探针的退火温度。来自疟原虫扩增产物的疟原虫探针的解链温度可证实样品中疟原虫的存在或不存在。

在每个热循环仪运行中，也可以循环控制样品。阳性对照样品可以使用例如对照引物和对照探针扩增靶核酸对照模板(不同于所述靶标基因的扩增产物)。阳性对照样品也可以扩增，例如，含有靶核酸分子的质粒构建体。此类质粒对照可在内部(例如，在样品内)扩增，或在与患者样品并排运行的单独样品中使用与用于检测预期靶标的相同的引物和探针进行扩增。此类对照是扩增、杂交和/或FRET反应成功或失败的指标。每个热循环仪运行还可以包括一个阴性对照，例如，缺少靶标模板DNA。阴性对照可以测量污染。这确保系统和试剂不会产生假阳性信号。因此，对照反应可以很容易地确定，例如，引物以序列特异性退火和启动延伸的能力，以及探针以序列特异性杂交和发生FRET的能力。

在一个实施方案中，该方法包括避免污染的步骤。例如，美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述了一种利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶促方法，以减少或消除一次热循环仪运行和下一次运行之间的污染。

可以使用结合FRET技术的常规PCR方法来实践这些方法。在一个实施方案中，使用仪器。以下专利申请描述了如技术中使用的实时PCR：国际专利公开号WO 97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。

可以使用PC工作站进行操作，并且可以使用Windows NT操作系统。当机器将毛细管按顺序放置在光学单元上时，可以获得来自样品的信号。软件可以在每次测量后立即实时显示荧光信号。荧光采集时间为10-100毫秒(msec)。在每个循环步骤之后，荧光与循环次数的定量显示可以针对所有样品不断更新。生成的数据可以存储以供进一步分析。

作为FRET的替代，使用双链DNA结合染料诸如荧光DNA结合染料(例如，Green或Gold(Molecular Probes))，可以检测扩增产物。在与双链核酸相互作用时，这样的荧光DNA结合染料在用合适波长的光激发后发射荧光信号。还可以使用双链DNA结合染料(诸如核酸)嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时，通常进行解链曲线分析用于证实扩增产物的存在。

本领域技术人员会理解，也可以采用其他核酸或信号放大方法。此类方法的实例包括但不限于分支DNA信号扩增、环介导等温扩增(LAMP)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自持序列复制(3SR)、链置换扩增(SDA)或智能放大过程版本2(SMAP 2)。

应当理解，本公开的实施方案不受一种或多种市售仪器的配置的限制。

制品/试剂盒

本公开进一步提供了用于检测疟疾寄生虫(包括疟原虫)的制品或试剂盒。制品可包括用于检测疟原虫基因靶标的引物和探针，以及合适的包装材料。用于检测疟原虫的代表性引物和探针能够与疟原虫靶核酸分子杂交。此外，试剂盒还可包括适当包装的DNA固定、杂交和检测所需的试剂和材料，例如固体支持物、缓冲剂、酶和DNA标准品。本文公开了设计引物和探针的方法，并且提供了扩增疟原虫靶核酸分子并与之杂交的引物和探针的代表性实例。

制品还可以包括一种或多种用于标记探针的荧光部分，可替代地，可以标记随试剂盒提供的探针。例如，制品可包括用于标记疟原虫探针的供体和/或受体荧光部分。上文提供了合适的FRET供体荧光部分和对应的受体荧光部分的实例。

制品还可含有包装说明书或包装标记，其上具有使用疟原虫引物和探针来检测样品中的疟原虫的说明。制品可另外包括用于实施本文公开的方法的试剂(例如，缓冲液、聚合酶、辅因子、或防止污染的药剂)。此类试剂可以专用于本文所述的市售仪器之一。

本公开还提供了用于检测样品中的疟疾寄生虫(包括疟原虫)的一组引物和一个或多个可检测探针。

本公开的实施方案将进一步在以下实例中描述，这些实例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实例

提供以下实例和附图以帮助理解本发明，本主题的真正范围在所附权利要求书中阐明。应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可对所阐述的程序进行修改。

该测试是全自动样品制备(核酸提取和纯化)，然后是PCR扩增和检测。使用的系统是6800/8800System，它由样品供应模块、转移模块、处理模块和分析模块组成。

靶核酸的选择性扩增通过使用选自靶核酸的高度保守区的特异性正向和反向引物来实现。热稳定性DNA聚合酶用于逆转录和扩增二者。主混合物包括脱氧尿苷三磷酸(dUTP)，而非脱氧胸苷三磷酸(dTTP)，后者被并入新合成的DNA(扩增产物或扩增子)中。PCR混合物中包括的AmpErase酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)在第一个热循环步骤中加热时会破坏来自先前PCR运行的任何污染扩增子。然而，新形成的扩增子没有被破坏，这是因为AmpErase酶一旦暴露于55℃以上的温度就会失活。

疟原虫主混合物含有对疟原虫和对照核酸具有特异性的检测探针。特异性疟原虫和对照检测探针各自用充当报告物的两种独特荧光染料中的一种进行标记。每个探针还具有充当猝灭剂的第二染料。报告物染料在定义的波长下测量，从而允许检测和区分扩增的疟原虫靶标和对照物。完整探针的荧光信号被猝灭剂染料抑制。在PCR扩增步骤期间，探针与特异性单链DNA模板的杂交导致DNA聚合酶的5'到3'核酸酶活性的切割，从而导致报告物染料和猝灭剂染料分离，并生成荧光信号。随着每个PCR循环，生成越来越多数量的经切割的探针，并且报告物染料的累积信号也随之增加。因为这两种特异性报告物染料是在定义的波长下测量的，所以可同时检测和区分扩增的疟原虫靶标和对照物。

疟原虫基因组的靶向区域是18S核糖体RNA和28S核糖体RNA。所公开的疟疾寄生虫测定被设计为泛疟疾测定，其能够检测以下疟原虫物种：恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫。该测定排除了与密切相关的物种(例如寄生虫和细菌)和人类具有同源性的靶序列，以及可能在各种测定试剂中发现的环境DNA。疟疾测定旨在检测样品，诸如生物学样品，诸如全血中的疟原虫物种。所公开的疟疾测定检测约1.1ml全血中的疟原虫物种。在一些情况下，将全血样品置于管/容器中，诸如真空管/容器，其在内部还含有试剂/溶液，该试剂/溶液将溶解、变性和稳定全血组分(包括核酸)，诸如核酸-稳定溶液，使得被抽取的全血立即接触血液收集容器中的核酸稳定溶液。所公开的具有SEQ IDNO:1和2的核酸序列的引物对以及所公开的具有SEQ ID NO:3和/或4的核酸序列的探针检测和/或扩增18S核糖体RNA靶标。所公开的具有SEQ ID NO:13和14的核酸序列的引物对以及所公开的具有SEQ ID NO:15的核酸序列的探针可检测和/或扩增28S核糖体RNA靶标。

因此，开发了作为基于qPCR的测定的用于检测疟疾寄生虫的测定来检测以下疟原虫物种：血液样品中导致疟疾的恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫和三日疟原虫。该qPCR测定是为cobas6800/8800平台设计的。尽管美国被认为是非流行国家，但全球旅行可能导致输入性疟疾病例增加，从而影响血液供应。存在两种针对疟疾的策略可用于维持血液供应的安全：(1)选择性检测，以及(2)献血者延期。目前，美国对献血实行献血者延期政策，其中献血者根据其有关疟疾感染史、以前居住过流行国家以及去过流行国家的调查问卷回答而被延期。由于无论疟疾状况如何而基于问卷回答排除捐献，献血者延期对供血产生负面影响。另一方面，与献血者延期相比，选择性检测减少了对供血库存的影响。献血的选择性检测也基于问卷；然而，选择性检测政策允许根据献血者的疟疾状况缩短延期时间和使献血者恢复献血。在有选择性检测政策的国家，检测通过酶免疫测定法来完成。目前尚无现在可用于筛选献血的IVD核酸检测。与酶免疫测定相比，核酸测试在检测血液中的疟疾寄生虫方面更加灵敏。基于qPCR的测试的该测定的设计策略是靶向细胞内存在多个拷贝的基因。该测试靶向28S和18S核糖体RNA。并行检测多拷贝DNA和RNA靶标允许提高灵敏度。医院和血液中心可以使用这种qPCR测定来筛选所收集的献血中的疟疾。

实例1：18S rRNA靶标测定的设计

使用来自ATCC的恶性疟原虫培养物(目录号30932)的恶性疟原虫测试18S rRNA靶核酸测定。考虑18S rRNA的基于出版物(Seilie等人,“Beyond Blood Smears:Qualification of Plasmodium 18S rRNA as a Biomarker for Controlled HumanMalaria Infections,”The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 100(6):1466-1476(2019)；Rougemont等人,“Detection ofFour Plasmodium Species inBlood from Humans by 18S rRNA Gene Subunit-Based and Species-Specific Real-Time PCR Assays,”Journal of Clinical Microbiology 42(12):5636-5643(2004)；Kamau等人,“Development of a Highly Sensitive Genus-Specific QuantitativeReverse Transcriptase Real-Time PCR Assay for Detection and QuantitationofPlasmodium by Amplifying RNA and DNA of the 18S rRNA Genes,”Journal ofClinical Microbiology 49(8):2946-2953(2011)；Waggoner等人,“Multiplex NucleicAcid Amplification Test for Diagnosis of Dengue Fever,Malaria,andLeptospirosis,”Journal of Clinical Microbiology 52(6):2011-2018(2014))四个不同区域，如图1中所描绘的。使用的试剂包括6800/8800通用PCR主混合物(PCRMaster Mix)，以及与6800/8800一起使用的配置文件和条件，并使用扩增和检测技术。预混液中寡核苷酸的最终浓度对于引物为0.3μM，并且对于探针为0.1μM。遍及这些实例中所采用的6800/8800 PCR配置文件在下表3中描绘：

表3

四个候选者中的每一者都用全血洗脱物背景中的恶性疟原虫ATCC培养物洗脱物进行评估。巴贝虫交叉反应性测试也同时进行(数据未显示)。在评估的四个候选区域中，靶向映射到恶性疟原虫3D7的染色体5上18S rRNA的1,290,600至1,290,800个碱基之间的区域的寡核苷酸显示出最高的RFI(数据未显示)，并被选择进行进一步评估。测试了另外几种重新设计的靶向映射到恶性疟原虫3D7的染色体5上18S rRNA的1,290,600至1,290,800个碱基之间的区域的候选寡核苷酸。这些候选寡核苷酸针对疟原虫物种以及巴贝虫进行映射，如图2中所描绘的。再次用全血洗脱物背景中的恶性疟原虫ATCC培养物测试重新设计的寡核苷酸的不同组合。结果在图3中所描绘的。如图3中所示，一些组合显示出与巴贝虫的高交叉反应性(由星号指示)。包含表示为1073F的正向引物和表示为1262R的反向引物的引物组显示出最高的RFI，同时未表现出与巴贝虫的交叉反应性。

因此，这些研究证明，针对18S rRNA靶标的许多候选引物/探针设计有效检测和扩增来自全血洗脱物环境中的疟原虫样品的18S rRNA靶标。

实例2：28S rRNA靶标测定的设计

使用来自ATCC的恶性疟原虫培养物(目录号30932)的恶性疟原虫测试28S rRNA靶核酸测定。如同实例1，使用的试剂包括6800/8800通用PCR主混合物，具有与6800/8800一起使用的配置文件和条件，并使用扩增和检测技术。预混液中寡核苷酸的最终浓度对于引物为0.3μM，并且对于探针为0.1μM。所采用的6800/8800PCR配置文件绘于下表3中。

测试了三种不同正向引物候选物、两种不同反向引物候选物和一种探针的组合，该组合靶向来自染色体5的28S rRNA区域，如图4中所描绘的。候选者中的每一者都用全血洗脱物背景中的恶性疟原虫和间日疟原虫(间日疟原虫数据未显示)ATCC培养物洗脱物进行评估。巴贝虫交叉反应性测试也同时进行(数据未显示)。这些研究显示，引物的所有组合均显示出检测和扩增恶性疟原虫和间日疟原虫的能力(间日疟原虫数据未显示)，如图5中所描绘的。然而，引物组合中的两者表现出与巴贝虫的交叉反应性(由图5中的星号指示)，并且没有被进一步考虑。

因此，这些研究证明，针对28S rRNA靶标的许多候选引物/探针设计有效检测和扩增来自全血洗脱物环境中的疟原虫样品的28S rRNA靶标。

实例3：用于改善性能的18S和28S rRNA候选引物/探针的修饰

如实例1和2中所讨论的，随后对针对18S和28S的候选引物/探针列表进行修饰以潜在地进一步改善和增强性能。为此，对引物进行修饰以评定是否可以改善性能。使用来自ATCC的恶性疟原虫培养物(目录号30932)的恶性疟原虫在单重测定中测试针对18S和28SrRNA靶标的修饰引物。如同实例1和2，使用的试剂包括6800/8800通用PCR主混合物，具有与6800/8800一起使用的配置文件和条件，并使用扩增和检测技术。预混液中寡核苷酸的最终浓度对于引物为0.3μM，并且对于探针为0.1μM。所采用的6800/8800 PCR配置文件绘于下表3中。

结果在图6A的流程图中。所有引物/探针组合均显示出检测和扩增来自全血背景中的培养物的18S或28S rRNA恶性疟原虫靶核酸的能力。因此，表现出最佳RFI的单靶标测定(由图6A中的星号表示)被选择在双靶标测定配置中进行进一步测试。双靶测定配置在图6B中描绘，该图显示了FAM通道中的18S和28S rRNA靶引物/探针，以及Cy5.5通道中的内部对照。理想的18S rRNA靶引物/探针对应于SEQ ID NO:1-3的核酸序列，并且理想的28SrRNA靶引物/探针对应于SEQ ID NO:13-15的核酸序列。值得注意的是，用于检测18S rRNA靶标的探针(即，具有SEQ ID NO:3的序列)源自用于与来自2019年出版物(Seilie等人,“Beyond BloodQualification of Plasmodium 18S rRNA as a Biomarker forControlled Human Malaria Infections,”Am.J.Trop.Med.Hyg.100(6):1466-1476(2019))的18S rRNA靶标进行杂交的探针。18S/28S rRNA双靶标疟原虫测定的序列在下表4中显示。

表4：18S/28S rRNA双靶标疟原虫测定的序列

因此，这些研究证明，针对18S rRNA靶标的经修饰引物/探针(对应于SEQ ID NO:1-3)和针对28S rRNA靶标的经修饰引物/探针(对应于SEQ ID NO:13-15)有效地检测和扩增分别来自全血环境中的恶性疟原虫培养物的18S和28S rRNA靶核酸。

实例4：包容性分析

选择核糖体RNA(rRNA)靶标18S和28S rRNA，因为它们以多个拷贝存在。在不同的疟原虫物种中，不同染色体上的rRNA序列是保守的，但并不相同，并且rRNA的表达取决于发育阶段。对于不太主要的物种，染色体rRNA表达尚未得到很好的表征。

使用生物信息学PLR工具进行计算机包容性分析。该分析的这些结果证明，对于所有疟原虫序列，18S rRNA靶标比28S rRNA靶标具有更多的保藏序列(数据未显示)。此外，预计该测定将覆盖18S和28S靶标中的大多数，其中包括A型和S型。事实上，已经确定，每个基因组有4-8个rRNA基因拷贝，如果预测一个拷贝失败，则其他拷贝将提供覆盖(数据未显示)。因此，如图7A和7B中可以看到的，其显示了候选双靶标测定引物/探针与靶标的比对，18S/28S rRNA双靶标测定提供了增加的包容性。

为了确认物种包容性，与现有的仅18S双靶标测定(即两个靶标均在18S rRNA区域中的双靶标测定)相比，通过验证性测定(即，本18S/28SrRNA双靶标测定，其中针对18SrRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:1-3，并且针对28S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:13-15)测试含有来自疟原虫(恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫)中每一物种的全长18S rRNA的小基因。图8显示了这两种不同测定的比对。结果在图9A中显示，其显示了确认本18S/28SrRNA双靶标测定(其中针对18S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:1-3，并且针对28S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQID NO:13-15)能够检测所有疟原虫物种(包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫)的数据。特别地，图9B显示了恶性疟原虫的结果；图9C显示了间日疟原虫的结果；图9D显示了三日疟原虫的结果；图9E显示了卵形疟原虫的结果；并且图9F显示了诺氏疟原虫的结果。

总而言之，这些研究明确地证明，本18S/28S rRNA双靶标测定(其中针对18S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:1-3，并且针对28S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:13-15)能够检测所有疟原虫物种。

实例5：仅针对疟原虫物种的18S/28S rRNA双靶标测定的特异性分析

已经证明本18S/28S rRNA双靶标测定(其中针对18S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:1-3，并且针对28S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:13-15)能够检测所有疟原虫物种，关键是确认本18S/28S rRNA双靶标测定不会表现出与其他非疟原虫靶标的交叉反应性。为此，用本18S/28S rRNA双靶标测定测试一组非疟原虫样品(包括巴贝虫、流感嗜血杆菌、白色念珠菌、痤疮丙酸杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、HIV、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和西尼罗河病毒)。这些研究显示18S/28S rRNA双靶标测定不与测试的非疟原虫样品中的任一者反应，如图10中所描绘的。

因此，这些研究证明，18S/28S rRNA双靶标测定(其中针对18S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:1-3，并且针对28S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:13-15)对疟原虫物种具有特异性，并且不会与巴贝虫、流感嗜血杆菌、白色念珠菌、痤疮丙酸杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、HIV、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和西尼罗河病毒中的任一者交叉反应。

实例6：18S/28S rRNA双靶标疟原虫测定的灵敏度分析

已经证明本18S/28S rRNA双靶标测定(其中针对18S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:1-3，并且针对28S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:13-15)能够特异性检测所有疟原虫物种，关键是分析18S/28S rRNA双靶标测定的灵敏度。为此，使用来自ATCC的恶性疟原虫和间日疟原虫培养物(目录号30932和30139)的核酸测试18S/28SrRNA双靶标测定，在cobas 6800/8800上提取该核酸，并且然后与全血洗脱物共混。然后对这些样品进行18S/28S rRNA双靶标测定。如同实例1-3，使用的试剂包括6800/8800通用PCR主混合物，具有与6800/8800一起使用的配置文件和条件，并使用扩增和检测技术。预混液中寡核苷酸的最终浓度对于引物为0.3μM，并且对于探针为0.1μM。所采用的6800/8800PCR配置文件绘于下表3中。

结果在图11A、11B和11C中描绘。图11A描述了数据，其显示18S/28S rRNA双靶标测定足够灵敏以检测0.000224个寄生虫/ml(针对恶性疟原虫)和0.0000536个寄生虫/ml(针对间日疟原虫)。图11B和图11C分别显示恶性疟原虫和间日疟原虫的PCR生长曲线。

因此，这些研究证明，18S/28S rRNA双靶标测定(其中针对18SrRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:1-3，并且针对28S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:13-15)是一种非常灵敏的测定，能够检测到甚至非常低量/水平的疟原虫物种。

实例7：利用疟原虫阳性临床样本进行18S/28S rRNA双靶标疟原虫测定的全过程

为了评定18S/28S rRNA双靶标疟原虫测定对实际临床样品是否有效，进行了全过程研究。在本研究中，采用已知疟原虫阳性的临床样品(经显微镜检查证实)，并对其进行18S/28S rRNA双靶标疟原虫测定。将这些疟原虫阳性临床样本在阴性全血中连续稀释。如同实例1-3和6，使用的试剂包括6800/8800通用PCR主混合物，具有与6800/8800一起使用的配置文件和条件，并使用扩增和检测技术。预混液中寡核苷酸的最终浓度对于引物为0.3μM，并且对于探针为0.1μM。所采用的6800/8800PCR配置文件在下表3中描绘。

结果在图12中描绘，其显示18S/28S rRNA双靶标疟原虫测定能够检测并扩增来自阳性临床样品的恶性疟原虫和间日疟原虫核酸。

因此，这些研究证明，18S/28S rRNA双靶标测定(其中针对18SrRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:1-3，并且针对28S rRNA靶标的引物/探针具有序列SEQ ID NO:13-15)能够从临床样品中检测到疟原虫。

因此，综上所述，这些实例和结果证明，SEQ ID NO:1-39的寡核苷酸组，特别是包含SEQ ID NO:1-3的引物/探针和具有包含SEQ ID NO:13-15的序列的引物/探针，特异性地且高效地扩增和检测全血中的疟疾寄生虫，包括疟原虫(包括恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫和三日疟原虫)。此外，这些实例和结果证明，在多重测定(诸如双靶标测定)中可以采用SEQ ID NO:1-39的寡核苷酸组，特别是包含SEQ ID NO:1-3的引物/探针和具有包含SEQ ID NO:13-15的序列的引物/探针，从而特异性地且灵敏地检测和扩增临床样品(诸如全血)中的所有疟原虫物种。

虽然为了清楚和理解的目的已经相当详细地描述了上述发，但是本领域技术人员通过阅读本公开将清楚，在不脱离本发明的真实范围的情况下，可在形式和细节上进行各种改变。例如，上述所有技术和设备可以以各种组合使用。本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文档全文以引用方式并入以用于所有目的，其程度如同每项单独的出版物、专利、专利申请和/或其他文档被单独地指示通过引用并入以用于所有目的。

Claims

1.一种用于检测样品中一种或多种疟疾寄生虫物种的方法，所述方法包括：

(a)执行扩增步骤，所述扩增步骤包括使所述样品与一组或多组寡核苷酸引物接触以产生扩增产物，如果所述一种或多种疟疾寄生虫物种的靶核酸存在于所述样品中的话；

(b)执行杂交步骤，所述杂交步骤包括使一种或多种寡核苷酸探针与所述扩增产物接触，如果所述一种或多种疟疾寄生虫物种的靶核酸存在于所述样品中的话；以及

(c)检测所述扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示所述样品中所述一种或多种疟疾寄生虫物种的存在，并且其中所述扩增产物的不存在指示所述样品中所述一种或多种疟疾寄生虫物种的不存在；并且

其中所述一组或多组寡核苷酸引物和所述一种或多种寡核苷酸探针包括：

(1)一组寡核苷酸引物，所述一组寡核苷酸引物包括含有SEQ ID NO:1和2的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸引物；以及含有SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸探针；和/或

(2)一组寡核苷酸引物，所述一组寡核苷酸引物包括含有SEQ ID NO:13和14的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸引物；以及

含有SEQ ID NO:15的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸探针。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种疟疾寄生虫物种属于疟原虫属。

3.根据权利要求2所述的方法，其中属于疟原虫属的所述一种或多种疟疾寄生虫物种为恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和/或诺氏疟原虫。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述样品为生物学样品。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述生物学样品为全血、呼吸道样本、尿液、粪便样本、血液样本、血浆、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤、或软组织感染。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物学样品为全血。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种寡核苷酸探针中的至少一者是经标记的。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述一种或多种寡核苷酸探针中的所述至少一者用供体荧光部分和对应的受体部分进行标记。

9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤(c)进一步包括检测所述一种或多种寡核苷酸探针的所述供体荧光部分与所述受体部分之间荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在指示所述样品中所述一种或多种疟疾寄生虫物种的存在或不存在。

10.一种用于检测样品中一种或多种疟疾寄生虫物种的第一靶核酸和/或第二靶核酸的方法，所述方法包括：

(a)执行扩增步骤，所述扩增步骤包括使所述样品与一组或多组寡核苷酸引物接触以产生扩增产物，如果所述一种或多种疟疾寄生虫物种的所述第一靶核酸和/或所述第二靶核酸存在于所述样品中的话；

(b)执行杂交步骤，所述杂交步骤包括使一种或多种寡核苷酸探针与所述扩增产物接触，如果所述一种或多种疟疾寄生虫物种的所述第一靶核酸和/或所述第二靶核酸存在于所述样品中的话；以及

(1)用于所述一种或多种疟疾寄生虫物种的所述第一靶核酸的一组寡核苷酸引物以及寡核苷酸探针，其中所述一组寡核苷酸引物包括含有SEQ ID NO:1和2的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸引物；并且其中所述寡核苷酸探针含有SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列；以及

(2)用于所述一种或多种疟疾寄生虫物种的所述第二靶核酸的一组寡核苷酸引物以及寡核苷酸探针，其中所述一组寡核苷酸引物包括含有SEQ ID NO:13和14的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸引物；并且其中所述寡核苷酸探针含有SEQ ID NO:15的核酸序列或其互补序列。

11.一种用于检测样品中一种或多种疟疾寄生虫物种的方法，所述方法包括：

(b)执行杂交步骤，所述杂交步骤包括使一种或多种寡核苷酸探针与所述扩增产物接触，如果所述一种或多种疟疾寄生虫物种的所述靶核酸存在于所述样品中的话；以及

其中所述一组或多组寡核苷酸引物和所述一种或多种寡核苷酸探针包括：一组寡核苷酸引物，所述一组寡核苷酸引物包括含有SEQ ID NO:1和2的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸引物；

以及含有SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸探针。

12.一种用于检测样品中一种或多种疟疾寄生虫物种的方法，所述方法包括：

其中所述一组或多组寡核苷酸引物和所述一种或多种寡核苷酸探针包括：一组寡核苷酸引物，所述一组寡核苷酸引物包括含有SEQ ID NO:13和14的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸引物；以及含有SEQ ID NO:15的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸探针。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述一种或多种疟疾寄生虫物种属于疟原虫属。

14.根据权利要求13所述的方法，其中属于疟原虫属的所述一种或多种疟疾寄生虫物种为恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和/或诺氏疟原虫。

15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述样品为生物学样品。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物学样品为全血、呼吸道样本、尿液、粪便样本、血液样本、血浆、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤、或软组织感染。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述生物学样品为全血。

18.根据权利要求10至17中任一项所述的方法，其中所述一种或多种寡核苷酸探针中的至少一者是经标记的。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种寡核苷酸探针中的所述至少一者用供体荧光部分和对应的受体部分进行标记。

20.一种用于检测可能存在于样品中的一种或多种疟疾寄生虫物种的试剂盒，所述试剂盒包括扩增试剂，所述扩增试剂包含DNA聚合酶和核苷酸单体中的至少一者，以及一组或多组寡核苷酸引物和一种或多种寡核苷酸探针，其中所述一组或多组寡核苷酸引物和所述一种或多种寡核苷酸探针包括：

含有SEQ ID NO:15的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸探针。

21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述一组或多组寡核苷酸引物和所述一种或多种寡核苷酸探针包括：

(1)一组寡核苷酸引物，所述一组寡核苷酸引物包括含有SEQ ID NO:1和2的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸引物；以及含有SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸探针；以及

含有SEQ ID NO:15的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸探针。

22.根据权利要求20至21中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种疟疾寄生虫物种属于疟原虫属。

23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中属于疟原虫属的所述一种或多种疟疾寄生虫物种为恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和/或诺氏疟原虫。

24.根据权利要求20至23中任一项所述的试剂盒，其中所述样品为生物学样品。

25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述生物学样品为全血、呼吸道样本、尿液、粪便样本、血液样本、血浆、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤、或软组织感染。

26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述生物学样品为全血。

27.根据权利要求20至26中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种寡核苷酸探针中的至少一者是经标记的。

28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述一种或多种寡核苷酸探针中的所述至少一者用供体荧光部分和对应的受体部分进行标记。

29.一种用于检测可能存在于样品中的一种或多种疟疾寄生虫物种的第一靶核酸和/或第二靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包括扩增试剂，所述扩增试剂包含DNA聚合酶和核苷酸单体中的至少一者，以及一组或多组寡核苷酸引物和一种或多种寡核苷酸探针，其中所述一组或多组寡核苷酸引物和所述一种或多种寡核苷酸探针包括：

30.一种用于检测可能存在于样品中的一种或多种疟疾寄生虫物种的试剂盒，所述试剂盒包括扩增试剂，所述扩增试剂包含DNA聚合酶和核苷酸单体中的至少一者，以及一组或多组寡核苷酸引物和一种或多种寡核苷酸探针，

其中所述一组或多组寡核苷酸引物和一种或多种探针包括：一组寡核苷酸引物，所述一组寡核苷酸引物包括含有SEQ ID NO:1和2的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸引物；以及含有SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列的寡核苷酸探针。

31.一种用于检测可能存在于样品中的一种或多种疟疾寄生虫物种的试剂盒，所述试剂盒包括扩增试剂，所述扩增试剂包含DNA聚合酶和核苷酸单体中的至少一者，以及一组或多组寡核苷酸引物和一种或多种寡核苷酸探针，

32.根据权利要求29至31中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种疟疾寄生虫物种属于疟原虫属。

33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中属于疟原虫属的所述一种或多种疟疾寄生虫物种为恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和/或诺氏疟原虫。

34.根据权利要求29至33中任一项所述的试剂盒，其中所述样品为生物学样品。

35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述生物学样品为全血、呼吸道样本、尿液、粪便样本、血液样本、血浆、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤、或软组织感染。

36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述生物学样品为全血。

37.根据权利要求29至36中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种寡核苷酸探针中的至少一者是经标记的。

38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述一种或多种寡核苷酸探针中的所述至少一者用供体荧光部分和对应的受体部分进行标记。