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CN118165096A - 一种胸腺法新的纯化方法 - Google Patents

一种胸腺法新的纯化方法 Download PDF

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CN118165096A
CN118165096A CN202410287733.1A CN202410287733A CN118165096A CN 118165096 A CN118165096 A CN 118165096A CN 202410287733 A CN202410287733 A CN 202410287733A CN 118165096 A CN118165096 A CN 118165096A
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CN
China
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thymalfasin
hydrogen phosphate
disodium hydrogen
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Application number
CN202410287733.1A
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李增礼
史文青
沈笑媛
闫晓鸽
徐杭鑫
周大为
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SHANGHAI SOHO-YIMING PHARMACEUTICALS CO LTD
Original Assignee
SHANGHAI SOHO-YIMING PHARMACEUTICALS CO LTD
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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Abstract

本申请涉及多肽药物的纯化技术领域，公开了一种胸腺法新粗肽的前处理方法，包括将胸腺法新粗肽溶解于磷酸盐溶液中，过滤，得待纯化溶液。本申请还公开一种胸腺法新的纯化方法，所述纯化方法中，洗脱时使用含有磷酸盐的溶液为流动相。该方法可提高胸腺法新溶解度，显著降低特定杂质Des‑Ala3‑胸腺法新和Asp28‑胸腺法新的含量。

Description

一种胸腺法新的纯化方法
技术领域
本说明书涉及多肽药物的纯化技术领域，特别涉及一种胸腺法新的纯化方法。
背景技术
胸腺法新(Thymalfasin，CAS号62304-98-7)分子式：C129H215N33O55，分子量：3108.28，肽序列：Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。
胸腺法新是一种细胞免疫增强剂，原研公司为意大利塞生公司，于1997年获批上市，有较强的免疫增强活性，可以通过促进淋巴细胞成熟和分泌γ-干扰素、白细胞介素等细胞因子，增强机体的抗病毒、抗细菌、抗肿瘤的免疫活性，临床上主要用于慢性乙型病毒性肝炎和恶性肿瘤的辅助治疗。
胸腺法新目前国内大多采用化学固相合成方法获得粗品,其杂质的理化性质和目标多肽十分相似，导致分离纯化比较困难。常规的分离纯化技术，如溶媒、沉淀、萃取等技术操作过程复杂、提取时间长、消耗原料多、回收率低。目前多用反相高效液相色谱纯化方法进行精制提纯，其具有分辨率高、重复性好、回收率高等优点。
目前有较多关于胸腺法新纯化的公开技术，如CN201910998635公开了一种固液相结合制备胸腺法新的方法、CN201910184738公开了一种胸腺法新的纯化方法与用途、CN201811564487公开了一种制备胸腺法新的方法、CN201310399935中公开了一种胸腺法新的纯化方法。现有纯化方法存在粗肽样品溶解度较小、对特定杂质去除效果不明显、纯化收率较低等问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本申请提供一种新的胸腺法新纯化方法，该方法可提高胸腺法新溶解度，显著降低特定杂质Des-Ala3-胸腺法新和Asp28-胸腺法新的含量。
本申请提供一种胸腺法新粗肽的前处理方法，包括将胸腺法新粗肽溶解于磷酸盐溶液中，过滤，得待纯化溶液。
本申请还提供一种胸腺法新的纯化方法，所述纯化方法中，洗脱时使用含有磷酸盐的溶液为流动相。
本申请还提供上述的纯化方法制备的胸腺法新，所述胸腺法新纯度≥99％；和/或，所述胸腺法新中缺失肽杂质的含量为0.02～0.06％(w/w)；和/或，所述胸腺法新中水解杂质的含量为0.02～0.06％(w/w)。
本说明书提出的胸腺法新的纯化方法，带来的有益效果包括但不限于：(1)胸腺法新粗肽含有大量三氟乙酸,以往发明用纯化水溶解，溶解度较低，样品易析出，本发明用磷酸氢二钠溶液溶解粗肽，粗肽不易析出避免了色谱柱和设备堵塞，同时提高了粗品溶解度,粗肽浓度可以达到50g/L，溶解后的粗肽溶液体积小，缩短了纯化周期。(2)第一步纯化以耐碱填料为固定相，用磷酸氢二钠溶液为A相，用含有机试剂的磷酸氢二钠溶液为B相，进行梯度洗脱，可以去除与胸腺法新极性相差较大的杂质及部分缺失肽，特别是Des-Ala3-胸腺法新。通过合成杂质Des-Ala3-胸腺法新，确认该缺失肽杂质在纯化中控方法中相对保留时间为0.95，纯化后该杂质还有0.04％。(3)第二步纯化以反相填料为固定相,含有机试剂的磷酸盐缓冲溶液为流动相，进行等度洗脱，可以去除胸腺法新中难去除的消旋杂质及水解杂质，特别是水解杂质Asp28-胸腺法新。通过合成杂质Asp28-胸腺法新，确认该水解杂质在纯化中控方法中相对保留时间为1.20，纯化后该杂质还有0.04％。
附图说明
本申请将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，其中：
图1为本申请实施例1制得的胸腺法新粗品HPLC色谱图；
图2为本申请实施例2制备胸腺法新第一步纯化色谱图；
图3为本申请实施例2制得的胸腺法新第一步纯化合格组分HPLC色谱图；
图4为本申请实施例4制备胸腺法新第二步纯化色谱图；
图5为本申请实施例6制得的胸腺法新成品HPLC色谱图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。
如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
本说明书中使用了流程图用来说明根据本说明书的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是，前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反，可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时，也可以将其他操作添加到这些过程中，或从这些过程移除某一步或数步操作。
本申请提供一种胸腺法新粗肽的前处理方法，包括将胸腺法新粗肽溶解于磷酸盐溶液中，过滤，得待纯化溶液。
在一些实施例中，所述胸腺法新粗肽可以为脱除保护基的胸腺法新粗肽。在一些实施例中，优选的，所述胸腺法新粗肽可以通过化学固相合成方法获得。在一些实施例中，更优选的，所述胸腺法新粗肽的纯度≥50％。
在一些实施例中，所述磷酸盐溶液可以为磷酸氢二钠的水溶液。在一些实施例中，优选的，所述磷酸氢二钠水溶液的浓度可以为5～15g/L。例如，磷酸氢二钠水溶液的浓度可约为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15g/L。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，更优选的，所述磷酸氢二钠水溶液的浓度可以为10g/L。在一些实施例中，进一步优选的，所述磷酸氢二钠水溶液的pH可以为8～12。例如，磷酸氢二钠水溶液的pH可约为8、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0、10.2、10.4、10.5、10.6、10.8、11.0、11.2、11.4、11.6、11.8或12。在一些实施例中，更进一步优选的，所述磷酸氢二钠水溶液的pH可以为10.5。
在一些实施例中，所述过滤前需将胸腺法新粗肽完全溶解。在一些实施例中，优选的，所述过滤可以使用滤膜过滤。在一些实施例中，更优选的，所述滤膜可以为有机滤膜。在一些实施例中，进一步优选的，所述滤膜孔径可以为0.1～0.45μm。例如，滤膜孔径可约为0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.22、0.24、0.26、0.28、0.3、0.32、0.34、0.36、0.38、0.4、0.42或0.45μm。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，更进一步优选的，所述滤膜孔径可以为0.22μm。
本申请还提供一种胸腺法新的纯化方法，所述纯化方法中，洗脱时使用含有磷酸盐的溶液为流动相。在一些实施例中，所述磷酸盐可以包括磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾中的至少一种。
在一些实施例中，所述纯化方法可以包括以下步骤：1)将采用权利要求1或2所述的前处理方法制备得到的待纯化溶液经色谱柱纯化，得第一步样品溶液；2)将所述第一步样品溶液浓缩，得第一步样品浓缩液；3)将所述第一步样品浓缩液经色谱柱纯化，得第二步样品溶液；4)将所述第二步样品溶液浓缩，得第二步样品浓缩液；5)将所述第二步样品浓缩液冷冻干燥，得胸腺法新。
在一些实施例中，所述步骤1)中，所述色谱柱可以以耐碱填料为固定相。在一些实施例中，所述耐碱填料可以包括聚合物填料或耐碱硅胶填料。在一些实施例中，所述耐碱填料粒径可以在5-100微米之间。例如，耐碱填料粒径可约为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μm。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，优选的，所述步骤1)中，所述色谱柱可以以耐碱硅胶为固定相，所述耐碱硅胶的粒径可以为10微米。在一些实施例中，更优选的，所述步骤1)中，所述色谱柱可以为C18色谱柱；在一些实施例中，进一步优选的，所述步骤1)中，所述色谱柱可以为Unisil 10-200C18 Ultra，50mm*250mm。
在一些实施例中，所述步骤1)中，所述色谱柱洗脱时使用的流动相可以包括流动相A和流动相B。在一些实施例中，优选的，所述流动相A和流动相B均可以为磷酸盐溶液。在一些实施例中，更优选的，所述流动相A和流动相B均可以为磷酸氢二钠溶液。在一些实施例中，进一步优选的，所述流动相B可以为含有机溶剂的磷酸氢二钠水溶液。
在一些实施例中，所述步骤1)中，所述纯化过程中使用的检测波长:230/280nm。
在一些实施例中，所述第一步样品溶液的纯度大于90％。
在一些实施例中，所述流动相A中，所述磷酸氢二钠溶液可以为磷酸氢二钠的水溶液。在一些实施例中，优选的，所述流动相A中，所述磷酸氢二钠溶液的浓度可以为8～12g/L，pH为8～13。例如，磷酸氢二钠溶液的浓度可约为8、8.2、8.4、8.6、8.8、9、9.2、9.4、9.6、9.8、10、10.2、10.4、10.6、10.8、11、11.2、11.4、11.6、11.8或12g/L。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。例如，磷酸氢二钠溶液的pH可约为8、8.2、8.4、8.6、8.8、9、9.2、9.4、9.6、9.8、10、10.2、10.4、10.6、10.8、11、11.2、11.4、11.6、11.8、12、12.2、12.4、12.6、12.8或13。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，更优选的，所述流动相A中，所述磷酸氢二钠溶液的浓度可以为10g/L，pH为10.5。
在一些实施例中，所述流动相B中，以磷酸氢二钠水溶液总体积为基准计，所述有机溶剂在磷酸氢二钠水溶液中的体积百分比可以为20～40％。例如，有机溶剂在磷酸氢二钠水溶液中的体积百分比可约为20％、22％、24％、26％、28％、30％、32％、34％、36％、38％或40％。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，优选的，所述有机溶剂在磷酸氢二钠水溶液中的体积百分比可以为30％。在一些实施例中，更优选的，所述有机溶剂可以选自甲醇、乙腈、乙醇或异丙醇。在一些实施例中，进一步优选的，所述有机溶剂可以为乙腈。
在一些实施例中，所述流动相B中，所述磷酸氢二钠水溶液的浓度可以为8～12g/L，pH为3～7。例如，磷酸氢二钠溶液的浓度可约为8、8.2、8.4、8.6、8.8、9、9.2、9.4、9.6、9.8、10、10.2、10.4、10.6、10.8、11、11.2、11.4、11.6、11.8或12g/L。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。例如，磷酸氢二钠溶液的pH可约为3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5、5.2、5.4、5.5、5.6、5.8、6、6.2、6.4、6.6、6.8或7。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，优选的，所述磷酸氢二钠溶液的浓度可以为10g/L，pH为5.5。
在一些实施例中，所述洗脱可以为线性梯度洗脱，线性梯度洗脱条件可以为：流速50～70mL/min，时间75min，以流动相总体积为基准计，流动相A的体积百分比在75min内由100％下降至50％，动相B的体积百分比在75min内由0％上升至50％。例如，线性梯度洗脱流速可约为50、55、60、65或70mL/min。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，优选的，流速可以为60mL/min。
在一些实施例中，所述步骤2)中，所述浓缩可以为减压旋蒸浓缩。在一些实施例中，优选的，所述减压旋蒸浓缩条件可以为水温30～35℃，真空度-0.14～-0.05Mbar。例如，减压旋蒸浓缩水温可约为30、31、32、33、34或35℃。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。例如，减压旋蒸浓缩真空度可约为-0.14、-0.13、-0.12、-0.11、-0.10、-0.09、-0.08、-0.07、-0.06或-0.05Mbar。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，更优选的，所述减压旋蒸浓缩条件可以为水温30℃，真空度-0.09Mbar。
在一些实施例中，所述步骤3)中，所述色谱柱可以以反相填料为固定相。在一些实施例中，所述步骤3)中，所述填料的粒径可以5-100μm。例如，填料的粒径可约为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μm。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，优选的，所述步骤3)中，所述色谱柱可以以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，所述十八烷基硅烷键合硅胶的粒径可以为10微米。在一些实施例中，更优选的，所述步骤3)中，所述色谱柱可以为C18色谱柱。在一些实施例中，进一步优选的，所述步骤3)中，所述色谱柱可以为Unisil 10-200C18，50mm*250mm。
在一些实施例中，所述步骤3)中，所述色谱柱洗脱时使用的流动相可以为含有机溶剂的磷酸氢二钠水溶液。在一些实施例中，优选的，所述步骤3)中，以磷酸氢二钠水溶液总体积为基准计，所述有机溶剂在磷酸氢二钠水溶液中的体积百分比可以为18～22％。例如，有机溶剂在磷酸氢二钠水溶液中的体积百分比可约为18％、19％、20％、21％或22％。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，更优选的，所述步骤3)中，所述有机溶剂在磷酸氢二钠水溶液中的体积百分比可以为20％。在一些实施例中，进一步优选的，所述步骤3)中，所述磷酸氢二钠水溶液的浓度可以为40～60mM，所述有机溶剂可以选自甲醇、乙腈、乙醇或异丙醇。例如，磷酸氢二钠水溶液的浓度可约为40、45、50、55或60mM。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，更进一步优选的，所述步骤3)中，所述磷酸氢二钠水溶液的浓度可以为50mM，所述有机溶剂可以为乙腈。
在一些实施例中，所述步骤3)中，所述洗脱可以为等度洗脱，洗脱条件可以为：流速50～70mL/min。例如，等度洗脱流速可约为50、55、60、65或70mL/min。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，优选的，所述步骤3)中，洗脱条件可以为：流速60mL/min。
在一些实施例中，所述步骤3)中，所述纯化过程中使用的检测波长:230nm。
在一些实施例中，所述第二步样品溶液纯度大于99％，单杂含量小于0.15％。
在一些实施例中，所述步骤4)中，所述浓缩可以为减压旋蒸浓缩。在一些实施例中，优选的，所述步骤4)中，所述减压旋蒸浓缩条件可以为水温30～35℃，真空度-0.14～-0.05Mbar。例如，减压旋蒸浓缩水温可约为30、31、32、33、34或35℃。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。例如，减压旋蒸浓缩真空度可约为-0.14、-0.13、-0.12、-0.11、-0.10、-0.09、-0.08、-0.07、-0.06或-0.05Mbar。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，更优选的，所述步骤4)中，所述减压旋蒸浓缩条件可以为水温30℃，真空度-0.09Mbar。
在一些实施例中，所述第二步样品浓缩液浓度可以为20～40mg/mL。例如，第二步样品浓缩液浓度可约为20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40mg/mL。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，优选的，所述第二步样品浓缩液浓度可以为30mg/mL。
本申请还提供由上述的纯化方法制备的胸腺法新，所述胸腺法新纯度≥99％；和/或，所述胸腺法新中缺失肽杂质的含量为0.02～0.06％(w/w)。和/或，所述胸腺法新中水解杂质的含量为0.02～0.06％(w/w)。例如，胸腺法新中缺失肽杂质的含量可约为0.02％、0.03％、0.04％、0.05％或0.06％(w/w)。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。例如，胸腺法新中水解杂质的含量可约为0.02％、0.03％、0.04％、0.05％或0.06％(w/w)。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。
在一些实施例中，优选的，所述胸腺法新纯度可以为99.61％。
在一些实施例中，所述胸腺法新中缺失肽杂质的含量可以为0.04％(w/w)。在一些实施例中，优选的，所述缺失肽杂质可以为Des-Ala3-胸腺法新。
在一些实施例中，所述胸腺法新中水解杂质的含量可以为0.04％(w/w)。在一些实施例中，优选的，所述水解杂质可以为Asp28-胸腺法新。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1粗肽前处理
溶解液配制:精密称量磷酸氢二钠10g倒入900mL水,用氢氧化钠调pH到10.5，用水定容到1L。取配制好的溶解液1L,加入粗肽50g，超声搅拌使样品完全溶解后用0.22μm有机滤膜过滤，收集滤液。其中，粗肽是本公司通过化学固相合成方法获得的脱除保护基的胸腺法新粗肽，纯度≥50％。
检测滤液，结果如图1所示HPLC色谱图，具体检测方法如下：
色谱柱：Waters X-bridge 5μm C18(4.6mm*250mm)色谱柱或相当柱；
流动相A：硫酸铵缓冲液(取硫酸铵26.4g，磷酸25ml加水溶解并稀释至2L)-乙腈(90：10)；
流动相B：硫酸铵缓冲液-乙腈(50：50)；
检测波长210nm；
洗脱梯度：
表1
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 88 12
45 82 18
50 82 18
65 50 50
66 88 12
80 88 12
实施例2第一步纯化
纯化条件:色谱柱:以耐碱硅胶为固定相的色谱柱(Unisil 10-200C18 Ultra，50mm*250mm)。流动相:A相:10g/L磷酸氢二钠溶液,用氢氧化钠调pH10.5；B相:10g/L磷酸氢二钠溶液含30％乙腈(v/v)水溶液，用磷酸调pH5.5,流速:60mL/min,梯度:A％:100％-50％,B％:0％-50％,线性梯度洗脱75min；检测波长:230/280nm。进样量为6.0g。收集纯度大于90％的组分待旋蒸备用。
其中，A相的配制方法为精密称量磷酸氢二钠10g倒入900mL水,用氢氧化钠调pH到10.5，用水定容到1L。B相的配制方法为精密称量磷酸氢二钠10g倒入600mL水，用磷酸调pH到5.5，加入300mL乙腈，用水定容到1L。
检测本实施例制备的胸腺法新，结果如图2所示。
检测本实施例制备的合格组分，结果如图3所示，具体检测方法如下：
色谱柱：Waters X-bridge 5μm C18(4.6mm*250mm)色谱柱或相当柱；
流动相A：硫酸铵缓冲液(取硫酸铵26.4g，磷酸25ml加水溶解并稀释至2L)-乙腈(90：10)；
流动相B：硫酸铵缓冲液-乙腈(50：50)；
检测波长210nm；
洗脱梯度：
表2
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 88 12
45 82 18
50 82 18
65 50 50
66 88 12
80 88 12
实施例3第一步纯化馏分浓缩
将收集的胸腺法新第一步纯化合格馏分混合,于水温30℃,真空度在-0.09Mbar的条件下减压旋蒸浓缩去除大部份乙腈后备用。
实施例4第二步纯化
纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱(Unisil 10-200C18，50mm*250mm)。流动相:50mM磷酸氢二钠溶液含20％乙腈(v/v)水溶液，流速:60mL/min；检测波长:230nm。进样量为5.1g。收集纯度大于99％，单杂小于0.15％的组分待旋蒸备用，组分的色谱图如图4所示。
其中,流动相的配制方法为精密称量磷酸氢二钠7.05g倒入700mL水,加入200mL乙腈，用水定容到1L。
实施例5第二步纯化馏分浓缩
将收集的胸腺法新第二步纯化合格馏分混合，减压旋蒸浓缩到30mg/mL。
实施例6冷冻、干燥
将样品放进冻干盘,进行冷冻干燥，即可得到99.61％,最大单杂小于0.15％的胸腺法新3.87克，纯化总收率为64.5％，检测胸腺法新成品，结果如图5所示的HPLC色谱图，具体检测方法如下：
色谱柱：Waters X-bridge 5μm C18(4.6mm*250mm)色谱柱或相当柱；
流动相A：硫酸铵缓冲液(取硫酸铵26.4g，磷酸25ml加水溶解并稀释至2L)-乙腈(90：10)；
流动相B：硫酸铵缓冲液-乙腈(50：50)；
检测波长210nm；
洗脱梯度：
表3
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 88 12
45 82 18
50 82 18
65 50 50
66 88 12
80 88 12
杂质去除验证：
通过合成缺失肽杂质及水解杂质验证杂质位置。缺失肽杂质为Des-Ala3-胸腺法新，水解杂质为Asp28-胸腺法新。缺失肽杂质相对保留时间为0.95，水解杂质相对保留时间为1.20，实施例1制得的胸腺法新粗品中缺失肽杂质含量为0.42％，水解杂质含量为4.45％，通过纯化后，缺失肽杂质含量为0.04％，水解杂质含量为0.04％。
以下是发明人采用现有技术方法纯化胸腺法新粗品(胸腺法新粗品来源及样品检测方法与上述实验相同)所得到的产品中杂质Des-Ala3-胸腺法新和Asp28-胸腺法新的含量:
表4
对比粗肽前处理：
采用下表所示的溶解体系溶解粗肽。取配制好的溶解缓冲液，加入粗肽，超声搅拌使样品完全溶解后用0.22μm有机滤膜过滤，收集滤液。
表5
由于胸腺法新粗品不易溶解，现有技术只能降低上样量和上样浓度，大大降低生产效率，本发明采用pH＝10.5的磷酸氢二钠溶液可以极大提高粗肽溶解度，溶解后的粗肽溶液体积小，缩短了纯化周期，能够更高效的用于柱层析分离，同时本发明的方法配制得到溶液非常稳定,没有析出,能够避免柱子堵塞。
上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。
同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
最后，应当理解的是，本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此，作为示例而非限制，本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地，本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。

Claims (11)

1.一种胸腺法新粗肽的前处理方法，包括将胸腺法新粗肽溶解于磷酸盐溶液中，过滤，得待纯化溶液。
2.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述胸腺法新粗肽为脱除保护基的胸腺法新粗肽，优选的，所述胸腺法新粗肽通过化学固相合成方法获得，更优选的，所述胸腺法新粗肽的纯度≥50％；
和/或，所述磷酸盐溶液为磷酸氢二钠的水溶液，优选的，所述磷酸氢二钠水溶液的浓度为5～15g/L，更优选的，所述磷酸氢二钠水溶液的浓度为10g/L，进一步优选的，所述磷酸氢二钠水溶液的pH为8～12，更进一步优选的，所述磷酸氢二钠水溶液的pH为10.5；和/或，所述过滤前需将胸腺法新粗肽完全溶解，优选的，所述过滤使用滤膜过滤，更优选的，所述滤膜为有机滤膜，进一步优选的，所述滤膜孔径为0.1～0.45μm，更进一步优选的，所述滤膜孔径为0.22μm。
3.一种胸腺法新的纯化方法，所述纯化方法中，洗脱时使用含有磷酸盐的溶液为流动相。
4.如权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将采用权利要求1或2所述的前处理方法制备得到的待纯化溶液经色谱柱纯化，得第一步样品溶液；
2)将所述第一步样品溶液浓缩，得第一步样品浓缩液；
3)将所述第一步样品浓缩液经色谱柱纯化，得第二步样品溶液；
4)将所述第二步样品溶液浓缩，得第二步样品浓缩液；
5)将所述第二步样品浓缩液冷冻干燥，得胸腺法新。
5.如权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤1)中，
所述色谱柱以耐碱填料为固定相，优选的，所述色谱柱以耐碱硅胶为固定相，更优选的，所述色谱柱为C18色谱柱；
和/或，所述色谱柱洗脱时使用的流动相包括流动相A和流动相B，优选的，所述流动相A和流动相B均为磷酸盐溶液，更优选的，所述流动相A和流动相B均为磷酸氢二钠溶液，进一步优选的，所述流动相B为含有机溶剂的磷酸氢二钠水溶液；
和/或，所述纯化过程中使用的检测波长:230/280nm；
和/或，所述第一步样品溶液的纯度大于90％。
6.如权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述流动相A中，所述磷酸氢二钠溶液为磷酸氢二钠的水溶液，优选的，所述磷酸氢二钠溶液的浓度为8～12g/L，pH为8～13，更优选的，所述磷酸氢二钠溶液的浓度为10g/L，pH为10.5；
和/或，所述流动相B中，以磷酸氢二钠水溶液总体积为基准计，所述有机溶剂在磷酸氢二钠水溶液中的体积百分比为20～40％，优选的，所述有机溶剂在磷酸氢二钠水溶液中的体积百分比为30％，更优选的，所述有机溶剂选自甲醇、乙腈、乙醇或异丙醇，进一步优选的，所述有机溶剂为乙腈；
和/或，所述流动相B中，所述磷酸氢二钠水溶液的浓度为8～12g/L，pH为3～7，优选的，所述磷酸氢二钠溶液的浓度为10g/L，pH为5.5；
和/或，所述洗脱为线性梯度洗脱，线性梯度洗脱条件为：流速50～70mL/min，时间75min，以流动相总体积为基准计，流动相A的体积百分比在75min内由100％下降至50％，流动相B的体积百分比在75min内由0％上升至50％，优选的，流速为60mL/min。
7.如权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤2)中，
所述浓缩为减压旋蒸浓缩，优选的，所述减压旋蒸浓缩条件为水温30～35℃，真空度-0.14～-0.05Mbar，更优选的，所述减压旋蒸浓缩条件为水温30℃，真空度-0.09Mbar。
8.如权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤3)中，
所述色谱柱以反相填料为固定相，优选的，所述色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，更优选的，所述色谱柱为C18色谱柱；
和/或，所述色谱柱洗脱时使用的流动相为含有机溶剂的磷酸氢二钠水溶液，优选的，以磷酸氢二钠水溶液总体积为基准计，所述有机溶剂在磷酸氢二钠水溶液中的体积百分比为18～22％，更优选的，所述有机溶剂在磷酸氢二钠水溶液中的体积百分比为20％，进一步优选的，所述磷酸氢二钠水溶液的浓度为40～60mM，所述有机溶剂选自甲醇、乙腈、乙醇或异丙醇，更进一步优选的，所述磷酸氢二钠水溶液的浓度为50mM，所述有机溶剂为乙腈；
和/或，所述洗脱为等度洗脱，洗脱条件为：流速50～70mL/min，优选的，洗脱条件为：流速60mL/min；
和/或，所述纯化过程中使用的检测波长:230nm；
和/或，所述第二步样品溶液纯度大于99％，单杂含量小于0.15％。
9.如权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤4)中，
所述浓缩为减压旋蒸浓缩，优选的，所述减压旋蒸浓缩条件为水温30～35℃，真空度-0.14～-0.05Mbar，更优选的，所述减压旋蒸浓缩条件为水温30℃，真空度-0.09Mbar；所述第二步样品浓缩液浓度为20～40mg/mL，优选的，所述第二步样品浓缩液浓度为30mg/mL。
10.由权利要求3～9任一项所述的纯化方法制备的胸腺法新，所述胸腺法新纯度≥99％；
和/或，所述胸腺法新中缺失肽杂质的含量为0.02～0.06％；
和/或，所述胸腺法新中水解杂质的含量为0.02～0.06％。
11.如权利要求10所述的胸腺法新，其特征在于，所述胸腺法新纯度为99.61％；
和/或，所述胸腺法新中缺失肽杂质的含量为0.04％，优选的，所述缺失肽杂质为Des-Ala3-胸腺法新；
和/或，所述胸腺法新中水解杂质的含量为0.04％，优选的，所述水解杂质为Asp28-胸腺法新。
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