CN118184809B

CN118184809B - 罗布麻叶多糖及其制备方法和应用

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Publication number: CN118184809B
Application number: CN202410351140.7A
Authority: CN
Inventors: 绪扩; 付先军; 谢文丽; 李卉
Original assignee: Qingdao Academy Of Traditional Chinese Medicine Shandong University Of Traditional Chinese Medicine; Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Qingdao Academy Of Traditional Chinese Medicine Shandong University Of Traditional Chinese Medicine; Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2024-03-26
Filing date: 2024-03-26
Publication date: 2024-11-26
Anticipated expiration: 2044-03-26
Also published as: CN118184809A

Abstract

本发明属于中药活性提取物制备领域，涉及罗布麻叶多糖及其制备方法和应用。多糖AV1‑N1重均分子量64.1kDa，多分散指数2.317；其单糖组成岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、甘露糖醛酸的摩尔百分比分别为0.13％、40.23％、50.00％、2.05％、1.58％、1.41％、0.80％和3.80％。多糖AV2‑N1重均分子量58.8kDa，多分散指数1.753；其单糖组成岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸的摩尔百分比分别为：0.95％、50.04％、37.31％、0.95％、1.09％、0.68％、3.56％和5.42％。实验发现两种多糖均能够改善阿霉素引起的心力衰竭，具有抗心力衰竭的活性。

Description

罗布麻叶多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于中药活性提取物制备领域，涉及罗布麻叶多糖及其制备方法和应用，具体涉及到两种新的罗布麻叶多糖的提取与纯化，及其在防治心血管疾病方面的应用。

背景技术

心血管疾病(CVD)是严重危害我国人民群众健康和生命的重大疾病。2023年11月15日，国家卫生健康委牵头制定的《健康中国行动-心脑血管疾病防治行动实施方案(2023—2030年)》明确指出，要“实施危险因素控制，降低发病和死亡风险”，“强化关口前移，创新心脑血管疾病同防同治路径”。《中国心血管健康与疾病报告2022》数据显示，在我国城乡居民疾病死亡构成比中，CVD占首位。目前我国心力衰竭患者的主要病因是高血压和冠心病。因此，寻找疗效确切、副作用小的防治心力衰竭的药物，对提高患者生活质量至关重要。

罗布麻叶(Apocynum venetum L.)是临床治疗高血压的特色中药之一，自1977年开始被《中国药典》收录，2020版《中国药典》记载，罗布麻叶甘、苦，凉，归肝经，具有“平肝安神，清热利水”之功效，中医临床主要用于治疗肝阳眩晕，心悸失眠，浮肿尿少，即现代医学用语中的高血压病。当前，罗布麻叶制剂以单用为主，现已批准的55个中成药等品种的适应症也以高血压病居多。

罗布麻叶的主要活性成分为黄酮类小分子化合物，《中国药典》规定的罗布麻叶的指标成分金丝桃苷即为一种黄酮苷，具有较广泛的心血管相关活性报道。然而，当前罗布麻叶多糖类成分的研究不足，文献已报道的罗布麻叶多糖非常少。

青岛大学周金辉在其硕士毕业论文“罗布麻叶多糖提取及其生物活性的研究”中，采用酸(HCl)、碱(NaOH)和蒸馏水提取罗布麻叶多糖，研究了不同提取溶剂和提取温度对罗布麻叶多糖产率的影响；此外，还发现碱提取的罗布麻叶多糖的抗氧化能力和酶抑制活性最强。经小鼠活体实验发现罗布麻叶多糖对于治疗II型糖尿病，改善胰岛β细胞功能发挥着重要的作用；血脂谱的分析结果表明，罗布麻叶多糖对于改善血脂水平很有效果。东北师范大学魏柠柠在其硕士论文“罗布麻叶多糖的分离纯化、结构分析以及与半乳凝集素的相互作用”中，采用干燥的罗布麻叶经过热水煮提、乙醇沉淀和Sevag法脱蛋白得到罗布麻叶水溶性粗多糖ALP(5.8％)。ALP经过柱层析得到一个中性糖级分ALPN和两个酸性糖级分ALPA-1和ALPA-2，ALPA-1和ALPA-2进一步得到两个较均一的多糖组分ALPA-1a和ALPA-2a。在血细胞凝集阻抑实验中，ALPA-1b和ALPA-2a表现出明显的抑制血细胞凝集的活性。

中国专利CN109288856A提供了罗布麻叶多糖在制备降血糖和/或降血脂药物中的应用。CN112516014A公开了一种罗布麻提取物，有效成分包括罗布麻精油和罗布麻多糖，其中罗布麻多糖除了常见的锁水保湿功效外，还具有优良的抗氧化与抗紫外辐射作用，能够保护皮肤，隔绝外界的刺激、炎症及紫外线污染。CN112353733A公开了一种罗布麻发酵产物的发酵方法及其在抗炎化妆品中的应用，其提供的发酵方法使发酵液中有效成分罗布麻多糖含量高达0.56％，罗布麻发酵产物具有良好的体内抗炎活性。CN112494360A公开了一种罗布麻多糖提取物的提取方法、罗布麻多糖提取物及应用，其罗布麻多糖提取物具有良好的体内美白活性。CN109517087A公开了一种罗布麻叶多糖的制备方法，包括将罗布麻叶与提取液混合进行提取，得到提取物等步骤，以提高罗布麻叶多糖的产率，但是并没有涉及到罗布麻叶多糖的应用。

现有研究中，大多是针对罗布麻叶多糖等提取物的制备工艺的优化，其功效研究较少，在目前的功效研究中，又以罗布麻叶多糖的抗氧化、降血压、抗抑郁的活性研究居多，未见罗布麻叶多糖在防治心血管疾病方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了罗布麻叶多糖及其制备方法和应用，从中药罗布麻叶的提取物中发现了两个新的多糖，属于新化学成分，并通过实验发现这两个多糖具有抗心力衰竭活性。

本发明的技术方案是：

本发明提供了一种罗布麻叶多糖AV1-N1，所述多糖AV1-N1的重均分子量为64.1kDa，多分散指数为2.317；其单糖组成为岩藻糖Fuc、鼠李糖Ara、半乳糖Gal、葡萄糖Glc、木糖Xyl、甘露糖Man、核糖Rib和甘露糖醛酸Glc-UA，所述岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、甘露糖醛酸的摩尔百分比分别为0.13％、40.23％、50.00％、2.05％、1.58％、1.41％、0.80％和3.80％。

进一步的，所述多糖AV1-N1具有如下结构单元：

本发明还提供了一种罗布麻叶多糖AV2-N1，所述多糖AV2-N1的重均分子量为58.8kDa，多分散指数为1.753；其单糖组成为岩藻糖Fuc、鼠李糖Ara、半乳糖Gal、葡萄糖Glc、木糖Xyl、甘露糖Man、半乳糖醛酸Gal-UA和甘露糖醛酸Glc-UA，所述岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸的摩尔百分比分别为：0.95％、50.04％、37.31％、0.95％、1.09％、0.68％、3.56％和5.42％。

进一步的，所述多糖AV2-N1具有如下结构单元：

进一步的，上述罗布麻叶多糖AV1-N1和/或罗布麻叶多糖AV2-N1的制备方法，包括以下步骤：

(1)取烘干后的罗布麻叶粉碎过筛，加入无水乙醇常温超声提取，合并提取液，离心收集沉淀，向沉淀中加入适量纯水，60℃超声提取，再次合并提取液，离心，收集上清提取液，45℃减压浓缩提取液至原体积的1/10，加入4倍体积无水乙醇4℃环境下过夜醇沉，离心收集固体沉淀，即得到多糖粗提物；

(2)向多糖粗提物中加入适量纯水和木瓜蛋白酶，过夜酶解；然后加入适量三氯甲烷和正丁醇，充分搅拌混匀，收集上层水相；再加入适量石油醚，充分搅拌混匀，收集下层水相；最后，向水相中加入适量AB-8型大孔吸附树脂，充分混匀后，静置过夜；收集滤液，透析、冷冻干燥，得到罗布麻叶粗多糖；

(3)取适量粗多糖溶解于纯水中，配成浓度10mg/mL的多糖母液，离心取上清液，采用离子交换柱进行洗脱，收集洗脱液，经减压浓缩、透析、冷冻干燥，得到数个粗多糖组分；

(4)取离子柱纯化后的1个粗多糖加纯水，配成浓度15mg/mL的多糖母液，离心取上清液，采用凝胶柱层析柱进行洗脱，收集洗脱液，经减压浓缩、透析、冷冻干燥，得到多糖AV1-N1；采用同样操作，对离子柱纯化后的另一粗多糖组分进行凝胶柱层析，得到多糖AV2-N1。

进一步的，所述步骤(3)中采用DEAE seplife FF型阴离子交换柱，规格为26mm×400mm，依次采用纯水、0.1mol/L、0.2mol/L和0.3mol/L氯化钠溶液等梯度洗脱，流速4mL/min；所述步骤(4)中采用Sephacryl S-400HR型凝胶柱层析柱，规格为26mm×1000mm，采用纯水洗脱1.5倍柱体积，流速1mL/min。

本发明还提供了上述罗布麻叶多糖AV1-N1和/或罗布麻叶多糖AV2-N1在制备改善或治疗心力衰竭的药物中的应用。

本发明还提供了上述罗布麻叶多糖AV1-N1和/或罗布麻叶多糖AV2-N1在制备改善心力衰竭的食品、保健品中的应用。

本发明又提供了一种改善或治疗心力衰竭的药品，所述药品含有上述罗布麻叶多糖AV1-N1和/或罗布麻叶多糖AV2-N1。

斑马鱼模型在筛选心脏保护活性成分方面具有独特优势，斑马鱼心脏在结构、功能、信号通路和离子通道方面与人类心脏高度相似，血脂组成、代谢与人类的基本一致，且胚胎及其幼体近乎透明，心血管可视，可活体观察心跳、血管形成和血管病变。基于此，本发明制备两种罗布麻叶多糖，并评价了罗布麻叶多糖在改善阿霉素引起的心力衰竭的作用功效，为其临床应用提供科学依据。

本发明的有益效果：

本发明从中药罗布麻叶的提取物中进一步纯化得到2个新的罗布麻叶多糖AV1-N1和AV2-N1，通过纯度及分子量测定、单糖组成测试分别得到这两个多糖的分子量及单糖组成，其中多糖AV1-N1和AV2-N1的数均分子量分别为27.7和33.6kDa，峰值分子量分别为29.9和55.3kDa，重均分子量分别为64.1和58.8kDa，z均分子量分别为590.8和164.1kDa，多分散指数分别为2.317和1.753；多糖AV1-N1的单糖组成为岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、甘露糖醛酸；AV2-N1的单糖组成为岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和甘露糖醛酸；通过单糖甲基化测试、多糖核磁检测分别得到这两种多糖的糖苷键的类型和连接顺序，以及主链与支链的连接位点等结构信息，得到多糖的结构单元。本发明基于斑马鱼模型，对上述两种多糖在改善或治疗阿霉素引起的心力衰竭方面的功效进行实验，发现这两个多糖具有抗心力衰竭活性。

附图说明

图1为洗脱曲线；其中，(A)为离子柱洗脱曲线，(B)为AV1-N1凝胶柱洗脱曲线，(C)为AV2-N1凝胶柱洗脱曲线；

图2为分子构型分析图和绝对分子量分析图；其中，(A)为AV1-N1分子构型分析图；(B)为AV1-N1绝对分子量分析图；(C)为AV2-N1分子构型分析图；(D)为AV2-N1绝对分子量分析图；

图3为离子色谱图，其中，(A)为标准样品离子色谱图，(B)为AV1-N1样品离子色谱图，(C)为AV2-N1样品离子色谱图；

图4为甲基化GC/MS总离子流图，其中，(A)为AV1-N1样品的甲基化GC/MS总离子流图，(B)为AV2-N1的甲基化GC/MS总离子流图；

图5为AV1-N1和AV2-N1核磁谱图；

图6为多糖AV1-N1和AV2-N1的抗心衰活性结果；其中，(A)为各组斑马鱼典型的明场侧视图和心脏荧光图，(B)为心包面积统计图，(C)为心率统计图，(D)为短轴缩短率统计图，(E)为射血分数统计图，(F)为每搏输出量统计图，(G)为心搏量统计图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本发明，将结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1罗布麻叶多糖的提取与纯化

1、多糖的提取

取500g烘干后的罗布麻叶粉碎、过60目筛后，转移至圆底烧瓶中，加入适量无水乙醇常温超声提取3次，每次30min。合并提取液后，6000×g转速离心10min，收集沉淀，再取上述沉淀加入适量纯水，60℃超声提取3次，每次60min，合并提取液后，6000×g转速离心10min，收集上清提取液。45℃减压浓缩提取液至原体积的1/10，加入4倍体积无水乙醇4℃环境下过夜醇沉，然后，8000×g转速离心10min，收集固体沉淀，即得到多糖粗提物。

将粗提物加入适量纯水和木瓜蛋白酶，过夜酶解；然后，再加入适量三氯甲烷和正丁醇，充分搅拌混匀，收集上层水相；再加入适量石油醚，充分搅拌混匀，收集下层水相。最后，向水相中加入适量AB-8型大孔吸附树脂，充分混匀后，静置过夜。收集滤液，最后用3000Da透析袋透析48h后，将留下的液体进行冷冻干燥，得到罗布麻叶粗多糖6.92g，用硫酸苯酚法测得多糖含量为84.5％，备用。

2、多糖的纯化

取适量粗多糖溶解于纯水中，配成浓度10mg/mL的多糖母液；10000×g转速离心10min，取上清液在DEAE seplife FF型阴离子交换柱(26mm×400mm)上进行洗脱；依次采用纯水、0.1mol/L、0.2mol/L和0.3mol/L氯化钠溶液等梯度洗脱，流速4mL/min，每15mL收集1管，并依次编号。采用硫酸-苯酚法测定各管洗脱液的多糖含量，并绘制如图1(A)所示的离子纯化洗脱曲线。根据多糖含量测定结果，合并同一个洗脱峰对应的各收集管洗脱液，45℃减压浓缩至原体积的1/5，再用3000Da的透析袋透析48h，将留下的液体进行冷冻干燥，得到4个粗多糖组分，分别对应图1(A)上标号1、2、3、4的四个峰。

取离子柱纯化后的3号峰对应的粗多糖组分，加纯水，配成浓度15mg/mL的多糖母液；10000×g转速离心10min，取上清液在Sephacryl S-400HR型凝胶柱层析柱(26mm×1000mm)上进行洗脱，采用纯水洗脱1.5倍柱体积，流速1mL/min，每12mL收集1管，并依次编号。采用硫酸-苯酚法测定各管洗脱液的多糖含量，并绘制如图1(B)和图1(C)所示的凝胶纯化洗脱曲线。根据多糖含量测定结果，合并主峰对应的各收集管洗脱液，45℃减压浓缩至原体积的1/5，再用3000Da的透析袋透析48h，将留下的液体进行冷冻干燥，得到1个均一多糖(图1(B))，命名为AV1-N1，重量235.9mg。采用同样操作，对离子柱纯化后的4号峰对应的粗多糖组分进行Sephacryl S-400HR型凝胶柱层析，得到1个均一多糖(图1(C))，命名为AV2-N1，重量192.3mg。

实施例2多糖的纯度及分子量测定

采用凝胶色谱-示差-多角度激光光散射系统测定多糖的纯度及分子量，液相系统为U3000(Thermo)，配备Optilab T-rEX示差检测器(Wyatt technology)和DAWN HELEOSⅡ激光光散射检测器(Wyatt technology)；凝胶排阻色谱柱包括Ohpak SB-805HQ(300×8mm)、Ohpak SB-804HQ(300×8mm)、Ohpak SB-803HQ(300×8mm)串联。

首先，将样品溶解在0.1mol/L NaNO₃水溶液(含0.02％NaN₃，w/w)中，终浓度为1mg/mL，经0.45μm滤膜过滤后上机检测。进样量100μL，柱温45℃，流动相A为0.1mol/LNaNO₃水溶液(含0.02％NaN₃，w/w)，流速0.4mL/min，洗脱梯度：等度100min。

以检测的保留时间为横坐标，以摩尔质量为纵坐标绘制绝对分子量分析图；以摩尔质量为横坐标，以均方根半径为纵坐标绘制分子构型图。如图2所示为样品的绝对分子量分析图和分子构型分析图，其中，图2(A)为多糖AV1-N1的分子构型分析图，图2(B)为多糖AV1-N1的绝对分子量分析图，图2(C)为多糖AV2-N1的分子构型分析图，图2(D)为多糖AV2-N1的绝对分子量分析图。由图计算得知，多糖AV1-N1和AV2-N1的数均分子量(Mn)分别为：27.7和33.6kDa；峰值分子量(Mp)分别为：29.9和55.3kDa；重均分子量(Mw)分别为：64.1和58.8kDa；z均分子量(Mz)分别为：590.8和164.1kDa；多分散指数(Mw/Mn)分别为2.317和1.753。

实施例3单糖组成测试

色谱系统采用的是Thermo ICS5000离子色谱系统，利用电化学检测器对单糖组分进行分析检测。采用Dionex^TMCarboPac^TMPA20(150*3.0mm，10μm)液相色谱柱；进样量为5μl。流动相A为H₂O，流动相B为0.1mol/LNaOH，流动相C为0.1mol/LNaOH(含0.2M NaAc)，流速0.5mL/min；柱温为30℃；洗脱梯度：0min，A相/B相/C相(95：5：0，V/V/V)；26min，A相/B相/C相(85：5：10，V/V/V)；42min，A相/B相/C相(85：5：10，V/V/V)；42.1min，A相/B相/C相(60：0：40，V/V/V)；52min，A相/B相/C相(60：40：0，V/V/V)；52.1min，A相/B相/C相(95：5：0，V/V/V)；60min，A相/B相/C相(95：5：0，V/V/V)。

称取适量的AV1-N1和AV2-N1多糖样品，加入1mL 2mol/LTFA酸溶液，121℃加热2小时，通氮气，吹干；加入99.99％甲醇清洗，再吹干，重复甲醇清洗2～3次。加入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测。再分别准确称取所需的如表1所示的各单糖标准品后，加入水配成10mg/mL标准溶液母液单标，然后取适量标准品母液单标混合配制成最高指标浓度为50μg/mL的标准品混标，然后分别稀释至25μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL和0.5μg/mL系列浓度。

采用外标法定量，通过配制不同浓度标样来制定标准曲线。以横坐标为保留时，纵坐标为响应值，得到如图3所示的标准样品离子色谱图和样品离子色谱图。其中，图3(A)为标准样品离子色谱图，图3(B)为多糖AV1-N1离子色谱图，图3(C)为多糖AV2-N1离子色谱图。

单糖标准曲线和AV1-N1和AV2-N1的测量值如表1所示：

表1单糖标曲信息汇总和AV1-N1和AV2-N1多糖样品的分子量

实施例4单糖甲基化测试

本实施例所用分析仪器为安捷伦7890A-5977B气质联用仪，自动进样器型号为G4567A。色谱系统采用的是Agilent气相色谱系统Agilent 7890A，色谱柱：BPX70(30m×0.25mm×0.25μm，SGE)。进样量为1μl，分流比10:1，载气为高纯氦气；柱温箱的初始温度为140℃保持2.0min，以3℃/min程序升温至230℃，保持3min。

质谱系统采用的是美国Aiglent公司的四极杆质谱检测系统Agilent 5977B，配有电子轰击离子源(EI)和MassHunter工作站。采用电子轰击离子源(EI)，分析物在全扫描(SCAN)模式下进行检测，质量扫描范围(m/z)：50～350。

取2～3mg的AV1-N1和AV2-N1多糖样品，加入500μl DMSO溶解。加入1mg NaOH，孵育30min，加入50μl碘甲烷溶液反应1h，加入1mL水和2mL二氯甲烷，涡旋混匀，离心，弃水相。重复水洗3次，吸取下层二氯甲烷相并用氮气吹干。加入100μl 2M TFA，121℃反应90min；30℃蒸干。加入50μl 2M氨水，50μl 1M NaBD₄，混匀，室温下反应2.5h。加入20μl乙酸终止反应，氮气吹干，250μl甲醇洗两次，氮气吹干。加入乙酸酐250μl，涡旋混匀，100℃反应2.5h。加入1mL水静置10min；加入500μl二氯甲烷，涡旋混匀，离心，弃水相，重复水洗3次；取下层二氯甲烷相，GC-MS上机检测，得到如图4所示的AV1-N1和AV2-N1的甲基化GC/MS总离子流图。

AV1-N1和AV2-N1的键合结构分析结果如表2所示：

表2多糖样品键合结构分析结果

注：*相对摩尔量＝峰面积/分子量；*相对摩尔比(％)＝相对摩尔量/各组分相对摩尔量总和。

实施例5多糖的核磁检测

采用布鲁克600MHz核磁共振波谱仪对目标物进行定量分析，扫描温度为25℃。液体探头QXI 1H/31P/13C/15N 5mm四共振反向检测探头(Z-gradient，ATMAcc)，技术参数：信噪比(1H)：888；分辨率(Hz)：0.32(rotating)BBFO 1H-19F，31P-15N，1H decoupling/observe多核正向检测探头(Z-gradient，ATM)。技术参数：信噪比(1H)：798；分辨率(Hz)：0.26(rotating)；信噪比(13C):328；分辨率(Hz):0.1。

取适量AV1-N1多糖样品充分溶解至D₂O中，配制成浓度大于等于40mg/mL多糖溶液。将溶解后溶液转移至核磁管中，加入量0.5mL。将核磁管放入核磁共振波谱仪中扫描一维¹H谱、¹³C谱，HSQC和HMBC谱图，如图5所示。

结合一维NMR和二维NMR谱图，对AV1-N1多糖样品的糖残基信号进行归属，如下表：

表3AV1-N1各糖残基¹H和¹³C的化学位移

根据AV1-N1样品中各糖残基¹³C和¹H的化学位移，结合HMBC谱图分析该多糖中结构片段的连接方式：糖残基A-H1与残基B-C3存在交叉峰δ5.17/80.24ppm，糖残基A-C1与残基B-H3存在交叉峰δ109.28/3.68ppm。糖残基B-H1与残基B-C6存在交叉峰δ4.42/69.49ppm，与残基C-C6存在交叉峰δ4.42/69.41ppm。糖残基B-C1与残基E-H5存在交叉峰δ103.41/3.82ppm(交叉峰信号比较微弱)。糖残基D-H1与残基B-C6存在交叉峰δ4.46/69.49ppm。糖残基E-H1与残基D-C3存在交叉峰δ5.02/81.98ppm。结合NOESY谱图进一步判断验证该多糖中各残基的连接顺序，糖残基A-H1与残基B-H3存在交叉峰δ5.17/3.68ppm。糖残基B-H1与残基B-H6存在交叉峰δ4.42/3.87ppm，与残基C-H6存在交叉峰δ4.42/3.86ppm。糖残基C-H1与残基B-H6存在交叉峰δ4.62/3.98ppm，与残基C-H6存在交叉峰δ4.62/3.86ppm。糖残基D-H1与残基B-H6存在交叉峰δ4.46/3.87ppm。因此，综合一维核磁和二维核磁信息分析，推断出该多糖主链主要是由→6)-β-D-Galp-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→和少量→5)-α-L-Araf-(1→组成，支链主由α-L-Araf-(1→连接在糖残基→3,6)-β-D-Galp-(1→的O-3位置构成。结合键合结构(甲基化)信息，推断该多糖链的结构为：

结合一维NMR和二维NMR谱图，对AV2-N1多糖样品的糖残基信号进行归属，如下表：

表4AV2-N1各糖残基¹H和¹³C的化学位移

根据AV2-N1样品中各糖残基¹³C和¹H的化学位移，结合HMBC谱图分析该多糖中结构片段的连接方式：糖残基A-H1与残基B-C3存在交叉峰δ5.17/80.1ppm。糖残基B-H1与残基B-C6存在交叉峰δ4.44/69.18ppm。糖残基C-H1与残基B-C6存在交叉峰δ4.67/69.18ppm，与残基C-C4存在交叉峰δ4.67/79.12ppm；糖残基C-C1与残基C-C4存在交叉峰δ100.79/3.51ppm。结合NOESY谱图进一步判断验证该多糖中各残基的连接顺序，糖残基A-H1与残基B-H3存在交叉峰δ5.17/3.66ppm。糖残基B-H1与残基B-H6存在交叉峰δ4.44/3.85ppm。糖残基C-H1与残基C-H4存在交叉峰δ4.67/3.51ppm。因此，综合一维核磁和二维核磁信息分析，推断出该多糖主要是由→3,6)-β-D-Galp-(1→的O-6和→4)-β-D-Galp-(1→相互连接组成，支链主由α-L-Araf-(1→连接在糖残基→3,6)-β-D-Galp-(1→的O-3位置构成。结合键合结构(甲基化)信息，推断该多糖链的结构为：

实施例6多糖改善或治疗阿霉素诱导的心力衰竭活性

选取3dpf野生型AB系健康斑马鱼，置于24孔板中，每孔10条。设置用于对照的空白组和10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL六个浓度的多糖给药组。孵育24h，拍照观察，统计各组斑马鱼畸形率和死亡率，根据安全浓度确定后续活性评价实验给药浓度。结果发现，与空白组相比，10-800μg/mLAV1-N1和AV2-N1均未造成斑马鱼畸形或死亡。可选用800μg/mL以下浓度作为活性评价给药浓度。

选择心脏荧光标记的转基因斑马鱼Tg(cmLc2:EGFP)，将2dpf健康斑马鱼转移至24孔板中，每孔10条，分为空白组、模型组(60μM阿霉素DOX)、阳性药组(200μM右雷佐生DXZ)，以及DOX与多糖联合给药组(AV1-N1和AV2-N1给药的终浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)。避光孵育24h后，在显微镜明场下拍照，观察各组斑马鱼心率、心包面积，并进行统计分析。在倒置荧光显微镜下观察并记录各组斑马鱼心跳视频，提取舒张末期和收缩末期图像，计算心室短轴缩短率、每搏输出量和射血分数。

如图6(A)所示，阿霉素处理组(DOX)斑马鱼心包水肿面积显著增大，心率显著降低，心室短轴缩短率、每搏输出量和射血分数显著降低，说明造造模成功。

如图6(B)所示，DOX与多糖联合给药组(Sugars)中，50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的AV1-N1和AV2-N1均能明显改善阿霉素引起的斑马鱼心包水肿，且呈剂量依赖性；200μg/mL的AV2-N1甚至要优于阳性药右雷佐生(DXZ)。

如图6(C)所示，50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的AV1-N1和AV2-N1均能明显提高心率，AV2-N1的改善作用呈剂量依赖性，100μg/mL和200μg/mL的AV2-N1甚至要优于阳性药右雷佐生。

如图6(D)所示，阳性药右雷佐生、AV1-N1和AV2-N1对短轴缩短率的改善作用都不显著。

如图6(E)所示，50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的AV1-N1和AV2-N1均能明显改善阿霉素引起的射血分数降低，100μg/mL的AV2-N1甚至要优于阳性药右雷佐生。

如图6(F)所示，50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的AV1-N1和AV2-N1均能改善阿霉素引起的每搏输出量降低，但效果均弱于阳性药右雷佐生。

如图6(G)所示，50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的AV1-N1和AV2-N1均能改善阿霉素引起的心搏量降低，与模型组相比，100μg/mL、200μg/mL浓度下有显著性差异，但效果均弱于阳性药右雷佐生。

综合以上信息，显示罗布麻叶多糖AV1-N1和AV2-N1可明显改善阿霉素诱导的心力衰竭，针对阿霉素诱导的心力衰竭的治疗效果显著，具有潜在的临床应用价值。

上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种罗布麻叶多糖AV1-N1，其特征在于，所述多糖AV1-N1的重均分子量为64.1kDa，多分散指数为2.317；其单糖组成为岩藻糖Fuc、鼠李糖Ara、半乳糖Gal、葡萄糖Glc、木糖Xyl、甘露糖Man、核糖Rib和甘露糖醛酸Glc-UA，所述岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、甘露糖醛酸的摩尔百分比分别为0.13％、40.23％、50.00％、2.05％、1.58％、1.41％、0.80％和3.80％。

2.根据权利要求1所述的罗布麻叶多糖AV1-N1，其特征在于，所述多糖AV1-N1具有如下结构单元：

3.一种罗布麻叶多糖AV2-N1，其特征在于，所述多糖AV2-N1的重均分子量为58.8kDa，多分散指数为1.753；其单糖组成为岩藻糖Fuc、鼠李糖Ara、半乳糖Gal、葡萄糖Glc、木糖Xyl、甘露糖Man、半乳糖醛酸Gal-UA和甘露糖醛酸Glc-UA，所述岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸的摩尔百分比分别为：0.95％、50.04％、37.31％、0.95％、1.09％、0.68％、3.56％和5.42％。

4.根据权利要求3所述的罗布麻叶多糖AV2-N1，其特征在于，所述多糖AV2-N1具有如下结构单元：

5.权利要求1所述的罗布麻叶多糖AV1-N1和/或权利要求3所述的罗布麻叶多糖AV2-N1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取烘干后的罗布麻叶粉碎过筛，加入无水乙醇常温超声提取，合并提取液，离心收集沉淀，向沉淀中加入纯水，60℃超声提取，再次合并提取液，离心，收集上清提取液，45℃减压浓缩提取液至原体积的1/10，加入4倍体积无水乙醇4℃环境下过夜醇沉，离心收集固体沉淀，即得到多糖粗提物；

(2)向多糖粗提物中加入纯水和木瓜蛋白酶，过夜酶解；然后加入三氯甲烷和正丁醇，充分搅拌混匀，收集上层水相；再加入石油醚，充分搅拌混匀，收集下层水相；最后，向水相中加入AB-8型大孔吸附树脂，充分混匀后，静置过夜；收集滤液，透析、冷冻干燥，得到罗布麻叶粗多糖；

(3)取粗多糖溶解于纯水中，配成浓度10mg/mL的多糖母液，离心取上清液，采用离子交换柱进行洗脱，收集洗脱液，经减压浓缩、透析、冷冻干燥，得到4个粗多糖组分；

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中采用DEAE seplife FF型阴离子交换柱，规格为26mm×400mm，依次采用纯水、0.1mol/L、0.2mol/L和0.3mol/L氯化钠溶液等梯度洗脱，流速4mL/min；所述步骤(4)中采用Sephacryl S-400HR型凝胶柱层析柱，规格为26mm×1000mm，采用纯水洗脱1.5倍柱体积，流速1mL/min。

7.权利要求1-2任一项所述的罗布麻叶多糖AV1-N1和/或权利要求3-4任一项所述的罗布麻叶多糖AV2-N1在制备改善或治疗心力衰竭的药物中的应用。

8.权利要求1-2任一项所述的罗布麻叶多糖AV1-N1和/或权利要求3-4任一项所述的罗布麻叶多糖AV2-N1在制备改善心力衰竭的食品、保健品中的应用。

9.一种治疗心力衰竭的药品，其特征在于，所述药品含有权利要求1-2任一项所述的罗布麻叶多糖AV1-N1和/或权利要求3-4任一项所述的罗布麻叶多糖AV2-N1。