CN118178640A - 含有牛分枝杆菌表面多糖的佐剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开含有牛分枝杆菌表面多糖的佐剂及其应用，所述佐剂包括：牛分枝杆菌表面多糖，所述牛分枝杆菌表面多糖包含：LAM多糖，以及LM多糖和/或PIMs多糖。本发明的佐剂可提高疫苗抗原组分的免疫效应、安全性好。由此，本发明的佐剂能进一步提高疫苗的预防和/或治疗效果，应用前景广阔。

Description

含有牛分枝杆菌表面多糖的佐剂及其应用

技术领域

本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及含有牛分枝杆菌表面多糖的佐剂及其应用。

背景技术

结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)引起的一种危害极大的慢性消耗性传染病。牛结核病(Bovine Tuberculosis)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis，M.bovis)引起的一种人兽共患的慢性传染病，以组织器官的结核结节性肉芽肿和干酪样、钙化的坏死病灶为特征。BCG(卡介苗)作为WHO目前唯一批准的预防结核病的疫苗，对婴儿及青少年具有保护作用，但是对成年人的保护作用并不明确。由此，亟需开发更加有效的新型结核病疫苗及免疫佐剂。

纯化后的BCG糖脂作为ELISA检测方法中的包被抗原，用于测定结脑CSF中特异性IgG，敏感性强。尚未见BCG糖脂用于疫苗佐剂的报道。由此，迫切需要加强疫苗免疫效应的新佐剂的研发。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了含有牛分枝杆菌表面多糖的佐剂及其应用，本发明的含有牛分枝杆菌表面多糖的佐剂可提高疫苗抗原组分的免疫效应、安全性好，由此，本发明的佐剂能进一步提高疫苗的预防和/或治疗效果，应用前景广阔。

需要声明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

发明人通过脱脂、脱蛋白、DNA、RNA等处理，从BCG菌体中得到了BCG表面多糖提取物。经鉴定，该BCG表面多糖提取物为包含LAM、LM、PIMs三种多糖的高纯提取物。将该BCG表面多糖提取物用于加强BCG(卡介苗)和AL(结核病亚单位疫苗)的免疫效应，意外发现，免疫后小鼠生存力无影响，安全性高而且能降低牛分枝杆菌在小鼠肺部的细菌载量。

进一步地，发明人将该BCG表面多糖提取物与铝佐剂混合交联，得到了一种复合佐剂，并用该复合佐剂免疫小鼠发现，BCG的免疫效应显著提高，试验小鼠生存力无影响，安全性好。

因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种佐剂。根据本发明的实施例，所述佐剂包括：牛分枝杆菌表面多糖，所述牛分枝杆菌表面多糖包含：LAM多糖，以及LM多糖和/或PIMs多糖。根据本发明实施例的佐剂可提高疫苗抗原组分的免疫效应，安全性好，由此，本发明的佐剂能进一步提高疫苗的预防和/或治疗效果，应用前景广阔。

在本发明的第二方面，本发明提出了前述牛分枝杆菌表面多糖在制备佐剂中的用途，所述牛分枝杆菌表面多糖包含：LAM多糖，以及LM多糖和/或PIMs多糖。根据本发明实施例的牛分枝杆菌表面多糖可提高疫苗抗原组分的免疫效应，由此，可用于开发新的疫苗佐剂。

在本发明的第三方面，本发明提出了前述佐剂在制备疫苗中的用途。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对佐剂所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种亚单位疫苗。根据本发明的实施例，所述亚单位疫苗包括：包含Ag85A片段的融合蛋白；以及前述佐剂。根据本发明实施例的亚单位疫苗免疫保护效果高，安全性好；而且，该亚单位疫苗可进一步加强BCG疫苗的免疫效应。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：前述的亚单位疫苗。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对佐剂、亚单位疫苗所描述的特征和优点，同样适用于该药物组合物，在此不再赘述。

在本发明的第六方面，本发明提出了一种疫苗。根据本发明的实施例，所述疫苗包括：抗原；以及前述佐剂、前述的亚单位疫苗或前述的药物组合物。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对佐剂、亚单位疫苗所描述的特征和优点，同样适用于该疫苗，在此不再赘述。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本发明实施例1中BCG表面多糖提取物纯度和多糖种类鉴定结果图，其中(A)为BCG表面多糖提取物的SDS-PAGE电泳银染结果图；(B)为BCG表面多糖提取物的Westernblot检测结果图；(A)和(B)中，“M”表示蛋白Marker泳道，“S”表示样品泳道，“(KDa)”及下面的数字表示蛋白Marker泳道各电泳条带对应的标准蛋白分子量，“LAM”表示BCG表面多糖LAM，“LM”表示BCG表面多糖LM，“PIMs”表示BCG表面多糖PIMs；

图2为本发明实施例2中小鼠免疫方案示意图；

图3为本发明实施例2中攻菌后各试验组小鼠脏器细菌载量检测结果图，其中，(A)为各试验组小鼠肺部细菌载量；(B)为各试验组小鼠脾脏细菌载量为，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001；****表示P<0.0001；

图4为本发明实施例2中攻菌后各组小鼠血清抗体滴度检测结果图，其中(A)为IgG；(B)为IgG1；(C)为IgG2c；(D)为IgG3；

图5为本发明实施例2中图小鼠免疫完成两周后，小鼠血清对巨噬细胞吞噬细菌作用的考察结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

术语及定义

在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。

在本文中，术语“BCG”等同于“卡介苗”，是由牛型结核杆菌减毒活菌悬浮液制成的活菌疫苗。

在本文中，术语“融合蛋白”是指至少两个蛋白质或者多肽融合而成的新型蛋白，通常可以通过基因工程等技术实现上述融合操作，例如，通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。在本文中是指包含Ag85A片段的融合蛋白。

在本文中，术语“片段”是指蛋白片段，可包含蛋白的全长片段，也可包含蛋白的部分片段。示例性地，Ag85A片段可为Ag85A蛋白的全长片段，也可为Ag85A蛋白的部分片段；LpqH片段可为LpqH蛋白的全长片段，也可为LpqH蛋白的部分片段。

在本文中，术语“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地，本发明所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。

在本文中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。

在本文中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。

本发明提出了一种佐剂、用途、亚单位疫苗、药物组合物和疫苗，下面将分别对其进行详细描述。

佐剂

本发明提供一种佐剂。根据本发明的实施例，所述佐剂包括：牛分枝杆菌表面多糖，所述牛分枝杆菌表面多糖包含：LAM多糖，以及LM多糖和/或PIMs多糖。根据本发明实施例的佐剂可提高疫苗抗原组分的免疫效应，安全性好，由此，本发明的佐剂能进一步提高疫苗的预防和/或治疗效果，应用前景广阔。

根据本发明的实施例，所述LAM多糖的分子量为35～40KDa。根据发明的实施例，LAM多糖的分子量在此范围内，可提高疫苗抗原组分的免疫效应。

根据本发明的实施例，所述LM多糖的分子量为15～20KDa。根据发明的实施例，LM多糖的分子量在此范围内，可提高疫苗抗原组分的免疫效应。

根据本发明的实施例，所述PIMs多糖的分子量为2～10KDa。根据发明的实施例，PIMs多糖的分子量在此范围内，可提高疫苗抗原组分的免疫效应。

在本文中，术语“LAM多糖”等同于“lipoarabinomanna”。

在本文中，术语“LM多糖”等同于“lipomannans”。

在本文中，术语“PIMs多糖”等同于“phosphatidyl-myo-inositol mannosides”。

根据本发明的实施例，所述牛分枝杆菌为牛分枝杆菌减毒菌株。由此，进一步提高佐剂安全性。

根据本发明的实施例，所述牛分枝杆菌减毒菌株来自卡介苗。卡介苗(BCG)作为WHO目前唯一批准的预防结核病的疫苗，对婴儿及青少年具有保护作用。由此，根据本发明实施例的新佐剂，安全性高，易获得，用于开发免疫效应增强的疫苗，应用前景广阔。

在本发明的具体实施方案中，所述牛分枝杆菌表面多糖通过如下方法获得：

将卡介苗灭活菌体进行脱脂处理，得到脱脂菌体，将所述脱脂菌体进行脱蛋白、DNA、RNA处理，得到所述牛分枝杆菌表面多糖。

根据本发明的实施例，所述脱脂处理包括：将卡介苗灭活菌体与有机溶液接触，孵育1～3小时后，离心弃上清，收集菌体。

根据本发明的实施例，重复上述脱脂处理2～4次，直至获得脱脂完全的菌体。

根据本发明的实施例，所述有机溶液为体积比为1∶2的氯仿∶甲醇溶液。

根据本发明的实施例，在进行脱蛋白、DNA、RNA处理前，将所述脱脂完全的菌体进行破碎处理；所述破碎处理的方式为超声破碎，所述超声破碎的超声程序为：2s超声，3s暂停，所述超声破碎的时间为4～16min。

根据本发明的实施例，在进行超声破碎前，将所述脱脂完全的菌体中的有机溶液挥发完全。

根据本发明的实施例，所述脱蛋白、DNA、RNA处理包括：将破碎处理后的菌体溶液与DNA酶、RNA酶、PMSF和Triton X-114接触，4℃静置8小时以上，第一次离心处理后取上清液，所述上清液静置分层后，取有机层，加入7～11倍体积的95％乙醇，-80℃静置8小时以上，第二次离心处理后弃上清液取沉淀，将所述沉淀与蛋白酶K接触，56℃孵育1～3h，蛋白酶K灭酶后，PBS透析，得到所述BCG表面多糖提取物。

根据本发明的实施例，所述蛋白酶K的终浓度为2mg/mL。

根据本发明的实施例，所述第一次离心处理的条件为32000×g 4℃离心1h。

根据本发明的实施例，所述第二次离心处理的条件为10000rpm离心5min。

根据本发明的实施例，所述DNA酶和RNA酶的加入量分别为1000U/mL菌液，所述PMSF的终浓度为3mM，所述Triton X-114的终浓度为8％。

根据本发明实施例的方法得到的牛分枝杆菌表面多糖组分确定，纯度高，可进一步作为佐剂，用于提高疫苗抗原组分的免疫效应。

根据本发明的实施例，所述佐剂为复合佐剂。由此，进一步提高免疫效应增强性能。

根据本发明的实施例，所述佐剂还包括：铝佐剂、Poly IC佐剂、弗氏佐剂、CpGODN、CpG 1018、MF59、AS03、AS04、AF03、AS01_B、DDA、MPLA、IC31、明矾佐剂中的至少之一。根据本发明实施例的包含前述牛分枝杆菌表面多糖的复合佐剂，其对抗原组分的免疫效应增强性能进一步提高。

根据本发明的实施例，所述佐剂还包括：铝佐剂。发明人经过大量筛选试验确定，包含前述牛分枝杆菌表面多糖和铝佐剂的复合佐剂对抗原组分的免疫效应增强性能较佳。

需要说明的是，“铝佐剂”通常是指包含铝的免疫佐剂，其至少包括但不限于氢氧化铝凝胶、磷酸铝、硫酸铝、铵明矾和钾明矾中的一种或多种。例如，可为氢氧化铝和氢氧化镁悬浮液。

根据本发明的实施例，所述铝佐剂为氢氧化铝佐剂和/或铝盐佐剂。

根据本发明的实施例，所述牛分枝杆菌表面多糖与所述铝佐剂的质量比为2∶(5～15)；优选2∶5。发明人经过大量筛选试验确定此较佳质量比，由此，进一步提高根据本发明实施例的复合佐剂对疫苗抗原组分的免疫效应增强性能。

用途

本发明提供前述牛分枝杆菌表面多糖在制备佐剂中的用途，所述牛分枝杆菌表面多糖包含：LAM多糖，以及LM多糖和/或PIMs多糖。根据本发明实施例的牛分枝杆菌表面多糖可提高疫苗抗原组分的免疫效应，由此，可用于开发新的疫苗佐剂。

根据本发明的实施例，所述LAM多糖的分子量为35～40KDa。

根据本发明的实施例，所述LM多糖的分子量为15～20KDa。

根据本发明的实施例，所述PIMs多糖的分子量为1～10KDa。

根据本发明的实施例，所述佐剂用于加强分枝杆菌疫苗的免疫效应。

根据本发明的实施例，所述分枝杆菌为结核分枝杆菌。示例性地，结核分枝杆菌疫苗包括不限于：重组BCG(rBCG)疫苗、减毒M.tb疫苗、佐剂亚单位蛋白疫苗、病毒载体疫苗、全细胞疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗等。

在本发明的一些具体的实施方案中，所述结核分枝杆菌疫苗为卡介苗(BCG)。

根据本发明的实施例，所述佐剂为复合佐剂。

本发明还提供前述佐剂在制备疫苗中的用途。

根据本发明的实施例，所述疫苗为分枝杆菌疫苗。

根据本发明的实施例，所述分枝杆菌为结核分枝杆菌。

在本发明的一些具体的实施方案中，所述结核分枝杆菌疫苗为卡介苗(BCG)。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对佐剂所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。

亚单位疫苗

本发明提供一种亚单位疫苗。根据本发明的实施例，所述亚单位疫苗包括：包含Ag85A片段的融合蛋白；以及前述佐剂。根据本发明实施例的亚单位疫苗免疫保护效果好，安全性高；而且，该亚单位疫苗可进一步加强结核病疫苗(比如BCG)的免疫效应。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括：Ag85A片段和LpqH片段；进一步地，所述Ag85A片段和所述LpqH片段通过连接肽连接。

根据本发明的实施例，所述Ag85A片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

MQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAVGAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSDWYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQFVYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIANNTRVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEYWGAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGA(SEQ ID NO：1)。

根据本发明的实施例，所述LpqH片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

VKRGLTVAVAGAAILVAGLSGCSSNKSTTGSGETTTAAGTTASPGAASGPKVVIDGK DQNVTGSVVCTTAAGNVNIAIGGAATGIAAVLTDGNPPEVKSVGLGNVNGVTLGYTSGT GQGNASATKDGSHYKITGTATGVDMANPMSPVNKSFEIEVTCS(SEQ ID NO:2)。

根据本发明的实施例，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：3)。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

MQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAVGAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSDWYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQFVYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIANNTRVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEYWGAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGAGGGGSGGGGSGGGGSVKRGLTVAVAGAAILVAGLSGCSSNKSTTGSGETTTAAGTTASPGAASGPKVVIDGKDQNVTGSVVCTTAAGNVNIAIGGAATGIAAVLTDGNPPEVKSVGLGNVNGVTLGYTSGTGQGNASATKDGSHYKITGTATGVDMANPMSPVNKSFEIEVTCSHHHHHH(SEQIDN O：4)。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白和所述佐剂的质量比为1∶(1～8)。发明人通过大量实验，确定上述质量比。在此质量比范围内，包含Ag85A片段的融合蛋白和佐剂可协同增效，进一步提高亚单位疫苗的免疫效应，而且安全性好。

药物组合物

本发明提供一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：前述的亚单位疫苗。根据本发明的药物组合物可进一步提高机体的抵抗结核分枝杆菌的免疫效果，还可以作为免疫促进剂，提高机体免疫力。

根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的辅料。

根据本发明的实施例，所述辅料包括：药学上可接受的一种或多种赋形剂、稀释剂、稳定剂或载体。

根据本发明的实施例，所述药物组合物为注射剂。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对佐剂、亚单位疫苗所描述的特征和优点，同样适用于该药物组合物，在此不再赘述。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的亚单位疫苗以及药学上可接受的辅料。这类辅料包括(但并不限于)：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。

疫苗

本发明提供一种疫苗。根据本发明的实施例，所述疫苗包括：抗原；以及前述佐剂、前述的亚单位疫苗或前述的药物组合物。根据本发明实施例的疫苗免疫效果好，安全性高。

根据本发明的实施例，所述抗原为牛分枝杆菌减毒活菌。

根据本发明的实施例，所述疫苗进一步包括药学上可接受的辅料。

根据本发明的实施例，所述辅料包括：药学上可接受的一种或多种赋形剂、稀释剂、稳定剂或载体。

根据本发明的实施例，所述疫苗为注射剂。在本发明的一些具体的实施方式中，所述注射剂为皮下注射剂。

本发明所述的药学上可接受的辅料包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。辅料的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对佐剂、亚单位疫苗所描述的特征和优点，同样适用于该疫苗，在此不再赘述。

在本发明的实施例中，按如下方法测定BCG表面多糖的含量：

1、配置1mg/mL L-阿拉伯糖标准液。

2、配置梯度L-阿拉伯糖溶液：将L-阿拉伯糖标准液用蒸馏水稀释成0mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL。

3、配置6％苯酚溶液：6g苯酚溶解于100mL蒸馏水中。

4、多糖浓度测定：将上述梯度L-阿拉伯糖溶液样品和待测样本各取20μL，先加入20μL的6％苯酚，混合均匀后再加入200μL的浓硫酸混合均匀。酶标仪OD490读数，使用L-阿拉伯糖溶液OD值及浓度画标准曲线，代入多糖OD即可计算得到多糖浓度。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：BCG表面多糖的提取、鉴定

在该实施例中，参考如下方法从BCG菌体中提取BCG表面多糖，然后通过SDS-PAGE结合银染鉴定BCG表面多糖提取物的纯度，进一步通过Western blot鉴定确认BCG表面多糖类型。具体方案如下：

一、BCG表面多糖的提取

方法如下：

1、材料预处理：将7H9培养的BCG Pasteur 1173P2菌株热灭活后，收集菌体。

2、脱脂：在通风橱中配置氯仿：甲醇(v/v＝1：2)的溶液A，将热灭活菌体置于溶液A中于37℃摇动孵育2h，8000r/min离心弃上清，即完成一次脱脂。如此反复脱脂三次，获得已脱脂完全的菌体，利用通风橱将其中有机试剂挥发干，进行下一步操作。

3、研磨与破碎：向已脱脂菌体中加入PBS悬浮，按照2s超声，3s暂停程序进行冰浴超声破碎，超声破碎一共8min。

4、脱蛋白、DNA、RNA：向已超声破碎的菌液中加入1000U DNA酶、RNA酶、3mM PMSF和终浓度为8％的Triton X-114，放入4℃过夜。32000×g 4℃离心1小时，小心吸取上清液。置于50mL离心管中，37℃静置直至明显分层。取下层有机层，加入9倍体积(提前-20℃预冷)的95％乙醇，-80℃过夜。10000rpm离心5min，弃去上清获取沉淀。用2mL PBS重悬沉淀，向其中加入2mg/mL蛋白酶K，首先56℃孵育2h以酶解蛋白质后，95℃10min灭活蛋白酶K，PBS透析过夜，离心取上清即得到BCG表面多糖提取物，存入-20℃冰箱备用。

二、BCG表面多糖提取物纯度鉴定

采用SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)结合银染，对BCG表面多糖提取物的纯度进行鉴定，具体步骤如下：

1、SDS-PAGE电泳：制备浓缩胶5％，分离胶12％的蛋白电泳胶，样品加等体积的上样缓冲液煮沸3分钟，每孔加入样品20μL，浓缩胶工作电压80V，分离胶工作电压135V。待溴酚蓝至凝胶底部，停止电泳。

2、SDS-PAGE电泳结束后，进行高碘酸硝酸银染色，具体步骤如下：

(1)电泳后，将凝胶转移到含有100mL 40％(v/v)甲醇、10％(v/v)乙酸的去离子水(固定液A)的培养皿中室温摇动孵育45min。

(2)弃掉固定液A，向其中加入100mL含0.7％高碘酸的固定液A，室温摇动孵育7分钟。

(3)弃去高碘酸溶液，加入100mL5％(v/v)甲醇、7％(v/v)乙酸的去离子水(固定液B)室温摇动孵育5分钟。

(4)弃去固定液B，加入50mL 2.5％戊二醛室温摇动孵育5分钟。

(5)小心除去戊二醛，用100mL蒸馏水洗涤4次，每次10分钟。

(6)加入100mL 0.0025％的DTT溶液，孵育6分钟。

(7)弃去DTT溶液，加入100mL 0.1％硝酸银溶液室温摇动孵育5分钟。

(8)用100mL蒸馏水快速冲洗凝胶。

(9)在200mL 3％碳酸钠溶液(含100μL 37％甲醛)中显影凝胶。

(10)当样品条带和聚丙烯酰胺凝胶背景之间的对比度适中时，加入10mL 50％柠檬酸终止显色。

BCG表面多糖的纯度鉴定结果如图1A所示。

三、BCG表面多糖提取物多糖类型鉴定

采用Western blot，选择BCG表面多糖中的LAM，进行多糖类型的鉴定

SDS-PAGE电泳结束后，另一块胶作Western blot免疫印迹反应。使用半干转移系统将SDS-PAGE凝胶上的蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上，以2F12(抗LAM的抗体)为第一抗体，进行Western blot免疫印迹反应。

BCG表面多糖的鉴定结果如图1B所示。

结果显示：1)该实施例得到的BCG表面多糖提取物包含：LAM、LM、PIMs三种多糖，其中，所述LAM多糖的分子量为35～40KDa、LM的分子量为15～20KDa、PIMs的分子量为2～10KDa。2)该实施例得到的BCG表面多糖提取物纯度高，可进一步用于考察由LAM、LM、PIMs组成的BCG表面多糖在小鼠中对于结核病疫苗的免疫应答作用。

实施例2：BCG表面多糖在小鼠中对于结核病疫苗的免疫应答作用的影响

在该实施例中，进一步考察了实施例1的BCG表面多糖对结核病疫苗免疫小鼠血清抗体滴度以及小鼠血清对巨噬细胞吞噬细菌作用的影响。其中，试验动物为6-8周龄雌性SPF的C57BL/6J小鼠，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司；免疫动物用BCG为卡介苗(BCGPasteur 1173P2菌株)；铝盐佐剂购自Thermo Scientific^TMImject^TM，货号：77161。

一、免疫方案及抗体效价检测

将试验动物分为5组，按图2所示的免疫方案免疫小鼠，免疫完成后两周进行抗体效价检测，免疫方式采用皮下注射(s.c.)的方式。其中，BCG表面多糖为实施例1的BCG表面多糖提取物，免疫动物前，经除菌、除内毒素、除热源等处理以及必要的糖浓度定量。

在执行图2的免疫方案之前，发明人对BCG表面多糖的免疫剂量进行了摸索。具体方案如下：

发明人选择(20μg、40μg、60μg)不同剂量的实施例1的BCG表面多糖提取物，参考图2PBS组的实验方案免疫6-8周龄雌性SPF的C57BL/6J小鼠。试验发现，末次免疫后小鼠生存力正常，均无死亡。

上述实验结果显示：单独使用LAM多糖免疫小鼠，副作用明显，安全性低；含有LAM多糖、LM多糖、PIMs多糖的BCG表面多糖复合物免疫小鼠，小鼠生存力不受影响，安全性高。

由此，发明人选择40μg的实施例1的BCG表面多糖提取物作为加强免疫结核病亚单位的佐剂。

各试验组具体免疫方案如下：

PBS组：免疫四次，每两周免疫一次，每次每只小鼠免疫100μL PBS。

BCG组：初始免疫一次，每只小鼠免疫10⁶CFU BCG。

AL-Alum(ALA)组：初始免疫一次，每只小鼠免疫10⁶CFU BCG，四周后每隔两周免疫一次，共加强免疫三次，每次每只小鼠加强免疫20μg AL(结核病亚单位)和铝盐佐剂的混合物。其中，按质量比计算，AL和铝盐佐剂的混合比为20μg∶100μg。

AL-Alum-BCG多糖(ALS)组：初始免疫一次，每只小鼠免疫10⁶CFU BCG，四周后每隔两周免疫一次，共加强免疫三次，每次每只小鼠加强免疫20μg AL(结核病亚单位)和包含铝盐佐剂、BCG表面多糖的复合佐剂的混合物。其中，按质量比计算，BCG表面多糖和铝盐佐剂的质量比为40μg∶100μg，混合后于4℃摇床中300rpm混合30min，使之均匀交联，形成复合佐剂；AL和该复合佐剂的混合比为20μg∶140μg。

需要说明的是，每次每只小鼠加强免疫的剂量，以AL的蛋白含量计，为20μg。

AL为结核病亚单位，参考中国专利CN115850520A(发明名称：新型结核病亚单位疫苗AL的制备方法和应用)制得。其中，该结核病亚单位为包含Ag85A片段的融合蛋白。该融合蛋白包括：Ag85A片段和LpqH片段，Ag85A片段和LpqH片段通过连接肽连接。

Ag85A片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

MQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAVGAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSDWYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQFVYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIANNTRVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEYWGAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGA(SEQ ID NO：1)。

LpqH片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

VKRGLTVAVAGAAILVAGLSGCSSNKSTTGSGETTTAAGTTASPGAASGPKVVIDGK DQNVTGSVVCTTAAGNVNIAIGGAATGIAAVLTDGNPPEVKSVGLGNVNGVTLGYTSGT GQGNASATKDGSHYKITGTATGVDMANPMSPVNKSFEIEVTCS(SEQ ID NO:2)。

连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：3)。

包含Ag85A片段的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

MQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAVGAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSDWYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQFVYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIANNTRVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEYWGAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGAGGGGSGGGGSGGGGSVKRGLTVAVAGAAILVAGLSGCSSNKSTTGSGETTTAAGTTASPGAASGPKVVIDGKDQNVTGSVVCTTAAGNVNIAIGGAATGIAAVLTDGNPPEVKSVGLGNVNGVTLGYTSGTGQGNASATKDGSHYKITGTATGVDMANPMSPVNKSFEIEVTCSHHHHHH(SEQ IDNO：4)。

小鼠免疫实验结果显示：与BCG组和ALA组相比，ALS组试验小鼠加强免疫3次后，生存力无影响，实施例1的BCG表面多糖提取物用于加强BCG和AL的免疫效应，效果好、安全性高。

二、攻菌实验

抗体效价检测完成后进行攻菌，考察各实验组对试验小鼠的保护效果。

攻菌剂量为200CFU，菌株为M.bovis C68004，攻菌采用气溶胶感染。四周后麻醉安乐死小鼠，检测肺脏及脾脏的细菌载量(图3)。

攻菌结果显示：与ALA组相比，ALS组攻菌后，脏器细菌载量显著降低。该结果表明，铝盐佐剂和BCG表面多糖形成的复合佐剂，能进一步加强BCG的免疫效应，有效预防和治疗结核病。

三、小鼠血清抗体滴度检测

小鼠攻菌4周后，处死各试验组小鼠后，取小鼠血清检测抗体效价。具体检测方法如下：

使用M.bovis铺板，将M.bovis高压灭菌后用H₂O重悬，调整OD值为1.0，96孔板每孔加入100μL OD值为1.0的M.bovis混悬液，放置于60℃的烘箱中干燥，干燥后用冰冷的甲醇固定2h。PBS洗板四次，每次五分钟。用5％脱脂奶粉PBS溶液37℃封闭2h。PBS洗板三次，每次五分钟。将血清1：1000稀释，取100μL加入96孔板中，37℃孵育1h。PBS洗板三次，每次五分钟。将HRP标记的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2c、IgG3(Abcam)以1：10000稀释，取100μL加入96孔板中，37℃孵育1h。PBS洗板三次，每次五分钟。每孔加入100μL TMB(索莱宝，北京)显色，20min后每孔用50μL 2M H₂SO₄终止显色。酶标仪读取OD450。

结果如图4所示。

结果显示：与ALA组相比，ALS组攻菌4周后，小鼠血清中IgG1、IgG3抗体滴度显著升高。

四、小鼠血清对巨噬细胞吞噬细菌作用的影响考察

小鼠攻菌4周后，处死各试验组小鼠后，取小鼠血清，与巨噬细胞共培养后，通过考察巨噬细胞的细胞吞噬作用高低，评价小鼠血清对巨噬细胞吞噬细菌作用的影响。具体检测方法如下：

1、培养Raw264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)至状态良好，计数，于24孔板中每孔铺5×10⁵个细胞，并加入1mL的DMEM(不含FBS以及双抗)细胞培养液，培养箱培养8小时。

2、将FITC荧光探针溶解到CBC缓冲液中(0.05M碳酸盐碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6)中，浓度50mg/mL，备用。

3、取BCG(Pasteur 1173P2菌株)测OD600，加入FITC(FITC染色终浓度1mg/mL)37℃孵育2小时，离心弃上清，PBS洗三次，用含小鼠抗体(血清)的DMEM(不含FBS以及双抗)重悬后，按MOI为5∶1的量，加入BCG，混匀后再加入孔板中，加入量为每孔细胞培养液加入量的10％(v/v)，感染Raw264.7细胞2小时。

4、感染2小时后预冷的PBS洗三次。

5、每孔加入1mL的细胞固定液固定细胞，室温2h。

6、取出细胞使用BD流式细胞仪进行细胞吞噬检测。

结果如图5所示。

结果显示：与ALA组相比，ALS组攻菌2周后，小鼠血清可显著提高巨噬细胞的细菌吞噬活性。由此，进一步加强巨噬细胞杀灭肿瘤细胞的能力。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种佐剂，其特征在于，包括：牛分枝杆菌表面多糖，所述牛分枝杆菌表面多糖包含：LAM多糖，以及LM多糖和/或PIMs多糖。

2.根据权利要求1所述的佐剂，其特征在于，所述LAM多糖的分子量为35～40KDa；

任选地，所述LM多糖的分子量为15～20KDa；

任选地，所述PIMs多糖的分子量为1～10KDa。

3.根据权利要求1所述的佐剂，其特征在于，所述牛分枝杆菌为牛分枝杆菌减毒菌株；

任选地，所述牛分枝杆菌减毒菌株来自卡介苗；

任选地，所述佐剂为复合佐剂；

任选地，所述佐剂还包括：铝佐剂、Poly IC佐剂、弗氏佐剂、CpG ODN、CpG 1018、MF59、AS03、AS04、AF03、AS01_B、DDA、MPLA、IC31、明矾佐剂中的至少之一；

任选地，所述佐剂还包括：铝佐剂；

任选地，所述铝佐剂为氢氧化铝佐剂和/或铝盐佐剂；

任选地，所述牛分枝杆菌表面多糖与所述铝佐剂的质量比为2∶(5～15)；优选2∶5。

4.牛分枝杆菌表面多糖在制备佐剂中的用途，其特征在于，所述牛分枝杆菌表面多糖包含：LAM多糖，以及LM多糖和/或PIMs多糖；

任选地，所述LAM多糖的分子量为35～40KDa；

任选地，所述LM多糖的分子量为15～20KDa；

任选地，所述PIMs多糖的分子量为1～10KDa；

任选地，所述佐剂用于加强分枝杆菌疫苗的免疫效应；

任选地，所述分枝杆菌为结核分枝杆菌；

任选地，所述佐剂为复合佐剂。

5.权利要求1～3任一项所述佐剂在制备疫苗中的用途；

任选地，所述疫苗为分枝杆菌疫苗；

任选地，所述分枝杆菌为结核分枝杆菌。

6.一种亚单位疫苗，其特征在于，包括：

包含Ag85A片段的融合蛋白；以及

权利要求1～3任一项所述佐剂。

7.根据权利要求6所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述融合蛋白包括：Ag85A片段和LpqH片段；进一步地，所述Ag85A片段和所述LpqH片段通过连接肽连接；

任选地，所述Ag85A片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

任选地，所述LpqH片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

任选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

任选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

任选地，所述融合蛋白和所述佐剂的质量比为1∶(1～8)。

8.一种药物组合物，其特征在于，包括：权利要求6或7所述的亚单位疫苗。

9.一种疫苗，其特征在于，包括：

抗原；以及

权利要求1～3任一项所述佐剂、权利要求6或7所述的亚单位疫苗或权利要求8所述的药物组合物。

10.根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述抗原为牛分枝杆菌减毒活菌。