CN118165113A

CN118165113A - 一种改善免疫应答细胞功能的方法

Info

Publication number: CN118165113A
Application number: CN202410382150.7A
Authority: CN
Inventors: 李宗海; 狄升蒙; 高慧萍; 王华茂
Original assignee: Keji Biomedical Shanghai Co ltd
Current assignee: Kaixing Life Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2016-04-26
Filing date: 2017-04-26
Publication date: 2024-06-11
Also published as: CN108884459A; CN108884459B; CN118146379A; WO2017186121A1

Abstract

本发明涉及一种改善免疫应答细胞功能的方法。本发明揭示了一种免疫应答细胞，其表达至少一种能结合抗原的受体以及I型干扰素。将所述的免疫应答细胞应用于治疗肿瘤、传染病和其他疾病，具有显著优异的杀伤肿瘤或病原体的能力。

Description

一种改善免疫应答细胞功能的方法

本申请为申请号2017800217918、申请日为2017.4.26的“一种改善免疫应答细胞功能的方法”发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于免疫学领域，更具体地，本发明涉及一种改善免疫应答细胞功能的方法。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)是一种人工重组受体，通常含有位于胞外区的单克隆抗体的抗原识别结构域、跨膜区、及免疫应答细胞的胞内激活信号结构域组成。近年来，在临床试验中使用靶向CD19的CAR修饰的T细胞(CAR-T)细胞治疗B细胞白血病取得了巨大的成功。然而，有不少白血病患者会有复发。而且并不是所有的血液肿瘤都非常有效。此外，CAR-T细胞治疗实体性肿瘤也疗效不太显著。因此，如何改善现有CAR-T细胞技术，增加其抗肿瘤活性仍然是非常重要。

I型干扰素(Type I interferons)大概于半个多世纪前发现。I型干扰素包含IFNα蛋白(一类从IFNA1到IFNA13共13个人基因编码的同一性蛋白)，IFNβ(由单一个人和小鼠基因IFNB1编码)以及其他研究较少的干扰素如IFNε，IFNκand IFNω(2.Trinchieri，G.TypeIinterferon:friend or foe？J.Exp.Med.207，2053-2063(2010).3.Kaur，S.&Platanias，L.C.IFN-β-specific signaling via a unique IFNAR1 interaction.Nat.Immunol.14，884-885(2013))。I型干扰素由多种类型的细胞在模式识别受体(pattern recognitionreceptors(PRRs))活化后产生。PRRs对病毒或者细菌成分以及异位的内源分子(如细胞浆DNA与细胞外DNA和RNA)产生应答(Kawai，T.&Akira，S.The role of pattern-recognitionreceptors in innate immunity:update on Toll-like receptors.Nat.Immunol.¹¹，373–384(2010))。I型干扰素通过同一性二聚体IFNα/β受体1(IFNAR1)(该受体对IFNβ的亲和力特别高)或IFNAR1-IFNAR2异源二聚体(能与所有I型干扰素结合)传递信号。这些受体的活化，导致IFN-刺激基因(ISGs)的转录上调，引发很多免疫刺激效应(Hervas-Stubbs，S.etal.Direct effects of type Iinterferons on cells of the immunesystem.Clin.Cancer Res.17，2619er Res.es.mmde Weerd，N.A.et al.Structural basisof a unique interferon-βsignaling axis mediated via the receptorIFNAR1.Nat.Immunol.14，901ol.nol.is oMcNab，F.，Mayer-Barber，K.，Sher，A.，Wack，A.&O A.&，A.Type I interferons in infectious disease.Nat.Rev.Immunol.15，87nol.Immun)。已有研究表明，I型干扰素对一些肿瘤有抗癌作用，可能归因于它们的免疫刺激功能。但是，I型干扰素的全身用药可能发生免疫抑制作用(Lotrich，F.E.Majordepression during interferon-αtreatment:vulnerability andprevention.Dialogues Clin.Neurosci.¹¹，417-425(2009))，并伴有重大的不良事件，最常见的有乏力、厌食、肝毒性、流感样症状和严重的抑郁症(Kreutzer，K.，Bonnekoh，B.，Franke，I.，Ulrich，J.&Gollnick，H.Sarcoidosis，myasthenia gravis and anteriorischaemic optic neuropathy:severe side effects of adjuvant interferon-αtherapy in malignant melanoma？.J.Dtsch.Dermatol.Ges.2，689-694(in German)(2004))，这类严重的毒副作用严重限制了其应用。

发明内容

本发明克服了前述问题，并且具有额外的优势。

1.一种免疫应答细胞，该细胞表达结合抗原的受体；和外源性I型干扰素。

2.如项1所述的免疫应答细胞，所述的免疫应答细胞包括：T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤T细胞、DNT细胞、和/或调节性T细胞。

3.如前述项之一所述的免疫应答细胞，所述的抗原是肿瘤抗原或病原体抗原。

4.如前述项之一所述的免疫应答细胞，所述的外源性I型干扰素是组成性表达或诱导性表达；较佳地，用于表达所述的I型干扰素的启动子包括：免疫细胞诱导型启动子；较佳地，所述的免疫细胞诱导型启动子是NFAT6启动子。

5.如前述项之一所述的免疫应答细胞，该细胞表达内源性或重组的结合抗原的受体；较佳地，所述结合抗原的受体包括顺序连接的：特异性结合所述抗原的抗体，跨膜区和胞内信号区。

6.如前述项之一所述的免疫应答细胞，所述免疫应答细胞的胞内信号区含有T细胞刺激信号分子或T细胞刺激信号分子与T细胞激活共刺激分子的组合；较佳地，所述T细胞刺激信号分子选自：CD3ζ或FcεRIγ；更佳地为CD3ζ；或所述的T细胞激活共刺激分子选自：CD27，CD28，CD137，CD134，ICOS蛋白的胞内信号区，或其组合。

7.如前述项之一所述的免疫应答细胞，所述结合抗原的受体的氨基酸序列与以下序列中的一个具有至少90％的同一性：

SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50；SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:55；SEQID NO:56；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:62；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:65；SEQID NO:66；SEQ ID NO:67；SEQ ID NO:68；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:70；SEQ ID NO:71；SEQID NO:72；SEQ ID NO:73；SEQ ID NO:74；SEQ ID NO:75；以及SEQ ID NO:77。

8.如项7所述的免疫应答细胞，所述的特异性结合抗原的受体以及所述的外源性I型干扰素由与SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:76具有至少90％同一性的核苷酸序列编码。

9.如前述项之一所述的免疫应答细胞，所述的免疫应答细胞不包含外源的共刺激配体。

10.如前述项之一所述的免疫应答细胞，所述的I型干扰素包括：IFNα或IFNβ。

11.如前述项之一所述的免疫应答细胞，所述的结合抗原的受体和/或I型干扰素组成性或诱导性表达在免疫应答细胞的表面。

12.如前述项之一所述的免疫应答细胞，所述的免疫应答细胞中包含表达构建物，该表达构建物包括：所述结合抗原的受体的表达盒；和所述I型干扰素的表达盒。

13.如前述项之一所述的免疫应答细胞，所述的结合抗原的受体和/或I型干扰素利用病毒载体表达；较佳地，所述的病毒载体是逆转录病毒载体；更佳地，所述的病毒载体包括：慢病毒载体，逆转录病毒载体或腺病毒载体。

14.如前述项之一所述的免疫应答细胞，其中所述结合抗原的受体识别并结合病原微生物。

15.如项14所述的免疫应答细胞，其中所述病原微生物包括病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫；更佳地，所述病原微生物为病毒；或者更佳地，所述病原体微生物选自巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人类免疫缺陷病毒及流感病毒。

16.如前述项之一所述的免疫应答细胞，所述的抗原包括：前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、IL13Ralpha、HER-2、CD19、NY-ESO-1、HIV-1Gag、Lewis Y、MART-1、gp100、酪氨酸酶、WT-I、hTERT、间皮素、EGFR、EGFRvIII、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、EphA2、HER3、EpCAM、MUC1、MUC16、CLDN18.2、叶酸受体、CLDN6、CD30、CD138、ASGPR1、CDH16、GD2、5T4、8H9、αvβ6整合素、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD20、CD22、κ轻链(kappa light chain)、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD171、CSPG4、EGP2、EGP40、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胚胎型AchR、GD2、GD3、HLA-AI MAGE A1、MAGE3、HLA-A2、IL11Ra、KDR、Lambda、MCSP、NCAM、NKG2D配体、PRAME、PSCA、PSC1、ROR1、Sp17、SURVIVIN、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、HMW-MAA、VEGF受体、和/或纤连蛋白、腱生蛋白或肿瘤坏死区的癌胚变体。

17.一种表达构建物，该表达构建物包括顺序连接的：结合抗原的受体的表达盒；和I型干扰素的表达盒；其中所述结合抗原的受体和I型干扰素如前述项之一所定义。

18.一种提高向个体给予的免疫应答细胞活力的方法，所述免疫应答细胞表达如项1至16之一所述的结合抗原的受体，并且其中所述方法包括向所述个体给予所述免疫应答细胞以及有效量的外源性I型干扰素。

19.如项18所述的方法，其中所述外源性I型干扰素与所述表达结合抗原的受体的免疫应答细胞顺序给予或者同时给予。

20.如项18或19所述的方法，其中所述外源性I型干扰素通过在免疫应答细胞中共表达，与所述免疫应答细胞同时向患者给予。

21.如项18至20之一所述的方法，其中所述免疫应答细胞包括T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤T细胞、DNT细胞、和/或调节性T细胞。

22.如项18至21之一所述的方法，其中所述方法使得在向所述个体给予所述免疫应答细胞后，与不存在所述外源性I型干扰素的情况相比，所述个体外周血中细胞毒性T细胞和辅助T细胞的数量之和提高至少50％。

23.如项18至22之一所述的方法，其中所述方法使得在向所述个体给予所述免疫应答细胞约5天后，所述个体外周血中细胞毒性T细胞和辅助T细胞的数量之和大于15,000个/μL；给予所述免疫应答细胞约7天后，所述个体外周血中细胞毒性T细胞和辅助T细胞的数量之和大于500个/μL；或者给予所述免疫应答细胞约10天后，所述个体外周血中细胞毒性T细胞和辅助T细胞的数量之和大于50个/μL。

24.项1-16之一所述的免疫应答细胞在制备用于治疗有此需要的个体的肿瘤、病原体感染、或增强个体免疫耐受能力的药物组合物中的用途。

25.如项24所述的用途，所述的肿瘤包括：胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌、卵巢癌、宫颈癌或胶质瘤；或

所述的病原体包括：病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫；较佳地，所述的病毒包括：巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人类免疫缺陷病毒或流感病毒。

26.如项24或25所述的用途，其中根据计算机断层扫描测量，所述药物使得肿瘤减小至少30％。

27.如项24或25所述的用途，其中根据计算机断层扫描测量，所述药物使得肿瘤完全消失。

28.药物组合物，所述的药物组合物包括：

项1-16之一所述的免疫应答细胞；以及

药学上可接受的载体或赋形剂。

29.试剂盒，其包含：

如项1-16之一所述的免疫应答细胞；以及

指导如何向个体给予所述免疫应答细胞的说明书。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种免疫应答细胞，该细胞表达结合抗原的受体；和外源性I型干扰素。

在一些实施方案中，本发明的免疫应答细胞包括T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤T细胞、DNT细胞、和/或调节性T细胞。

在一些实施方案中，所述结合抗原的受体是内源性的。在一些实施方案中，所述结合抗原的受体是重组的。在一些实施方案中，所述结合抗原的受体是嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述结合抗原的受体包括顺序连接的胞外抗原结合区、跨膜区和胞内信号区。在一些实施方案中，所述抗原结合单元是特异性结合所述抗原的抗体或其片段。在一些实施方案中，所述胞内信号区可以含有已知的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号基序。在一些实施方案中，所述含有细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。

在一些实施方案中，所述结合抗原的受体的胞内信号区包括一个或多个共刺激结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域选自表1中所列举的之中的一种或多种。在一些实施方案中，所述共刺激结构域选自CD28、OX40、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BBL、MyD88和4-1BB中的一种或多种。在一些实施方案中，所述共刺激结构域选自CD28、OX40、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BBL、MyD88和4-1BB中的两种。

在一些实施方案中，所述结合抗原的受体的氨基酸序列与SEQ ID NO:49；SEQ IDNO:50；SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:61；SEQ IDNO:62；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:65；SEQ ID NO:66；SEQ ID NO:67；SEQ IDNO:68；SEQ ID NO:69；SEQ ID NO:70；SEQ ID NO:71；SEQ ID NO:72；SEQ ID NO:73；SEQ IDNO:74；SEQ ID NO:75；以及SEQ ID NO:77之一具有至少90％的同一性。

在一些实施方案中，所述结合抗原的受体由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:76具有至少90％的同一性。

在一些实施方案中，所述免疫应答细胞中不包含外源的共刺激配体。

在一些实施方案中，能够被所述的结合抗原的受体结合的抗原包括肿瘤抗原或病原体抗原。在一些实施方中，所述肿瘤抗原选自前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、IL13Ralpha、HER-2、CD19、NY-ESO-1、HIV-1Gag、Lewis Y、MART-1、gp100、酪氨酸酶、WT-I、hTERT、间皮素、EGFR、EGFRvIII、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、EphA2、HER3、EpCAM、MUC1、MUC16、CLDN18.2、叶酸受体、CLDN6、CD30、CD138、ASGPR1、CDH16、GD2、5T4、8H9、αvβ6整合素、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD20、CD22、κ轻链(kappa light chain)、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD171、CSPG4、EGP2、EGP40、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胚胎型AchR、GD2、GD3、HLA-AI MAGE A1、MAGE3、HLA-A2、IL11Ra、KDR、Lambda、MCSP、NCAM、NKG2D配体、PRAME、PSCA、PSC1、ROR1、Sp17、SURVIVIN、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、HMW-MAA、VEGF受体、和/或纤连蛋白、腱生蛋白或肿瘤坏死区的癌胚变体。

在一些实施方案中所述病原体抗原包括病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或寄生虫抗原。在一些实施方案中，所述的病原体是病毒。所述病毒包括巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人类免疫缺陷病毒及流感病毒。

在一些实施方案中，所述I型干扰素的表达是组成型表达。在一些实施方案中，所述I型干扰素的表达是诱导型表达。在一些实施方案中，所述I型干扰素表达在所述免疫应答细胞的表面。在一些实施方案中，所述I型干扰素包括：IFNα或IFNβ。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种表达构建物，其包括顺序连接的：本发明的结合抗原的受体的表达盒；和I型干扰素的表达盒。在一些实施方案中，所述I型干扰素的表达是组成型表达。在一些实施方案中，所述I型干扰素的表达是诱导型表达。在一些实施方案中，所述I型干扰素的表达是诱导型表达，并且用于表达所述I型干扰素的表达是诱导型启动子。在一些实施方案中，用于表达所述I型干扰素的诱导型启动子是NFAT6启动子。在一些实施方案中，所述NFAT6启动子包括如SEQ ID NO:78所述的核酸序列。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种载体，其表达本发明的结合抗原的受体和/或I型干扰素。在一些实施方案中，所述的病毒载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体。在一些实施方案中，所述的病毒载体是逆转录病毒载体。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种提高向个体给予的免疫应答细胞活力的方法，所述免疫应答细胞表达本发明所述的结合抗原的受体，并且其中所述方法包括向所述个体给予所述免疫应答细胞以及有效量的外源性I型干扰素。在一些实施方案中，所述外源性I型干扰素与所述表达结合抗原的受体的免疫应答细胞顺序给予或者同时给予。在一些实施方案中，所述外源性I型干扰素通过在免疫应答细胞中共表达，与所述免疫应答细胞同时向患者给予。

根据本发明的一个方面，本发明提供了本发明的免疫应答细胞在制备用于治疗有此需要的个体的肿瘤、病原体感染、或增强个体免疫耐受能力的药物组合物中的用途。本发明还提供了一种治疗个体的肿瘤或病原体感染，或用于增强个体免疫耐受能力方法，包括向有此需要的个体给予本发明的免疫应答细胞。

在一些实施方案中，本发明的方法使得在向所述个体给予所述免疫应答细胞后，与不存在所述外源性I型干扰素的情况相比，所述个体外周血中细胞毒性T细胞和辅助T细胞的数量之和提高至少50％。在一些实施方案中，所述方法使得在向所述个体给予所述免疫应答细胞约5天后，所述个体外周血中细胞毒性T细胞和辅助T细胞的数量之和大于15,000个/μL；给予所述免疫应答细胞约5天后，所述个体外周血中细胞毒性T细胞和辅助T细胞的数量之和大于500个/μL；或者给予所述免疫应答细胞约5天后，所述个体外周血中细胞毒性T细胞和辅助T细胞的数量之和大于50个/μL。

在一些实施方案中，所述的肿瘤包括：胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌、卵巢癌、宫颈癌或胶质瘤。在一些实施方案中，所述的病原体包括：病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫；较佳地，所述的病毒包括：巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人类免疫缺陷病毒或流感病毒。

在一些实施方案中，根据计算机断层扫描测量，在通过本发明方法治疗后，所述个体的肿瘤减小至少30％。在一些实施方案中，根据计算机断层扫描测量，在通过本发明方法治疗后，所述个体的肿瘤完全消失。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括本发明的免疫应答细胞以及药学上可接受的载体或赋形剂。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的免疫应答细胞以及指导如何向个体给予所述免疫应答细胞的说明书。

以引用的方式并入

本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入一般。

附图说明

附图更进一步说明了本说明书所公开的新特性。参照这些附图将能更好地理解本说明书中所公开的特性和优点，但应当理解，这些附图仅用于说明应用本文所公开原理的具体的实施方案，而非意欲对所附权利要求的范围加以限制。

图1所示为重组慢病毒载体pRRL-EF-1α-92-CAR结构示意图(图1A)，以及92-28Z-NFAT6-IFN-β质粒的构建(图1B)。

图2所示为慢病毒感染PBMC阳性率检测图。

图3所示为慢病毒感染PBMC阳性率检测图。

图4所示为含有IFN和不含IFN的GPC3 CAR-T细胞的细胞因子的释放对比图。图4A所示为GPC3-28Z-IFN及GPC3-28Z CAR T细胞对IFN-β诱导表达情况。结果显示，只有GPC3-28Z-IFN与Huh7细胞共孵育时有IFN-β的表达，说明GPC3-28Z-IFN在被靶抗原激活后，IFNβ能够被成功诱导表达，并分泌至细胞外。图4B所示为GPC3-28Z-IFN及GPC3-28Z CAR对INF-γ诱导表达对比。图4C所示为GPC3-28Z-IFN及GPC3-28Z CAR T细胞在体外导致IL-2释放的对比图。结果显示，GPC3-28Z-IFN能更有效地导致细胞因子释放，说明包含IFNβ的CAR T细胞能够被更有效地被激活。

图5所示为85-28Z T细胞和85-28Z-IFN T细胞在不同细胞系中体外诱导细胞因子释放的对比图。结果显示，包含IFNβ的CAR T细胞能够被更有效地被激活。

图6所示为包含IFNβ的GPC3-28Z CAR T细胞与不包含IFNβ的GPC3 CAR T细胞在体外对各种细胞系(图6A：Huh7；图6B：Hep3B；图6C：PLC/PRR/5；图6D：Hep G2；图6E：SK-hep-1)的杀伤效率对比图。

图7所示为含有IFN和不含IFN的CLD18A2 CAR-T细胞的杀伤活性图。

图8所示为包含IFNβ的CLD18A2 CAR-T细胞与不包含IFNβ的CLD18A2CAR-T细胞在小鼠外周血中在回输5天(图8A)所示为7天(图8B)和10天(图8C)后的存活细胞数对比图。结果显示，在所有时间点，包含IFNβ的CLD18A2CAR-T存活细胞数均显著高于不包含IFNβ的CLD18A2 CAR-T细胞组。

图9所示为包含IFNβ的GPC3-28Z CAR T细胞与不包含IFNβ的GPC3-28ZCAR T细胞在小鼠肿瘤模型中随时间对肿瘤体积影响的对比图(图9A)以及肿瘤照片对比图(图9B)。结果显示，包含IFNβ的GPC3-28Z CAR T细胞与不包含IFNβ的GPC3-28Z CAR T细胞和对照组相比，能够更显著地减小肿瘤体积。

图10所示为包含IFNβ的CLD18A2 CAR-T细胞与不包含IFNβ的CLD18A2CAR-T细胞在小鼠BGC-823-A2细胞皮下移植肿瘤模型中随时间对肿瘤体积影响的对比图(图10A)以及肿瘤照片对比图(图10B)。结果显示，包含IFNβ的CLD18A2CAR-T细胞与不包含IFNβ的CLD18A2CAR-T细胞和对照组相比，能够更显著地减小肿瘤体积。

图11所示为含有IFN和不含IFN的CLD18A2 CAR-T细胞在胃癌PDX模型皮下移植瘤中的抗肿瘤活性对比图。结果显示，含有IFN的治疗组中有1只小鼠肿瘤完全消退。

图12所示为含有IFN和不含IFN的GPC3 CAR-T(92-28Z)细胞在体内对肿瘤浸润对比图。其中图12A为组织化学图片，图12B为T细胞数量图。结果表明，对照组肿瘤组织中无明显浸润的CD3+细胞，INFβ-CAR-T治疗组中CD3+T细胞数量高于28Z CART组。

图13所示为含有IFN和不含IFN的CLD18A2 CAR-T细胞在体内对肿瘤浸润的免疫组化图对比。结果显示，Mock T细胞在肿瘤组织周围几乎观察不到T细胞的浸润，85-28Z和85-2-28Z CAR T细胞在肿瘤组织的边缘可以看到，而85-2-28Z-IFN T细胞在肿瘤组织内部可以观察到一定的浸润。

图14所示为含有IFN和不含IFN的EGFR-CAR结构示意图。

图15所示为逆转录病毒感染小鼠T淋巴细胞的感染阳性率图。

图16所示为含有IFN和不含IFN的EGFR CAR T细胞体外分泌mIFNβ能力对比图。结果显示，经过靶细胞刺激后，mCAR-806-mIFNβ能够被成功激活，并诱导表达mIFNβ，对照组则未检出有mIFNβ的表达

图17所示为含有IFN和不含IFN的EGFR CAR-T细胞在体外诱导细胞因子释放(图17A：mIL-2；图17B：mIFN-γ；图17C：mTNF-α)的对比图。

图18所示含有IFN和不含IFN的EGFR CAR-T细胞的体外毒性试验对比图。结果显示，EGFR-CAR和EGFR-CAR-IFN与UT细胞相比，对靶点阳性的CT26VIII细胞具有强效的杀伤作用，差异有显著意义(***P＜0.001)，杀伤百分比呈剂量依赖性，而未经转染的UT细胞对CT26及CT26VIII均没有杀伤作用，EGFR-CAR和EGFR-CAR-IFN两种CAR-T细胞对靶点阴性的CT26细胞没有杀伤作用。

图19所示为含有IFN和不含IFN的EGFR CAR-T细胞的体内毒性试验对比图。结果显示，EGFR-CAR-T细胞对对肿瘤大小与对照组基本一致，未观察到抑制作用，而EGFR-CAR-IFN细胞回输后，在第7天开始出现抑制肿瘤生长的现象，抑瘤率为5.9％，第10天时达到最强，为18.5％，到第17天时，抑瘤率仍可达到12.4％，明显优于EGFR-CAR-T细胞组。

具体实施方式

以下具体说明详尽地展示了本文所公开的实施方案。应当理解，本说明书并非意欲仅限于此处所公开的具体的实施方案，而是可以发生改变。本领域技术人员将理解，本说明书中所公开的内容可以有多种改变或变化，而均涵盖于所公开的范围和原则之内。除非另有说明，每个实施方案均可与任何其他实施方案任意组合。

本文所公开的某些实施方案包含了数值范围，并且本发明的某些方面可采用范围的方式描述。除非另有说明，应当理解数值范围或者以范围描述的方式仅是出于简洁、便利的目的，并不应当认为是对本发明的范围的严格限定。因此，采用范围方式的描述应当被认为具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的所有可能的具体数值点，正如这些子范围和数值点在本文中已经明确写出。例如，从1至6的范围的描述应当被认为具体公开了从1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及在这些范围内的具体的数值点，例如1、2、3、4、5、6。不论所述数值的宽窄，上述原则均同等适用。当采用范围描述时，该范围包括范围的端点。

为了克服现有技术中的缺陷，本发明进行了深入的研究，发现使CAR-T细胞诱导型表达I型干扰素，可有效地增加CAR-T细胞的抗肿瘤活性，而且降低其毒副作用。在此基础上，本发明提供了一种免疫应答细胞，其表达至少一种能结合抗原(如肿瘤抗原或来自病原体的抗原)的受体和I型干扰素，将其应用于治疗肿瘤、传染病和其他疾病，具有显著优异的杀伤肿瘤或病原体的能力。

本文所用的术语“激活”和“活化”可互换使用，它们以及其语法上的其他形式可以指细胞从静止状态转变为活性状态的过程。该过程可以包括对抗原、迁移和/或功能活性状态的表型或遗传变化的响应。例如，术语“激活”可以指T细胞逐步活化的过程。例如，T细胞可能需要至少两个信号才能完全激活。第一信号可以在由抗原-MHC复合物接合TCR之后发生，而第二信号可以通过共刺激分子(参见表1中所列举的共刺激分子)的接合发生。在体外，抗CD3可以模拟所述第一信号，抗CD28可以模拟所述第二信号。例如，工程化T细胞可以被表达的CAR激活。本文所用的T细胞激活或T细胞触发可以指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖、细胞因子产生和/或可检测的效应物功能的T细胞的状态。

本文所用的术语“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的同一性共刺激分子的抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突状细胞、B细胞等)上的分子，由此提供信号，与由例如TCR/CD3复合物与加载有肽的MHC分子的结合提供的第一信号共同介导T细胞应答，包括但不限于增殖、激活、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还特别包括与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，例如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。

本文所用的术语“共刺激分子”是指与共刺激配体特异性结合的T细胞上的同一性结合配偶体，从而介导T细胞的共刺激应答，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。

如本文所用的“共刺激信号”是指与第一信号，例如TCR/CD3结合，组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。

本文所用的术语“抗原结合单元”是指免疫球蛋白分子和免疫分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合(“免疫反应”)的抗原结合位点的分子。术语“抗原结合单元”中还包括各种物种来源的免疫球蛋白分子，包括无脊椎动物和脊椎动物。结构上，最简单的天然存在的抗体(例如IgG)包含四条多肽链，通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻链(L)链。免疫球蛋白代表包括几种类型的分子的一大家族的分子，如IgD、IgG、IgA、IgM和IgE。术语“免疫球蛋白分子”包括例如杂交抗体或改变的抗体及其片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过天然存在的抗体的片段进行。这些片段统称为“抗原结合单元”。术语“抗原结合单元”中还包括具有与表位吻合并识别表位的特定形状的任何含多肽链的分子结构，其中一个或多个非共价结合相互作用稳定分子结构和表位之间的复合物。

如果抗原结合单元以与其它参考抗原(包括多肽或其他物质)结合相比更大亲和力或亲合力结合抗原，则所述抗原结合单元与抗原“特异性结合”或与抗原是“免疫反应性的”。

本文所用的“抗原”是指被抗原结合单元识别并特异性结合的物质。抗原可以包括肽、蛋白质、糖蛋白、多糖和脂质，其部分及其组合。非限制性示例性抗原包括肿瘤抗原或病原体抗原。“抗原”也可以指引发免疫反应的分子。这种免疫反应可能涉及抗体产生或特定免疫活性细胞(immunologically-competent cells)的活化，或两者兼有。本领域技术人员将理解，任何大分子，包括实际上所有的蛋白质或肽，都可以作为抗原。

本文所用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”可以指作为抗体起作用的一类蛋白质。由B细胞表达的抗体有时称为嵌合抗原受体或抗原受体。包括在这类蛋白质中的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE，其中IgG是最常见的循环抗体。它是凝集、补体固定和其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，在防御细菌和病毒方面是重要的。例如，可以通过CAR识别肿瘤细胞抗原(或“肿瘤抗原”)或病原体抗原。

本文使用的术语“自体”及其语法上的其他形式可以指来自相同的本源。例如，样品(例如，细胞)可以被去除、处理并在稍后的时间给予相同的个体(例如，患者)。自体过程与其中供体和受体是不同个体的同种异体过程不同。

本文使用的“异种移植”及其语法上的其他形式可以包括其中接受者和供体是不同的物种的将细胞、组织或器官移植、植入或输注到受体中的任何程序。本文所述的细胞、器官和/或组织的移植可用于异种移植入人中。异种移植包括但不限于血管化异种移植物、部分血管化异种移植物、非血管化异种移植、异种敷料、异种绷带和异种结构等。

本文使用的“同种异体移植”及其语法上的其他形式(例如，同种异体的移植)可以包括其中受体和供体是同一物种但不同个体的将细胞、组织或器官移植，植入或输注到接受者中的任何程序。本文所述的细胞、器官和/或组织的移植可以用于同种异体移植入人体。同种异体移植包括但不限于血管化同种异体移植、部分血管化的同种异体移植、无血管化的同种异体移植、同种异体敷料、同种异体绷带、和同种异体结构。

本文所用的“自体移植”及其语法上的其他形式(例如，自体的移植)可以包括其中接受者和供体是相同的个体的将细胞、组织或器官移植、植入或输注到接受者中的任何程序。本文所述的细胞、器官和/或组织的移植可用于自体移植入人体。自体移植包括但不限于血管化自体移植、部分血管化自体移植、非血管化自体移植、自体敷料、自体绷带和自体结构。

本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指可以由包括但不限于T细胞的免疫细胞表达的工程化分子。CAR在T细胞中表达并且可以重定向T细胞以诱导以由人造受体决定的特异性杀死靶细胞。CAR的细胞外结合结构域可以衍生自鼠、人源化或完全人单克隆抗体。

本文所用的术语“表位”及其语法上的其他形式可以指可被抗体、B细胞、T细胞或工程细胞识别的部分抗原。例如，表位可以是被TCR识别的肿瘤表位或病原体表位。也可以识别抗原内的多个表位。表位也可以突变。

本文所用的术语“工程化”及其语法上的其他形式可以指核酸的一个或多个改变，例如生物体基因组内的核酸。术语“工程化”可以指基因的改变、添加和/或缺失。工程细胞还可以指具有加入、缺失和/或改变的基因的细胞。

本文所用的术语“细胞”或“工程细胞”及其语法上的其他形式可以指人或非人动物来源的细胞。工程细胞也可以指表达CAR的细胞。

本文所用的术语“转染”是指将外源核酸引入真核细胞。转染可以通过本领域已知的各种手段来实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹道技术(biolistics)。

术语“稳定转染”或“稳定地转染”是指将外源核酸、DNA或RNA引入和整合到转染细胞的基因组中。术语“稳定转染体”(stable transfectant)是指将外来DNA稳定地整合到基因组DNA中的细胞。

如本文所用，术语“核酸分子编码”、“编码DNA序列”和“编码DNA”是指沿着脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或顺序。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了沿着多肽(蛋白质)链的氨基酸的顺序。因此，核酸序列编码氨基酸序列。

本文所用的术语“个体”是指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本发明的个体包括但不限于人类、非人类灵长类动物(例如恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。

本文所用的术语“外周血淋巴细胞”(PBL)及其语法上的其他形式可以指在血液(例如外周血)中循环的淋巴细胞。外周血淋巴细胞可以指不局限于器官的淋巴细胞。外周血淋巴细胞可以包含T细胞、NK细胞、B细胞或其任何组合。

本文所用的术语“免疫应答细胞”或“免疫反应性细胞”可以指可以引发免疫应答的细胞，包括但不限于T细胞、B细胞和NKT细胞、它们各自的前体细胞及其后代。免疫应答细胞还可以指淋巴或骨髓谱系的细胞。

本文所用的术语“T细胞”及其语法上的其他形式可以指任何来源的T细胞。例如，T细胞可以是原代T细胞例如自体T细胞等。T细胞也可以是人或非人的。

本文所用的术语“T细胞活化”或“T细胞触发”及其语法上的其他形式可以指被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖、细胞因子产生和/或可检测的效应物功能的T细胞的状态。在一些实施方案中，“完全T细胞活化”可以类似于触发T细胞的细胞毒性。可以使用本领域已知的各种测定来测量T细胞活化。所述测定可以是测量细胞因子分泌的ELISA、ELISPOT、用于测量细胞内细胞因子表达的流式细胞术测定(CD107)、用于测量增殖的流式细胞术测定、和用于确定靶细胞消除的细胞毒性测定(51Cr释放测定)。所述测定通常使用对照(非工程细胞)与工程细胞(CAR T)进行比较，以确定与对照相比，工程细胞的相对激活。此外，所述测定可以与未表达靶抗原的靶细胞孵育或接触的工程细胞进行比较。例如，所述比较可以是与不表达CD19的靶细胞孵育的CD19-CART细胞进行的比较。

当用于指核苷酸序列时，本文所用的术语“序列”及其语法上的其他形式可以包括DNA或RNA，并且可以是单链或双链。核酸序列可以突变。核酸序列可以具有任何长度，例如长度为2至1,000,000或更个核苷酸(或其间或之上的任何整数值)核酸，例如长度为约100至约10,000个核苷酸或约200至约500个核苷酸。

本文所用的术语“有效量”是指提供治疗或预防益处的量。

本文所用的术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含与待表达的核苷酸序列有效连接的表达调控序列。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件(cis-acting elements)；用于表达的其它元件可以由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域所有已知的那些，例如粘粒、质粒(例如裸露或包含在脂质体中的)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

本文所用的术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的属。逆转录病毒在能够感染非分裂细胞方面是逆转录病毒中独特的；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。源自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。

本文所用的术语“可操作地连接”是指在调控序列和异源核酸序列之间的功能性连接，该连接导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列成功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接到编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在必要时在相同的阅读框中连接两个蛋白质编码区。

本文使用的术语“启动子”定义为由启动多核苷酸序列的特异性转录所需的细胞的合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列。

本文使用的术语“载体”是包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的组合物。在本领域中已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。

本文使用的术语序列“同一性”通过在比较窗口(例如至少20个位置)上比较两个经最佳匹配的序列来确定同一性百分比，其中比较窗口中多核苷酸或多肽序列的部分可以包含添加或缺失(即间隙)，例如对于最佳匹配的两个序列而言与参考序列(其不包含添加或缺失)相比20％或更少的间隙(例如5至15％、或10至12％)。通常通过确定在两个序列中发生相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目来计算百分比，以产生正确匹配的位置的数目，将正确匹配位置的数目除以参考序列中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100，以产生序列同一性的百分比。

本文所用的术语“I型干扰素”包括IFNα、IFNβ、以及IFN-ε、IFN-κ以及IFN-ω等。所有的I型干扰素均与由IFNAR1和IFNAR2两条链组成的特定的细胞表面受体(即所谓的IFN-α/β受体)结合。在一些实施方案中，本文所用的术语“I型干扰素”为IFNα或IFNβ。在一些实施方案中，本文所用的术语“I型干扰素”为IFNβ。在一些实施方案中，本文所用I型干扰素包括人类、小鼠、或者合成的I型干扰素。在一些实施方案中，本文所用的术语“干扰素α”可以是具有NCBI aaa52724.1或aaa52716.1或aaa52725.1所示序列的多肽，或者是序列与这些序列具有至少有85％的同一性的多肽。在一些实施方案中，本文所用的术语“干扰素β”(INF-β)可以是具有NCBI aac41702.1或np_002167.1或aah96152.1p41273或NP 001552至少有85％同一性的蛋白，或者是其具有肿瘤坏死因子(TNF)配体功能的片段。

在一些实施方案中，应用于构建所述的结合抗原的受体的元件或所述的I型干扰素可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物；也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组各元件或I型干扰素。优选的，本发明可采用重组的各元件或I型干扰素。

在所述各元件或I型干扰素多肽序列的基础上，经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列也包括在本发明中。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。

所述各元件或I型干扰素的多肽的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，所述的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其作为全长多肽的一部分，仍然能保持全长的多肽的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长多肽的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长多肽的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在所述各元件或I型干扰素多肽序列的基础上，经修饰或改良的多肽也可以应用到本发明中，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或多肽的效力而加以修饰或改良的多肽。也就是说，任何不影响多肽的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

本文所用的术语“疾病”或“病症”或“紊乱”等是指任何损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的改变或失调。例如，所述的“疾病”包括但不限于：肿瘤、病原体感染、自身免疫性疾病、T细胞功能障碍性疾病、或免疫耐受能力缺陷(如移植排斥)。

本文所用的术语“肿瘤”指的是一种以细胞或组织的病理性增生为特征的疾病，及其随后的迁移或侵袭其他组织或器官。肿瘤生长通常是不受控制的和进行性的，不诱导或抑制正常细胞增殖。肿瘤可影响多种细胞、组织或器官，包括但不限于选自膀胱、骨、脑、乳腺、软骨、神经胶质细胞、食管、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾、肝、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、尿道、输尿管、尿道、子宫、阴道器官，或组织或相应的细胞。肿瘤包括癌症，如肉瘤，癌，或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。本发明所述的肿瘤，可包括，但不限于白血病(如急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病，急性粒细胞白血病，急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性白血病、慢性白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症)，淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、原发性巨球蛋白血症，重链病，实体瘤如肉瘤和癌症(如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤，滑膜vioma，间皮瘤，尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、癌、支气管癌、髓样癌、肾细胞癌、肝癌，尼罗河管癌，绒癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤，颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤，听神经瘤，少突胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤)、食管癌、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤。较佳地，所述的“肿瘤”包括但不限于：胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌和胶质瘤。

本发明中提及的肿瘤抗原的类型也可以是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是肿瘤细胞独特的，不发生在体内的其他细胞上。TAA相关抗原不是肿瘤细胞独有的，而是在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在使得免疫系统能够对抗原作出反应的条件下发生。当免疫系统不成熟并且不能应答时，TAA可以是在胎儿发育期间在正常细胞上表达的抗原，或者它们可以是通常以正常细胞上极低水平存在但在肿瘤细胞上以更高水平表达的抗原。

TSA或TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多中心抗原如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位引起的独特的肿瘤抗原，例如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、和MYL-RAR；以及病毒抗原，如爱泼斯坦巴尔病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7等。其他大的、基于蛋白质的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、beta-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP、以及TPS。

在一些实施方案中，所述的“肿瘤抗原”包括但不限于：前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、IL13Ralpha、HER-2、CD19、NY-ESO-1、HIV-1Gag、Lewis Y、MART-1、gp100、酪氨酸酶、WT-I、hTERT、间皮素、EGFR、EGFRvIII、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、EphA2、HER3、EpCAM、MUC1、MUC16、CLDN18.2、叶酸受体、CLDN6、CD30、CD138、ASGPR1、CDH16、GD2、5T4、8H9、αvβ6整合素、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD20、CD22、κ轻链(kappa light chain)、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD171、CSPG4、EGP2、EGP40、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胚胎型AchR、GD2、GD3、HLA-AI MAGE A1、MAGE3、HLA-A2、IL11Ra、KDR、Lambda、MCSP、NCAM、NKG2D配体、PRAME、PSCA、PSC1、ROR1、Sp17、SURVIVIN、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、HMW-MAA、VEGF受体、和/或纤连蛋白、腱生蛋白或肿瘤坏死区的癌胚变体。

本文所用的术语“病原体”是指能够引起疾病的原生动物，包括：病毒、细菌、真菌或寄生虫。所述的“病毒抗原”是指病毒表达的，能够诱导免疫反应的多肽。

典型的病毒包括但不限于，逆转录病毒科(如人类免疫缺陷病毒，比如HIV-1(也被称为HDTV-III，LAVE或HTLV-Ⅲ/LAV，或HIV-III；和其他菌株，如HIV-LP；小核糖核酸病毒(如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；人类肠道病毒，柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒(例如菌株引起的肠胃炎)；披盖病毒(如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(如登革热病毒、乙型脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(例如冠状病毒)；弹状病毒科(如水泡性口炎病毒、狂犬病毒)；丝状病毒科(如埃博拉病毒)；副粘病毒科(如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒(如流感病毒)；亚病毒科(例如汉坦病毒，部分病毒，白蛉和内罗病毒)；舞台病毒科(出血热病毒)；呼肠病毒科(如呼肠孤病毒，环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒；肝病毒(乙型肝炎病毒)；微小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头状瘤病毒，多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒(单纯疱疹病毒(HSV)的1和2，水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒；痘病毒(天花病毒、牛痘病毒，痘病毒)；虹彩病毒科(如非洲猪瘟病毒)；和未分类的病毒(如三角洲肝炎剂(认为是一个有缺陷的卫星TE乙型病毒性肝炎)、非甲非乙型肝炎的药物，(1级＝内部传递；232类非肠道传播(即丙型肝炎)；诺瓦克和相关病毒和星状病毒)。

典型的细菌，包括但不限于，巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和铜绿假单胞菌。传染性细菌具体的实例包括，但不限于，幽门螺杆菌，螺旋体，嗜肺军团菌，分枝杆菌SPS(如结核杆菌，鸟型结核杆菌，内分枝杆菌，M.Kansaii，M.gordonae)，金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、单增李斯特菌、化脓性链球菌(A组链球菌)，无乳链球菌(B组链球菌链球菌(草绿色链球菌组)、粪链球菌、牛链球菌、链球菌(厌氧SPS)，肺炎链球菌，弯曲杆菌属、肠球菌属、流感嗜血杆菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、棒状杆菌属、梭菌属丹毒丝菌，产气荚膜梭菌、破伤风杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、多杀性巴氏杆菌、类杆菌属、具核梭杆菌、念珠状链，梅毒密螺旋体，雅司螺旋体、钩端螺旋体、立克次体、以色列放线菌。

在一些实施方案中，本发明的免疫应答细胞能够识别并结合寄生虫抗原。所述寄生虫包括内寄生虫和外寄生虫。所述内寄生虫包括原生动物、蠕虫、蛔虫、和吸虫。在一些实施方案中，所述寄生虫抗原例如是源自以下科的物种的抗原：Entamoeba histolytica；Babesia B.divergens,B.bigemina,B.equi,B.microfti,B.duncani；Balantidium coli；Blastocystis spp.；Trypanosoma cruzi；Cryptosporidium spp.；Cyclosporacayetanensis；Dientamoeba fragilis；Giardia lamblia；Balamuthia mandrillaris；Acanthamoeba spp.；Isospora belli；Leishmania spp.；Plasmodium falciparum,Plasmodium vivax,Plasmodium ovale curtisi,Plasmodium ovale wallikeri,Plasmodium malariae,Plasmodium knowlesi；Naegleria fowleri；Rhinosporidiumseeberi；Sarcocystis bovihominis,Sarcocystis suihominis；Trypanosoma brucei；Toxoplasma gondii；Trichomonas vaginalis；Taenia saginata；Bertiella mucronata,Bertiella studeri；Taenia solium；Diphyllobothrium latum；Echinococcusgranulosus,Echinococcus multilocularis,E.vogeli,E.oligarthrus；Hymenolepisnana,Hymenolepis diminuta；Spirometra erinaceieuropaei；Cestoda,Taeniamulticeps；Clonorchis sinensis；Clonorchis viverrini；Dicrocoelium dendriticum；Fasciola hepatica,Fasciola gigantica；Fasciolopsis buski；Gnathostomaspinigerum,Gnathostoma hispidum；Metagonimus yokogawai；Metorchis conjunctus；Opisthorchis viverrini,Opisthorchis felineus,Clonorchis sinensis；Paragonimuswestermani；Paragonimus africanus；Paragonimus caliensis；Paragonimuskellicotti；Paragonimus skrjabini；Paragonimus uterobilateralis；Schistosomasp.；Schistosoma mansoni and Schistosoma intercalatum；Schistosoma haematobium；Schistosoma japonicum；Schistosoma mekongi；Echinostoma echinatum；Trichobilharzia regenti,Schistosomatidae；Ancylostoma duodenale,Necatoramericanus；Angiostrongylus costaricensis；Anisakis；Ascaris sp.Ascarislumbricoides；Baylisascaris procyonis；Brugia malayi,Brugia timori；Dioctophymerenale；Dracunculus medinensis；Enterobius vermicularis,Enterobius gregorii；Halicephalobus gingivalis；Loa loa filaria；Mansonella streptocerca；Onchocercavolvulus；Strongyloides stercoralis；Thelazia californiensis,Thelaziacallipaeda；Toxocara canis,Toxocara cati；Trichinella spiralis,Trichinellabritovi,Trichinella nelsoni,Trichinella nativa；Trichuris trichiura,Trichurisvulpis；Wuchereria bancrofti；Archiacanthocephala,Moniliformis moniliformis；Linguatula serrata；Oestroidea；Calliphoridae,Sarcophagidae；Cochliomyiahominivorax；Tunga penetrans；Cimex lectularius；Dermatobia hominis；Pediculushumanus；Pediculus humanus corporis；Pthirus pubis；Demodex folliculorum/brevis/canis；Sarcoptes scabiei；Trombiculidae；Pulex irritans；Ixodidae和Argasidae。

本文所用的术语“自身免疫性疾病”定义为由自身免疫应答引起的病症。自身免疫性疾病是对自身抗原的不适当和过度反应的结果。自身免疫性疾病的实例包括但不限于阑尾炎、秃头症、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩病、糖尿病(I型)、营养不良的大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病、吉兰巴尔综合征、桥本病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、脊柱关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等。

“耐受”或“免疫耐受”是免疫系统对特定抗原产生防御性免疫应答的失败。耐受性可以是天然的或自身的，其中身体不会攻击其自身的蛋白质和抗原，或者可以通过免疫系统的操作而诱导。中枢耐受发生在淋巴细胞发育过程中，并在胸腺和骨髓中起作用。在此过程中，识别自身抗原的T淋巴细胞和B淋巴细胞在发育成完全免疫活性细胞之前被缺失。这个过程在胎儿发育过程中是最活跃的，但是随着未成熟的淋巴细胞的生成而持续终生。外周T细胞耐受性是指存在于外周组织中的自身抗原的功能性无反应性，并且在T和B细胞成熟并进入周边后发生。这些过程包括通过“调节性”T细胞抑制自身反应性细胞，以及在没有伴随炎症的共刺激信号的情况下遇到抗原的淋巴细胞中产生低反应性(无反应性)。“获得性”或“诱导耐受性”是指免疫系统对外部抗原的适应，其特征在于淋巴组织与给定抗原的特异性非反应性，在其他情况下可能诱导细胞介导的或体液免疫。在成年人中，可以通过重复施用非常大剂量的抗原或低于刺激免疫应答所需阈值的小剂量(例如通过静脉内或舌下施用可溶性抗原)来临床诱导耐受性。诱导免疫耐受性形成的抗原称为耐受原(Tolerogen)。免疫抑制也有利于诱导耐受。自我耐受的破坏可导致自身免疫。

非自身抗原的免疫识别通常使来自相同物种(同种异体移植物)的生物的外来组织的移植和移植复杂化，导致移植排斥。淋巴细胞，特别是T淋巴细胞，在同种异体移植排斥、移植失败和GVHD中起关键作用。通常有两种情况可以接受同种异体移植。一个是当细胞或组织移植到从免疫监视系统分离的免疫豁免位点(如在眼睛或睾丸中)时，或具有强的分子信号以防止危险的炎症(如在脑中)。第二种情况是当已经诱导出耐受状态时，无论是先前以致使免疫耐受而不是接受者致敏的方式暴露于供体的抗原，或者在慢性排斥之后。成功的同种异体移植需要针对同种异体抗原生出一定程度的免疫耐受性。免疫耐受性的实现可以防止导致移植排斥和失败的宿主抗移植物反应，并防止移植物抗宿主反应(GVHD)。

本文所用的术语“增强免疫应答细胞功能”包括例如增强T细胞功能。以T细胞为例，增强T细胞功能包括诱导、引起或刺激T细胞使其具有持续的或增强的生物功能，或更新或重新激活耗竭的(exhausted)或非活性的T细胞。增强T细胞功能的实例包括：相对于干预前水平，CD8+T细胞分泌的干扰素增加、增殖增加、抗原反应性(例如病毒或病原体清除率)增加。在一个实施方案中，增强水平至少为50％，或者60％，70％，80％，90％，100％，120％，150％，200％。测量这种增强的方式是本领域普通技术人员已知的。

本文所用的术语“T细胞功能障碍性疾病”包括以抗原刺激反应性降低为特征的T细胞的病症或病症。在一些实施方案中，所述T细胞功能障碍性病症是与通过PD-1的不适当增加的信号传导特异性相关的病症。在一些实施方案中，T细胞功能障碍性疾病是其中T细胞是无能的或分泌细胞因子、增殖或执行溶细胞活性的能力降低的疾病。以T细胞功能障碍为特征的T细胞功能障碍性疾病的实例包括未吸收的急性感染、慢性感染和肿瘤免疫。

本文所用的术语“外源性”指的是一个核酸分子或多肽，其在细胞内没有内源性表达，或表达水平不足以实现过表达时具有的功能。因而，“外源性”包括在细胞内表达的重组核酸分子或多肽，如外源性、异源性和过表达的核酸分子和多肽。

本文所用的术语“受体”是指一种多肽，或其部分，其在细胞膜上选择性地结合一个或多个配体。

在一些实施方案中，本发明的结合抗原的受体与能够与之结合的抗原特异性结合。

在一些实施方案中，本发明的结合抗原的受体是嵌合抗原受体。本文所用的术语“嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)”指一种融合到细胞内信号转导域的肿瘤抗原结合结构域，能激活T细胞。常见地，CAR的胞外结合结构域来源于小鼠或人源化或人的单克隆抗体。

嵌合抗原受体通常包含胞外抗原结合区或者抗原结合单元。在一些实施方案中，胞外抗原结合区可以是完全人的。在其他情况下，胞外抗原结合区域可以被人源化。在其他情况下，胞外抗原结合区可以是鼠源的，或者所述胞外抗原结合区中的嵌合体由来自至少两种不同动物的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述胞外抗原结合区可以是非人的。

可以设计多种抗原结合区域。非限制性实例包括衍生自抗体的单链可变片段(scFv)、选自文库的片段抗原结合区(Fab)、单结构域片段或与接合其同源受体的自然配体。在一些实施方案中，胞外抗原结合区域可以包含scFv、Fab或天然配体，以及它们的任何衍生物。胞外抗原结合区可以指除完整抗体之外的分子，其可以包含完整抗体的一部分并且可以与完整抗体所结合的抗原结合。抗体片段的实例可以包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；双功能抗体、线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

胞外抗原结合区，例如scFv、Fab或天然配体，可以是确定抗原特异性的CAR的一部分。胞外抗原结合区可以结合任何互补靶。胞外抗原结合区可以衍生自已知可变区序列的抗体。胞外抗原结合区可以从获自可获得的小鼠杂交瘤的抗体序列中得到。或者，可以从肿瘤细胞或原代细胞例如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的全外切割测序获得胞外抗原结合区。

在一些实施方案中，胞外抗原结合区的结合特异性可以通过互补决定区或CDR，如轻链CDR或重链CDR来确定。在许多情况下，结合特异性可以通过轻链CDR和重链CDR来确定。与其他参考抗原相比，给定的重链CDR和轻链CDR的组合可以提供给定的结合袋，其可以赋予抗原(例如GPC3)更大的亲和力和/或特异性。例如，特异于磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的CDR可以在CAR的细胞外结合区域中表达，使得靶向GPC3的CAR可以将免疫应答细胞靶向表达GPC3的肿瘤细胞。

在本文公开的任何实施方案的某些方面，胞外抗原结合区，例如scFv可以包含对抗原特异性的轻链CDR。轻链CDR可以是抗原结合单元例如CAR的scFv轻链的互补决定区。轻链CDR可以包含连续的氨基酸残基序列，或由非互补决定区(例如框架区)隔开的两个或更多个连续的氨基酸残基序列，。在一些实施方案中，轻链CDR可以包含两个或更多个轻链CDR，其可以被称为轻链CDR-1，CDR-2等。在一些实施方案中，轻链CDR可以包含三个轻链CDR，其可分别称为轻链CDR-1，轻链CDR-2和轻链CDR-3。在一些实例中，存在于普通轻链上的一组CDR可统称为轻链CDR。

在本文公开的任何实施方案的某些方面，胞外抗原结合区，例如scFv可以包含对抗原特异的重链CDR。重链CDR可以是抗原结合单元例如scFv的重链互补决定区。重链CDR可以包含氨基酸残基的连续序列，或由非互补决定区(例如框架区)隔开的两个或更多个氨基酸残基的连续序列。在一些实施方案中，重链CDR可以包含两个或更多个重链CDR，其可以称为重链CDR-1，CDR-2等。在一些实施方案中，重链CDR可以包含三个重链CDR，其可分别称为重链CDR-1，重链CDR-2和重链CDR-3。在一些实施方案中，存在于共同重链上的一组CDR可统称为重链CDR。

通过使用基因工程，可以以各种方式修饰胞外抗原结合区。在一些实施方案中，可以突变胞外抗原结合区域，从而可以选择胞外抗原结合区域以对其靶标具有更高的亲和力。在一些实施方案中，胞外抗原结合区域对其靶标的亲和力可针对可在正常组织上以低水平表达的靶标进行优化。可以进行此优化，以尽量减少潜在的毒性。在其他情况下，对靶标的膜结合形式具有更高亲和力的胞外抗原结合区域的克隆可以优于其可溶形式的对应物。可以进行这种修饰，因为也可以检测到不同水平的可溶形式的靶标，并且它们的靶向可引起不期望的毒性。

在一些实施方案中，胞外抗原结合区域包括铰链或间隔区。术语铰链和间隔区可以互换使用。铰链可以被认为是用于向胞外抗原结合区提供柔性的CAR的一部分。在一些实施方案中，铰链可用于检测细胞的细胞表面上的CAR，特别是当检测胞外抗原结合区的抗体不起作用或可用时。例如，衍生自免疫球蛋白的铰链的长度可能需要优化，这取决于胞外抗原结合区域靶向靶上的表位的位置。

在一些实施方案中，铰链可能不属于免疫球蛋白，而是属于另一种分子，如CD8α分子的天然铰链。CD8α铰链可以含有已知在CD8辅助受体和MHC分子的相互作用中起作用的半胱氨酸和脯氨酸残基。所述半胱氨酸和脯氨酸残基可影响所述CAR的性能。

CAR铰链可以是尺寸可调的。免疫应答细胞和靶细胞之间的免疫突触的这种形貌还限定了由于细胞表面靶分子上的膜远端表位而不能由CAR进行功能桥接的距离，即使用短铰链CAR也不能使突触距离达到信号能够传导的近似值。同样，膜近端CAR靶抗原表位仅在长铰链CAR的背景下观察到信号输出。可以根据所使用的胞外抗原结合区域来调节铰链。铰链可以是任何长度的。

跨膜结构域可以将CAR锚定在细胞的质膜上。CD28的天然跨膜部分可用于CAR。在其他情况下，也可以在CAR中使用CD8α的天然跨膜部分。“CD8”可以是与NCBI参考号：NP_001759或其具有刺激活性的片段具有至少85、90、95、96、97、98、99或100％同一性的蛋白质。“CD8核酸分子”可以是编码CD8多肽的多核苷酸，在某些情况下，跨膜区可以是CD28的天然跨膜部分，“CD28”可以指与NCBI参考号：NP_006130或其具有刺激活性的片段具有至少85、90、95、96、97、98、99或100％同一性的蛋白质。“CD28核酸分子”可以是编码CD28多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，跨膜部分可以包含CD8α区域。

CAR的(细)胞内信号传导区域可以负责活化CAR已经置于其中的免疫应答细胞的效应子功能中的至少一种。CAR可以诱导T细胞的效应子功能，例如，所述效应子功能是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语细胞内信号传导区域是指转导效应子功能信号并引导细胞进行特异功能的蛋白质部分。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导区域，但是在许多情况下，不必使用信号结构域的整个链。在一些实施方案中，使用细胞内信号传导区的截短部分。在一些实施方案中，术语细胞内信号传导区域因此意在包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导区的任何截短部分。

在CAR中使用的信号结构域的优选实例可以包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列和协同作用以在靶-受体结合之后启动信号转导的共同受体，以及它们的任何衍生物或变体序列和这些序列的具有相同功能性的任何合成序列。

在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域可以含有已知的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的信号基序。含有细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。然而，在优选的实施方案中，细胞内信号结构域衍生自CD3ζ链。

含有一个或多个ITAM基序的T细胞信号结构域的实例是CD3ζ结构域，也称为T细胞受体T3ζ链或CD247。该结构域是T细胞受体-CD3复合物的一部分，并且在将几种细胞内信号转导途径的抗原识别与T细胞的主效应激活相结合方面起重要作用。如本文所用，CD3ζ主要是指人类CD3ζ及其同种型，如从Swissprot条目P20963所知的，包括具有基本相同序列的蛋白质。作为嵌合抗原受体的一部分，再次重申，不需要全T细胞受体T3ζ链，并且其包含T细胞受体T3ζ链的信号结构域的任何衍生物都是合适的，包括其任何功能等同物。

细胞内信号传导结构域可以选自表1的任何一个结构域。在一些实施方案中，可以修饰结构域，使得与参考结构域的同一性可以为约50％至约100％。可以修饰表1的任何一个结构域，使得修饰形式可以包含约50、60、70、80、90、95、96、97、98、99或至多约100％的同一性。

CAR的细胞内信号传导区可以进一步包含一个或多个共刺激结构域。细胞内信号传导区可以包含单个共刺激结构域，例如ζ链(第一代CAR)或其与CD28或4-1BB(第二代CAR)。在其他实例中，细胞内信号传导区可以包含两个共刺激结构域，例如CD28/OX40或CD28/4-1BB(第三代)。

与细胞内信号结构域如CD8一起，这些共刺激结构域可以产生激酶途径的下游激活，从而支持基因转录和功能性细胞反应。CAR的共刺激结构域可以激活与CD28(磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶)或4-1BB/OX40(TNF-受体相关因子衔接蛋白)途径以及MAPK和Akt激活相关的近端信号蛋白。

在某些情况下，通过CAR产生的信号可能与辅助或共刺激信号相结合。对于共刺激信号结构域，嵌合抗原受体样复合物可被设计成包含若干可能的共刺激信号结构域。如本领域众所周知的，在幼稚T细胞中，T细胞受体的单独接合不足以诱导T细胞的完全活化为细胞毒性T细胞。完整的生产性T细胞激活需要第二共刺激信号。已经报道对T细胞活化提供共刺激的几种受体，包括但不限于CD28、OX40、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BBL、MyD88和4-1BB。这些共刺激分子使用的信号传导途径均能与主T细胞受体激活信号协同作用。这些共刺激信号传导区域提供的信号可以与源自一个或多个ITAM基序(例如CD3zeta信号转导域)的主效应激活信号协同作用，并且可以完成T细胞激活的要求。

在一些实施方案中，向嵌合抗原受体样复合物添加共刺激结构域可以增强工程细胞的功效和耐久性。在另一个实施方案中，T细胞信号结构域和共刺激结构域彼此融合从而构成信号传导区。

表1.共刺激结构域

嵌合抗原受体结合靶抗原。当在体外或离体测定T细胞活化时，可以从各种来源获得或分离靶抗原。本文使用的靶抗原是抗原或抗原上的免疫表位，其在哺乳动物中对于免疫识别和最终消除或控制致病因素或疾病状态中至关重要。免疫识别可以是细胞和/或体液。在细胞内病原体和癌症的情况下，免疫识别可以是例如T淋巴细胞反应。

靶抗原可以衍生或分离自例如病毒性微生物例如本文前述病毒的抗原。在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体结合例如包括HIV(Korber等，eds HIV MolecularImmunology Database，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，N.Mex.1977)、流感，疱疹、单纯疱疹人乳头状瘤病毒(美国专利号5,719,054)、乙型肝炎(美国专利号5,780,036)、丙型肝炎(美国专利号5,709,995)、EBV、巨细胞病毒(CMV)的病毒等。

靶抗原还可以衍生自或从本文前述的病原细菌分离。在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体结合例如来自衣原体(美国专利号5,869,608)、分枝杆菌、军团菌、脑膜炎、A组链球菌、沙门氏菌、李斯特菌、流感嗜血杆菌(美国专利号5,955,596)等的抗原。

在一些实施方案中，靶抗原可以衍生或分离自例如包括曲霉属(Aspergillus)、侵入性假丝酵母属(美国专利号5,645,992)、诺卡氏菌属、组织胞浆菌病、隐孢子虫病等的病原性酵母。

在一些实施方案中，靶抗原可以衍生或分离自例如致病性原生动物和病原性寄生虫，包括但不限于卡氏肺囊虫、锥虫病、利什曼原虫(美国专利号5,965,242)、疟原虫(美国专利号5,589,343)和弓形虫(Asxoplasma gondii)等。

在一些实施方案中，靶抗原包括与癌前或增生状态相关的抗原。靶抗原也可能与癌症相关或起因于癌症。例如，在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体识别并结合包括本文前述的TSA和TAA的肿瘤抗原。

本文所用的术语“调节”是指正向或负向改变。调节范例包括1％、2％、10％、25％、50％、75％、或100％变化。

本文所用的术语“治疗”是指在试图改变个人或处理细胞引起的的疾病过程中的临床干预，既可以进行预防也可以在临床病理过程干预。治疗效果包括但不限于，防止疾病的发生或复发、减轻症状、减少任何疾病直接或间接的病理后果、防止转移、减慢疾病的进展速度、改善或缓解病情、缓解或改善预后等。

本文所用的术语“免疫功能低下”是指受试者具有免疫缺陷，其很容易被感染。引起机会感染的生物体通常情况下不会导致具有健康免疫系统生病，但能感染免疫系统功能低下或免疫系统受抑制的人。

本文所用的术语“组成性表达”是指在所有的生理条件下的表达。

本文所用的术语“诱导表达”是指在一定条件下的表达，所述的条件例如T细胞与抗原发生结合的时候。本领域技术人员如何进行常规的“诱导表达”。

在一些实施方案中，本发明提供了一种免疫应答细胞，该细胞表达结合抗原的受体和外源性I型干扰素。

在一些实施方案中，本发明所述的免疫应答细胞可以靶向在癌症上表达的抗原。其抗原或表位可以在癌症或癌症相关组织上表达。在一些情况下，靶抗原可能在癌症上过表达，并且在正常组织上具有减少或无表达。在某些情况下，癌症的特异性抗原及其表位可以用本发明的免疫应答细胞靶向。抗原可以衍生自各种各样的肿瘤抗原，例如由突变产生的肿瘤抗原、共享的肿瘤特异性抗原、分化抗原和在肿瘤中过表达的抗原。仅仅举若干实例，可以被本发明所述的免疫应答细胞靶向或者结合的抗原可是是或者来源于，包括但不限于：叶酸受体α,707-AP,adipophilin,AFP,AIM-2,ALDH1A1,Annexin II,ART-4,ARTC1,BAGE,BAGE-1,BCLX(L),BCMA,BING-4,BRACHYURY(IVS7 T/C多态性),BRACHYURY(TIVS7-2,多态性),BRACHYURY,B-RAF,CAMEL,CAR-ABL融合蛋白(b3a2),CASP-5,CASP-8,Cdc27,CDC27/m,CDK4,CDK-4/m,CDKN2A,CEA,COA-1,CPSF,Cyp-B,DAM-6,-10,dek-can融合蛋白,DKK1,EFTUD2,EGFR,ELF2M,ENAH(hMena),EP-CAM,EphA3,ESO-1/LAGE-2,ETV6-AML1融合蛋白,ETV6/AML,EZH2,FGF5,FLT3-ITD,FN1,G250,G250/MN/CAIX,Gage 3,4,5,6,7,GAGE-1,2,8,GAGE-3,-4,-5,-6,-7B,GnT-V,GnTVf,Gp100,gp100/Pmel17,GPC3,GPNMB,Her2/neu,Her3,HERV-K-MEL,HLA-A1ld,HLA-A2d,HPV E6,HPV E7,hsp70-2,HSP70-2M,HST-2,hTERT,hTRT,iCE,IL13Rα2,KIAA0205,KK-LC-1,KM-HN-1,K-ras,LDLR/FUT,LDLR-岩藻糖基转移酶融合蛋白,MAGE-A1,MAGE-A10,MAGE-A12,MAGE-A2,MAGE-A3,MAGE-A4,MAGE-A6,MAGE-A9,MAGE-C2,MART-1,MART2,MC1R,M-CSFT,MCSP,mdm-2,ME1,Melan-A/MART-1,MMP-2,MUC1(VNTR多态性)-c,MUC1,MUC1-n,MUC2,MUM-1,MUM-1f,MUM-2,MUM-3,NA-88,NA88-A,NFYC,N-ras,NY-BR-1,NY-ESO-1,OA1,OGT,OS-9,P15,p53,PAP,PBF,Pml/RARα和TEL/AML1pml-RARα融合蛋白,PRAME,PRDX5,PSA,PSCA,PSMA,PTPRK,RAB38/NY-MEL-1,RAGE,RAGE-1,RBAF600,RGS5,RNF43,RU1,RU2,RU2AS,SAGE,SART-1,SART-2,SART-3,secernin 1,SIRT2,SNRPD1,SOX10,Sp17,SSX-2,SSX-4,STEAP,STEAP1,SYT-SSX1-或-SSX2融合蛋白质,TBRACHYURY,T,TAG-1,TAG-2,TGF-βRII,TPI/mbcr-abl,TRAG-3,TRP-2,TRP-1,TRP-1/gp75,TRP-2,TRP-2/INT2,TRP2-INT2g,VEGF和/或WT1,XAGE-1b,α-辅肌动蛋白-4,β-连环蛋白,β-连环蛋白/m,三磷酸异构酶,乳腺球蛋白-A,人乳头瘤病毒(HPV),人表皮生长因子受体2(HER2/neu),人表皮生长因子受体3(HER3),伸长因子2,前列腺特异性抗原(PSA),存活蛋白,新PAP,激肽释放酶4,甲胎蛋白,端粒酶,粘蛋白,细胞周期蛋白D1,肌球蛋白/m,肌球蛋白I,肠羧酸酯酶,胱天蛋白酶-8/m,酪氨酸酶。

此外，本发明的免疫应答细胞可以靶向肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原可以是宿主不正常表达的抗原，它们可能被宿主表达的分子突变，截短，错误折叠或其他异常表现；它们可以与通常表达的分子相同但却以异常高水平表达；或者它们可以在异常的环境中表达。肿瘤相关抗原可以是例如蛋白质或蛋白质片段，复合碳水化合物，神经节苷脂，半抗原，核酸，其他生物分子或其任何组合。在一些情况下，抗原可以是新抗原(neo-antigen)。新抗原可以衍生自癌细胞的体细胞突变。例如，新抗原可以是三磷酸异构酶(TPI)的突变形式。突变的纤连蛋白(FN)是可以用本发明的免疫应答细胞靶向的新抗原的另一个实例。新抗原可以通过筛选平台进行鉴定，例如生物化学，全外切割测序，遗传靶向表达(GTE)或其组合。

在某些情况下，可以被本发明的免疫应答细胞结合的靶标可能与癌症基质相关联。癌基质可能与肿瘤微环境相关。抗原可以是基质抗原。举例而言，基质抗原和表位可以存在于包括但不限于肿瘤内皮细胞、肿瘤脉管系统、肿瘤成纤维细胞、肿瘤周细胞、肿瘤基质和/或肿瘤间充质细胞上。那些抗原例如可以选自CD34、MCSP、FAP、CD31、PCNA、CD117、CD40、MMP4和/或腱生蛋白。

可以通过免疫组织化学(IHC)分析和/或流式细胞术来测量抗原的组织表达。组织表达也可以通过定量PCT(qPCR)获得的拷贝数来测量。在一些情况下，靶抗原可以在癌细胞的表面表达。在某些情况下，可被靶向的抗原可能不会在MHC或HLA的环境中表达。本发明的免疫应答细胞可以以非MHC限制的方式靶向细胞表面抗原。在一些情况下，与其在正常组织上的表达相比，可以用CAR-T靶向的抗原可能过表达。通过IHC、qPCR或流式细胞术来测量，过表达可以是在正常组织上的表达的约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或至多100倍。

在一些实施方案中，所述的结合抗原的受体包含抗原结合结构域(胞外结合区)与能活化免疫应答细胞的胞内信号结构域。较佳地，在抗原结合结构域与胞内信号结构域(胞内信号区)之间，还包括跨膜区。作为一种实施方式，所述胞外结合区包含针对抗原的抗体，所述抗原是肿瘤抗原或病原体抗原。将该结合抗原的受体表达于免疫应答细胞的表面，可使得免疫应答细胞对表达该抗原的肿瘤细胞或病原体具有高度特异性的细胞毒性作用。

在一些实施方案中，本发明所述的结合抗原的受体中，包含的抗体为单链抗体，其与跨膜区相连接，跨膜区后紧接胞内信号区。

在一些实施方案中，本发明所述的抗原结合结构域是结合肿瘤抗原的结合域。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原是分化抗原选自MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多中心抗原如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位引起的独特的肿瘤抗原，例如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、和MYL-RAR；以及病毒抗原，如爱泼斯坦巴尔病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7等。其他大的、基于蛋白质的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、beta-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP、以及TPS中的一种或多种。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原选自前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、IL13Ralpha、HER-2、CD19、NY-ESO-1、HIV-1Gag、Lewis Y、MART-1、gp100、酪氨酸酶、WT-I、hTERT、间皮素、EGFR、EGFRvIII、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、EphA2、HER3、EpCAM、MUC1、MUC16、CLDN18.2、叶酸受体、CLDN6、CD30、CD138、ASGPR1、CDH16、GD2、5T4、8H9、αvβ6整合素、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD20、CD22、κ轻链(kappa lightchain)、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD171、CSPG4、EGP2、EGP40、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胚胎型AchR、GD2、GD3、HLA-AI MAGE A1、MAGE3、HLA-A2、IL11Ra、KDR、Lambda、MCSP、NCAM、NKG2D配体、PRAME、PSCA、PSC1、ROR1、Sp17、SURVIVIN、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、HMW-MAA、VEGF受体、和/或纤连蛋白、腱生蛋白或肿瘤坏死区的癌胚变体中的一种或多种。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原选自前列腺特异性膜抗原、癌胚抗原、IL13Ralpha，HER-2，CD19，NY-ESO-1，HIV-1Gag，Lewis Y，MART-1，gp100，酪氨酸酶，WT-I，hTERT，间皮素，EGFR、EGFRvIII，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、EphA2，HER3，EpCAM，MUC1，MUC16，claudin 18.2，叶酸受体，claudin 6、CD30、CD138、MAGE3、ASGPR1和CDH16中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述结合抗原的受体的跨膜区可以选自CD8或CD28等蛋白的跨膜区。人CD8蛋白是个异二聚体，由αβ或者γδ两条链组成。在一些实施方案中，跨膜区选自CD8α或者CD28的跨膜区。此外，CD8α铰链区(hinge)是一个柔性区域，因此，CD8或CD28和跨膜区加上铰链区被用于将结合抗原的受体CAR的靶点识别结构域scFv和胞内信号区连接起来。

本发明的胞内信号结构域可以选自CD3ζ、FcεRIγ、CD28共刺激信号结构域、CD137共刺激信号结构域、及其组合。CD3分子由五个亚单位组成，其中CD3ζ亚单位(又称CD3zeta，简称Z)含有3个ITAM基序，该基序是TCR-CD3复合体中重要的信号转导区。此外，如前所述，CD28和CD137是共刺激信号分子，在与各自配体结合后其胞内信号区段产生的共刺激作用引起免疫应答细胞(主要是T淋巴细胞)的持续增殖，并能够提高免疫应答细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，提高CAR免疫应答细胞在体内的存活周期和抗肿瘤效果。在一些实施方案中，所述的细胞内的信号转导域是CD3ζ信号结构域或CD3ζ信号结构域与其它共刺激信号如CD28的组合。

在一些实施方案中，本发明的免疫应答细胞中可以包括表达构建物，该表达构建物中存在按如下方式顺序连接的元件：抗体、CD28共刺激信号结构域、CD3ζ，以及与前述元件反向连接的NFAT6、I型干扰素表达单元。较佳地，所述的抗体与CD28共刺激信号结构域之间通过CD8α跨膜区和CD8α铰链区相连。

在一些实施方案中，活化T细胞核因子NFAT(Nuclear factor of activated Tcells)在T细胞活化过程中细胞因子的转录表达起着重要的作用。基于这样考虑，本发明人将IFN-beta编码序列置于NFAT6启动子的调控之下，这样只有当CAR-T细胞接触抗原引发T细胞活化，IFN-beta才能高水平表达。

NFAT6启动子是利用6个NFAT的结合位子与IL2的最小启动子(minimal promoter)串联在一起组成的启动子(Hooijberg E,Bakker AQ,Ruizendaal JJ,Spits H.NFAT-controlled expression of GFP permits visualization and isolation of antigen-stimulated primary human Tcells.Blood.2000Jul 15；96(2):459-66)，可用于调节细胞因子如IL12等在T淋巴细胞如TCR-T中的表达(Zhang L,Kerkar SP,Yu Z,Zheng Z,Yang S,RestifoNP,Rosenberg SA，Morgan RA.Improving adoptive T cell therapy bytargeting and controlling IL-12expression to thetumor environment.MolTher.2011Apr；19(4):751-9)。

根据本发明的一个方面，本发明也包括编码所述结合抗原的受体的核酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。

本发明还提供了包含上述编码表达于免疫应答细胞表面的结合抗原的受体蛋白的核酸的载体。在一个具体实施方案中，本发明使用的载体是一种慢病毒质粒载体pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE。应理解，其它类型的病毒载体以及非病毒载体，也是可以应用的。

本发明还包括包含上述载体的病毒。本发明的病毒包括包装后的具有感染力的病毒，也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。本领域内已知的其它可用于将外源基因转导入免疫应答细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。

本发明的免疫应答细胞，其被转导有能表达结合抗原的受体和外源性I型干扰素的构建物，或表达载体，或包含该质粒的病毒。本领域常规的核酸转导方法，包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。

本发明所述的免疫应答细胞还可以进一步携带外源的细胞因子的编码序列；所述的细胞因子包括但不限于：IL-12，IL-15或IL-21等。这些细胞因子具有进一步的免疫调节或抗肿瘤的活性，能增强效应T细胞及活化的NK细胞的功能，或直接发挥抗肿瘤作用。因此，本领域技术人员可以理解，这些细胞因子的运用有助于所述的免疫应答细胞更好地发挥作用。

本发明所述的免疫应答细胞还可以表达除了上述结合抗原的受体以外的另一种结合抗原的受体。

本发明所述的免疫应答细胞还可以表达趋化因子受体；所述的趋化因子受体包括但不限于CCR2。本领域技术人员可以理解，所述的CCR2趋化因子受体可以使得体内的CCR2与之竞争性结合，对于阻断肿瘤的转移是有利的。

本发明所述的免疫应答细胞还可以表达能降低PD-1表达的siRNA或者阻断PD-L1的蛋白。本领域技术人员可以理解，竞争性阻断PD-L1与其受体PD-1的相互作用，有利于恢复抗肿瘤T细胞反应，从而抑制肿瘤生长。

本发明所述的免疫应答细胞还可以表达安全开关；较佳地，所述的安全开关包括：iCaspase-9，Truancated EGFR或RQR8。

在一些实施方案中，本发明的免疫应答细胞不表达诸如4-1BBL这类的共刺激配体。

可以将编码目标结合抗原的受体或CAR的转基因并入细胞中。例如，可将转基因并入免疫应答细胞，例如T细胞。当插入细胞时，转基因可以是互补DNA(cDNA)片段，其是信使RNA(mRNA)的拷贝；或者位于其基因组DNA原始区域的基因本身(含或不含内含子)。

编码转基因序列的核酸如DNA可以随机插入细胞的染色体。随机整合可以由将核酸(例如DNA)引入细胞的任何方法产生。例如，该方法可以包括但不限于电穿孔、超声、使用基因枪、脂转染、磷酸钙转染、使用树枝状大分子、显微注射和使用包括腺病毒、AAV和逆转录病毒载体的病毒载体、和/或II型核酶。

编码转基因的DNA也可以设计成包括报告基因，从而可以通过报告基因的活化检测转基因或其表达产物的存在。可以使用任何报道基因，例如上述那些。通过在细胞培养物中选择其中报道基因已经被活化的细胞，可以选择含有转基因的细胞。

CAR的表达可以通过表达测定法，例如qPCR或通过测量RNA的水平来验证。表达水平也可以指示拷贝数。例如，如果表达水平非常高，这可以表明CAR的多于一个拷贝被整合到基因组中。或者，高表达可以指示转基因整合在高转录区域中，例如高度表达的启动子附近。也可以通过测量蛋白质水平来验证表达，例如通过Western印迹。

在一些实施方案中，本发明的免疫应答细胞可以包含一种或多种转基因。所述一种或多种转基因可以表达CAR蛋白，而该CAR蛋白识别并结合抗原上的至少一个表位或结合抗原上的突变表位。CAR可以是功能性CAR。在一些实施方案中本发明的免疫应答细胞可以包含一种或多种CAR，或者其可以包含单一CAR和二次工程化受体。

在一些实施方案中，转基因可编码自杀基因。如癌症患者的许多有效治疗所证明的，CAR免疫应答细胞使得肿瘤消退但可伴随毒性。在一些实施方案中，当靶标抗原在正常组织和肿瘤细胞中共享时，CAR免疫应答细胞可能不能区分肿瘤和正常组织(“在靶/脱靶毒性”)。在另一些情况下，可以发生免疫系统的全身扰动，称为细胞因子释放综合征(CRS)。所述CRS可以包含全身炎症反应综合征或细胞因子风暴，这可能是CAR免疫应答细胞体内快速膨胀的后果。CRS是以发热和低血压为特征的病症，严重者可导致多器官功能衰竭。在大多数情况下，所述毒性与输注的CAR免疫应答细胞的体内扩增相关，其可引起免疫系统的整体扰动，以及释放高水平的促炎细胞因子，例如TNFα和IL-6。自杀基因可以诱导消除CAR免疫反应性细胞。自杀基因可以是在所述CAR免疫反应性细胞中诱导细胞凋亡的任何基因。自杀基因可以与所述结合抗原的受体一起编码在病毒载体内。编码自杀基因使得在特定的情况下可以缓解或者彻底中止由输注的CAR免疫应答细胞在体内扩增引起的毒性。

在一些实施方案中，可以产生存在于正常组织的抗原的CAR免疫反应性细胞，使得它们瞬时表达CAR，例如在电穿孔编码受体的mRNA之后。此外，通过包括安全开关来进一步加强CAR免疫反应性细胞的重大努力，在严重的在靶毒性的情况下，可以大大消除CAR免疫反应性细胞。编码CAR的载体可以与诸如可诱导的半胱天冬酶-9基因(由二聚化学诱导剂激活)或截短形式的EGF受体R(由单克隆抗体西妥昔单抗激活)或RQR8的安全开关组合。

本文所用的一个或多个转基因可以来自不同的物种。例如，一个或多个转基因可以包含人基因、小鼠基因、大鼠基因、猪基因、牛基因、狗基因、猫基因、猴基因、黑猩猩基因或其任何组合。例如，转基因可以来自具有人类遗传序列的人。一个或多个转基因可以包含人基因。在某些情况下，一个或多个转基因不是腺病毒基因。

如上所述，转基因可以以随机或位点特异性方式插入免疫反应性细胞的基因组中。例如，可以将转基因插入到免疫细胞的基因组中的随机位点。这些转基因可以是功能性的，例如，在插入到基因组中的任何地方中时是完全功能性的。例如，转基因可以编码其自身的启动子，或者可以插入其内部启动子控制的位置。或者，可以将转基因插入基因，例如基因的内含子或基因的外显子、启动子或非编码区。可以插入转基因使得插入破坏基因，例如内源性免疫检查点。

在一些实施方案中，一个以上拷贝的转基因可以插入到基因组内的多个随机位点。例如，可将多个拷贝插入基因组中的随机位点。与转基因随机插入一次相比，这可能导致整体表达增加。或者，转基因的拷贝可以插入到基因中，转基因的另一拷贝可以插入到不同的基因中。可以靶向转基因，使其可以插入到免疫反应性细胞的基因组中的特定位点。

在一些实施方案中，包含编码结合抗原的受体序列的多核酸可以采取质粒载体的形式。质粒载体可以包含启动子。在某些情况下，启动子可以是组成型的。在一些实施方案中，启动子是可诱导的。启动子可以是或可以衍生自CMV、U6、MND或EF1a。在一些实施方案中，启动子可以与CAR序列相邻。在一些实施方案中，质粒载体还包含剪接受体。在一些实施方案中，剪接受体可以与CAR序列相邻。启动子序列可以是PKG或MND启动子。MND启动子可以是含有骨髓增生性肉瘤病毒增强子修饰的MoMuLV LTR的U3区域的合成启动子。

在一些实施方案中，可以设计编码目标受体的多核酸，以通过非病毒技术递送至细胞。在某些情况下，多核酸可以是良好的制造规范(GMP)兼容试剂。

编码目标结合抗原的受体或CAR的多核酸的表达可以由一种或多种启动子控制。启动子可以是普遍存在的，组成型(不受限制的启动子，允许相关基因的连续转录)，组织特异性启动子或诱导型启动子。可以调节插入邻近或接近启动子的转基因的表达。例如，转基因可插入到普遍存在的启动子附近或旁边。一些普遍存在的启动子可以是CAGGS启动子、hCMV启动子、PGK启动子、SV40启动子或ROSA26启动子。

启动子可以是内源的或外源的。例如，可以将一个或多个转基因插入到内源或外源ROSA26启动子的邻近或接近处。此外，启动子可以是免疫反应性细胞的特异性。例如，一个或多个转基因可以插入猪ROSA26启动子的邻近或接近。

组织特异性启动子或细胞特异性启动子可用于控制表达的位置。例如，可以将一个或多个转基因插入组织特异性启动子的邻近或接近。组织特异性启动子可以是FABP启动子、Lck启动子、CamKII启动子、CD19启动子、角蛋白启动子、白蛋白启动子、aP2启动子、胰岛素启动子、MCK启动子、MyHC启动子、WAP启动子、或Col2A启动子。

也可以使用诱导型启动子。如果需要，可以通过添加或除去诱导剂来开启和关闭这些诱导型启动子。预期诱导型启动子可以是但不限于Lac、tac、trc、trp、araBAD、phoA、recA、proU、cst-1、tetA、cadA、nar、PL、cspA、T7、VHB、Mx和/或Trex。

本文所用的术语“诱导型启动子”是一种受控的启动子，其在所期待的条件未达成前不表达或者低表达与其可操作地连接的基因，而在所期待的条件达成的情况下表达或者高水平表达与其可操作地连接的基因。例如，在一些实施方中，本申请的诱导型启动子在细胞中的正常或高氧含量的条件下不表达或者低表达与其可操作地连接的基因，而响应于细胞中降低的氧含量，在缺氧条件下表达或者高表达与其可操作地连接的基因。在一些实施方案中，本文所用的诱导型启动子包括低氧可诱导的转录因子-1α(Hypoxia-InducibleTranscription factor-1α,HIF-1α)。在在一些实施方案中，本文所用的术语“诱导型启动子”是指“免疫细胞诱导型启动子”，其在免疫应答细胞接触抗原之前或免疫应答细胞未被激活之时不表达或者低表达与其可操作地连接的基因，而仅在免疫应答细胞接触抗原或免疫应答细胞被激活时，才会驱动与其操作性连接的基因发生高水平表达或者在缺氧等条件下表达。在一些实施方案中，所述的“免疫细胞诱导型启动子”包括NFAT(活化T细胞核因子)型启动子。

本文所用的“NFAT型启动子”是指基于NFAT结合活性进行调控与其可操作地连接的基因的表达的一类启动子。

NFAT是一个在免疫反应中具有重要作用的转录因子家族的统称。NFAT家族的一个或多个成员在免疫系统的大多数细胞中表达。NFAT也参与心脏、骨骼肌和神经系统的发育。

NFAT转录因子家族由五个成员NFAT1、NFAT2、NFAT3、NFAT4和NFAT5组成。NFAT1至NFAT4受钙信号调节。钙信号对NFAT激活至关重要，因为钙调蛋白(CaM)激活丝氨酸/苏氨酸磷酸酶钙调神经磷酸酶(CN)。活化的CN使NFAT蛋白氨基末端的丝氨酸丰富区域(SRR)和SP重复序列快速脱磷酸化，导致构象变化，暴露核定位信号，导致NFAT输入核中。

基于NFAT在T细胞活化过程中细胞因子的转录表达所起的作用，其可用于调控本文所述的免疫细胞诱导型启动子，从而在免疫应答细胞接触抗原活化时，表达或者高水平表达与其可操作地连接的基因。

本发明的核酸可以包含编码NFAT型启动子(或其功能部分或功能变体)的任何合适的核苷酸序列。本文所用的“NFAT型启动子”是指与T细胞表达的任何基因的最小启动子连接的一个或多个NFAT应答元件。优选地，由T细胞表达的基因的最小启动子是最小的人IL-2启动子。NFAT应答元件可以包括例如NFAT1、NFAT2、NFAT3和/或NFAT4应答元件。在一些实施方案中，本文所述的“NFAT型启动子”中可包括多于1个NFAT结合基序。例如，所述“NFAT型启动子”可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个NFAT结合基序。在一些实施方案中，所述的“NFAT型启动子”中包括多达12个NFAT结合基序。在一些实施方案中，所述“NFAT型启动子”可以是多个所述NFAT结合基序与启动子如IL2最小启动子串联所组成的启动子。在一些实施方案中，本文所述的NFAT型启动子包括6个NFAT结合基序，记作(NFAT)₆。出于便利的目的，所述(NFAT)₆也记作NFAT6。在一些实施方案中，所述NFAT6也表示在所述NFAT型启动子中的6个重复的NFAT结合基序(SEQ ID NO:78)。

此外，尽管不是表达必需的，但转基因序列还可以包括转录或翻译调控序列，例如启动子、增强子、绝缘体、内部核糖体进入位点、编码2A肽和/或多腺苷酸化信号的序列。

在一些实施方案中，转基因编码目标结合抗原的受体或CAR，其中将转基因插入安全港，使得表达所述结合抗原的受体。在一些实施方案中，将转基因插入PD1和/或CTLA-4基因座。在其他情况下，将转基因以慢病毒递送至细胞随机插入，而PD1-或CTLA-4特异性核酸酶可作为mRNA提供。在一些实施方案中，转基因通过病毒载体系统如逆转录病毒、AAV或腺病毒以及编码对于安全港特异的核酸酶(例如AAVS1、CCR5、白蛋白或HPRT)的mRNA递送。也可以用编码PD1和/或CTLA-4特异性核酸酶的mRNA处理细胞。在一些实施方案中，编码CAR的多核苷酸通过病毒递送系统与编码HPRT特异性核酸酶和PD1-或CTLA-4特异性核酸酶的mRNA一起提供。可以与本文公开的方法和组合物一起使用的CAR可以包括所有类型的这些嵌合蛋白，包括本文前述的第一、第二和第三代设计。

在一些实施方案中，可以使用逆转录病毒载体(γ-逆转录病毒或慢病毒载体)将转基因导入免疫反应性细胞。例如，编码CAR的转基因或结合抗原的任何受体或其变体或片段可被克隆到逆转录病毒载体中，并且可以由其内源性启动子、逆转录病毒长末端重复序列、或对靶细胞类型特异性的启动子驱动。也可以使用非病毒载体。非病毒载体递送系统可以包括DNA质粒、裸核酸和与递送载体如脂质体或泊洛沙姆复合的核酸。

已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将所选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体与衍生自逆转录病毒如鼠类白血病病毒的载体相比具有附加优点，因为它们可以转导非增殖细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。腺病毒载体的优点是它们不融合到靶细胞的基因组中，从而绕过负面的整合相关事件。

可以用编码所述结合抗原的受体的转基因转染细胞。转基因浓度可以为约100皮克至约50微克。在一些实施方案中，可以改变引入细胞的核酸(例如，ssDNA、dsDNA或RNA)的量以优化转染效率和/或细胞活力。例如，可以向每个细胞样品中加入1微克dsDNA用于电穿孔。在一些实施方案中，最佳转染效率和/或细胞活力所需的核酸(例如，双链DNA)的量根据细胞类型而不同。在一些实施方案中，用于每个样品的核酸(例如，dsDNA)的量可以直接对应于转染效率和/或细胞活力。例如，一系列转染浓度。由载体编码的转基因可以整合到细胞基因组中。在一些实施方案中，由载体编码的转基因前向整合。在其他情况下，由载体编码的转基因的反向整合。

在一些实施方案中，免疫反应性细胞可以是由CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和/或IL-7Rα+组成的干记忆T_SCM细胞，所述干记忆细胞还可以表达CD95、IL-2Rβ、CXCR3和/或LFA-1，并且显示出与所述干记忆细胞不同的许多功能属性。或者，免疫反应性细胞还可以是包含L-选择素和CCR7的中枢记忆体T_CM细胞，其中中枢记忆细胞可以分泌例如IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。免疫反应性细胞还可以是包含L-选择蛋白或CCR7的效应记忆T_EM细胞，并产生例如效应细胞因子如IFNγ和IL-4。

通常通过全身给药(例如静脉内、腹膜内、肌内、皮下或颅内输注)或局部应用，通过给予个体患者体内递送载体，如下所述。或者，载体可以离体递送到细胞，例如从个体患者(例如，淋巴细胞、T细胞、骨髓抽吸物、组织活检)移出的细胞，然后通常在选择并入了该载体的细胞后将细胞再植入患者体内。在选择之前或之后，可以扩增细胞。

用于表达结合抗原的受体的合适的免疫反应性细胞可以是对于有需要的个体是自体的或非自体的细胞。

可以从个体获得合适的免疫应答细胞的来源。在某些情况下，可以获得T细胞。所述T细胞可以从许多来源获得，包括PBMC、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织和来自感染部位、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤的组织。在某些情况下，可以使用任何数量的本领域技术人员已知的技术，例如Ficoll^TM分离，从自所述个体收集的血液获得T细胞。在一个实施方案中，通过单采血获得来自个体的循环血液的细胞。单采制品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采采集收集的细胞以除去血浆级分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于随后的加工步骤。

或者，可以从健康供体，来自诊断患有癌症的患者或诊断为感染的患者衍生细胞。在一些实施方案中，细胞可以是具有不同表型特征的混合细胞群体的一部分。还可以根据前述方法从转化的T细胞获得细胞系。还可以从细胞治疗库获得细胞。可以通过本文所述的任何方法获得对免疫抑制治疗有抗性的修饰细胞。还可以在修饰前选择合适的细胞群。修饰后也可以选择工程细胞群。工程细胞可用于自体移植。或者，细胞可用于同种异体移植。在一些实施方案中，将细胞施用于样品用于鉴定癌症相关靶序列的同一患者。在其他情况下，将细胞施用于不同于其样本用于鉴定癌症相关靶序列的患者的患者。

在一些实施方案中，合适的原代细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、外周血淋巴细胞(PBL)和其它血液细胞亚群，例如但不限于T细胞、天然杀伤细胞、单核细胞、天然杀伤剂T细胞、单核细胞前体细胞、造血干细胞或非多能干细胞。在一些实施方案中，细胞可以是任何免疫细胞，包括任何T细胞如肿瘤浸润细胞(TIL)，如CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或任何其他类型的T细胞。T细胞还可以包括记忆T细胞、记忆干T细胞或效应T细胞。也可以从大量群体中选择T细胞，例如从全血中选择T细胞。T细胞也可以从大量群体中扩增。T细胞也可能倾向于特定种群和表型。例如，T细胞可以倾斜于表型包含CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。合适的细胞可以选自以下列表中的一种或多种标志物：CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。合适的细胞还包括干细胞，例如，例如胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞和间充质干细胞。合适的细胞可以包含任何数量的原代细胞，例如人细胞、非人细胞和/或小鼠细胞。合适的细胞可以是祖细胞。合适的细胞可以衍生自要治疗的受试者(例如，患者)。

患者中需要的治疗有效的细胞的量可以根据细胞的存活力和细胞被遗传修饰的效率而变化(例如，转基因被整合到一个或多个细胞中的效率，或者由转基因编码的蛋白质的表达水平)。在一些实施方案中，遗传修饰后细胞存活力的产物(例如，倍增)和转基因整合的效率可以对应于可用于给予受试者的细胞的治疗量。在一些实施方案中，遗传修饰后细胞存活力的增加可能对应于给予治疗对患者有效的必需细胞量的减少。在一些实施方案中，转基因整合到一个或多个细胞中的效率的增加可以对应于给予在患者中治疗有效的必需的细胞数量的减少。在一些实施方案中，确定所需的治疗有效的细胞的量可以包括确定与细胞随时间变化相关的功能。在一些实施方案中，确定需要治疗有效的细胞的量可以包括确定与根据时间相关变量将转基因整合到一个或多个细胞中的效率变化相对应的功能(例如，细胞培养时间、电穿孔时间、细胞刺激时间)。在一些实施方案中，治疗有效的细胞可以是细胞群，其包含在细胞表面上约30％至约100％的结合抗原的受体的表达。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量，治疗有效的细胞可以在细胞表面上表达所述结合抗原的受体约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或超过约99.9％。

在一些实施方案中，当所述结合抗原的受体存在于细胞的质膜上时，并且当通过结合靶标而被活化时，可以导致具有对于其细胞表面表达所述结合抗原的受体能够结合的靶标的细胞的毒性。例如，在某些情况下，当细胞存在于细胞的质膜中时，细胞可以是细胞毒性细胞(例如，NK细胞或细胞毒性T淋巴细胞)，本文所述的结合抗原的受体，并且当其通过结合其靶标而被激活时可以增加细胞毒性细胞对靶细胞的细胞毒性活性。例如，在一些实施方案中，本文所述的结合抗原的受体，当通过其靶标的结合而被激活时，与对不存在结合靶的细胞的细胞毒性相比，可以使细胞毒性增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍或更多10倍。

本发明的免疫应答细胞可以应用于制备药物组合物。所述的药物组合物除了包括有效量的免疫应答细胞，还可包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用肠胃外给药(如注射)或其它治疗方式。

免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射或输注技术。

给予个体的包含免疫反应性细胞群体的制剂包含有效治疗和/或预防特定适应症或疾病的多个免疫反应性细胞。因此，可以向个体施用免疫反应性细胞的治疗有效群体。通常，施用包含约1×10⁴至约1×10¹⁰个免疫反应性细胞的制剂。在大多数情况下，制剂将包含约1×10⁵至约1×10⁹个免疫反应性细胞、约5×10⁵至约5×10⁸个免疫反应性细胞、或约1×10⁶至约1×10⁷个免疫反应性细胞。然而，根据癌症的位置、来源、身份、程度和严重程度、待治疗的个体的年龄和身体状况等，对个体施用的CAR免疫反应性细胞的数量将在宽的范围之间变化。医生将最终确定要使用的适当剂量。

在一些实施方案中，使用嵌合抗原受体来刺激免疫细胞介导的免疫应答。例如，T细胞介导的免疫应答是涉及T细胞活化的免疫应答。活化的抗原特异性细胞毒性T细胞能够在表面上显示外源抗原表位的靶细胞中诱导细胞凋亡，例如显示肿瘤抗原的癌细胞。在另一个实施方案中，使用嵌合抗原受体在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫。由于T细胞介导的免疫应答，受试者将产生抗肿瘤免疫。

在某些情况下，治疗患有癌症的受试者的方法可以涉及向需要治疗的受试者施用一种或多种本发明所述的免疫应答细胞。所述免疫应答细胞可结合肿瘤靶分子并诱导癌细胞死亡。如前文所述，本发明还提供治疗个体中的病原体感染的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的本发明的免疫应答细胞。

本发明的免疫反应性细胞的给药频率将根据包括所治疗疾病的因素、特定免疫反应性细胞的元件和给药方式。例如可以每日给药4次、3次、2次或每日一次、每隔一天、每三天、每四天、每五天、每六天一次、每周一次、每八天一次、每九天一次、每十天、每周一次、或者每月两次给药。如本文所述，由于本申请的免疫应答细胞具有改善的活力，从而可以不仅以与类似的但不表达外源性I型干扰素的免疫应答细胞更低的治疗有效的量给药，并且可以以更低的频率给药，以获得至少类似、并且优选更加显著的疗效。

在一些实施方案中，本发明的免疫应答细胞可以与另一治疗剂联合给药。在一些实施方案中，所述另一治疗剂是化疗药。可以与本发明的免疫应答细胞联合应用的化疗药物包括但不限于有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)，包括长春新碱、长春花碱、长春地辛和诺维宾(TM)(长春瑞滨，5'-去氢硫化氢)；拓扑异构酶I抑制剂，例如喜树碱化合物，包括Camptosar^TM(伊立替康HCL)、Hycamtin^TM(托泊替康HCL)和衍生自喜树碱及其类似物的其它化合物；鬼臼毒素衍生物，例如依托泊苷、替尼泊苷和米多昔佐兹；烷基化剂顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、布列喹嗪、尿嘧啶芥末、氯洛芬和达卡巴嗪；抗代谢物，包括阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼；抗生素，包括但不限于多柔比星、博来霉素、更生霉素、柔红霉素、霉素霉素、丝裂霉素、肉瘤霉素C和道诺霉素；以及其它化疗药物，包括但不限于抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮胞苷、阿姆沙康、美法仑、异环磷酰胺和米托蒽醌。

在一些实施方案中，可以与本发明的免疫应答细胞联合应用的化疗药物包括但不限于抗血管生成剂，包括抗VEGF抗体(包括人源化和嵌合抗体、抗VEGF适体和反义寡核苷酸)以及其他血管发生抑制剂，例如血管抑素、内皮抑制素、干扰素、白细胞介素1(包括α和β)白介素12、视黄酸和金属蛋白酶-1和-2的组织抑制剂。

在一些实施方案中，组合物可以是等渗的，即它们可以具有与血液和泪液相同的渗透压。本发明组合物的期望等渗性可以使用氯化钠或其它药学上可接受的试剂如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机溶质来实现。如果需要，组合物的粘度可以使用药学上可接受的增稠剂维持在选定的水平。合适的增稠剂包括，例如，甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选浓度将取决于所选择的试剂。显然，合适的载体和其它添加剂的选择将取决于确切的给药途径和特定剂型的性质，例如液体剂型。

本发明还提供了包含本发明免疫应答细胞的试剂盒。所述试剂盒可用于治疗或预防癌症、病原体感染、免疫病症或同种异体移植。在一个实施方案中，试剂盒可以包括含有有效量的包含一种或多种单位剂型的免疫应答细胞的治疗或预防组合物。在一些实施方案中，试剂盒包含可含有治疗或预防性组合物的无菌容器；这样的容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。这种容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适合于保持药物的材料制成。在一些实施方案中，可以提供免疫反应性细胞，例如CAR T细胞，以及将CAR免疫反应性细胞给予具有发生癌症、病原体感染、免疫病症或同种异体移植的风险的受试者的说明书。说明书通常将包括关于组合物用于治疗或预防癌症、病原体感染、免疫疾病或同种异体移植的信息。在一些实施方案中，试剂盒可以包括约1×10⁴个细胞至约1×10⁶个细胞。在一些实施方案中，试剂盒可以包括至少约1×10⁵个细胞，至少约1×10⁶个细胞，至少约1×10⁷个细胞，至少约4×10⁷个细胞，至少约5×10⁷个细胞，至少约6×10⁷个细胞，至少约6×10⁷个细胞，8×10⁷个细胞，至少约9×10⁷个细胞，至少约1×10⁸个细胞，至少约2×108个细胞，至少约3×10⁸个细胞，至少约4×10⁸个细胞，至少约5×10⁸个细胞，至少约6×10⁸个细胞，至少约6×10⁸细胞，至少约8×10⁸个细胞，至少约9×10⁸细胞，至少约1×10⁹个细胞，至少约2×10⁹个细胞，至少约3×10⁹个细胞，至少约4×10⁹个细胞，至少约5×10⁹个细胞，至少约6×10⁹个细胞，至少约8×10⁹个细胞，至少约9×10⁹个细胞，至少约1×10¹⁰个细胞，至少约2×10¹⁰个细胞，至少约3×10¹⁰个细胞，至少约4×10¹⁰个细胞，至少约5×10¹⁰个细胞，至少约6×10¹⁰个细胞，至少为ab至少约9×10¹⁰个细胞，至少约9×10¹⁰个细胞，至少约1×10¹¹个细胞，至少约2×10¹¹个细胞，至少约3×10¹¹个细胞，至少约4×10¹¹个细胞，至少约5×10¹¹个细胞，至少约8×10¹¹个细胞，至少约9×10¹¹个细胞，或至少约1×10¹²个细胞。例如，可以在试剂盒中包括大约5×10¹⁰个细胞。在另一个实例中，试剂盒可以包括3×10⁶个细胞；细胞可以扩增至约5×10¹⁰个细胞并施用于受试者。

在一些实施方案中，试剂盒可以包括同种异体细胞。在一些实施方案中，试剂盒可以包括可以包含基因组修饰的细胞。在一些实施方案中，试剂盒可以包含“现成的”细胞。在一些实施方案中，试剂盒可以包括可以扩展用于临床使用的细胞。在某些情况下，试剂盒可能包含用于研究目的的内容物。

在一些实施方案中，说明书包括以下中的至少一个：治疗剂的描述；用于治疗或预防肿瘤、病原体感染、免疫疾病或同种异体移植或其症状的剂量方案和给药；预防措施、警示、禁忌症、过量信息、不良反应、动物药理学、临床研究、和/或引用文献。说明书可以直接打印在容器上(如果有的话)，或作为容器上的标签，或作为容器内或容器中提供的单独的纸张、小册子、卡片或文件夹打印。在一些实施方案中，说明书提供施用本发明所述的免疫应答细胞用于治疗或预防肿瘤、病原体感染、免疫疾病或同种异体移植或其症状的方法。在某些情况下，说明书提供了施用化学治疗剂之前、之后或同时给予本发明的免疫反应性细胞的方法。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种治疗个体的肿瘤或病原体感染，或用于增强个体免疫耐受能力方法。在一些实施方案中，所述方法包括向有此需要的个体给予本发明的免疫应答细胞，所述免疫细胞表达所述结合抗原的受体以及外源性I型干扰素。在一些实施方案中，所述方法包括向有此需要的个体给予本发明所述的结合抗原的受体以及外源性I型干扰素。在一些实施方案中，所述外源性I型干扰素与所述表达结合抗原的受体的免疫应答细胞顺序给予或者同时给予。在一些实施方案中，所述外源性I型干扰素通过在免疫应答细胞中共表达，与所述免疫应答细胞同时向患者给予。

本发明提供了一种提高向个体给予的免疫应答细胞活力的方法，所述免疫应答细胞表达本发明所述的结合抗原的受体，并且其中所述方法包括向所述个体给予所述免疫应答细胞以及有效量的外源性I型干扰素。在一些实施方案中，所述外源性I型干扰素与所述表达结合抗原的受体的免疫应答细胞顺序给予或者同时给予。在一些实施方案中，所述外源性I型干扰素通过在免疫应答细胞中共表达，与所述免疫应答细胞同时向患者给予。

在一些实施方案中，正是由于本发明的免疫应答细胞活力得以提高，从而与不给予外源性I型干扰素或者所述免疫应答细胞不共表达所述外源性I型干扰素的情况下相比，能够以更低的剂量和/或更低的频率向给予本发明的免疫应答细胞。

在一些实施方案中，与不给予外源性I型干扰素或者所述免疫应答细胞不共表达所述外源性I型干扰素的情况下相比，向有此需要的个体给予的本发明的免疫应答细胞的量降低至少10％、20％、30、40、50％、60、70％、80％或90％。在一些实施方案中，与不给予外源性I型干扰素或者所述免疫应答细胞不共表达所述外源性I型干扰素的情况下相比，向有此需要的个体给予的本发明的免疫应答细胞的频率降低至少10％、20％、30、40、50％、60、70％、80％、或90％。或者，与不给予外源性I型干扰素或者所述免疫应答细胞不共表达所述外源性I型干扰素的情况下相比，在需要多次向有此需要的个体给予的本发明的免疫应答细胞的情况下，每次给予的间隔时间延长至少10％、20％、30、40、50％、60、70％、80％、90％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、500％、750％、1000％。

在一些实施方案中，本发明的方法使得在向所述个体给予所述免疫应答细胞后，与不存在所述外源性I型干扰素的情况相比，所述个体外周血中细胞毒性T细胞和辅助T细胞的数量之和提高至少10％、20％、30、40、50％、60、70％、80％、90％、100％、120％、140％、160％、180％、200％、500％、750％、1000％。在一些实施方案中，所述方法使得在向所述个体给予所述免疫应答细胞约5天后，所述个体外周血中细胞毒性T细胞和辅助T细胞的数量之和大于5,000个/μL、10,000个/μL、15,000个/μL、20,000个/μL、25,000个/μL；给予所述免疫应答细胞约7天后，所述个体外周血中细胞毒性T细胞和辅助T细胞的数量之和大于100个/μL、200个/μL、300个/μL、400个/μL、500个/μL、600个/μL、700个/μL、800个/μL、900个/μL、1,000个/μL、1,500个/μL、2,000个/μL、2,500个/μL、3,000个/μL、3,500个/μL、4,000个/μL、4,500个/μL、或5,000个/μL；或者给予所述免疫应答细胞约10天后，所述个体外周血中细胞毒性T细胞和辅助T细胞的数量之和大于10个/μL、20个/μL、30个/μL、40个/μL、50个/μL、60个/μL、70个/μL、80个/μL、90个/μL、或100个/μL。

本发明还提供了一种在个体中调节免疫反应的方法，该方法包括给予个体本发明的任意一种有效量的免疫应答细胞。

本发明还提供了一种加强个体免疫耐受的方法，该方法包括给予个体施用有效量本发明的免疫应答细胞，该细胞包含结合肿瘤抗原的受体和编码I型干扰素的载体。较佳地，该方法能防止或减少自身免疫性疾病或与同种异体移植相关的疾病。

本发明还提供了一种治疗或预防个体病原体感染的方法，该方法包括施用有效量的免疫应答细胞，该细胞包含结合病毒抗原的受体和编码I型干扰素的载体。

自体淋巴细胞输注可用于治疗。可以从需要治疗的患者收集自体外周血单核细胞(PBMC)，并且可以使用本文所述和本领域已知的方法活化和扩增T细胞，然后注入患者体内。在其他情况下，同种异体细胞可用于治疗患者。

本文公开的方法可以包括移植。移植可以指细胞产品的过继性移植。移植可以是自体移植、同种异体移植、异种移植或任何其他移植。例如，移植可以是异种移植。移植也可以是同种异体移植。

在一些实施方案中，受试者可以给予免疫反应性细胞，其中可以施用的免疫反应性细胞可以是约1至约35天龄。例如，所施用的细胞可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或最多约40天。可以从刺激时起计算CAR免疫反应性细胞的年龄。可以从血液采集的时间开始计算免疫反应性细胞的年龄。可以从转导时起计算免疫反应性细胞的年龄。在一些实施方案中，可以给予受试者的免疫反应性细胞为约10至约14或约20天龄。在一些实施方案中，免疫反应性细胞的“年龄”可以通过端粒长度来确定。例如，“年轻”的免疫反应细胞可以具有比“耗尽”或“老”的免疫反应性细胞更长的端粒长度。不受特定理论的束缚，可以认为免疫反应性细胞在培养物中每周丢失约0.8kb的估计端粒长度，并且年轻的免疫反应性细胞培养物可以具有比约44天的免疫反应性细胞长约1.4kb的端粒。不受特定理论的束缚，人们认为更长的端粒长度可以与患者中的阳性客观临床反应和体内细胞的持久性相关联。

在移植之前、之后和/或期间，细胞(例如，工程细胞或工程化的原代T细胞)可以是功能性的。例如，移植的细胞可以是在移植后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18，19、20、21、22、23、24、25、6、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100天起作用。移植细胞可以在移植后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月起作用。移植细胞可以在移植后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30年起作用。在一些实施方案中，移植细胞可以在接受者的寿命期间起作用。

此外，移植细胞可以以其正常预期功能的100％起作用。移植细胞还可以发挥其正常预期功能约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或高达约100％的功能。

移植细胞也可以发挥其正常预期功能的超过100％的作用。例如，移植的细胞可以起到正常预期功能的约110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000或至多约5000％的功能。

移植可以通过任何类型的移植。局部可以包括但不限于肝下囊空间、脾囊下空间、肾囊下空间、网膜、胃或肠粘膜下层、小肠血管节段、静脉囊、睾丸、脑、脾或角膜。例如，移植可以是囊下移植。移植也可以是肌内移植。移植可以是门静脉移植。

与当一个或多个野生型细胞被移植到接受者之时相比，采用本发明的免疫应答细胞治疗之后可以改善移植排斥反应。例如，移植排斥可以是超急性排斥反应。移植排斥也可以是急性排斥反应。其他类型的排斥可能包括慢性排斥反应。移植排斥也可以是细胞介导的排斥反应或T细胞介导的排斥反应。移植排斥也可以是自然杀伤细胞介导的排斥反应。

改善移植可能意味着减轻超急性排斥反应，其可以包括减少、减轻或降低不良作用或症状。移植可以指细胞产品的过继性移植。

移植成功的另一个迹象可以是接受者不需要免疫抑制治疗的天数。例如，在提供本发明的免疫应答细胞之后，接受者可以不要求至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天的免疫抑制治疗。这可以表明移植成功。这也可以表明移植的细胞，组织和/或器官没有排斥。

在某些情况下，接受者不需要免疫抑制治疗至少1天。接受者也可不需要免疫抑制治疗至少7天。接受者不需要免疫抑制治疗至少14天。接受者不需要免疫抑制治疗至少21天。接受者不需要免疫抑制治疗至少28天。接受者不需要免疫抑制治疗至少60天。此外，接受者可能不需要至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年的免疫抑制治疗。

移植成功的另一个迹象可能就是接受者需要减少的免疫抑制治疗的天数。例如，在本文提供的所述治疗之后，接受者可能需要至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天的减少的免疫抑制治疗。这可以表明移植成功。这也可以表明移植的细胞、组织和/或器官没有或仅有很小的排斥。

例如，接受者可能需要至少1天的减少的免疫抑制治疗。接受者也可能需要至少7天的减少的免疫抑制治疗。接受者可能需要至少14天的减少的免疫抑制治疗。接受者需要至少21天的减少的免疫抑制治疗。接受者需要至少28天的减少的免疫抑制治疗。接受者需要至少60天的减少的免疫抑制治疗。此外，接受者可能需要至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年的减少的免疫抑制治疗。

减少的免疫抑制治疗可以指与当将一种或多种野生型细胞移植到接受者中时所需的免疫抑制治疗相比而言较少的免疫抑制治疗。

免疫抑制治疗可以包括抑制免疫系统的任何治疗。免疫抑制治疗可以帮助缓解、减少或消除患者的移植排斥反应。例如，免疫抑制剂可以在移植之前、期间和/或之后使用，包括MMF(霉酚酸酯(Cellcept))、ATG(抗胸腺细胞球蛋白)、抗-CD154(CD4OL)、抗-CD40(2C10)、的免疫抑制药物、抗-IL-6R抗体(tocilizumab、Actemra)、抗-IL-6抗体(sarilumab、olokizumab)、CTLA4-Ig(Abatacept/Orencia)、抗-IL-6抗体(ASKP1240、CCFZ533X2201)、安非他明(Campath)、抗CD20(利妥昔单抗)、贝伐单抗(LEA29Y)、西罗莫司(Rapimune)、依维莫司、他克莫司(Prograf)、达替珠单抗(Ze-napax)、巴利昔单抗(Similect)、英夫利昔单抗(Remicade)、环孢菌素、脱氧精蛋白、可溶性补体受体1、眼镜蛇毒素、抗C5抗体(eculizumab/Soliris)、甲基泼尼松龙、FTY720、依维莫司、来氟米特、抗IL-2R-Ab、雷帕霉素、抗CXCR3抗体、抗ICOS抗体、抗OX40抗体和抗CD122抗体。此外，一种或多种免疫抑制剂/药物可一起使用或依次使用。一种或多种免疫抑制剂/药物可用于诱导治疗或维持治疗。诱导和维持阶段可以使用相同或不同的药物。在某些情况下，daclizumab(Zenapax)可用于诱导治疗，他克莫司(Prograf)和西罗莫司(Rapimune)可用于维持治疗。还可以使用非药物方案来实现免疫抑制，包括但不限于全身照射，胸腺照射和全部和/或部分脾切除术。这些技术也可以与一种或多种免疫抑制药组合使用。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

在本发明以下实施例中，当构建所述的结合抗原的受体或CAR时，CD28共刺激信号结构域简称为28；CD3ζ简称为Z；4-1BB或CD137简称为BB。例如，将代码为85-2的scFv与CD3ζ以及CD28共刺激信号结构域作为胞内信号结构域所构建的嵌合抗原受体可以记作85-2-28Z。针对不同抗原的CAR的构建均是如此。

1.实验材料

肝癌细胞系SK-HEP-1和PLC/PRF/5购自ATCC细胞库，Huh-7购自日本RIKEN细胞库。

PBMC来自上海市血液中心。

AIM V培养基：CTS，Cat#1665773。

Human T-Activator CD3/CD28：Life technologies，Cat#11161D。

胎牛血清(FCS)：Gibco，Cat#10099-141。

IL-2：上海华新，注射用重组人白介素-2。

羊抗人F(ab’)₂抗体：Jackson ImmunoResearch,Cat#109-066-006。

PE-Streptavidin：BD pharmingen，Cat#554061。

CytoTox非放射性细胞毒性检测：Promega，Cat#G1780。

2.实验方法

2.1慢病毒载体构建

2.1.1pRRL-EF1α-92-CAR慢病毒载体的构建

作为示例，以下构建本发明的慢病毒质粒载体使用的载体系统属于第三代自灭活慢病毒载体系统，该系统共有四个质粒：即编码蛋白Gag/Pol的包装质粒pMDLg RRE(购自addgene)，编码Rev蛋白的包装质粒pRSV-REV(购自addgene)，编码VSV-G蛋白的包膜质粒pCMV-VSV-G(购自addgene)及基于空载体pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE(购自addgene)的编码目的基因CAR的重组表达载体，该系统可以有效降低形成可复制性慢病毒颗粒的风险。

在本系统中，本发明人首先通过常规分子克隆的技术方式，对空载体pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE进行改造，用延长因子-1α(elongation factor-1α，简称EF-1α)的启动子替代了原载体的启动子，并在启动子和CD8αsp信号肽之间增加了MluI酶切位点。具体地，使用ClaI/SalI(购自NEB)双酶切载体pWPT-EGFP(购自addgene)，回收1.1Kb的DNA片段，用T4 DNA连接酶连接于经ClaI/SalI双酶切的载体pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE，并转化于宿主菌TOP10中，挑取克隆通过菌落PCR鉴定阳性克隆并通过测序确认，获得重组质粒pRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP.WPRE。

在中国专利201510481235.1中阐述了经过人源化改造、能特异性识别人源GPC3蛋白的抗体92。为了构建92-CAR慢病毒质粒，以包含92重链可变区(专利201510481235.1中的SEQ ID NO:80)片段的质粒为模板，采用上游引物5’-ctccacgccgccaggccggaggtgcagctggtgcag-3’(SEQ ID NO:1)和下游引物5’-GCGGTGTCCTCGCTCCGCAGGCTGCTCAGCTCCATGTAGGCGGTG-3’(SEQ ID NO:2)扩增出重链可变区片段；以包含92轻链可变区(专利201510481235.1中的SEQ ID NO:79)片段的质粒为模板，采用上游引物5’-GCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTTCTACAGCTAC-3’(SEQ ID NO:3)和下游引物5’-CGGCGCTGGCGTCGTGGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTG-3’(SEQ ID NO:4)扩增出轻链可变区片段。上述重链和轻链可变区引物通过搭桥PCR，进一步扩增出含有与上游CD8α信号肽和下游铰链区重复序列的92scFv片段(SEQ ID NO:5)，命名为片段1，大小765bp。PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：58℃，40s；延伸：68℃，40s；进行25个循环，然后在68℃延伸10min。PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电泳确认符合预计的片段大小。

采用上游引物5’-gcaggggaaagaatagtagaca-3’(SEQ ID NO:6)和下游引物5’-CGGCCTGGCGGCGTGGAG-3’(SEQ ID NO:7)，以本实施例中构建的载体质粒pRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP.WPRE为模板，扩增出含有CD8α信号肽的EF-1αpromoter(SEQ ID NO:8)(内含MluI酶切位点)，命名为片段2，大小442bp。PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，30s；退火：53℃，30s；延伸：68℃，30s；进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电泳确认符合预计的片段大小。

采用上游引物5’-accacgacgccagcgccg-3’(SEQ ID NO:9)和下游引物5’-aatccagaggttgattgtcgacctagcgagggggcagggcctgc-3’(SEQ ID NO:10)，分别以pWPT-eGFP-F2A-GPC3-BBZ、pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z和pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28BBZ为模板(具体参考中国专利CN 104140974 A)，扩增出含有Hinge-BBZ(SEQ ID NO:11)的片段3、Hinge-28Z(SEQ IDNO:12)的片段4和Hinge-28BBZ(SEQ ID NO:13)的片段5(均内含Sal I酶切位点)，大小分别为694bp、703bp和829bp。PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，30s；退火：60℃，30s；延伸：68℃，30s；进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电泳确认符合预计的片段大小。

分别将等摩尔约50ng片段2、片段1和片段3进行拼接PCR，拼接条件为：预变性94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，140s，进行5个循环，然后总延伸68℃，10min，补充DNA聚合酶及上游引物5’-gcaggggaaagaatagtagaca-3’(SEQ ID NO:6)和下游引物5’-aatccagaggttgattgtcgacctagcgagggggcagggcctgc-3’(SEQ ID NO:10)，通过PCR扩增25个循环，扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，140s，总延伸68℃，10min。扩增获得92-BBZ的DNA片段(SEQ ID NO:14)理论大小分别为1865bp。扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。

分别将等摩尔约50ng片段2、片段1和片段4进行拼接PCR，同上拼接反应条件，扩增获得92-28Z的DNA片段(SEQ ID NO:15)理论大小分别为1874bp。扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。

分别将等摩尔约50ng片段2、片段1和片段5进行拼接PCR，同上拼接反应条件，扩增获得92-28BBZ的DNA片段(SEQ ID NO:16)理论大小分别为2000bp，。扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。

采用限制性内切酶Mlu I和SalI(购自NEB)分别酶切上述载体质粒pRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP.WPRE和片段92-BBZ、92-28Z以及92-28BBZ。通过T4连接酶(购自NEB)进行连接，转化TOP10，挑克隆进行进行PCR鉴定阳性菌，送到Invitrogen进行测序确认序列正确，由此获得pRRL-EF-1α-92-BBZ、pRRL-EF-1α-92-28Z和pRRL-EF-1α-92-28BBZ。

2.1.2共表达4-1BBL的92-CAR慢病毒载体的构建

此外，为构建共表达92-28Z和41BBL的质粒，以上述构建的pRRL-EF-1α-92-28Z质粒为模板，先使用上游引物5’-gcaggggaaagaatagtagaca-3’(SEQ ID NO:6)和下游引物5’-TCAGAAGGTCAAAATTCAAAGTCTGTTTCACGCGAGGGGGCAGGGCCTGCA TGTGAA-3’(SEQ ID NO:17)，通过PCR扩增出片段6。为得到F2A-41BBL片段，以质粒HG15693-G(购自北京义翘神州生物技术有限公司，该41BBL基因的第562碱基包含一个由G到A的突变)为模板，分别使用上游引物5’-gagacgttgagtccaaccctgggcccatggaatacgcctctgacgc-3’(SEQ ID NO:18)和下游引物5’-TCGGAGGAGGCGGGTGGCAGGTCCACGGTC-3’(SEQ ID NO:19)，通过PCR扩增出片段7；使用上游引物5’-ctgccacccgcctcctccgaggctcggaa-3’(SEQ ID NO:20)和下游引物5’-TGATTGTCGACTTATTCCGACCTCGGTGAAGGGA-3’(SEQ ID NO:21)，通过PCR扩增出片段8，再将片段7和8等摩尔拼接后，用引物对(SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:21)进行PCR扩增，得到片段9。最后将等摩尔的片段6和9进行拼接，用引物对(SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:21)进行扩增，得到92-28Z-F2A-41BBL(SEQ ID NO:22)。采用Mlu I和SalI酶切此片段，使用上述同样的方法，插入到经同样酶切的载体pRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP.WPRE，经测序确认正确，得到质粒pRRL-EF-1α-92-28Z-F2A-41BBL。

2.1.3可调控共表达IFN的92-CAR慢病毒载体的构建

为构建可以共表达92-28Z及IFN beta(同时通过在IFN beta前面插入NFAT元件以实现可控表达)的质粒，首先通过引物搭桥的方式，利用引物(SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35)合成片段10，然后以pWPT-EGFP质粒为模板，以上游引物(SEQ ID NO:36)和下游引物(SEQ ID NO:37)，扩增出片段11。将片段10和11等摩尔混合，通过搭桥PCR，并使用引物对(SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:38)进行扩增后，采用ClaI和SalI酶切此片段，使用上述同样的方法，插入到经同样酶切的载体pRRLSIN-cPPT-PGK-EGFP.WPRE，经测序确认正确，获得包含三个NFAT重复序列的载体pRRLSIN-NFAT3-EGFP-PA2。以此pRRLSIN-NFAT3-EGFP-PA2为模板，分别用引物对(SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40)及引物对(SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42)扩增出片段12和13，然后通过搭桥PCR，以引物对(SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:42)进行扩增得到片段14，随后用Mlu I和SalI酶切此片段，连接于同样酶切的pRRLSIN-NFAT3-EGFP-PA2中，经测序确认，得到包含六个NFAT重复序列的载体pRRLSIN-NFAT6-EGFP-PA2。以载体pGMT-IFN-β(购自北京义翘神州生物技术有限公司)为模板，通过引物对(SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44)扩增得到片段15。以此片段为模板，使用引物对(SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:38)进行PCR扩增，扩增产物经过Mlu I和Cla I酶切，连接于同样酶切的载体pRRLSIN-NFAT6-EGFP-PA2，经测序确认正确，获得pRRLSIN-NFAT6-huIFNβ-PA2质粒。以此构建好的pRRLSIN-NFAT6-huIFNβ-PA2质粒为模板，通过引物对(SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46)扩增得到带有NdeI酶切位点的EGFP片段16；以上述构建好的质粒pRRLSIN-NFAT6-EGFP-PA2质粒为模板，通过引物对(SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48)扩增，获得带有NdeI酶切位点的NFAT6片段17(需要扩增6个单位的片段，同时消除SalI的酶切位点)。将片段16和17等摩尔混合，使用引物对(SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:48)扩增，使用EcoRI和KpnI双酶切此片段，连接于同样酶切的载体pRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP.WPRE中，经测序验证正确，得到pRRLSIN-EF1α-EGFP-NFAT6-huIFNβ-PA2质粒。最后，使用MluI和SalI双酶切质粒pRRL-EF-1α-92-28Z，获得92-28Z片段，将此片段连接于同样双酶切的pRRLSIN-EF1α-EGFP-NFAT6-huIFNβ-PA2载体，得到测序正确的质粒pRRLSIN-EF1α-92-28Z-NFAT6-hu IFNβ-PA2。

以上五种质粒pRRL-EF-1α-92-BBZ、pRRL-EF-1α-92-28Z、pRRL-EF-1α-92-28BBZ、pRRL-EF-1α-92-28Z-F2A-41BBL和pRRL-EF-1α-92-28Z-NFAT6-huIFNβ-PA2通称为pRRL-EF-1α-92-CAR(图1)。92-BBZ、92-28Z、92-28BBZ和92-28Z-F2A-41BBL对应的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52。92-28Z-NFAT6-IFN-β表达的氨基酸序列包含两段，分别为如SEQ ID NO:50所示的构建为92-28Z的CAR和如SEQ ID NO:53所示的IFN，其载体构建如图1B所示。

2.2病毒制备

1)以4.5×10⁶的密度接种293T细胞于10cm培养皿中，37℃，5％ CO₂培养过夜准备包装病毒，培养基为含DMEM，添加10％胎牛血清；

2)将慢病毒穿梭载体pRRL-92-28Z-NFAT6-IFN-β5.2ug与包装质粒pRsv-REV 6.2μg、pRRE-PMDLg 6.2μg、VSVg 2.4μg溶入800μL无血清DMEM培养液，混匀；

3)将60μg PEI(1μg/μl)溶解于800μl的无血清DMEM培养液中，轻轻混匀(或1000rpm涡旋5秒钟)，室温孵育5min；

4)转染复合物的形成：将质粒混合液加入PEI混合液中，加入后立即涡旋混合或轻轻混匀，室温下孵育20min；

5)将转染复合物1.6ml滴加入含11ml DMEM培养基的10cm培养皿中，4-5h小时后，更换新鲜培养基；

6)72h后，收集病毒液上清。

2.3病毒浓缩

1)5X PEG8000 NaCl配制：称取NaCl 8.766g、PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，121℃30min湿热灭菌30min，降至室温后放4℃冰箱保存；

2)将收集的病毒上清液使用0.45μm滤头过滤，加入1/4的5X PEG-8000NaCl母液7.5ml，上下颠倒混匀；

3)每20～30min混合一次，共进行3-5次；

4)4℃放置过夜；

5)4℃，4000g，离心60min；

6)去上清后，加入适量的AIM V培养基(含2％AB血清)溶解重悬病毒沉淀；

7)浓缩后的慢病毒悬液分装成50μl每份，保存在成品管中，储存在-80℃；单嗜性逆转录病毒不稳定，包装后需尽快使用，不推荐-80℃冻存。

2.4慢病毒滴度测定

以1×10⁵细胞数目接种293T细胞于12孔培养板；

浓缩后的慢病毒分别以1uL、0.2uL和0.04uL添加到细胞悬液中，并添加polybrene至终浓度6ug/mL；

37℃，5％ CO₂培养过夜后，更换新鲜培养基；

感染72h后，胰酶消化293T细胞，加等量培养基终止后，吹打均匀，将细胞悬液转移入1.5mL离心管中；

400g离心5min，弃上清，PBS+2％ FBS溶液洗一次；

6)取适量细胞，按1:50稀释比例加入Biotin标记的羊抗人Fab抗体，冰上孵育30min；

7)加入1mL PBS+2％ FBS溶液清洗一次后，按1:50稀释比例加入PE标记的streptavidin，冰上孵育30min；

8)PBS+2％FBS溶液清洗两次后，加入适量体积的PBS+2％FCS溶液重悬细胞，转移至流式管中；

9)流式细胞仪检测后，取阳性率为5～20％的细胞样品为宜，计算滴度(TU/mL)＝细胞数量(10⁵)×阳性率/病毒体积(mL)。

2.5慢病毒转导T淋巴细胞-CAR-T淋巴细胞的制备

1)T淋巴细胞活化：人PBMC来源于上海市血液中心，培养基为AIM V+2％AB血清+IL-2(500U/mL)调整PBMC密度为1×10⁶/mL，按1:1的比例加入抗人CD3和CD28抗体包被的磁珠活化48h；

2)Retronectin包被48孔板：每孔加入160μl retronectn溶液(5μg/mL)，4℃孵育过夜；

3)弃去48孔板中的Retronectin溶液，1ml PBS洗两次；

4)将细胞接种于Retronectin包被的48孔板中，每孔细胞数目3×10⁵，按照MOI＝10加入慢病毒，补充培养基至300μL；

5)32℃，1800rpm，离心40min后，转移至细胞培养箱继续培养24h；

6)更换新鲜培养基，调整细胞密度为5×10⁵/mL，每2-3天进行传代。

2.6T淋巴细胞嵌合抗原受体表达

1)感染7天后，取4×10⁵的T细胞，4℃，400g，离心5min，弃上清，PBS+2％FCS清洗一次；

2)加50μL PBS+2％FCS重悬细胞，加入1μL Biotin标记的羊抗人Fab抗体，冰上孵育30min；

3)PBS+2％ FCS清洗两次后，加入50μL PBS+2％FCS重悬细胞，加入1μL PE标记的Streptavidin，冰上孵育30min；

4)PBS+2％FCS清洗两次后，加入400μL PBS+2％FCS重悬细胞，转移至流式管中，采用流式细胞仪检测感染效率。

2.7体外毒性实验

靶细胞

92-CAR对应的靶细胞为SK-HEP-1(GPC3-)和Huh-7(GPC3+)；

调整靶细胞浓度为1×10⁶/mL，取100μL接种到96well板；

效应细胞：按效靶比0.3:1、1:1和3:1向96孔板中加入CAR-T细胞及对照T细胞；

各组均设5个复孔，取5个复孔的平均值。

其中各实验组和各对照组如下：

各实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的CTL；

对照组1：靶细胞最大释放LDH；

对照组2：靶细胞自发释放LDH；

对照组3：效应细胞自发释放LDH；

检测方法：效应细胞与靶细胞共培养18h后，采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行。该方法是基于比色法的检测方法，可替代⁵¹Cr释放法。CytoTox通过检测乳酸脱氢酶(LDH)的含量反映细胞的裂解程度。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与⁵¹Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。具体参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。

细胞毒性计算公式为：

3、结果

实施例1、92-CAR在人T淋巴细胞上的表达

人T淋巴细胞采用抗CD3和CD28抗体包被的磁珠刺激48h后采用高滴度的慢病毒以MOI＝10离心感染。感染后第7天通过流式细胞术检测慢病毒感染T淋巴细胞阳性率。表达92-28Z(SEQ ID NO:15，编码核苷酸序列如SEQ ID NO:57所示)的T细胞(图2中的GPC3-CD28Z)感染效率为35.1％，表达92-28Z-NFAT6-IFN-β的T细胞(图2中的GPC3-CD28Z-IFN)感染效率为19.2％，对照载体MOCK感染效率为49％，如图2。

实施例2、92-CAR T细胞的体外抗肿瘤活性

将感染阳性率检测后的92-CAR T分别按效靶比0.3:1、1:1、3:1检测表达92-28Z-NFAT6-IFN-β、92-28Z及空载体MOCK的T淋巴细胞对肝癌细胞系SK-HEP-1(GPC3^-)和Huh-7(GPC3⁺)及PLC/PRF/5(GPC3⁺)的体外杀伤效果，共培养18h后，检测上清中LDH的含量。结果中可以看出表达92-28Z CAR-T细胞特异性杀伤GPC3阳性的Huh-7及PLC/PRF/5细胞，而不杀伤GPC3阴性的SK-HEP-1细胞；共表达huIFN-β的CAR-T细胞的杀伤能力高于同等效靶比的92-28Z CAR-T细胞，见表2。

表2、92-CAR T细胞对靶细胞的毒性杀伤检测

本发明人进一步将92-28Z-NFAT6-IFN-β与其它通过同一保外抗原结合单元92(SEQ ID NO:5)构建的GPC3-BBZ、GPC3-28BBZ和GPC3-41BBL(在CD28Z基础上共表达了4-1BBL)CAR-T细胞相比。首先FACS检测各种CAR的表达(见图3)，各种CAR的表达比率基本在40％左右。

然后分别按效靶比0.3:1、1:1、3:1检测这些CAR-T细胞及空载体MOCK T淋巴细胞对肝癌细胞系SK-HEP-1(GPC3^-)和Huh-7(GPC3⁺)及PLC/PRF/5(GPC3⁺)的体外杀伤效果，共培养18h后，检测上清中LDH的含量。结果中可以看出表达92CAR-T的细胞特异性杀伤GPC3阳性的Huh-7及PLC/PRF/5细胞，而不杀伤GPC3阴性的SK-HEP-1细胞。在效靶比1:1的情况下共表达IFN-β的CAR-T细胞对两种GPC3阳性肝癌细胞的杀伤能力高于其它所有CAR-T细胞，见表3。

表3、各种GPC3 CAR-T细胞对靶细胞的毒性杀伤检测

以上研究表明在CD28-Z的CAR T细胞基础上带上外源表达的IFN-beta可以增强抗肿瘤活性。并且，表达CD28Z的CAR-T共表达IFN-beta后，在某些效靶比上比表达CD28Z-41BBL的免疫细胞具有更好的肿瘤杀伤能力。

实施例3、含有IFN和不含IFN的GPC3 CAR-T细胞体外诱导细胞因子释放试验

分别检测未转染的T细胞、92-28Z T细胞和92-28Z-IFN T细胞释放的细胞因子。收集慢病毒感染后1-2周内生长状态良好的上述三种T细胞，接种5×10⁴/200μL(阳性细胞数)于24孔板，再同样方法接种5×10⁴/200μL/24孔huh7细胞，与CAR T细胞共孵育24小时后收集上清，检测IFN-β、IFN-γ、及IL-2的浓度，结果如图4A-4C所示。

根据图4A，只有GPC3-28Z-IFN T与Huh7细胞共孵育时有IFNβ的表达，说明GPC3-28Z-IFN T细胞在被靶抗原激活后，IFNβ能够被成功诱导表达，并分泌至细胞外。根据图4B和4C中对体外细胞因子的检测，结果说明在多种GPC3阳性的细胞中，如Huh7、PLC\PRF\5、Hep-3B等细胞中，GPC3-28Z-IFN T细胞能更有效的被激活。

实施例4、含有IFN和不含IFN的CLD18A2 CAR-T细胞体外诱导细胞因子释放试验

嵌合抗原受体85-28Z及85-2-28Z质粒的构建：

以PRRLSIN-cPPT.EF-1α为载体，分别构建了表达抗体85及85-2的二代嵌合抗原受体85-28Z(SEQ ID NO:55)和85-2-28Z(SEQ ID NO:54)的慢病毒质粒。85-28Z序列由CD8α信号肽、85scFV、CD8 hinge、CD28跨膜区和胞内信号传导结构域区以及CD3的胞内段CD3ξ组成；85-2-28Z的序列由CD8α信号肽、hu8E5-2IscFV、CD8铰链区、CD28跨膜区和胞内信号传导结构域区以及CD3的胞内段CD3ξ组成。

嵌合抗原受体85-28Z-IFN及85-2-28Z-IFN质粒的构建：

在85-28Z及85-2-28Z的基础上构建了表达IFNb细胞因子的85-28Z-IFNb CAR(编码核苷酸序列如SEQ ID NO:58所示)，在85-2-28Z CAR的基础上构建了可以表达IFNb细胞因子的85-2-28Z-IFNb CAR(编码核苷酸序列如SEQ ID NO:59所示)。

为了验证构建的85-28Z T细胞和85-28Z-IFN T细胞同样能够在靶细胞刺激下被有效激活，我们检测了在与靶细胞共孵育后，85-28Z T、85-28Z-IFN T细胞因子的分泌。

分别检测转染空载后的T细胞(Mock)、85-28Z T细胞和85-28Z-IFN T细胞释放的细胞因子。收集慢病毒感染后1-2周内生长状态良好的上述三种T细胞，接种5×104/200μL(阳性细胞数)于24孔板，按效靶比1:1分别接种5×104/200μL/24孔靶细胞。靶细胞包括293T-A1、293T-A2、AGS、AGS-A2、BGC-823以及BGC-823-A2细胞。共培养24小时后收集上清。采用夹心ELISA的方法检测上清中CAR T淋巴细胞与靶细胞共同培养过程中释放的IFN-γ细胞因子。

实验结果如图5所示，IFN的存在导致85-28Z CAR T细胞与靶细胞共孵育时IFN-γ细胞因子分泌增多。

实施例5、含有IFN和不含IFN的GPC3 CAR-T(92-28Z)细胞的杀伤活性

SK-HEP-1为GPC3阴性的人肝细胞肝癌细胞系，PLC/PRF/5为GPC3阳性的人肝细胞肝癌细胞系，HepG2为GPC3阳性的人肝细胞肝癌细胞系，Hep3B为GPC3阳性的人肝细胞肝癌细胞系，均购自美国模式培养物保藏所(ATCC)；Huh-7(又称Huh7)为GPC3阳性的人肝细胞肝癌细胞系，购自日本RIKEN细胞库。

检测方法：使用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行检测(具体方法可参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书)，检测了CAR T淋巴细胞对Huh 7、Hep 3B、PLC/PRF/5、Hep G2及SK-HEP-1肝癌细胞的体外毒性杀伤作用。

分别用表达未转染的T细胞、92-28Z T细胞和92-28Z-IFN T细胞与肿瘤细胞以效靶比1:3、1:1和3:1，共培养18h。各实验组与各对照组的设置如下：

实验组设置：各靶细胞+表达不同的嵌合抗原受体的T淋巴细胞；

对照组1：效应细胞自发LDH释放；

对照组2：靶细胞自发LDH释放；

对照组3：靶细胞最大LDH释放

对照组4：体积校正对照；

对照组5：培养基背景对照。

实验结果的计算：将所有实验组、靶细胞自发LDH释放组和效应细胞自发LDH释放组的吸光度减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大LDH释放对照的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值；将上述步骤获得的经过校正的值代入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性(％)

计算公式：％细胞毒性＝(实验组-效应细胞自发组-靶细胞自发组/靶细胞最大-靶细胞自发)*100

结果如图6A-6E所示，以上数据表明，表达有IFN的CAR-GPC3 T不仅能够特异性的杀伤GPC3阳性的细胞，表达有IFN的CAR-T细胞(GPC3-28Z-IFN)的杀伤活性还能够提高。

实施例6、含有IFN和不含IFN的CLD18A2 CAR-T细胞的杀伤活性

293T-A1和293T-A2细胞为体外构建的稳定表达CLD18A1和CLD18A2的人肾上皮细胞系细胞系。AGS、BGC-823为人胃癌细胞系，并在此基础上构建了稳定表达CLD18A2的AGS-A2、BGC-823-A2细胞系。

检测方法：使用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行检测(具体方法可参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书)，检测了CAR T淋巴细胞对293T-A1、293T-A2、AGS、AGS-A2、BGC-823、BGC-823-A2细胞的体外毒性杀伤作用。

为了比较85-2-28Z和85-2-28Z-IFN T细胞对靶细胞的杀伤作用，我们

分别按照效靶比1:3、1:1和3:1将表达空载T细胞(Mock)、85-28Z T细胞和85-28Z-IFN T细胞与CLD18A2阳性的293T-A2、AGS-A2和BGS-823A2细胞18小时，CLD18A2阴性的293T-A1、AGS和BGC-823细胞作为对照。

实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的CAR T；

①效应细胞自发LDH释放：校正效应细胞自发释放出来的LDH；

②靶细胞自发LDH释放：校正靶细胞自发释放出来的LDH；

③靶细胞最大LDH释放：计算时需要该对照确定100％的LDH释放；

④体积校正对照：校正由于加入裂解液(10×)引起的体积变化；

⑤培养基背景对照：校正由培养基中血清产生的LDH活性以及酚红造成的背景吸收。

计算公式：细胞毒性％＝[(实验组–效应细胞对照–靶细胞对照)/(靶细胞最大裂解量–靶细胞对照)]×100。在计算前，效应细胞对照，靶细胞对照，实验组减掉培养基对照；靶细胞最大裂解量减掉体积对照。

体外毒性实验分别用表达Mock、85-2-28Z以及85-2-28Z-IFN的CAR T淋巴细胞与肿瘤细胞以效靶比1:3、1:1和3:1，共培养18h，两种CART细胞对CLD18A2阳性的靶细胞的杀伤活性结果如图7所示。

实施例7、GPC3 CAR-T细胞体内存活时间测定

参照实施例3中步骤1)～3)的实验操作，通过尾静脉输注CAR-T(GPC3-28ZT细胞或GPC3-28Z-IFN T细胞)细胞7天后，检测CAR-T细胞(GPC3-28Z T细胞或GPC3-28Z-IFN T细胞)在体内存活情况。结果如表4所示，GPC3-28Z-IFN T细胞组每μl外周血中含有的T细胞(CD3+)数及CAR-T细胞数均高于GPC3-28ZT细胞组和Mock组。

表4、外周血中T细胞存活数量

	CD3+(个/μL)	CAR-T(个/μL)
			Mock	193.1453	0
GPC3-28Z	375.802	232.2
			GPC3-28Z-IFN	1034.315	439.5

实施例8、CLD18A2 CAR-T细胞体内存活时间测定

胃癌PDX模型的建立：

接种约2×2×2mm大小的胃癌PDX瘤块于NOD/SCID小鼠的右侧腋部皮下，在肿瘤细胞接种之日记为D0天。

过继转移T细胞：

在肿瘤体积为100mm³时，腹腔注射100mg/kg的环磷酰胺，注射24小时后通过尾静脉输注1.0×10⁷CAR-T细胞(85-2-28Z T细胞或85-2-28Z-IFN T细胞)，同时以Mock T细胞组作为对照。

分别在CAR-T细胞输注后的D5，D7和D10天，经小鼠隐静脉抽取外周血，检测CAR-T细胞(空载T细胞(Mock)，85-2-28Z T细胞或85-2-28Z-IFN T细胞)在体内的存活情况。

结果如图8A-8C所示，85-2-28Z-IFN T细胞治疗组的T细胞存活数量明显多于85-2-28Z T细胞治疗组。

实施例9、含有IFN和不含IFN的GPC3 CAR-T(92-28Z)细胞的体内杀伤活性

测定未转染的T细胞(Mock)、GPC3-28Z T细胞和GPC3-28Z-IFN T细胞对Huh7皮下移植瘤的抗肿瘤治疗实验。

1)实验分组：NOD-SCID小鼠21只，6-8周龄随机分为3组，每组7只，分为未转染的T细胞组、GPC3-28Z T细胞组和GPC3-28Z-IFN T细胞组。

2)皮下移植瘤的接种：收集处于对数生长期并且生长状态良好的Huh7细胞使用生理盐水调整密度为1×10⁷/mL，接种NOD-SCID小鼠制作小鼠模型，注射体积约为200μL(2×10⁶/只)，在肿瘤细胞接种之日记为第0天。

3)过继转移T细胞：在肿瘤体积为200-300mm³时，腹腔注射200mg/kg的环磷酰胺，注射24小时后通过尾静脉输注1.4×10⁷CAR-T细胞(GPC3-28Z T细胞或GPC3-28Z-IFN T细胞)，同时以未转染的T细胞组作为对照，观察测量皮下移植瘤的生长(图9A)，待对照组小鼠肿瘤大小达到2000mm³时，即将实验处死，分离肿瘤后进行拍照(图9B)。

结果如图9A和9B所示，GPC3-28Z-IFN T细胞能够显著抑制肿瘤细胞生长，在CART细胞回输后第13天时，GPC3-28Z CART细胞的抑瘤率为66.5％，GPC3-28Z-IFN CART细胞的抑瘤率为82.3％，表明GPC3-28Z-IFN T细胞进一步增强了CAR-T细胞抑制肿瘤生长的能力。

实施例10、含有IFN和不含IFN的CLD18A2 CAR-T细胞的体内杀伤活性

测定未转染的T细胞(Mock)、85-28Z T细胞和85-2-28Z-IFN T细胞对BGC-823-A2细胞皮下移植瘤的抗肿瘤治疗实验。

1)BGC-823-A2皮下移植瘤的接种：收集处于对数生长期并且生长状态良好的BGC-823-A2细胞使用生理盐水调整密度为2.5×10⁷/mL，注射细胞悬液体积200μL(5×10⁶/只)于小鼠右侧腋部皮下。在肿瘤细胞接种之日记为第0天。

2)实验分组：肿瘤接种第11天，测量BGC-823-A2移植瘤体积，将NOD-SCID小鼠随机分为4组，每组6只。分别为未转染的T细胞组、85-28Z T细胞组、85-2-28Z细胞组和85-2-28Z-IFN T细胞组。

3)过继转移T细胞：在肿瘤体积为100-150mm³时(第11天)，腹腔注射100mg/kg的环磷酰胺，注射24小时后通过尾静脉输注1×10⁷CAR T细胞(Mock细胞、85-28Z T、85-2-28Z T细胞或85-2-28Z-IFN细胞)，同时以未转染的T细胞组(Mock组)作为对照，观察测量皮下移植瘤的生长。

动物实验结果如图10A和图10B所示，结果表明85-2-28Z-IFN CAR T细胞对BGC-823-A2移植瘤的治疗效果要优于85-2-28Z CAR T细胞。

实施例11、含有IFN和不含IFN的CLD18A2 CAR-T细胞在胃癌PDX模型皮下移植瘤中的抗肿瘤试验

观察未转染的T细胞(UTD)、85-2-28Z T细胞和85-2-28Z-IFN T细胞对胃癌PDX模型皮下移植瘤的抗肿瘤治疗实验。

1)胃癌PDX模型的建立：接种约2×2×2mm大小的胃癌PDX瘤块于6-8周龄的雌性NOD/SCID小鼠的右侧腋部皮下，在肿瘤细胞接种之日记为D0天。

2)实验分组：肿瘤接种D15天，将NOD-SCID小鼠随机分为3组，每组7只，分为未转染的T细胞组、85-2-28Z T细胞组和85-2-28Z-IFN T细胞组。

3)过继转移T细胞：在肿瘤体积为30mm3时，腹腔注射100mg/kg的环磷酰胺，注射24小时后通过尾静脉输注1.0×107CAR-T细胞(85-2-28Z T细胞或85-2-28Z-IFN T细胞)，同时以未转染的T细胞组作为对照。观察测量胃癌PDX皮下移植瘤的生长。

结果如图11所示，85-2-28Z-IFN治疗组7只小鼠有1只小鼠肿瘤完全消退。

实施例12、含有IFN和不含IFN的GPC3 CAR-T(92-28Z)细胞在体内对肿瘤浸润的影响

参照实施例9中建立的动物模型，回输GPC3-28Z及GPC3-28Z-IFN两种CAR-T细胞14天后，取肿瘤组织，组化检测CD3+细胞，结果如图12A和12B所示：每个样品取4-7个视野，统计CD3阳性T细胞数量。结果表明，对照组肿瘤组织中无明显浸润的CD3+细胞，INFβ-CAR-T治疗组中CD3+T细胞数量高于28ZCART组。

实施例13、含有IFN和不含IFN的CLD18A2 CAR-T细胞在体内对肿瘤浸润的影响

参照实施例10中建立的动物模型，回输Mock、85-28Z、85-2-28Z以及85-2-28Z-IFN细胞17天后，取肿瘤组织，组化检测CD3+细胞。

结果如图13所示，Mock T细胞在肿瘤组织周围几乎观察不到T细胞的浸润，85-28Z和85-2-28Z CAR T细胞在肿瘤组织的边缘可以看到，而85-2-28Z-IFN T细胞在肿瘤组织内部可以观察到一定的浸润。

实施例14、含有IFN和不含IFN的EGFR CAR的构建

EGFR-CAR(806-28Z,SEQ ID NO:56)和EGFR-CAR-IFN(由SEQ ID NO:60所示的核酸编码)结构如图14中所示。

采用逆转录病毒包装体系包装成逆转录病毒后感染小鼠T淋巴细胞，分别为EGFR-CAR和EGFR-CAR-IFN，感染阳性率分别为65.1％和35.2％(图15)。

实施例15、含有IFN和不含IFN的EGFR CAR(806-28Z)T细胞体外分泌mIFNβ能力的测定

为了检测EGFR-CAR-IFN诱导分泌mIFNβ的功能，我们将CAR-T细胞与靶细胞CT26-VIII按1:1和3:1共培养24h，取上清，ELISA检测mIFNβ的表达。同时，以没有靶点的CT26细胞作为阴性对照，刀豆蛋白A(ConA)作为阳性对照。结果显示，经过靶细胞刺激后，mCAR-806-mIFNβ能够被成功激活，并诱导表达mIFNβ，对照组则未检出有mIFNβ的表达(图16)。

实施例16、含有IFN和不含IFN的EGFR CAR(806-28Z)-T细胞的细胞因子的释放

为了验证构建的EGFRCAR和EGFR-CAR-IFN同样能够在靶细胞刺激下被有效激活，我们检测了在与靶细胞共孵育后muCAR-T细胞因子的分泌。将未经转染的UT细胞、EGFR-CAR和EGFR-CAR-IFN分别与靶点阳性的CT26-VIII细胞按照1:1比例共孵育24小时，取培养上清检测细胞因子mIL-2，mIFN-γ，mTNF-α分泌情况，靶点阴性的CT26细胞作为对照。结果显示，EGFR-CAR和egfr-CAR-IFN与靶细胞共孵育后均有较高浓度的mIL-2，mIFN-γ，mTNF-α分泌(图17A、17B、17C)，说明EGFR-CAR和EGFR-CAR-IFN在靶抗原的刺激下，两种muCAR-T细胞均能被有效激活。

实施例17、含有IFN和不含IFN的EGFR CAR(806-28Z)-T细胞的体外毒性试验

为了比较EGFR-CAR和EGFR-CAR-IFN对靶细胞的体外杀伤活性，我们分别按照1:3、1:1或3:1的比例将EGFR-CAR和EGFR-CAR-IFN与EGFR阳性的CT26VIII细胞共孵育18小时，未经转染的小鼠UT细胞作为同型对照，CT26作为EGFR阴性对照。

结果显示，EGFR-CAR和EGFR-CAR-IFN与UT细胞相比，对靶点阳性的CT26VIII细胞具有强效的杀伤作用，差异有显著意义(***P＜0.001)，杀伤百分比呈剂量依赖性，而未经转染的UT细胞对CT26及CT26VIII均没有杀伤作用，EGFR-CAR和EGFR-CAR-IFN两种CAR-T细胞对靶点阴性的CT26细胞没有杀伤作用(图18)。

实施例18、含有IFN和不含IFN的EGFR CAR(806-28Z)-T细胞的体内毒性试验

使用稳定转染人源EGFRvIII-806位点的小鼠结肠癌CT26细胞系，在Babl/c小鼠体内接种皮下移植瘤，然后给予EGFR-CAR T细胞的治疗，结果如图19所示，EGFR-CAR-T细胞对对肿瘤大小与对照组基本一致，未观察到抑制作用，而EGFR-CAR-IFN细胞回输后，在第7天开始出现抑制肿瘤生长的现象，抑瘤率为5.9％，第10天时达到最强，为18.5％，到第17天时，抑瘤率仍可达到12.4％，明显优于EGFR-CAR-T细胞组。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

表5、本文中所用的序列

Claims

1.结合CLD18A2的抗体，其特征在于，所述抗体具有SEQ ID NO：54或55中第1-247位所示的氨基酸序列。

2.包含权利要求1所述抗体的受体。

3.如权利要求2所述的受体，其特征在于，所述的受体包括顺序连接的：权利要求1所述的抗体、跨膜区和胞内信号区。

4.如权利要求3所述的受体，其特征在于，所述的胞内信号区包含：T细胞刺激信号分子或T细胞刺激信号分子与T细胞激活共刺激分子的组合。

5.如权利要求3或4所述的受体，其特征在于，所述胞内信号区选自：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d；或所述共刺激结构域选自：CD28、OX40、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BBL、MyD88和4-1BB的胞内信号区，或其组合。

6.如权利要求3-5任一所述的受体，其特征在于，所述跨膜区选自：CD8或CD28的跨膜区或与CD8或CD28天然跨膜区具有至少85、90、95、96、97、98、99或100％同一性的蛋白质。

7.如权利要求2-6任一所述的受体，其特征在于，所述的胞内信号区选自：CD3ζ，或CD137和CD3ζ、或CD28和CD3ζ、或CD28和CD137和CD3Z的胞内信号区。

8.编码权利要求1所述的抗体或权利要求2-7任一所述的受体的核酸。

9.载体，其特征在于，所述载体包含权利要求8所述的核酸。

10.如权利要求9所述的载体，所述载体是表达载体。

11.包含权利要求8所述的核酸或权利要求9或10所述载体的病毒。

12.工程细胞，其特征在于，所述工程细胞包含权利要求1所述的抗体、权利要求2-7任一所述的受体、权利要求8所述的核酸、和/或权利要求9或10所述的载体；或所述细胞采用权利要求11所述的病毒转导制备而成。

13.如权利要求12所述的工程细胞，其特征在于，所述工程细胞是免疫应答细胞。

14.如权利要求12或13所述的工程细胞，其特征在于，所述工程细胞是T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤T细胞、DNT细胞、和/或调节性T细胞。

15.如权利要求12-14任一所述的工程细胞，其特征在于，所述工程细胞还携带外源的细胞因子的编码序列；或还表达另一种结合抗原的受体；或还表达趋化因子受体；或还表达能降低PD-1表达的siRNA或者阻断PD-L1的蛋白；或还表达安全开关。

16.如权利要求12-14任一所述的工程细胞，其特征在于，所述工程细胞还组成性表达或诱导性表达外源性干扰素β。

17.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1所述的抗体、权利要求2-7任一所述的受体、权利要求8所述的核酸、权利要求9或10所述的载体、权利要求11所述的病毒、和/或权利要求12-16任一所述的工程细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

18.权利要求1所述的抗体、权利要求2-7任一所述的受体、权利要求8所述的核酸、权利要求9或10所述的载体、权利要求11所述的病毒、权利要求12-16任一所述的工程细胞、和/或权利要求17所述的药物组合物，在制备治疗疾病的药物中的应用。

19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述药物用于治疗或预防肿瘤、病原体感染、增强免疫耐受能力、自体移植或同种异体移植。

20.如权利要求18或19所述的应用，其特征在于，所述药物用于诱导癌细胞死亡。

21.如权利要求18-20任一所述的应用，其特征在于，所述药物用于诱导CLD18A2阳性细胞死亡。

22.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自：胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌、或胶质瘤。