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CN118165069A - 一种含氮螺吲哚啉化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种含氮螺吲哚啉化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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CN118165069A
CN118165069A CN202311688905.8A CN202311688905A CN118165069A CN 118165069 A CN118165069 A CN 118165069A CN 202311688905 A CN202311688905 A CN 202311688905A CN 118165069 A CN118165069 A CN 118165069A
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CN
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oxo
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pyrrolidine
dihydrospiro
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Application number
CN202311688905.8A
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赖英杰
熊金锋
肖瑛
段振芳
邢伟
乐晓亮
刘汉斌
田泽兵
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Shenzhen Salubris Pharmaceuticals Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen Salubris Pharmaceuticals Co Ltd
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Publication date
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Abstract

本申请属于化学药物技术领域，涉及一种通式(I)所示的化合物，或其消旋体、或其异构体及其可药用的盐，作为一种3C样蛋白酶抑制剂以及使用其治疗多种特定疾病或病状的方法。

Description

一种含氮螺吲哚啉化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于化学药物技术领域，涉及一种含氮螺吲哚啉化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，及其制备方法与应用。作为一种3C样蛋白酶抑制剂，以及使用其治疗多种特定疾病或病状的方法。
背景技术
冠状病毒(CoV)是一种包膜正链RNA致病病毒家族，可导致急性和慢性疾病，包括中枢神经系统疾病、普通感冒、下呼吸道感染和腹泻。冠状病毒进入宿主细胞后会被分解释放出核衣壳和病毒基因组。宿主细胞核糖体将病毒基因组的开放阅读框架(ORF)1a和ORF1b分别翻译成多聚蛋白pp1a和pp1b，用于编码16个非结构蛋白(nsps)，而其余的ORF编码结构蛋白和附属蛋白。3C样半胱氨酸蛋白酶(3CLpro)和木瓜样半胱氨酸蛋白酶(PLpro)催化PP裂解生成nsp2-16，进而形成复制-转录复合体(RTC)。这些蛋白酶活性缺失会导致病毒生命周期停止。
3C样蛋白酶(3CLpro)又称主要蛋白酶(Mpro)，全称由306个氨基酸组成，可进一步切割新冠多聚蛋白，从而产生解旋酶、RNA依赖的RNA聚合酶等相关复制元件，在病毒增殖和组装中具有重要作用。天然的3CLpro单体由三个结构域组成，两个单体相互作用形成包含底物结合位点的口袋结构。活性中心位于结构域I和II之间的缝隙中，催化位点为145位的Cys和41位的His。Paxlovid的作用靶点是3C样蛋白酶(3CLpro)，通过抑制病毒3CLpro，抑制RNA复制及相关非结构蛋白的生成，从而抑制病毒的复制。
目前，辉瑞制药PF-07321332的作用靶点是3C样蛋白酶(3CLpro)，通过抑制病毒3CLpro，抑制RNA复制及相关非结构蛋白的生成，从而抑制病毒的复制。PF-07321332已获得FDA紧急用药上市批准，用于新冠病毒感染的治疗。但是，PF-07321332治疗新型冠状病毒感染时，如遇到其他处方药物，如抗血脂药物他汀类药物、抗凝血剂以及抗抑郁药，会增加这些药物毒副作用，甚至可能导致死亡等严重不良反应的发生。研究中尽管有报道称某些化合物可以抑制3CLpro活性，但它们尚未被批准作为冠状病毒疗法。
综上所述，本领域迫切需要更加安全、有效、便捷的抗新冠药物。卤代抗新冠药物不仅是国际抗新冠病毒研究的热点，也是我国传染病防治的重要工具。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本申请提供一种通式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，及其制备方法与应用。作为一种3C样蛋白酶抑制剂，以及使用其治疗多种特定疾病或病状的方法。
第一方面，本申请提供一种通式(I)所示的化合物，或其或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐。
第二方面，本发明还提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的上述任一项所述的化合物或其药物可接受的盐和药物可接受的载体。
第三方面，本发明还提供一种治疗有效量的上述所述的化合物或其药物可接受的盐在制备用于治疗病况的药物中的用途，所述疾病是3C样蛋白酶抑制剂相关疾病，具体地，所述病况选自新型冠状病毒感染等病症。
具体地，本发明通过以下技术方案来实现：
一种通式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，包括：
A＝-C(O)-芳基，或者-C(O)-杂芳基，或者芳基或者杂芳基可以进一步被卤素、烷基所取代；
R1是氢、-CN、卤素、烷基或者卤代烷基；
R2是烷基、或者卤代烷基、或者芳基烷基、或者环烷基烷基；
R3是烷基或者卤代烷基；
R4是是烷基、卤代烷基、环烷基或者环烷基烷基；
R5是烷基或者卤代烷基；
表示连接键。
作为本发明的一种优选技术方案，所述烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、仲戊基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、仲己基、叔己基、新己基、2-甲基戊基、1,2-二甲基丁基、1-乙基丁基。
作为本发明的一种优选技术方案，所述环烷基选自C3-6的环烷，C3-6的环烷选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基。
作为本发明的一种优选技术方案，所述卤素选自氟、氯、溴、碘。
作为本发明的一种优选技术方案，所述芳基选自苯；所述杂芳基选自吲哚，芳基可以进一步被卤素所取代。
作为本发明的一种优选技术方案，所述环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基。
作为本发明的一种优选技术方案，选自：
或者R1是氢；R2是环丙基甲基、叔丁基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基或R3是甲基、-CD3。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，选自：
作为本发明的一种优选技术方案，所述药学上可接受的盐是指所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐与药学上可接受的酸或碱制备。
作为本发明的一种优选技术方案，所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐的一个以上的氢原子上被同位素氘取代。
本发明进一步提供了一种药物组合物，其特征在于，包含治疗有效量的所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐和药物可接受的载体。
本发明进一步提供了所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐的医药用途，具体地，在制备用于治疗疾病的药物中的用途，所述疾病为3C样蛋白酶抑制剂相关疾病，具体选自新型冠状病毒感染等病症。
为清楚起见，本文定义了在化合物的描述中所使用的通用术语。
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与药学上可接受的酸或碱制备。
除了盐的形式，本发明所提供的化合物还存在前药形式。本文所描述的化合物的前药容易地在生理条件下发生化学变化从而转化成本发明的化合物。此外，前体药物可以在体内环境中通过化学或生化方法被转换到本发明的化合物。
例如以下通式结构的前药：
Y选自-(CH2)m-(O)n-C(O)-(O)p-R6，R6是烷基、环烷基或者m、n、p独立地选自0、1、2。
作为本发明的一种优选技术方案，Y选自
作为本发明的一种优选技术方案，选自：
本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式或者溶剂化形式存在，包括水合物形式。一般而言，溶剂化形式与非溶剂化的形式相当，都包含在本发明的范围之内。
本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，阻转异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，所述混合物例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。
可以通过的手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(R)-和(S)-异构体，以及D和L异构体，阻转异构体等。如果想得到本发明某化合物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，其中将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过使用色谱法完成的，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合(例如由胺生成氨基甲酸盐)。
本发明化合物分子的原子是同位素，通过同位素衍生化通常可以延长半衰期、降低清除率、代谢稳定和提高体内活性等效果。并且，包括一个实施方案，其中至少一个原子被具有相同原子数(质子数)和不同质量数(质子和中子和)的原子取代。本发明化合物中包括的同位素的实例包括氢原子、碳原子、氮原子、氧原子、磷原子、硫原子、氟原子、氯原子，其分别包括2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F、36Cl。特别的是，随其衰退而发射辐射的放射性同位素例如3H或14C可用于药物制剂或者体内化合物的局部解剖学检验。稳定的同位素既不随其量衰减或变化，也不具有放射性，因此其可以安全使用。当构成本发明化合物分子的原子是同位素时，通过用包含相应同位素的试剂替代合成中所用的试剂，可以根据通用方法转化同位素。
本发明的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氘(2H)，碘-125(125I)或C-14(14C)。本发明的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。
进一步地，本发明的化合物一个或多个氢原子上被同位素氘(2H)取代，本发明化合物氘代后，具有延长半衰期、降低清除率、代谢稳定和提高体内活性等效果。
所述同位素衍生物的制备方法通常包括：相转移催化方法。例如，优选的氘化方法采用相转移催化剂(例如，四烷基铵盐，NBu4HSO4)。使用相转移催化剂交换二苯基甲烷化合物的亚甲基质子，导致比在酸(例如，甲磺酸)存在下用氘化硅烷(例如三乙基氘化甲硅烷)或用路易斯酸如三氯化铝采用氘化硼酸钠还原而引入较高的氘。
术语“药学上可接受的载体”是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂载体或介质，代表性的载体包括水、油、蔬菜和矿物质、膏基、洗剂基质、软膏基质等。这些基质包括悬浮剂、增粘剂、透皮促进剂等。它们的制剂为化妆品领域或局部药物领域的技术人员所周知。关于载体的其他信息，可以参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins(2005)，该文献的内容通过引用的方式并入本文。
术语“赋形剂”通常是指配制有效的药物组合物所需要载体、稀释剂和/或介质。
针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。对于本发明中的口服剂型，组合物中一种活性物质的“有效量”是指与该组合物中另一种活性物质联用时为了达到预期效果所需要的用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。
术语“活性成分”、“治疗剂”，“活性物质”或“活性剂”是指一种化学实体，它可以有效地治疗目标紊乱、疾病或病症。
“任选”或“任选地”指的是随后描述的事件或状况可能但不是必需出现的，并且该描述包括其中所述事件或状况发生的情况以及所述事件或状况不发生的情况。
本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
本发明化合物具有较好病毒抑制活性和药代pk性质。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请作进一步详细的描述，但本申请的实施方式不限于此。
实施例1
合成1-叔丁基-N-(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙基-2-基)-N-甲基-d3-1H-吡唑-4-甲酰胺
合成路线
步骤A：合成(S)-2-氨基-3-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基)丙酸甲酯
室温下，将7-氮杂-L-色氨酸(4.0克，19.5毫摩尔)溶于甲醇(50毫升)中，然后把温度降到零摄氏度缓慢滴加二氯亚砜(6.96克，58.5毫摩尔)，加毕，反应缓慢升温到70摄氏度搅拌2小时。
反应结束，待反应液温度降到室温，真空浓缩得到4.4克土黄色粗品(S)-2-氨基-3-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基)丙酸甲酯盐酸盐，直接用于下一步。LC-MS：[M+H]+＝220。
步骤B：合成6，7，8，9-四氢-5H-吡咯并[2，3-b：5，4-c′]二吡啶-6-羧酸甲酯
室温下，将(S)-2-氨基-3-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基)丙酸甲酯盐酸盐(4.4克，20.1毫摩尔)，吡啶(4.76克，60.2毫摩尔)和多聚甲醛(904毫克，10.0毫摩尔)溶于甲醇(50毫升)中，然后70摄氏度搅拌2小时。
反应结束，待反应液温度降到室温，将反应液过滤，滤液真空浓缩得到4.6克土黄色粗品6，7，8，9-四氢-5H-吡咯并[2，3-b：5，4-c′]二吡啶-6-羧酸甲酯，直接用于下一步。LC-MS：[M+H]+＝232。
步骤C：合成7-叔丁基6-甲基-5，6，8，9-四氢-7H-吡咯并[2，3-b：5，4-c′]二吡啶-6，7-二羧酸酯
室温下，将6，7，8，9-四氢-5H-吡咯并[2，3-b：5，4-c′]二吡啶-6-羧酸甲酯(4.6克，19.9毫摩尔)和三乙胺(6.04克，59.7毫摩尔)溶于四氢呋喃(60毫升)和水(20毫升)中，随后缓慢加入二碳酸二叔丁基酯(8.68克，39.9毫摩尔)，加毕，该反应25摄氏度搅拌2小时。
反应结束，向反应液加入饱和氯化铵溶液(100毫升)，然后用乙酸乙酯(40毫升×3)萃取。合并有机相，干燥、过滤、真空浓缩得到残余物。残余物通过正相柱(正已烷/乙酸乙酯＝5/1)纯化的到2.8克黄色固体产物7-叔丁基6-甲基-5，6，8，9-四氢-7H-吡咯并[2，3-b：5，4-c′]二吡啶-6，7-二羧酸酯(收率：42％)。LC-MS：[M+H]+＝332。
步骤D：合成1-叔丁基5-甲基(3R，5S)-2′-氧代-1，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1，5-二羧酸酯
室温下，将7-叔丁基6-甲基-5，6，8，9-四氢-7H-吡咯并[2，3-b：5，4-c′]二吡啶-6，7-二羧酸酯(28克，8.45毫摩尔)溶于四氢呋喃(40毫升)和水(5毫升)中，将温度降到0摄氏度后，依次加入溴代丁二酰亚胺(1.5克，8.45毫摩尔)和冰醋酸(3.45克，57.5毫摩尔)，加毕，然后0摄氏度搅拌2小时。
反应结束，向反应液加入饱和碳酸氢钠溶液(100毫升)，然后用乙酸乙酯(40毫升×3)萃取。合并有机相，干燥、过滤、真空浓缩得到22克黄色粗品1-叔丁基5-甲基(3R，5S)-2′-氧代-1，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1，5-二羧酸酯，直接用于下一步。LC-MS∶[M+H]+＝348。
步骤E：合成(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧，代-1，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-羧酸叔丁酯
室温下，将1-叔丁基5-甲基(3R，5S)-2′-氧代-1，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1，5-二羧酸酯(22克，6.33毫摩尔)溶于胺甲醇(40毫升，7M)中，然后50摄氏度搅拌48小时。
反应结束，待反应液温度降到室温，真空浓缩得到残余物。残余物通过反相柱(C18，330g，水∶乙腈＝3∶1)纯化得到1.0克黄色固体(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-羧酸叔丁酯(收率：47％)。LC-MS：[M+H]+＝333。
步骤F：合成(3R，5S)-2-氧代-1，2-二氢螺吡咯烷-3，3-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺
室温下，将(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-羧酸叔丁酯(1.0克，3.01毫摩尔)溶于盐酸乙酸乙酯(20毫升，2M)中，然后25摄氏度搅拌2小时。
反应结束，反应液真空浓缩得到900毫克黄色固体(3R，5S)-2-氧代-1，2-二氢螺吡咯烷-3，3-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐。LC-MS：[M+H]+＝233。
步骤G：合成(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基甲酸叔丁酯
室温下，将(S)-2-(叔丁氧羰基)(甲基-d3)氨基)-3-环丙基丙酸(600毫克，2.44毫摩尔)，N-甲基吗啡啉(493毫克，4.87毫摩尔)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(928毫克，2.44毫摩尔)混合在二氯甲烷(15毫升)中，室温反应半个小时后，将(3R，5S)-2-氧代-1，2-二氢螺吡咯烷-3，3-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(496毫克，1.62毫摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(3毫升)的溶液加入到以上混合液中，室温25摄氏度下再反应1.5小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(40毫升)，用二氯甲烷(15毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(40毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过正相柱(正已烷/乙酸乙酯＝1∶5)纯化得到500毫克白色产物(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基甲酸叔丁酯(收率67％)。LC-MS：[M+H]+＝461
步骤H：合成(3R，5S)-1-(S)-3-环丙基-2-(甲基-d3)氨基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺室温下，(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基甲酸叔丁酯(500毫克，1.09毫摩尔)溶于盐酸/乙酸乙酯(1M，10毫升)中，室温反应2小时。
反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物470毫克(3R，5S)-1-(S)-3-环丙基-2-(甲基-d3)氨基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M+H]+＝361。
步骤I：合成(3R，5S)-1-(S)-2-(1-叔丁基)-N-甲基-d3-1H-吡唑-4-甲酰胺基)-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺
室温下，将1-叔丁基-1H-吡唑-4-羧酸(200毫克，1.09毫摩尔)溶于二氯甲烷(3毫升)中，0摄氏度下缓慢滴加二氯亚砜，然后升至室温搅拌两个小时。随后将三乙胺(375毫克，3.70毫摩尔)和(3R，5S)-1-(S)-3-环丙基-2-(甲基-d3)氨基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(266毫克，740微摩尔)溶于二氯甲烷(3毫升)加入到以上混合液中，室温25摄氏度下再反应1小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(20毫升)，用二氯甲烷(10毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(30毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过正相柱(正已烷/乙酸乙酯＝1∶5)纯化得到350毫克白色产物(3R，5S)-1-(S)-2-(1-叔丁基)-N-甲基-d3-1H-吡唑-4-甲酰胺基)-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺(收率95％)。LC-MS：[M+H]+＝511。
步骤J：合成1-叔丁基-N-(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙基-2-基)-N-甲基-d3-1H-吡唑-4-甲酰胺
室温下，将(3R，5S)-1-(S)-2-(1-叔丁基)-N-甲基-d3-1H-吡唑-4-甲酰胺基)-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺(350毫克，720微摩尔)溶于二氯甲烷(10毫升)中，随后缓慢加入伯吉斯试剂(520毫克，217毫摩尔)。该反应搅拌1小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(20毫升)，用二氯甲烷(10毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(20毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝2∶3)纯化得到74.6毫克白色产物1-叔丁基-N-(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙基-2-基)-N-甲基-d3-1H-吡唑-4-甲酰胺(收率21％)。LC-MS：[M+H]+＝493。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.32(s，1H)，8.06-8.00(m，1H)，7.95(s，1H)，7.62(s，1H)，7.38(dd，J＝7.4，1.6Hz，1H)，6.88(dd，J＝7.4，5.3Hz，1H)，5.17(dd，J＝8.7，6.9Hz，2H)，4.15-4.06(m，1H)，3.84(d，J＝10.8Hz，1H)，2.69(dd，J＝13.4，8.7Hz，1H)，2.50(hept，J＝3.1Hz，1H)，1.75(dt，J＝14.4，7.4Hz，1H)，1.63(dt，J＝14.0，6.9Hz，1H)，1.51(s，9H)，0.69-0.65(m，1H)，0.44-0.28(m，2H)，0.15-0.10(m，2H).
实施例2
合成N-(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-4，6，7-三氟-N-甲基-d3-1H-吲哚-2-甲酰胺
合成路线
步骤A：合成(3R，5S)-1-(S)-3-环丙基-2-(4，6，7-三氟-N-甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺基丙酰基)-2-氧代-1，2-二氢螺吡咯烷-3，3-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺
室温下，将4，6，7-三氟吲哚-2-羧酸(180毫克，837微摩尔)，N-甲基吗啡啉(169毫克，1.67毫摩尔)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(318毫克，837微摩尔)混合在二氯甲烷(10毫升)中，室温反应半个小时后，将(3R，5S)-1-(S)-3-环丙基-2-(甲基-d3)氨基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(242毫克，558微摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(2毫升)的溶液加入到以上混合液中，室温25摄氏度下再反应15小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(20毫升)，用二氯甲烷(15毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(30毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过正相柱(正已烷/乙酸乙酯＝1∶5)纯化得到120毫克白色产物(3R，5S)-1-(S)-3-环丙基-2-(4，6，7-三氟-N-甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺基丙酰基)-2-氧代-1，2-二氢螺吡咯烷-3，3-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺(收率39％)。LC-MS：[M+H]+＝558。
步骤D：合成N-(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-4，6，7-三氟-N-甲基-d3-1H-吲哚-2-甲酰胺
室温下，将(3R，5S)-1-(S)-3-环丙基-2-(4，6，7-三氟-N-甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺基丙酰基)-2-氧代-1，2-二氢螺吡咯烷-3，3-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺(120毫克，90微摩尔)溶于二氯甲烷(5毫升)中，随后缓慢加入伯吉斯试剂(128毫克，270微摩尔)。该反应搅拌1小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(10毫升)，用二氯甲烷(5毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(20毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝2∶3)纯化得到16.1毫克白色产物N-(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-4，6，7-三氟-N-甲基-d3-1H-吲哚-2-甲酰胺(收率14％)。LC-MS：[M+H]+＝540。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.55(s，1H)，11.31(s，1H)，7.99(dd，J＝5.3，1.5Hz，1H)，7.47(d，J＝7.4Hz，1H)，7.13(td，J＝10.8，5.1Hz，1H)，6.94-6.83(m，2H)，5.31-5.15(m，2H)，4.01(d，J＝10.9Hz，1H)，2.77-2.67(m，1H)，259-2.52(m，1H)，1.85-1.67(m，2H)，0.76(s，1H)，0.41(dt，J＝15.9，8.3Hz，2H)，0.20-0.14(m，2H).
实施例3
合成(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-D3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺
合成路线
步骤A：合成叔丁基-1-((S)-1-(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙基-2-基(甲基-D3)氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基甲酸酯
室温下，将(叔丁氧羰基)-L-丙氨酸(200毫克，1.06毫摩尔)，N-甲基吗啡啉(214毫克，2.11毫摩尔)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(403毫克，1.06毫摩尔)混合在二氯甲烷(10毫升)中，室温反应半个小时后，将(3R，5S)-1-(S)-3-环丙基-2-(甲基-d3)氨基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(240毫克，634微摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(3毫升)的溶液加入到以上混合液中，室温25摄氏度下再反应15小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(30毫升)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(50毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过正相柱(正已烷/乙酸乙酯＝1∶5)纯化得到160毫克白色产物叔丁基-1-((S)-1-(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙基-2-基(甲基-D3)氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基甲酸酯(收率43％)。LC-MS：[M+H]+＝532。
步骤B：合成(3R，5S)-1-(S)-2-氨基-N-甲基-d3丙酰胺基-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐
室温下，叔丁基-1-((S)-1-(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙基-2-基(甲基-D3)氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基甲酸酯(160毫克，301微摩尔)溶于盐酸/乙酸乙酯(2M，5毫升)中，室温反应1小时。
反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物150毫克(3R，5S)-1-(S)-2-氨基-N-甲基-d3丙酰胺基-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M+H]+＝432。
步骤C：合成(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-D3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺
室温下，将(3R，5S)-1-(S)-2-氨基-N-甲基-d3丙酰胺基-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(150毫克，297微摩尔)和三乙胺(150毫克，1.49毫摩尔)溶于二氯甲烷(5毫升)中，降至温度等于0摄氏度，随后缓慢滴加溶于二氯甲烷(1毫升)的三氟乙酸酐(312毫克，1.49微摩尔)。加毕，该反应零摄氏度下搅拌30分钟。
反应结束，加入冰的饱和氯化铵(10毫升)，用二氯甲烷(5毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(20毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝2∶3)纯化得到189毫克(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-D3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺(收率12％)。LC-MS：[M+H]+＝510。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.36(s，1H)，9.61(d，J＝7.0Hz，1H)，8.12(dd，＝5.3，1.5Hz，1H)，7.46(dd，J＝7.4，1.6Hz，1H)，6.99(dd，J＝7.4，5.3Hz，1H)，5.16(ddd，J＝13.9，8.5，6.8Hz，2H)，4.63(p，J＝6.8Hz，1H)，3.83(d，J＝10.7Hz，1H)，3.74(d，J＝10.7Hz，1H)，2.71(dd，J＝13.4，8.8Hz，1H)，2.50(p，J＝1.8Hz，1H)，1.71-1.51(m，2H)，0.92(d，J＝7.0Hz，3H)，0.54(qd，J＝7.3，3.9Hz，1H)，0.32(dtd，J＝34.7，9.3，8.7，4.9Hz，2H)，0.06(qd，J＝8.0，6.9，4.6Hz，2H).
实施例4
合成7-氯-N-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-d3-1H-吲哚-2-甲酰胺
合成路线
步骤A：(3R，5S)-1-(S)-2-(7-氯-N-甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺基)-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺
室温下，将7-氯吲哚-2-羧酸(200毫克，1.02毫摩尔)，N-甲基吗啡啉(207毫克，2.04毫摩尔)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(388毫克，1.02毫摩尔)混合在二氯甲烷(10毫升)中，室温反应半个小时后，将(3R，5S)-1-(S)-3-环丙基-2-(甲基-d3)氨基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(180毫克，499微摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(3毫升)的溶液加入到以上混合液中，室温25摄氏度下再反应1.5小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(30毫升)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(50毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过正相柱(正已烷/乙酸乙酯＝1∶5)纯化得到180毫克白色产物(3R，5S)-1-(S)-2-(7-氯-N-甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺基)-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺(收率49％)。LC-MS：[M+H]+＝538。
步骤B：7-氯-N-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-d3-1H-吲哚-2-甲酰胺
室温下，将(3R，5S)-1-(S)-2-(7-氯-N-甲基-d3)-1H-吲哚-2-甲酰胺基)-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺(180毫克，335微摩尔)溶于二氯甲烷(5毫升)中，随后缓慢加入伯吉斯试剂(240毫克，1.00微摩尔)。该反应搅拌1小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(10毫升)，用二氯甲烷(5毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(20毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝2∶3)纯化得到51.3毫克白色产物7-氯-N-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-d3-1H-吲哚-2-甲酰胺(收率29％)。LC-MS：[M+H]+＝520。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.66(s，1H)，11.33(s，1H)，8.05(d，J＝5.3Hz，1H)，7.58(d，J＝7.9Hz，1H)，7.51(d，J＝7.2Hz，1H)，7.27(d，J＝7.7Hz，1H)，7.06(t，J＝7.7Hz，1H)，6.93(d，J＝6.4Hz，1H)，6.79(s，1H)，5.31-5.18(m，2H)，4.06-3.93(m，2H)，2.72(t，J＝11.2Hz，1H)，2.59-2.52(m，1H)，1.88-1.66(m，2H)，0.78(s，1H)，0.44(t，J＝7.7Hz，2H)，0.17(s，2H).
实施例5
合成(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)-N-甲基-D3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺
合成路线
步骤A：合成(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)(甲基-D3)氨基甲酸酯
室温下，将(S)-2-(叔丁氧羰基)(甲基-d3)氨基)-4，4-二甲基戊酸(260毫克，991微摩尔)，N-甲基吗啡啉(251毫克，2.48毫摩尔)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(377毫克，991微摩尔)混合在二氯甲烷(10毫升)中，室温反应半个小时后，将(3R，5S)-2-氧代-1，2-二氢螺吡咯烷-3，3-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(252毫克，826微摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(3毫升)的溶液加入到以上混合液中，室温25摄氏度下再反应1.5小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(30毫升)，用二氯甲烷(10毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(30毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝1∶1)纯化得到200毫克白色产物(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)(甲基-D3)氨基甲酸酯(收率51％)。LC-MS：[M+H]+＝477
步骤B：合成(3R，5S)-1-(S)-4，4-二甲基-2-(甲基-d3)氨基)戊酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺
室温下，((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)(甲基-D3)氨基甲酸酯(200毫克，420微摩尔)溶于盐酸/乙酸乙酯(2M，5毫升)中，室温反应1小时。
反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物180毫克(3R，5S)-1-(S)-4，4-二甲基-2-(甲基-d3)氨基)戊酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M+H]+＝377。
步骤C：合成叔丁基-1-((S)-1-(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基(甲基-D3)氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基甲酸酯
室温下，将(叔丁氧羰基)-L-丙氨酸(150毫克，793微摩尔)，N-甲基吗啡啉(160毫克，1.59毫摩尔)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(301毫克，793微摩尔)混合在二氯甲烷(10毫升)中，室温反应半个小时后，将(3R，5S)-1-(S)-4，4-二甲基-2-(甲基-d3)氨基)戊酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(199毫克，529微摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(3毫升)的溶液加入到以上混合液中，室温25摄氏度下再反应1.5小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(30毫升)，用二氯甲烷(15毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(30毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝1∶1)纯化得到80毫克白色产物叔丁基-1-((S)-1-(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基(甲基-D3)氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基甲酸酯(收率28％)。LC-MS：[M+H]+＝548。
步骤D：合成(3R，5S)-1-(S)-2-氨基-N-甲基-d3丙酰胺基)-4，4-二甲基戊酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺
室温下，叔丁基-1-((S)-1-(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基(甲基-D3)氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基甲酸酯(80毫克，146微摩尔)溶于盐酸/乙酸乙酯(2M，5毫升)中，室温反应1小时。
反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物70毫克(3R，5S)-1-(S)-2-氨基-N-甲基-d3丙酰胺基)-4，4-二甲基戊酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M+H]+＝448。
步骤E：合成(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)-N-甲基-D3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺
室温下，将3R，5S)-1-(S)-2-氨基-N-甲基-d3丙酰胺基)-4，4-二甲基戊酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(70毫克，138微摩尔)混合于二氯甲烷(5毫升)中，零摄氏度下缓慢加入吡啶(109毫克，1.38毫摩尔)和三氟乙酸酐(145毫克，692微摩尔)。该温度下反应搅拌30分钟。
反应结束，加入饱和氯化铵(10毫升)，用二氯甲烷(5毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(10毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝2∶3)纯化得到16.1毫克白色产物(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)-N-甲基-D3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺(收率3％)。LC-MS：[M+H]+＝526。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.38(s，1H)，9.60(d，J＝7.1Hz，1H)，8.12(dd，J＝5.3，1.5Hz，1H)，7.39(dd，J＝7.5，1.6Hz，1H)，6.98(dd，J＝7.4，5.3Hz，1H)，5.23(t，J＝63Hz，1H)，5.16(t，J＝8.0Hz，1H)，4.59(p，J＝6.9Hz，1H)，3.88-3.75(m，2H)，2.70(dd，J＝13.4，8.7Hz，1H)，2.54(s，1H)，1.97(dt，J＝14.2，7.5Hz，1H)，1.41(dd，J＝14.1，5.8Hz，1H)，0.88(d，J＝7.0Hz，3H)，0.85(s，9H).
实施例6
合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丁酰胺
合成路线
步骤A：合成叔丁基-((S)-1--(((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶基]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯
0℃下，将(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸(89.71毫克，0.439毫摩尔)溶于二氯甲烷(10毫升)，加入HATU(181.81毫克，0.478毫摩尔)，DIPEA(167.7毫克，1.3毫摩尔)和中，搅拌10民后，将(3R，5S)-1-(S)-3-环丙基-2-(甲基-d3)氨基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(103毫克，0.26微摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(10毫升)的溶液加入到以上混合液中，加完后转至室温下反应2h小时。
反应结束，加入H2O(20毫升)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，浓缩至干得到残余，残余物反向柱纯化得到141.7毫克白色产物叔丁基(((S)-1-(((()S)-1-)((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶基]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(收率100％)，未完全拉干，超重，收率胺100％计算。LC-MS：[M-H]-＝544。
步骤B：合成(3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-N-(甲基-d3)丁酰胺基)-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺并[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐
室温下，叔丁基(((S)-1-(((()S)-1-)((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶基]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(141.7毫克，260微摩尔)溶于DCM(5毫升)终，加入盐酸/二氧六环(4M，10毫升)中，室温反应2小时。
反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物150毫克(3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-N-(甲基-d3)丁酰胺基)-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺并[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M-H]-＝444。
步骤C：合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丁酰胺
-15二，将(3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-N-(甲基-d3)丁酰胺基)-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺并[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(125.06毫克，260微摩尔)溶于DCM(20毫升)，加入吡啶(205.6毫克，2.6毫摩尔)，随后缓慢滴加溶于二氯甲烷(2毫升)的三氟乙酸酐(273.39毫克，1.3微摩尔)。加毕，该反应-15摄氏度下搅拌1小时。
反应结束，加入H2O(20毫升)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱纯化得到83毫克(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丁酰胺(收率61％，3steps)。LC-MS：[M-H]-＝522。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.38(s，1H)，9.58(d，J＝7.6Hz，1H)，8.14(d，J＝5.2Hz，1H)，7.45(d，J＝7.4Hz，1H)，7.11-6.93(m，1H)，5.19(q，J＝9.2，8.6Hz，2H)，4.46(q，J＝7.4Hz，1H)，3.86-3.66(m，2H)，2.71(dd，J＝13.4，8.7Hz，1H)，2.54(s，1H)，1.79-1.57(m，2H)，1.22(p，J＝7.1Hz，2H)，0.98-0.62(m，3H)，0.60-0.47(m，1H)，0.44-0.22(m，2H)，0.15--0.06(m，2H).
实施例7
合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-3-环丙烷-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺
合成路线
步骤A：合成叔丁基(((S)-1-(((R)-1-(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-3-环丙烷-1-氧代丙基-2-基)氨基甲酸酯
0℃下，将(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-环丙基丙酸(65.6毫克，0.28毫摩尔)溶于二氯甲烷(10毫升)，加入HATU(113.6毫克，0.299毫摩尔)，DIPEA(167.7毫克，1.3毫摩尔)和中，搅拌10民后，将(3R，5S)-1-(S)-3-环丙基-2-(甲基-d3)氨基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(103毫克，0.26微摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(10毫升)的溶液加入到以上混合液中，加完后转至室温下反应2h小时。
反应结束，加入H2O(20毫升)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，浓缩至干得到残余，残余物反向柱纯化得到149毫克白色产物叔丁基(((S)-1-(((R)-1-(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-3-环丙烷-1-氧代丙基-2-基)氨基甲酸酯(收率100％)，未完全拉干，超重，收率胺100％计算。LC-MS：[M-H]-＝570。
步骤B：合成(3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-3-环丙基-N-(甲基-d3)丙酰胺基)-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐
室温下，叔丁基(((S)-1-(((R)-1-(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-y1)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-3-环丙烷-1-氧代丙基-2-基)氨基甲酸酯(149毫克，260微摩尔)溶于DCM(5毫升)终，加入盐酸/二氧六环(4M，8毫升)中，室温反应2小时。
反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物132.32毫克(3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-3-环丙基-N-(甲基-d3)丙酰胺基)-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M-H]-＝470。
步骤C：合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-y1)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-3-环丙烷-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺
在-15℃下，将(3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-3-环丙基-N-(甲基-d3)丙酰胺基)-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(132.32毫克，260微摩尔)溶于DCM(20毫升)，加入吡啶(246.48毫克，3.12毫摩尔)，随后缓慢滴加溶于二氯甲烷(2毫升)的三氟乙酸酐327.6毫克，1.56微摩尔)。加毕，该反应-15摄氏度下搅拌1小时。
反应结束，加入H2O(20毫升)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱纯化得到70毫克(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-3-环丙烷-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺(收率49％，3steps)。LC-MS：[M-H]-＝548。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.37(s，1H)，9.68(s，1H)，813(s，1H)，7.44(s，1H)，6.98(s，1H)，5.16(d，J＝29.3Hz，2H)，4.66(s，1H)，3.80(s，2H)，2.70(s，2H)，1.61(s，2H)，1.19(d，J＝49.5Hz，2H)，0.54(s，2H)，0.33(s，4H)，0.20-0.02(m，3H)，-0.04(s，1H).
实施例8
合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-2-环丙基-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)乙酰胺
合成路线：
步骤A：合成叔丁基(((S)-2-((((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-环丙基-2-氧代乙基)氨基甲酸酯
在0℃下，将(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-环丙基丙酸(88.66毫克，0.4119毫摩尔)溶于二氯甲烷(10毫升)，加入HATU(156.6毫克，0.4119毫摩尔)，DIPEA(212.5毫克，1.64毫摩尔)和中，搅拌10min后，将(3R，5S)-1-(S)-3-环丙基-2-(甲基-d3)氨基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(108.75毫克，0.2746微摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(10毫升)的溶液加入到以上混合液中，加完后转至室温下反应2h小时。
反应结束，加入H2O(20毫升)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，浓缩至干得到残余，残余物反向柱纯化得到130毫克白色产物叔丁基(((S)-2-((((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-y1)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-环丙基-2-氧代乙基)氨基甲酸酯(收率85％)，未完全拉干，超重，收率胺100％计算。LC-MS：[M-H]-＝556。
步骤B：合成叔丁基(((S)-2-((((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-bl吡啶]-1-yl)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-环丙基-2-氧代乙基)氨基甲酸酯
室温下，叔丁基(((S)-2-((((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-y1)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-环丙基-2-氧代乙基)氨基甲酸酯(130毫克，0.233微摩尔)溶于DCM(5毫升)中，加入盐酸/二氧六环(4M，10毫升)中，室温反应2小时。
反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物115.06毫克叔丁基(((S)-2-((((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-环丙基-2-氧代乙基)氨基甲酸酯，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M-H]-＝456。
步骤C：合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-2-环丙基-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)乙酰胺
在-15℃下，将叔丁基(((S)-2-((((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-环丙基-2-氧代乙基)氨基甲酸酯(115.06毫克，0.233微摩尔)溶于DCM(20毫升)，加入吡啶(221.53毫克，28毫摩尔)，随后缓慢滴加溶于二氯甲烷(2毫升)的三氟乙酸酐(300毫克，1.4微摩尔)。加毕，该反应-15摄氏度下搅拌1小时。
反应结束，加入H2O(20毫升)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱纯化得到80毫克(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-2-环丙基-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)乙酰胺(收率64％，2steps)。LC-MS：[M-H]-＝534。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.38(s，1H)，9.58(d，J＝7.6Hz，1H)，8.14(d，J＝5.2Hz，1H)，7.45(d，J＝7.4Hz，1H)，7.11-6.93(m，1H)，5.19(q，J＝9.2，8.5Hz，2H)，4.46(d，J＝7.3Hz，1H)，3.86-3.66(m，2H)，2.71(dd，J＝13.4，8.7Hz，1H)，2.54(s，1H)，1.79-1.57(m，2H)，1.22(p，J＝7.4，7.0Hz，2H)，0.69(t，J＝7.2Hz，3H)，0.60-0.47(m，1H)，0.32(dd，J＝27.4，11.4Hz，2H)，0.06(tt，J＝9.4，4.5Hz，2H).
实施例9
合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺
合成路线
步骤A：((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸叔丁酯
室温下，将(S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基-d3)氨基)-3-(4-氟苯基)丙酸(585毫克，1.95毫摩尔)溶于二氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺(8毫升/2毫升)中，加入N-甲基吗啡啉(577微升，52毫摩尔)，加入HATU(741毫克，1.95毫摩尔)，室温搅拌1小时。加入(3R，5S)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(450毫克，1.3毫摩尔)，室温搅拌反应3小时。
反应结束，加入水(40毫升)淬灭反应，用二氯甲烷(30毫升×4)萃取，合并有机相，减压浓缩，残余物通过反向柱纯化得到380毫克叔丁基((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸叔丁酯(收率56.7％)。LC-MS：[M-H]+＝514。
步骤B：合成(3R，5S)-1-((S)-3-(4-氟苯基)-2-((甲基-d3)氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐
室温下，将叔丁基((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸叔丁酯(380毫克，0.74毫摩尔)溶于二氯甲烷(2毫升)中，加入盐酸二氧六环(4M，3毫升)，室温反应2小时。
反应结束，浓缩至干，得到白色固体产物422毫克(3R，5S)-1-((S)-3-(4-氟苯基)-2-((甲基-d3)氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M+H-HCl]+＝415。
步骤C：叔丁基((S)-1-(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-氧基丙-2-基氨基甲酸酯
室温下，将(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸(69.9毫克，0.37毫摩尔)，溶于DCM(1.6毫升)和DMF(0.4毫升)的混合溶液中，室温下搅拌，加入NMM(109微升，0.99毫摩尔)，HATU(140毫克，0.37毫摩尔)，然后室温下搅拌1h，加入(3R，5S)-1-((S)-3-(4-氟苯基)-2-((甲基-d3)氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(140毫克，0.247毫摩尔)，室温搅拌3h。
反应结束，加入水(20ml)，用二氯甲烷(20毫升×4)萃取。合并有机相，减压浓缩，残余物通过反向柱纯化得到73毫克白色固体产物叔丁基((S)-1-(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-氧基丙-2-基氨基甲酸酯(收率39.3％)。LC-MS：[M-H]-＝584。
步骤D：合成(3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-N-(甲基-d3)丙酰胺基)-3-(4-氟苯基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐
室温下，将叔丁基((S)-1-(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-y1)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-氧基丙-2-基氨基甲酸酯(73毫克，0.12毫摩尔)溶于二氯甲烷(5毫升)中，加入盐酸二氧六环(4M，0.13毫升)，室温反应2小时。
反应结束，浓缩至干，得到白色固体产物81毫克(3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-N-(甲基-d3)丙酰胺基)-3-(4-氟苯基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M-H-HCl]+＝484。
步骤E：合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺
室温下，(3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-N-(甲基-d3)丙酰胺基)-3-(4-氟苯基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(81毫克，0.49毫摩尔)，溶于DCM(5毫升)中，室温下搅拌，加入三乙胺(94.8毫克，1.2毫摩尔)，冰浴条件下滴加TFAA(126毫克，0.6毫摩尔)，在冰浴条件下搅拌30分钟。
反应结束，加入水(20ml)，用二氯甲烷(20毫升×4)萃取。合并有机相，减压浓缩，残余物通过反向柱纯化得到37毫克白色固体产物(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺(收率54.8％)。
LC-MS：[M-H]-＝562.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.32(s，1H)，9.41(d，J＝7.5Hz，1H)，8.11(d，J＝5.3Hz，1H)，7.47(d，J＝7.3Hz，1H)，7.22(dd，J＝8.3，5.5Hz，2H)，7.03-6.88(m，3H)，5.33(dd，J＝9.3，5.9Hz，1H)，5.16(t，J＝7.8Hz，1H)，4.58(t，J＝7.1Hz，1H)，3.68(dd，2H)，3.15-2.92(m，2H)，2.70(dd，J＝13.3，8.8Hz，1H)，2.46(s，1H)，0.84(d，J＝7.0Hz，3H).
实施例10
合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丁酰胺
合成路线：
步骤A：叔丁基((S)-1-(((S)-1-(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯
室温下，将(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸(75毫克，0.37毫摩尔)，溶于DCM(5毫升)和DMF(5毫升)的混合溶液中，室温下搅拌，加入DIPEA(257微升，1.48毫摩尔)，HATU(140毫克，0.37毫摩尔)，然后室温下搅拌1h，加入(3R，5S)-1-((S)-3-(4-氟苯基)-2-((甲基-d3)氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(140毫克，0.247毫摩尔)，室温搅拌3h。
反应结束，加入水(20ml)，用二氯甲烷(20毫升×4)萃取。合并有机相，减压浓缩，残余物通过反向柱纯化得到121毫克白色固体产物叔丁基((S)-1-(((S)-1-(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(收率81.7％)。LC-MS：[M-H]-＝598。
步骤B：合成(3R，5S)-1-((S)-2-SS)-2--氨基-N-(甲基-d3)丁酰胺基)-3-(4-氟苯基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐
室温下，将叔丁基((S)-1-(((S)-1-(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(121毫克，0.2毫摩尔)溶于二氯甲烷(5毫升)中，加入盐酸二氧六环(4M，0.5毫升)，室温反应2小时。
反应结束，浓缩至干，得到白色固体产物100毫克(3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-N-(甲基-d3)丁酰胺基)-3-(4-氟苯基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M-H-HCl]+＝498。
步骤C：合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丁酰胺
室温下，(3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-N-(甲基-d3)丁酰胺基)-3-(4-氟苯基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(100毫克，0.2毫摩尔)，溶于DCM(5毫升)中，室温下搅拌，加入三乙胺(273毫克，2毫摩尔)，冰浴条件下滴加TFAA(140毫克，1毫摩尔)，在冰浴条件下搅拌30分钟。
反应结束，加入水(20ml)，用二氯甲烷(20毫升×4)萃取。合并有机相，减压浓缩，残余物通过反向柱纯化得到93毫克白色固体产物(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丁酰胺(收率80.6％)。
LC-MS：[M-H]-＝576.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.36(s，1H)，9.32(d，J＝8.1Hz，1H)，8.12(dd，J＝5.3，1.6Hz，1H)，7.46(dd，J＝7.5，1.6Hz，1H)，7.21(dd，J＝8.5，5.7Hz，2H)，7.00(dd，J＝7.4，5.3Hz，1H)，6.94(t，J＝8.9Hz，2H)，5.37(dd，J＝9.6，5.8Hz，1H)，5.20(t，J＝8.0Hz，1H)，4.38(ddd，J＝10.0，8.1，4.2Hz，1H)，3.73-3.55(m，2H)，3.11-2.88(m，2H)，2.71(dd，J＝13.3，8.6Hz，1H)，2.49-2.45(m，1H)，1.06(dddt，J＝47.0，14.3，11.6，7.2Hz，2H)，0.61(t，J＝7.3Hz，3H).
实施例11
合成(S)-1-(3R，5S)-5-(L2-氮杂亚基)-L3-甲基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺旋[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丁基-1-氧代丙烷-2-基)-3-环丙基-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺
合成路线：
步骤A：合成(S)-2-((叔丁氧羰基)(氘代甲基)氨基)-环丁基丙酸
室温下，氢化钠(247克，61.65毫摩尔，60％)悬浮在50毫升四氢呋喃中，氮气置换三次，然后降温到0℃，随后将氮-Boc-L-环丁基丙氨酸(3克，12.33毫摩尔)溶于四氢呋喃(15毫升)的溶液缓慢注射到悬浮有氢化钠的四氢呋喃溶液中，加毕，25℃搅拌1小时，最后将氘代碘甲烷(894克，6165毫摩尔)在0℃下注射至混合液中，该反应升至25℃后再搅拌15小时。
反应结束，加入100毫升水用甲叔醚50毫升萃取，留下的水相用1M的盐酸水溶液调节pH到20，然后用乙酸乙酯(50毫升×6)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(100毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干，不做进一步的处理，得到3克(S)-2-((叔丁氧羰基)(氘代甲基)氨基)-环丁基丙酸。LC-MS：[M-H]+＝275。
步骤B：合成(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丁基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基甲酸酯
室温下，将(S)-2-((叔丁氧羰基)(氘代甲基)氨基)-环丁基丙酸(650毫克，2.50毫摩尔)，N-甲基吗啡啉(842毫克，8.32毫摩尔)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(951毫克，2.50毫摩尔)混合在二氯甲烷(20毫升)中，室温反应半个小时后，将(3R，5S)-2-氧代-1，2-二氢螺吡咯烷-3，3-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(508毫克，1.66毫摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(4毫升)的溶液加入到以上混合液中，室温25摄氏度下再反应1.5小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(30毫升)，用二氯甲烷(10毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(30毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝1∶1)纯化得到500毫克白色产物(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丁基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基甲酸酯(收率63％)。LC-MS：[M+H]+＝475
步骤C：(3R，5S)-1-(S)-3-环丁基-2-(甲基-d3)氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺
室温下，(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丁基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基甲酸酯(70毫克，148微摩尔)溶于盐酸/乙酸乙酯(2M，5毫升)中，室温反应1小时。
反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物70毫克(3R，5S)-1-(S)-3-环丁基-2-(甲基-d3)氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M+H]+＝375。
步骤D：合成叔丁基-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丁基-1-氧代丙基-2-基(甲基-D3)氨基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基氨基甲酸酯
室温下，将氮-Boc-L-环丙基丙氨酸(100毫克，436微摩尔)，N-甲基吗啡啉(118毫克，1.16毫摩尔)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(166毫克，436微摩尔)混合在二氯甲烷(6毫升)中，室温反应半个小时后，将(3R，5S)-1-(S)-3-环丁基-2-(甲基-d3)氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(70毫克，191微摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(2毫升)的溶液加入到以上混合液中，室温25摄氏度下再反应1.5小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(20毫升)，用二氯甲烷(15毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(30毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝1∶1)纯化得到70毫克白色产物叔丁基-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丁基-1-氧代丙基-2-基(甲基-D3)氨基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基氨基甲酸酯(收率41％)。LC-MS：[M+H]+＝586。
步骤E：合成(3R，5S)-1-(S)-2-(S)-2-氨基-3-环丙基-N-甲基-d3丙酰胺基)-3-环丁基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺
室温下，叔丁基-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丁基-1-氧代丙基-2-基(甲基-D3)氨基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基氨基甲酸酯(70毫克，120微摩尔)溶于盐酸/乙酸乙酯(2M，5毫升)中，室温反应1小时。
反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物66毫克(3R，5S)-1-(S)-2-(S)-2-氨基-3-环丙基-N-甲基-d3丙酰胺基)-3-环丁基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M+H]+＝486。
步骤F：合成(S)-1-(3R，5S)-5-(L2-氮杂亚基)-L3-甲基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺旋[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丁基-1-氧代丙烷-2-基)-3-环丙基-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺
室温下，将(3R，5S)-1-(S)-2-(S)-2-氨基-3-环丙基-N-甲基-d3丙酰胺基)-3-环丁基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(66毫克，118微摩尔)混合于二氯甲烷(5毫升)中，零摄氏度下缓慢加入吡啶(93毫克，1.18毫摩尔)和三氟乙酸酐(124毫克，591微摩尔)。该温度下反应搅拌30分钟。
反应结束，加入饱和氯化铵(10毫升)，用二氯甲烷(5毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(10毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝2∶3)纯化得到16.1毫克白色产物(S)-1-(3R，5S)-5-(L2-氮杂亚基)-L3-甲基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺旋[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丁基-1-氧代丙烷-2-基)-3-环丙基-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺(收率33％)。
LC-MS：[M+H]+＝564。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.34(s，1H)，9.74-9.40(m，1H)，8.13(d，J＝5.1Hz，1H)，7.41(d，J＝7.2Hz，1H)，6.99-6.95(m，1H)，5.07(dd，J＝20.6，13.1Hz，2H)，4.62(s，1H)，3.72(dd，J＝49.3，10.6Hz，2H)，2.76-2.64(m，1H)，2.48(s，1H)，2.17-2.06(m，1H)，1.92(s，1H)，1.82-1.68(m，5H)，1.60(s，2H)，1.22(d，J＝152Hz，1H)，1.16-1.03(m，1H)，0.55(s，1H)，0.41-0.29(m，2H)，0.13(s，1H)，-0.05(s，1H).
实施例12
合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)-3-环丙基-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺
合成路线：
步骤A：叔丁基((S)-1-(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-3-环丙基-1-氧代丙基-2-基)氨基甲酸酯
室温下，将(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-环丙基丙酸(113毫克，0.494毫摩尔)，溶于DCM(5毫升)和DMF(5毫升)的混合溶液中，室温下搅拌，加入DIPEA(257微升，1.48毫摩尔)，HATU(188毫克，0.494毫摩尔)，然后室温下搅拌1h，加入(3R，5S)-1-((S)-3-(4-氟苯基)-2-((甲基-d3)氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(123毫克，0.214毫摩尔)，室温搅拌3h。
反应结束，加入水(20ml)，用二氯甲烷(20毫升×4)萃取。合并有机相，减压浓缩，残余物通过反向柱纯化得到80毫克白色固体产物叔丁基((S)-1-(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-3-环丙基-1-氧代丙基-2-基)氨基甲酸酯(收率60.9％)。LC-MS：[M-H]-＝624。
步骤B：合成(3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-3-环丙基-N-(甲基-d3)丙酰胺基)-3-(4-氟苯基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐
室温下，将叔丁基((S)-1-(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-3-环丙基-1-氧代丙基-2-基)氨基甲酸酯(80毫克，0128毫摩尔)溶于二氯甲烷(5毫升)中，加入盐酸二氧六环(4M，0.25毫升)，室温反应2小时。
反应结束，浓缩至干，得到白色固体产物100毫克(3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-3-环丙基-N-(甲基-d3)丙酰胺基)-3-(4-氟苯基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M-H-HCl]+＝524。
步骤c：合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)-3-环丙基-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺
室温下，(3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-3-环丙基-N-(甲基-d3)丙酰胺基)-3-(4-氟苯基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸(100毫克，0.2毫摩尔)，溶于DCM(5毫升)中，室温下搅拌，加入三乙胺(184毫克，1.28毫摩尔)，冰浴条件下滴加TFAA(896毫克，0.64毫摩尔)，在冰浴条件下搅拌30分钟。
反应结束，加入水(20ml)，用二氯甲烷(20毫升×4)萃取。合并有机相，减压浓缩，残余物通过反向柱纯化得到73毫克白色固体产物(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙-2-基)-3-环丙基-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺(收率94.6％)。LC-MS：[M-H]-＝602.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.35(s，1H)，9.38(d，J＝8.3Hz，1H)，8。16-8.09(m，1H)，7.45(s，1H)，7。21(dd，J＝8。4，5。4Hz，2H)，6.96(dt，J＝17。5，7.0Hz，3H)，5.38(dd，J＝9。6，5。7Hz，1H)，5。17(t，J＝7。9Hz，1H)，4.58(td，J＝9。3，3。9Hz，1H)，3.73-3.59(m，2H)，3。10-2.92(m，2H)，2.70(dd，J＝13。3，8。7Hz，1H)，2.46(d，J＝7。1Hz，1H)，1。15(ddd，J＝14。1，10。4，6。8Hz，1H)，0。91(ddd，J＝14。2，6.9，4。2Hz，1H)，0.47(q，J＝6.6，5。5Hz，1H)，0。31(t，J＝7.1Hz，2H)，0.06(d，J＝5.2Hz，1H)，-0.11(dd，J＝8.0，4.0Hz，1H).
实施例13
合成(S)-1-(3R，5S)-5-(L2-氮杂亚基)-L3-甲基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丁基-1-氧代丙烷-2-基)-N-(甲基-D3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺
合成路线：
步骤A：合成叔丁基-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丁基-1-氧代丙烷-2-基(甲基-D3)氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基甲酸酯
室温下，将(叔丁氧羰基)-L-丙氨酸(120毫克，634微摩尔)，N-甲基吗啡啉(128毫克，1.27毫摩尔)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(161毫克，634微摩尔)混合在二氯甲烷(10毫升)中，室温反应半个小时后，将(3R，5S)-1-(S)-3-环丁基-2-(甲基-d3)氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(189毫克，423微摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(3毫升)的溶液加入到以上混合液中，室温25摄氏度下再反应1.5小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(30毫升)，用二氯甲烷(15毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(30毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝1∶1)纯化得到130毫克白色产物叔丁基-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丁基-1-氧代丙烷-2-基(甲基-D3)氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基甲酸酯(收率56％)。LC-MS∶[M+H]+＝546。
步骤B：合成(3R，5S)-1-(S)-2-(S)-2-氨基-N-甲基-d3丙酰胺基)-3-环丁基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺
室温下，将叔丁基-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丁基-1-氧代丙烷-2-基(甲基-D3)氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基甲酸酯(130毫克，238微摩尔)溶于盐酸/乙酸乙酯(2M，5毫升)中，室温反应1小时。
反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物120毫克(3R，5S)-1-(S)-2-(S)-2-氨基-N-甲基-d3丙酰胺基)-3-环丁基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M+H]+＝446。
步骤C：合成(S)-1-(3R，5S)-5-(L2-氮杂亚基)-L3-甲基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丁基-1-氧代丙烷-2-基)-N-(甲基-D3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺
室温下，将(3R，5S)-1-(S)-2-(S)-2-氨基-N-甲基-d3丙酰胺基)-3-环丁基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(120毫克，231微摩尔)混合于二氯甲烷(5毫升)中，零摄氏度下缓慢加入吡啶(183毫克，231毫摩尔)和三氟乙酸酐(243毫克，116毫摩尔)。该温度下反应搅拌30分钟。
反应结束，加入饱和氯化铵(10毫升)，用二氯甲烷(5毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(10毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝2∶3)纯化得到43.5毫克白色产物(S)-1-(3R，5S)-5-(L2-氮杂亚基)-L3-甲基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丁基-1-氧代丙烷-2-基)-N-(甲基-D3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺(收率36％)。
LC-MS：[M+H]+＝524。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.35(s，1H)，9.59(d，J＝6.8Hz，1H)，8.11(d，J＝5.3Hz，1H)，7.43(d，J＝7.3Hz，1H)，6.98(t，J＝6.4Hz，1H)，5.14(t，J＝7.9Hz，1H)，5.04(t，J＝7.6Hz，1H)，4.61-4.56(m，1H)，3.79(d，J＝10.7Hz，1H)，3.66(d，J＝10.8Hz，1H)，2.70(dd，J＝13.3，8.8Hz，1H)，2.52(s，1H)，2.16-2.08(m，1H)，2.00-1.90(m，1H)，1.80-1.73(m，3H)，1.70(d，J＝7.0Hz，2H)，1.60(d，J＝9.0Hz，2H)，0.88(d，J＝7.0Hz，3H).
实施例14
合成(S)-1-(3R，5S)-5-(L2-氮杂亚基)-L3-甲基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-3-甲基-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丁酰胺
合成路线：
步骤A：合成叔丁基-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基(甲基-D3)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯
室温下，将Boc-L-缬氨酸(150毫克，690微摩尔)，N-甲基吗啡啉(140毫克，1.38毫摩尔)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(262毫克，690微摩尔)混合在二氯甲烷(10毫升)中，室温反应半个小时后，将3R，5S)-1-(S)-3-环丙基-2-(甲基-d3)氨基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(200毫克，460微摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(3毫升)的溶液加入到以上混合液中，室温25摄氏度下再反应1.5小时。
反应结束，加入饱和氯化铵(30毫升)，用二氯甲烷(15毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(30毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝1∶1)纯化得到180毫克白色产物叔丁基-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基(甲基-D3)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(收率70％)。LC-MS：[M+H]+＝560。
步骤B：合成(3R，5S)-1-(S)-2-(S)-2-氨基-3-甲基-N-甲基-d3)丁酰胺-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺
室温下，叔丁基-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基(甲基-D3)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(180毫克，323微摩尔)溶于盐酸/乙酸乙酯(2M，5毫升)中，室温反应1小时。
反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物170毫克(3R，5S)-1-(S)-2-(S)-2-氨基-3-甲基-N-甲基-d3)丁酰胺-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M+H]+＝460。
步骤C：合成(S)-1-(3R，5S)-5-(L2-氮杂亚基)-L3-甲基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-3-甲基-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丁酰胺
室温下，将(3R，5S)-1-(S)-2-(S)-2-氨基-3-甲基-N-甲基-d3)丁酰胺-3-环丙基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(170毫克，319微摩尔)混合于二氯甲烷(5毫升)中，零摄氏度下缓慢加入吡啶(253毫克，3.19毫摩尔)和三氟乙酸酐(335毫克，1.60毫摩尔)。该温度下反应搅拌30分钟。
反应结束，加入饱和氯化铵(10毫升)，用二氯甲烷(5毫升×3)萃取。合并有机相，再用饱和盐水(10毫升)洗涤，干燥，过滤减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱(水/乙腈＝2∶3)纯化得到83毫克白色产物(S)-1-(3R，5S)-5-(L2-氮杂亚基)-L3-甲基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-3-甲基-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丁酰胺(收率48％)。LC-MS：[M+H]+＝538。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.37(s，1H)，9.68(s，1H)，8.16-8.11(m，1H)，7.41(d，J＝7.3Hz，1H)，7.00-6.96(m，1H)，5.19(d，J＝8.0Hz，2H)，4.56-4.40(m，1H)，3.86(q，J＝10.2Hz，2H)，2.69(t，J＝10.1Hz，1H)，2.49-2.44(m，1H)，1.98-1.88(m，1H)，1.73-1.51(m，2H)，1.00(dd，J＝43.4，6.7Hz，1H)，0.72(d，J＝6.6Hz，3H)，0.62-0.50(m，3H)，0.36-0.28(m，2H)，0.10-0.04(m，2H).
实施例15
合成(s)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丁酰胺
合成路线：
步骤A：合成叔丁基((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸酯
室温下，将(3R，5S)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(500毫克，1.86毫摩尔)，(S)-2-((叔丁氧基羰基)(甲基-d3)氨基)-4，4-二甲基戊酸(586毫克，2.23毫摩尔)，N，N-二甲基甲酰胺(2毫升)，二氯甲烷(10毫升)，N，N-二异丙基乙胺(962毫克，7.44毫摩尔)，HATU(850毫克，2.23毫摩尔)依次加入反应瓶，搅拌1小时。
反应完毕，加3毫升水，旋干，粗品经反相柱纯化(乙腈/水＝0％～40％)得到360毫克白色固体叔丁基((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-y1)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸酯(收率：40.5％)。
步骤B：合成(3R，5S)-1-((S)-4，4-二甲基-2-((甲基-d3)氨基)戊酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐
室温下，将叔丁基((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸酯(360毫克，0.75毫摩尔)，乙酸乙酯(5毫升)，盐酸二氧六环(5毫升)加入反应瓶中，室温反应40分钟。
反应完毕，浓缩除掉溶剂，得到360毫克黄色固体(3R，5S)-1-((S)-4，4-二甲基-2-((甲基-d3)氨基)戊酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(收率：N/A)。
步骤C：合成叔丁基((S)-1-(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯
室温下，将(3R，5S)-1-((S)-4，4-二甲基-2-((甲基-d3)氨基)戊酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(120毫克，0.29毫摩尔)，(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸(110毫克，0.58毫摩尔)，二异丙基乙基胺(150毫克，1.16毫摩尔)，HATU(210毫克，0.55毫摩尔)和二氯甲烷(10毫升)，DMF(1mL)加入反应瓶，搅拌1小时。
反应完毕，加3毫升水，浓缩，所得残余物用反相柱纯化(乙腈/水＝0％～35％)，得到90毫克白色固体叔丁基((S)-1-(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(收率：55.2％)。
步骤D：合成(3R，5′S)-1′-((S)-2-((S)-2-氨基-N-(甲基-d3)丙酰胺基)-3-环丙基丙酰基)-5-(甲基磺酰胺基)-2-氧代螺[吲哚-3，3′-吡咯烷]-5′-甲酰胺
室温下，将叔丁基((S)-1-(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(85毫克，015毫摩尔)，三氟乙酸(2毫升)，二氯甲烷(6毫升)加入反应瓶，搅拌1小时。反应完毕，浓缩，所得残余物用于下一步反应。
步骤E：(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丁酰胺
室温下，将(3R，5′S)-1′-((S)-2-((S)-2-氨基-N-(甲基-d3)丙酰胺基)-3-环丙基丙酰基)-5-(甲基磺酰胺基)-2-氧代螺[吲哚-3，3′-吡咯烷]-5′-甲酰胺(85毫克，0.15毫摩尔)溶于二氯甲烷(6毫升)和吡啶(0.6毫升)，加入三氟乙酸酐(0.1毫升)，室温反应15分钟。
反应完毕，加2毫升水，浓缩，所得残余物经反向柱纯化(洗脱剂：乙腈/水＝0％～4％)，得到60毫克(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丁酰胺。
LC-MS：[M-1]-＝538.4。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.40(s，1H)，9.70-9.45(m，1H)，8.24-7.98(m，1H)，7.40(d，J＝7.2Hz，1H)，7.06-6.88(m，1H)，5.29-5.15(m，2H)，4.43(s，1H)，3.97-3.64(m，2H)，2.75-2.55(m，2H)，2.10-1.90(m，1H)，1.48-1.37(m，1H)，1.25-1.18(m，2H)，0.86(s，9H)，0.70-0.65(m，3H).HPLC：98.0％
实施例16
合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)-3-环丙基-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺
合成路线：
步骤A：合成叔丁基((S)-1-(((S)-1-(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)(甲基-d3)氨基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯
室温下，将(3R，5S)-1-((S)-4，4-二甲基-2-((甲基-d3)氨基)戊酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(120毫克，0.29毫摩尔)，(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-环丙基丙酸(133毫克，0.58毫摩尔)，二异丙基乙基胺(150毫克，1.16毫摩尔)，HATU(210毫克，0.55毫摩尔)和二氯甲烷(10毫升)，DMF(1mL)加入反应瓶，搅拌1小时。
反应完毕，加3毫升水，浓缩，所得残余物用反相柱纯化(乙腈/水＝0％～35％)，得到95毫克白色固体叔丁基((S)-1-(((S)-1-(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)(甲基-d3)氨基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯(收率：59.7％)。
步骤B：合成(3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-3-环丙基-N-(甲基-d3)丙酰胺基)-4，4-二甲基戊酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺并[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺
室温下，将叔丁基((S)-1-(((S)-1-(3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)(甲基-d3)氨基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯(90毫克，0.15毫摩尔)，三氟乙酸(2毫升)，二氯甲烷(6毫升)加入反应瓶，搅拌1小时。
反应完毕，浓缩，所得残余物用于下一步反应。
步骤c：(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)-3-环丙基-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺
室温下，将(3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-3-环丙基-N-(甲基-d3)丙酰胺基)-4，4-二甲基戊酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺并[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺(90毫克，0.15毫摩尔)溶于二氯甲烷(6毫升)和吡啶(0.6毫升)，加入三氟乙酸酐(0.1毫升)，室温反应15分钟。
反应完毕，加5毫升水，浓缩，所得残余物经反向柱纯化(洗脱剂：乙腈/水＝0％～45％)，得到65毫克(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-4，4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)-3-环丙基-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺。
LC-MS：[M-1]-＝564.4。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.38(s，1H)，9.65(d，J＝8.0Hz，1H)，8.14(dd，J＝5.2，1.6Hz，1H)，7.43-7.36(m，1H)，6.97(dd，J＝7.2，5.2Hz，1H)，5.26(t，J＝6.4Hz，1H)，5.15(t，J＝8.0Hz，1H)，4.64(td，J＝9.2，4.0Hz，1H)，3.84(d，J＝10.6Hz，1H)，3.77(d，J＝10.6Hz，1H)，2.70(dd，J＝13.2，8.4Hz，1H)，2.56-2.50(m，1H)，1.94(dd，J＝14.4，6.4Hz，1H)，1.45(dd，J＝14.4，6.4Hz，1H)，1.30-1.17(m，1H)，1.16-1.06(m，1H)，0.86(s，9H)，0.60-0.45(m，1H)，0.39-0.25(m，2H)，0.19-0.10(m，1H)，-0.00--0.06(m，1H).HPLC：98.2％
实施例17
合成(S)-N-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环戊基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-d3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺
合成路线：
步骤A：合成(S)-2-(叔丁氧羰基)(甲基-d3)氨基)-3-环戊基丙酸
将（S）-2-(叔丁氧羰基)氨基)-3-环戊基丙酸(3.0克，11.66毫摩尔)溶于四氢呋喃(150毫升)，冰浴下，分批加入NaH(1.87克，46.63毫摩尔，60％Wt)，自然升至RT，再搅拌30min，然后滴加CD3I，再搅拌12h。
反应结束，将反应液加入到H2O(300毫升)，先用MTBE(80毫升×3)萃取。取水相，用1M HCl(aq)调pH约为3，再用乙酸乙酯(100毫升×3)萃取。合并有机相，用无水Na2SO4干燥，浓缩至干得到残余。残余物用ACN/H2O过反相柱纯化得到2.68克浅棕色产物(S)-2-(叔丁氧羰基)(甲基-d3)氨基)-3-环戊基丙酸(收率89％)LC-MS：[M-H]-＝273。
步骤B：合成叔丁基(（S）-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环戊基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸酯
0℃下，将(S)-2-(叔丁氧羰基)(甲基-d3)氨基)-3-环戊基丙酸(711毫克，2.71毫摩尔)溶于二氯甲烷(30毫升)中，再依次加入NMM(1.82克，12.67毫摩尔)和HATU(1.47克，2.71毫摩尔)，搅拌10min，然后将(3R，5S)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(600毫克，1.81毫摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(10毫升)的溶液加入到以上混合液中，加完后转至室温下反应2h小时。
反应结束，加入H2O(50毫升)，用二氯甲烷(30毫升×3)萃取。合并有机相，浓缩至干得到残余，残余物反向柱纯化得到475毫克白色产物叔丁基((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环戊基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸酯(收率53％)，LC-MS：[M-H]-＝487。
步骤C：合成(3R，5S)-1-((S)-3-环戊基-2-((甲基-d3)氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺
室温下，叔丁基((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环戊基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基甲酸酯(475毫克，972微摩尔)溶于DCM(20毫升)中，加入盐酸/乙酸乙酯(2M，10毫升)中，室温反应1小时。
反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物450毫克((3R，5S)-1-((S)-3-环戊基-2-((甲基-d3)氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M-H]-＝387。
步骤D：合成叔丁基((S)-1-(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环戊基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸酯
0℃下，将(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸(110毫克，0.579毫摩尔)溶于二氯甲烷(5毫升)中，再依次加入NMM(234毫克，2.31毫摩尔)和HATU(220毫克，0.579毫摩尔)，搅拌10min，然后将(((3R，5S)-1-((S)-3-环戊基-2-((甲基-d3)氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(150毫克，0.386毫摩尔)溶于N，N-二甲基甲酰胺(3毫升)的溶液加入到以上混合液中，加完后保持冰浴下反应1.5h小时。
反应结束，加入H2O(20毫升)淬灭反应，分液，水相用乙酸乙酯(20毫升×3)萃取。合并有机相，用无水硫酸钠干燥后浓缩至干得到残余，残余物用ACN/H2o过反向柱纯化得到145毫克白色产物叔丁基((S)-1-(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环戊基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸酯(收率67％)，LC-MS：[M-H]-＝558。
步骤E：合成((3R，5S)-1-((S)-2-(S)-2--氨基-N-(甲基-d3)丙酰胺基)-3-环戊基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺
室温下，叔丁基((S)-1-(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-yl)-3-环戊基-1-氧代丙-2-基)(甲基-d3)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸酯(145毫克，259微摩尔)溶于DCM(4毫升)中，加入盐酸/二氧六环(4M，1毫升)中中，室温反应1小时。
反应结束，浓缩至干，得到类白色固体产物149毫克((3R，5S)-1-((S)-3-环戊基-2-((甲基-d3)氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐，不做进一步的处理，直接用于下一步反应。LC-MS：[M-H]-＝458。
步骤F：合成(S)-N-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环戊基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-d3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺
-15℃，将((3R，5S)-1-((S)-3-环戊基-2-((甲基-d3)氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(149毫克，0.261毫摩尔)微溶于DCM(20毫升)，加入吡啶(250毫克，3.132毫摩尔)，随后缓慢滴加溶于二氯甲烷(2毫升)的三氟乙酸酐(330毫克，1.566毫摩尔)。加毕，该反应-15摄氏度下搅拌1小时。
反应结束，加入H2O(20毫升)，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并有机相，减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱纯化得到102.5毫克（S）-N-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环戊基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-d3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺。
LC-MS：[M-H]-＝536。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.36(s，1H)，9.60(d，J＝6.9Hz，1H)，8.13(dd，J＝5.3，1.6Hz，1H)，7.44(dd，J＝7.4，1.6Hz，1H)，7.00(dd，J＝7.4，5.3Hz，1H)，5.21-5.11(m，2H)，4.59(p，J＝7.0Hz，1H)，3.82(d，J＝10.7Hz，1H)，3.71(d，J＝10.6Hz，1H)，2.71(dd，J＝13.3，8.8Hz，1H)，2.54(s，1H)，1.85-1.67(m，2H)，1.67-1.47(m，5H)，1.46-1.31(m，2H)，1.16-0.96(m，2H)，0.89(d，J＝7.0Hz，3H).
实施例18
合成(S)-N-(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-D3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丁酰胺
合成路线：
步骤A：合成叔丁基-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯
室温下把(3R，5S)-1-(S)-3-环已基-2-(甲基-d3)氨基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺(150毫克，0.373毫摩尔)，(S)-2-(叔丁氧羰基)氨基)丁酸(98.5毫克，0.485毫摩尔)加入N，N-二甲基甲酰胺中(10毫升)，零度下加入N-甲基吗啡啉(226毫克，2.24毫摩尔)，HATU(198毫克，0.522毫摩尔)接着20度下搅拌6小时。
反应完毕，反应完毕，加水(100毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(50毫升×3)，合并有机相，依次用水(50毫升)、饱和食盐水(50毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈∶水5∶95到60∶40)得到130毫克白色固体叔丁基-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯.(收率：85％)。LC-MS：[M-H]+＝586。
步骤B：合成(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯
室温下把叔丁基-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(130毫克，0.221毫摩尔)加入到盐酸二氧六环(4摩尔，10毫升)中，室温下反应2小时。
反应完毕，直接旋干得到108毫克粗品(游离的质量投下一步)(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯，直接用于下一步，LC-MS：[M-H]+＝486。
步骤C：合成(S)-N-(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-D3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丁酰胺
室温下把(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(108毫克，0.221毫摩尔)加入到二氯甲烷(10毫升)，接着-15度下加入吡啶(175毫克，2.21毫摩尔)，三氟乙酸酐(233毫克，1.11毫摩尔)，接着-15度搅拌3个小时。
反应完毕，加水(20毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(10毫升×3)，合并有机相，依次用水(10毫升)、饱和食盐水(10毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈∶水5∶9到50∶50)得到纯品58毫克白色固体(S)-N-(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-D3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丁酰胺(收率：65％)。
LC-MS：[M-H]+＝550，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.37(s，1H)，9.60(d，J＝7.4Hz，1H)，8.16-8.11(m，1H)，7.43(d，J＝7.3Hz，1H)，7.00(dd，J＝7.4，5.3Hz，1H)，5.27-5.13(m，2H)，4.47-4.37(m，1H)，3.81(d，J＝10.7Hz，1H)，3.66(d，J＝10.7Hz，1H)，2.71(dd，J＝13.3，8.7Hz，1H)，2.52(s，1H)，1.77-0.63(m，18H).
实施例19
(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)-3-环丙基-N-(甲基-D3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺
合成路线：
步骤A：合成叔丁基-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯
室温下把(3R，5S)-1-(S)-3-环已基-2-(甲基-d3)氨基丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺(150毫克，0.373毫摩尔)，(S)-2-(叔丁氧羰基)氨基)-3-环丙基丙酸(111毫克，0.485毫摩尔)加入N，N-二甲基甲酰胺中(10毫升)，零度下加入N-甲基吗啡啉(226毫克，2.24毫摩尔)，HATU(198毫克，0.522毫摩尔)接着20度下搅拌6小时。
反应完毕，反应完毕，加水(100毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(50毫升×3)，合并有机相，依次用水(50毫升)、饱和食盐水(50毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈∶水5∶95到60∶40)得到160毫克白色固体叔丁基-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯.(收率：85％)。LC-MS：[M-H]+＝612。
步骤B：合成(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯
室温下把叔丁基-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(160毫克，0.261毫摩尔)加入到盐酸二氧六环(4摩尔，10毫升)中，室温下反应2小时。
反应完毕，直接旋干得到130毫克粗品(游离的质量投下一步)(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯，直接用于下一步。LC-MS：[M-H]+＝512。
步骤C：合成(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)-3-环丙基-N-(甲基-D3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺
室温下把(S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)(甲基-D3)氨基)-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(130毫克，0.253毫摩尔)加入到二氯甲烷(10毫升)，接着-15度下加入吡啶(200毫克，2.53毫摩尔)，三氟乙酸酐(266毫克，1.27毫摩尔)，接着-15度搅拌3个小时。
反应完毕，加水(20毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(10毫升×3)，合并有机相，依次用水(10毫升)、饱和食盐水(10毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈∶水5∶9到50∶50)得到纯品75毫克白色固体(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环已基-1-氧代丙烷-2-基)-3-环丙基-N-(甲基-D3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺((收率：65％)。
LC-MS：[M-H]+＝591，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.36(s，1H)，9.69(d，J＝7.5Hz，1H)，8.14(d，J＝5.1Hz，1H)，7.41(d，J＝7.3Hz，1H)，7.00-6.96(m，1H)，5.24(s，1H)，5.15(d，J＝8.0Hz，1H)，4.62(s，1H)，3.80(s，1H)，3.70(d，J＝10.7Hz，1H)，2.70(t，J＝11.0Hz，1H)，251(t，1H)，1.59(dt，J＝58.9，21.7Hz，7H)，1.28(s，1H)，1.14-0.92(m，6H)，0.76(d，J＝10.9Hz，1H)，0.58(s，1H)，0.46-0.30(m，2H)，0.15(s，1H)，-0.01(d，J＝13.1Hz，1H).
实施例20
合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代-2-yl)-2-3环戊基-N-(三氘甲基)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)乙酰胺
合成路线：
步骤1：合成叔-丁基((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-y1)-4，4-二甲基-1-氧代-2-yl)三氘甲基)氨基甲酸酯
0℃，二氯甲烷(1.50mL)中加入(S)-2-((叔-丁氧羰基)(三氘甲基)氨基)-4，4-二甲戊酸(500mg，1.91mmol，1eq)、DIEA(739mg，5.72mmol，996μL，3eq)、HATU(797mg，210mmol，11eq)，搅拌10min后，将(3R，5S)-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(512mg，1.91mmol，1eq，盐酸盐)溶于DMF(1.50mL)加入上述反应液，25℃，反应2小时，LCMS：显示53.4％原料剩余，反应缓慢升温至40～60℃。
LCMS：显示36.0％的产物生成，RT＝0.695min；46.0％的原料剩余，RT＝0.424min。反应液冷却至室温，加水稀释(2.00mL)，二氯甲烷：甲醇＝60∶1萃取分液(10.0mL)，饱和食盐水(5.00mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。粗品爬大板，二氯甲烷：甲醇＝10∶1，Rf＝0.55。叔-丁基((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代-2-yl)三氘甲基)氨基甲酸酯为白色固体(220mg，461.62μmol，24.2％yield)。LCMS：RT＝0.686min，MS(ESI)m/z＝475.3[M-H]-
步骤2：合成(3R，5S)-1-((S)-4，4-二甲基-2-((三氘甲基)氨基)戊醇)-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′吡咯[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐
25℃，二氯甲烷(11.0mL)溶液中加入叔-丁基((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代-2-yl)三氘甲基)氨基甲酸酯(220mg，462μmol，1eq)、HCl/dioxane(15.0mL)，25℃，反应2hrs。
LCMS：显示原料消耗完全，100％产物生成，反应液浓缩除去溶剂，无需纯化，直接投下一步。(3R，5S)-1-((S)-4，4-二甲基-2-((三氘甲基)氨基)戊醇)-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′吡咯[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(330mg，crude，HCl)为白色固体。LCMS：RT＝0.524min，MS(ESI)m/z＝375.1[M-H]-
步骤3：合成叔-丁基((S)-2-(((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代-2-y1)(三氘甲基)氨基)-1-环戊基-2-乙氧基)氨基甲酸酯
0℃，二氯甲烷(1.00mL)中加入(2S)-2-(叔-丁氧基羰基氨基)-2-环戊基-乙酸(90.0mg，370μmol，1eq)、DIEA(143mg，1.11mmol，193μL，3eq)、HATU(154.72mg，406.91μmol，1.1eq)，搅拌30min。0℃，将(3R，5S)-1-((S)-4，4-二甲基-2-((三氘甲基)氨基)戊醇)-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′吡咯[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(153mg，370μmol，1eq，HCl)溶于DMF(1.00mL)中缓慢加入上述反应中，20℃，反应2hrs。
LCMS：显示218％产物生成；反应液加水稀释(5.00mL)，二氯甲烷∶甲醇＝60∶1(15.0mL)萃取分液，饱和食盐水洗涤(5.00mL)，无水硫酸钠干燥，浓缩。粗品爬大板纯化，二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，Rf＝0.57。叔-丁基((S)-2-(((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代-2-yl)(三氘甲基)氨基)-1-环戊基-2-乙氧基)氨基甲酸酯(0.1g，166.18μmol，44.92％yield)为白色固体。LCMS：RT＝0.750min，MS(ESI)m/z＝600.1[M-H]-
步骤4：合成(S)-2-氨基-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代-2-yl)-2-环戊基-N-(三氘甲基)乙酰胺盐酸盐
0℃，二氯甲烷(0.5mL)中加入叔-丁基((S)-2-(((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-y1)-4，4-二甲基-1-氧代-2-y1)(三氘甲基)氨基)-1-环戊基-2-乙氧基)氨基甲酸酯(100mg，166μmol，1eq)HCl/dioxane(1mL)，20℃，反应2hrs。
LCMS：显示原料消耗完全，64.4％产物生成，RT＝0.535min，[M-H]-＝500.3。反应液浓缩除去溶剂，无需处理。粗品直接投下一步。(S)-2-氨基-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代-2-y1)-2-环戊基-N-(三氘甲基)乙酰胺盐酸盐(120mg，crude，HCl)为白色固体。LCMS：RT＝0.535min，MS(ESI)m/z＝500.3[M-H]-
步骤5：合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代-2-yl)-2-环戊基-N-(三氘甲基)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)乙酰胺
-15℃，二氯甲烷(1.00mL)中加入(S)-2-氨基-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代-2-yl)-2-环戊基-N-(三氘甲基)乙酰胺盐酸盐(120mg，223μmol，1eq，HCl)，缓慢加入吡啶(176mg，2.23mmol，180.00μL，10eq)、三氟乙酸酐(234mg，1.12mmol，155μL，5eq)。-15℃，反应2hrs。
LCMS：显示原料消耗完全，产品RT＝0.822min，[M-H]-＝578.3。反应液加水稀释(2.00mL)，二氯甲烷(100mL)萃取分液，饱和食盐水洗涤(5.00mL)，无水硫酸钠干燥，浓缩。粗品合并纯化：prep-HPLC(TFA，ACN/H2O)，浓缩得到产品。(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-yl)-4，4-二甲基-1-氧代-2-yl)-2-环戊基-N-(三氘甲基)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)乙酰胺(24.86mg，42.9μmol，19.2％yield)为灰白色固体。
LCMS：RT＝0.697min，MS(ESI)m/z＝580.3[M+H]+，1H NMR(ACETONITRILE-d3，400MHz)：δ9.15(br S，1.0H)，8.12(dd，J＝5.3，1.5Hz，1.1H)，7.67(br d，J＝8.1Hz，1.0H)，7.26(dd，J＝7.4，1.5Hz，1.1H)，6.95(dd，J＝7.4，5.3Hz，1.1H)，5.31(dd，J＝6.9，5.6Hz，1.1H)，4.96(t，J＝8.2Hz，11H)，4.65(t，J＝8.1Hz，1.0H)，3.98(d，J＝10.6Hz，1.0H)，3.77(d，J＝10.6Hz，1.0H)，2.62(d，J＝8.3Hz，2.0H)，2.00-2.13(m，2.3H)，1.16-1.50(m，9.3H)，0.88ppm(s，9.5H).
实施例21
合成(S)-N-(((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2’-氧代-1’，2’-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基)-3-甲基-N-三氘甲基-2-(2，2-三氟乙酰胺)丁酰胺
合成路线：
步骤1：合成(S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙酸
20℃下，将(S)-2-氨基-3-(4-氟苯基)丙酸(5.00g，27.3mmol，1.00eq)，碳酸氢钠(6.88g，81.9mmol，3.00eq)溶解在四氢呋喃(25mL)和水(25mL)中，降温至0℃，加入BOC酸酐，升温至20℃，反应2小时。
LCMS显示原料消失，检测到产物MS(RT＝0.635min)。
向反应液中加50mL水稀释，用1M柠檬酸水溶液调至反应液PH为5左右，用乙酸乙酯萃取(20ml*3)，干燥，过滤，浓缩。得到产物(S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙酸(7.00g，90.5％yield)。
步骤2：合成(S)-2-((叔丁氧羰基)三氘甲基氨基)-3-(4-氟苯基)丙酸
将氢化钠(847mg，21.2mmol，3.00eq)溶于四氢呋喃(20mL)中，氮气置换，降温至0℃，将(S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙酸(2.00g，7.06mmol，1.00eq)溶于四氢呋喃(10mL)中，加入上述溶液中，反应30分钟，滴加CD3I，反应1小时，升温至20℃，反应12小时。
LCMS检测到产物MS(RT＝0.516min)。向反应液中加30mL水，加入20mL甲基叔丁基醚萃取，水相用1M盐酸调至PH为2-3，用乙酸乙酯萃取(10ml*3)，合并有机相，饱和食盐水洗涤，干燥，过滤，浓缩。粗品经反相柱(盐酸，甲醇体系)纯化，得到产物(S)-2-((叔丁氧羰基)三氘甲基氨基)-3-(4-氟苯基)丙酸(700mg，33.0yield)，LCMS：RT＝0.517min，MS(ESI)m/z＝323.1[M+23]+。
步骤3：合成叔丁基((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氧苯基)-1-氧代丙烷-2-基)三氘甲基氨基甲酸酯
0℃下，(S)-2-((叔丁氧羰基)三氘甲基氨基)-3-(4-氟苯基)丙酸(700mg，2.33mmol，1.00eq)，HATU(975mg，2.56mmol，1.10eq)和N，N-二异丙基乙胺(904mg，6.99mmol，3.00eq)溶于二氯甲烷(10mL)中，搅拌30分钟，将(3R，5S)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺(626mg，2.33mmol，1.00eq，HCl)溶于N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中，再加入上述反应液中，维持在0℃下搅拌2小时。
LCMS显示原料消失，检测到产物MS(RT＝0.465min)。向反应液中加50mL水，用乙酸乙酯(30ml*3)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，干燥浓缩。粗品经柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10∶1to 0∶1)，得到叔丁基((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基)三氘甲基氨基甲酸酯(600mg，50.0％yield)，LCMS：RT＝0.464min，MS(ESI)m/z＝515.4[M+1]+。
步骤4：合成(3R，5S)-1-((S)-3-(4-氟苯基)-2-(三氘甲基氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺
25℃下，将叔丁基((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基)三氘甲基氨基甲酸酯(600mg，1.17mmol，1.00eq)溶于二氯甲烷(10mL)中，滴加HCl/dioxane(5mL)，反应1小时。
TLC(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)显示原料(Rf＝0.49)消失，有新点生成(Rf＝0.00)。将反应液浓缩干，得到(3R，5S)-1-((S)-3-(4-氟苯基)-2-(三氘甲基氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺(500mg)，LCMS：RT＝0.345min，MS(ESI)m/z＝415.3[M+1]+。
步骤5：合成叔丁基(((S)-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基)三氘甲基氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯
0℃下，将(叔丁氧羰基)-L-缬氨酸(212mg，976μmol，2.00eq)，HATU(408mg，1.07mmol，2.20eq)，N，N-二异丙基乙胺(505mg，3.90mmol，8.00eq)溶于二氯甲烷(20mL)中，搅拌30分钟，将(3R，5S)-1-((S)-3-(4-氟苯基)-2-(三氘甲基氨基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺(220mg，488μmol，1.00eq，HCl))溶于N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中，加入上述反应液中，维持在0℃下搅拌2小时。
LCMS显示原料消失，检测到产物MS(RT＝0.477min)。向反应液中加30mL水，用二氯甲烷(10mL*3)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩。粗品薄层色谱分离纯化(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)，得到叔丁基(((S)-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基)三氘甲基氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(110mg，36.7％yield)，LCMS：RT＝0.481min，MS(ESI)m/z＝614.3[M+1]+。
步骤6：合成(3R，5S)-1-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基-N-三氘甲基丁酰胺基)-3-(4-氟苯基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺环[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺
25℃下，将叔丁基(((S)-1-((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基)三氘甲基氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(120mg，196μmol，1.00eq)溶于二氯甲烷(10mL)中，滴加HCl/dioxane(5mL)，反应1小时。
LCMS显示原料消失，检测到产物MS(RT＝0.331min)。将反应液浓缩干，得到产物(3R，5S)-1-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基-N-三氘甲基丁酰胺基)-3-(4-氟苯基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺环[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺(100mg)，LCMS：RT＝0.336min，MS(ESI)m/z＝514.3[M+1]+。
步骤7：合成(S)-N-(((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2’-氧代-1’，2’-二氢螺[吡咯烷-3，3’-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基)-3-甲基-N-三氘甲基-2-(2，2-三氟乙酰胺)丁酰胺
0℃下，将(3R，5S)-1-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基-N-三氘甲基丁酰胺基)-3-(4-氟苯基)丙酰基)-2′-氧代-1′，2′-二氢螺环[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺(100mg，195μmol，1.00eq)溶于二氯甲烷(10mL)中，滴加吡啶(154mg，1.95mmol，10.0eq)和三氟乙酸酐(204mg，974μmol，5.00eq)，反应1小时。
LCMS显示原料消失，检测到产物MS(RT＝0.506min)。向反应液中加20mL水，用二氯甲烷(10mL*3)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，干燥，过滤。粗品经反相制备纯化(TFAcondition；column：Phenomenex luna C18 150*25mm*10um；mobile phase：[water(TFA)-ACN]；gradient：36％-66％B over min)，用碳酸氢钠水溶液调至PH为弱碱性，用二氯甲烷(20mL*3)萃取，饱和食盐水洗涤，干燥过滤，浓缩，得到产物(S)-N-(((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2’-氧代-1’，2’-二氢螺[吡咯烷-3，3’-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基)-3-甲基-N-三氘甲基-2-(2，2-三氟乙酰胺)丁酰胺(45.52mg，38.6％yield)，LCMS：RT＝0.505min，MS(ESI)m/z＝592.2[M+1]+。
δ8.11(dd，J＝1.4，5.4Hz，1H)，7.37(dd，J＝1.4，7.4Hz，1H)，7.25(dd，J＝5.4，8.5Hz，2H)，7.03-6.91(m，3H)，5.39(t，J＝7.9Hz，1H)，5.12(t，J＝8.4Hz，1H)，4.53(d，J＝8.0Hz，1H)，3.90(d，J＝10.5Hz，1H)，3.51(d，J＝10.6Hz，1H)，3.22(dd，J＝7.8，13.7Hz，1H)，3.11-3.02(m，1H)，2.61(dd，J＝3.2，8.4Hz，2H)，1.89-1.77(m，1H)，0.72(dd，J＝6.7，12.7Hz，6H).
实施例22
合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-((λ2-azaneylidene)-λ3-甲基)-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-yl)-3-(4-氟苯基)-1-氧代-2-yl)-2-环戊基-N-(三氘甲基)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)乙酰胺
合成路线
步骤1：合成叔-丁基((S)-2-(((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-yl)-3-(4-氟苯基)-1-氧代-2-yl)(三氘甲基)氨基)-1-环戊基-2-乙氧基)氨基甲酸酯
0℃，二氯甲烷(1.00mL)中加入(2S)-2-(叔-丁氧基羰基氨基)-2-环戊基-乙酸(130mg，534.32μmol，1eq)、DIEA(138mg，1.07mmol，186.14μL，2eq)、HATU(223mg，588μmol，1.1eq)，搅拌30分钟。0℃，(3R，5S)-1-((S)-3-(4-氟苯基)-2-((三氘甲基)氨基)丙酰基)-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(168.65mg，374.03μmol，0.70eq，盐酸盐)溶于DMF(1.00mL)中缓慢加入上述反应中。0～20℃，反应2小时。
TLC(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，Rf＝0.45)显示(3R，5S)-1-((S)-3-(4-氟苯基)-2-((三氘甲基)氨基)丙酰基)-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-5-甲酰胺盐酸盐(168mg，374μmol，0.70eq，盐酸盐)消耗完全，有一个小极性主点生成。反应液加水稀释(5.00mL)，二氯甲烷∶甲醇＝60∶1萃取分液(15.0mL*2)，饱和食盐水洗涤(5.00mL)，无水硫酸钠干燥，浓缩。粗品爬大板纯化，二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，Rf＝0.45。得到叔-丁基((S)-2-(((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-yl)-3-(4-氟苯基)-1-氧代-2-yl)(三氘甲基)氨基)-1-环戊基-2-乙氧基)氨基甲酸酯(100mg，156μmol，29.2％yield)。
LCMS：RT＝0.770min，MS(ESI)m/z＝638.2[M-H]-
步骤2：合成(3R，5S)-1-((S)-2-((S)-2-氨基2-环戊基-N-(三氘甲基)乙酰氨基)-3-(4-氟苯基)丙酰基)-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-5-酰胺盐酸盐
0℃，二氯甲烷(1.00mL)中加入叔-丁基((S)-2-(((S)-1-((3R，5S)-5-氨基甲酰-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-yl)-3-(4-氟苯基)-1-氧代-2-yl)(三氘甲基)氨基)-1-环戊基-2-乙氧基)氨基甲酸酯(100mg，156.3μmol，1eq)、盐酸/二氧六环(05mL)。20℃，反应1小时。
LCMS：显示73.6％产物生成，反应液直接浓缩得粗品直接用于下一步。
步骤3：合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-((λ2-azaneylidene)-λ3-甲基)-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-y1)-3-(4-氟苯基)-1-氧代-2-y1)-2-环戊基-N-(三氘甲基)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)乙酰胺
-15℃，二氯甲烷(1.00mL)溶液中加入(3R，5S)-1-((S)-2-((S)-2-氨基2-环戊基-N-(三氘甲基)乙酰氨基)-3-(4-氟苯基)丙酰基)-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-5-酰胺盐酸盐(100mg，173，μmol，1eq，盐酸盐)，缓慢加入吡啶(137mg，1.74mmol，140.11μL，10eq)、三氟乙酸酐(182mg，867μmol，120.65μL，5eq)。-15℃，反应30分钟。
LCMS：显示原料消耗完全，69.0％的产物生成。反应液加水稀释，二氯甲烷(20.0mL)萃取分液，饱和食盐水(10.0mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。纯化：经反相制备(三氟乙酸，乙腈/水)，浓缩除去乙腈，加入饱和碳酸氢钠调节pH＝7，加入二氯甲烷(30.0mL)萃取分液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得到产品。(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-((λ2-azaneylidene)-λ3-甲基)-2′-氧-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯[2，3-b]吡啶]-1-yl)-3-(4-氟苯基)-1-氧代-2-yl)-2-环戊基-N-(三氘甲基)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)乙酰胺(19.07mg，30.78μmol，17.73％yield)为灰白色固体。
LCMS：RT＝0.682，MS(ESI)m/z＝618[M+H]+，1H NMR(ACETONITRILE-d3，400MHz)：δ8.98(br s，1.0H)，812(dd，J＝5.3，..5Hz，1.0H)，7.30(dd，J＝7.4，1.5Hz，1.0H)，7.26(brd，J＝8.4Hz，0.9H)，7.16-7.23(m，2.0H)，6.89-7.00(m，3.1H)，5.40-5.44(m，0.9H)，4.96(t，J＝8.1Hz，1.0H)，4.52-4.62(m，1.0H)，3.59-3.73(m，2.0H)，2.95-3.18(m，1.9H)，2.50-2.69(m，2.0H)，1.25-1.50ppm(m，8.3H).
实施例23
3CLpro蛋白酶相关活性测试
采用体外酶学试验，检测化合物对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)3CLpro蛋白酶的抑制活性。
1化合物用DMSO进行1∶3系列稀释10个浓度点，每个浓度双复孔，加入384反应板中。DMSO对照孔含有0.5％终浓度的DMSO、酶和底物但不含化合物，作为无抑制作用对照，Low control对照只含05％DMSO和Buffer，读值设为100％抑制率。
2将3CLpropro蛋白酶加入含化合物的384反应板中，1000rpm，离心1分钟，25℃孵育10分钟；
3然后加入反应底物，1000rpm，离心1分钟，25℃孵育60分钟；
4用多功能酶标仪读板检测荧光读数。
5计算抑制率，采用GraphPad Prism软件分析计算化合物对3CLpro蛋白酶的半数抑制浓度(IC50)值。
试验结果：IC50如下表1所示：
表1.3CLpro蛋白酶IC50数据
实施例 IC50(nm) 实施例 IC50(nm)
1 2.36 13 2.87
2 3.41 14 4.82
3 3.12 15 5.53
5 6.46 16 1.68
6 6.55 17 1.14
7 3.45 18 4.21
8 2.00 19 0.92
9 4.55 20 3.76
10 3.67 21 6.76
11 2.13 22 3.57
12 1.23 对照化合物 7.72
实施例24CYP酶诱导实试验
采用冷冻人肝细胞作为测试体系，体外评价对CYP3A4的mRNA水平的诱导作用。
1试验设计
1.1受试物工作液的制备
将受试物、阳性和阴性对照药制备成1000×的DMSO储备液，使用前用37℃孵育培养基稀释到所需工作浓度。体系中的DMSO终浓度为01％。用孵育培养基配制25μM氯丙嗪溶液作为细胞毒性对照。空白对照是用1μL DMSO加入1mL孵育培养基中配制而成。
1.2肝细胞种板和培养
1)取一管超低温保存的肝细胞，确保肝细胞在复苏之前仍处于低温冰冻状态。将肝细胞迅速置于37℃水浴中并轻摇直至所有冰晶全部分散，喷洒75％乙醇后转移至生物安全柜中。
2)将肝细胞小管的内容物(1mL，约5×106个细胞)倾入盛有50mL复苏培养基的50mL离心管中，将其于100g离心10分钟。离心后，吸出复苏培养基并加入足量孵育培养基得到细胞密度约1.0×106个细胞/mL的细胞混悬液。
3)用细胞计数仪对肝细胞进行计数及确定活细胞密度，肝细胞成活率必须大于80％，用接种培养基将细胞密度调整为0.55×106细胞/mL，接种于collagen I包被的96孔板中，每孔100μL。将培养板置于5％的CO2培养箱中，95％相对湿度，37℃培养4-6小时。
4)在每次更换培养基之前，检查细胞形态和单层细胞完整性。
5)用孵育培养基按1∶15(Matrigel：孵育培养基)的比例稀释Matrigel(蛋白浓度：8-12mg/mL)以得到最终蛋白浓度为0.5-0.75mg/mL的Matrigel孵育培养基。且在使用前需放置在冰上。
6)孵育后，在显微镜下观察细胞状态。轻轻晃动培养板，吸去旧培养基，每孔加入125μL Matrigel孵育培养基。放入培养箱再培养18小时。此时的细胞可以供试验所用。
7)所用培养基于使用前置于37℃水浴中至少预热15分钟。
8)从培养箱中取出细胞培养板，吸出培养板中的培养基，各孔对应加入125μL0.1％DMSO、阳性对照和受试物溶液。每种条件测试两个平行。
9)加药后每过24小时换液。
1.3肝细胞活力检测
1.3.1诱导试验肝细胞活力检测
1)受试物作用72小时以后，从培养箱中取出细胞培养板，在显微镜下观察细胞形态待用。
2)将CellTiter-FluorTM细胞活力试验的试剂置于37℃水浴融化，把GF-AFC(10μL)底物加入Assay Buffer(10mL)中，形成2×反应液。然后用10mL PBS稀释一倍，成为1×反应液。从培养箱中取出细胞培养板。吸出各孔的培养基，用PBS洗两次。各孔中加入100μL的1＝CellTiter反应液，不含细胞的孔作为背景对照。将细胞培养板置于37℃孵育30分钟。
3)取出培养板，冷却至室温后，转移80μL 1×CellTiter反应液到一个新的黑色平底96孔板中。用200酶标仪测定各孔的荧光值。400nm激发光，505nm发射光。
1.4mRNA水平检测
1)移除剩余的培养基，用PBS洗细胞2次，把细胞板放在冰上。使用Cells-to-Ct试剂盒提取和检测mRNA。每孔加入50μL Cells-to-CT试剂盒中的裂解液，用移液器上下吹打5次混匀，在室温下裂解反应8分钟，每孔加入5μL终止液，用移液器上下吹打5次混匀，在室温下反应2分钟。
2)按下表准备反转录混合液，将反转录混合液加入96孔PCR板中，每孔35μL。
表2
3)向含35μL反转录混合液的96孔PCR板中每孔加15μL上一步的裂解样品，使每孔混合液总体积为50μL。轻轻混匀，点甩离心去除气泡。
4)在QPCR仪中，使用下表程序进行反转录。
表3
5)按下表分别准备Real-Time PCR反应液。
表4
6)将反应液加到96孔PCR板中，每孔16μL。向每孔加入4μL反转录的cDNA样品，使反应液总体积为20μL。轻轻混匀，点甩离心去除气泡。在QPCR仪上进行Real-Time PCR反应。Real-Time PCR反应程序见下表。
表5
1.5数据分析
所有的数据计算均通过Microsoft Exce1进行。
1.5.1细胞活力
CellTiter-FluorTM细胞活力检测试剂盒用于检测细胞内蛋白酶活性。细胞活力检测试剂盒用于定量细胞内ATP含量。采用下列公式计算细胞活力百分比：
细胞活力百分比(％)＝(I样品-I背景值)/(I溶媒-I背景值)×100
公式中：I样品是受试孔中的荧光强度值；
I溶媒是0.1％DMSO处理细胞的平均荧光强度值；
I背景值是不含细胞只含培养基的平均荧光强度值。
化合物的细胞活力表示为每个浓度的平均细胞活力百分比，当细胞活力大于80％则认为无细胞毒性。
1.5.2mRNA的诱导倍数
各孔mRNA的含量由2Ct(ACTB)-Ct(诱导)表示。Ct值是荧光信号与某一阈值交叉的循环数。产生Ct值的阈值由仪器自动生成。DMSO对照组的平均Ct值用于确定无诱导mRNA水平。
mRNA诱导倍数由下列方程确定：
诱导百分比用下面的公式计算：
2诱导风险判断标准
对于酶活性和mRNA水平上，阳性诱导剂诱导倍数≥6，认为细胞是可诱导的。
在酶活性和mRNA水平上，受试物的诱导倍数≥2，认为其具有诱导风险。此时CV值应≤20％。
如果观察到酶活性或mRNA表达水平上浓度依赖性有50％降低现象，且不是由细胞毒性引起的，表明化合物可能有酶下调作用，建议进行进一步研究。
3试验结果
对CYP3A4的mRNA水平的诱导作用试验结果见下表：
表6化合物对体外肝细胞CYP酶的诱导数据
实施例23和24对照化合物结构式如下：
实施例25
合成(3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-基)碳酸甲酯异丙酯(化合物A1)
室温下，将(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′-，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺(130毫克，0.255微摩尔)混合于丙酮(8毫升)中，加入K2Co3(70.4毫克，0.510毫摩尔)和氯甲基碳酸异丙酯(58.36毫克，0.3825毫摩尔)，升温至60℃下反应搅拌8小时。
反应结束，过滤，用30毫升的二氯甲烷洗涤，减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱纯化得到56毫克(3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-基)碳酸甲酯异丙酯。
LC-MS：[M+H]+＝626。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.60(d，J＝6.9Hz，1H)，8.28(dd，J＝5.2，1.5Hz，1H)，7.67(dd，J＝7.4，1.6Hz，1H)，7.19(dd，J＝7.4，5.3Hz，1H)，5.73(d，J＝2.9Hz，2H)，5.16(ddd，J＝9.3，6.2，3.0Hz，2H)，4.87-4.78(m，1H)，4.67(t，J＝7.0Hz，1H)，3.92(d，J＝10.8Hz，1H)，3.82(d，J＝10.8Hz，1H)，2.81(dd，J＝13.4，9.1Hz，1H)，2.60(dd，J＝13.5，5.7Hz，1H)，1.62(q，J＝7.5Hz，2H)，1.24(d，J＝6.2Hz，6H)，1.04(d，J＝7.0Hz，3H)，0.63-0.53(m，1H)，0.37(td，J＝8.9，8.1，4.5Hz，1H)，0.30(dq，J＝9.4，5.7，5.0Hz，1H)，0.12-0.01(m，2H).
实施例26
合成(3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡(化合物A2)
0℃下，将(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′-，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺(100毫克，0.196毫摩尔)和三乙胺(79毫克，0.784毫摩尔)溶于二氯甲烷(5毫升)中，再滴加溶有氯甲酸正已酯(64毫克，0.392毫摩尔)的二氯甲烷溶液，保持冰浴反应2小时。
反应结束，加入H2O(20毫升)淬灭反应，分液，水相用乙酸乙酯(20毫升×3)萃取。合并有机相，用无水硫酸钠干燥后浓缩至干得到残余，残余物用C18反相柱柱层析纯化(流动相：ACN/H2O，60％ACN)，得到46.9毫克(3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-（S）-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-羧酸已酯。
LC-MS：[M+H]+＝638。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.60(s，1H)，8.27(s，1H)，7.67(s，1H)，7.30-7.03(m，1H)，5.75(s，2H)，5.33-5.01(m，2H)，4.82-4.52(m，1H)，4.24-4.05(m，2H)，3.99-3.73(m，2H)，2.80(t，J＝11.0Hz，1H)，1.79-1.46(m，4H)，1.41-1.18(m，6H)，1.05(d，J＝6.8Hz，3H)，0.86(s，3H)，0.58(s，1H)，0.34(d，J＝32.9Hz，2H)，0.07(s，2H).
实施例27
合成(3R，5S)-5-氰基-1-(（S）-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-羧酸环戊酯(化合物A3)
0℃下，将(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′-，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺(100毫克，0.196毫摩尔)和三乙胺(79毫克，0.784毫摩尔)溶于二氯甲烷(5毫升)中，再滴加溶有氯甲酸环戊酯(58毫克，0.392毫摩尔)的二氯甲烷溶液，保持冰浴反应2小时。
反应结束，加入H2O(20毫升)淬灭反应，分液，水相用乙酸乙酯(20毫升×3)萃取。合并有机相，用无水硫酸钠干燥后浓缩至干得到残余，残余物用C18反相柱柱层析纯化(流动相：ACN/H2O，60％ACN)，得到91.3毫克(3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-羧酸已酯。
LC-MS：[M+H]+＝623。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.60(d，J＝6.9Hz，1H)，8.32(dd，J＝5.1，1.6Hz，1H)，7.68(dd，J＝7.6，1.7Hz，1H)，7.23(dd，J＝7.5，5.1Hz，1H)，5.34(dq，J＝5.8，3.1，2.6Hz，1H)，5.14(dd，J＝8.8，5.9Hz，2H)，4.68(p，J＝6.9Hz，1H)，3.90(dd，J＝77.5，10.9Hz，2H)，2.89-2.61(m，2H)，2.02-1.88(m，2H)，1.88-1.71(m，4H)，1.62(dn，J＝21.2，14.0，7.5Hz，4H)，1.06(d，J＝7.0Hz，3H)，0.58(dd，J＝9.9，4.9Hz，1H)，0.47-0.25(m，2H)，0.08(qd，J＝8.1，7.1，4.5Hz，2H).
实施例28
合成(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-1′-(叔丁酰基羟甲基)-2′-氧代-1′-，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺(化合物A4)
室温下，将(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′-，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺(70毫克，0.137微摩尔)混合于丙酮(8毫升)中，加入K2CO3(37.9毫克，0.275毫摩尔)和特戊酸氯甲酯(30.9毫克，0.205毫摩尔)，升温至60℃下反应搅拌8小时。
反应结束，过滤，用30毫升的二氯甲烷洗涤，减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱纯化得到45毫克(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-1′-(叔丁酰基羟甲基)-2′-氧代-1′-，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺。
LC-MS：[M+H]+＝624。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.60(d，J＝6.8Hz，1H)，8.31-8.25(m，1H)，7.67-7.63(m，1H)，7.18(dd，J＝7.4，5.3Hz，1H)，5.73(s，2H)，5.16(t，J＝7.3Hz，2H)，4.66(t，J＝7.0Hz，1H)，3.92(d，J＝10.8Hz，1H)，3.81(d，J＝10.8Hz，1H)，2.83-2.76(m，1H)，2.60-2.55(m，1H)，1.67-1.58(m，2H)，1.12(s，9H)，1.03(d，J＝7.0Hz，3H)，0.86(s，1H)，0.58(s，1H)，0.38-0.27(m，2H)，0.06(s，2H).
实施例29
(3R，5S)-5-氰基-1-(S)-3-环丙基-2-(S)-N-甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-甲基甲基碳酸甲酯(化合物A5)
室温下把(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-d3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺(150毫克，0.295毫摩尔)加入丙酮(10毫升)，室温下下加入氯甲基碳酸甲酯(147毫克，1.18毫摩尔)，碳酸钾(162毫克，1.18毫摩尔)，碘化钠(1.77毫克，1.18毫摩尔)，接着60度下搅拌12小时。
反应完毕，反应液过滤，滤饼用丙酮洗两次(1毫升×2)，滤液浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈∶水5∶95到70∶30)得到95毫克(3R，5S)-5-氰基-1-(S)-3-环丙基-2-(S)-N-甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-甲基甲基碳酸甲酯。
LC-MS：[M-H]+＝596。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.61(d，J＝6.9Hz，1H)，8.31-8.25(m，1H)，7.66(dd，J＝7.4，15Hz，1H)，7.19(dd，J＝7.4，5.2Hz，1H)，5.76(d，J＝2.0Hz，2H)，5.16(td，J＝6.7，5.8，2.0Hz，2H)，4.67(p，J＝7.0Hz，1H)，3.93(d，J＝10.7Hz，1H)，3.81(d，J＝10.8Hz，1H)，3.75(s，3H)，2.80(dd，J＝13.6，9.1Hz，1H)，2.60(dd，J＝13.6，5.7Hz，1H)，1.63(dp，J＝21.2，7.2Hz，2H)，1.04(d，J＝7.0Hz，3H)，0.58(t，J＝7.7Hz，1H)，0.40-0.36(m，1H)，0.30(dt，J＝8.2，3.8Hz，1H)，0.09-0.05(m，2H).
实施例30
庚基(3R，5S)-5-氰基-1-(S)-3-环丙基-2-(S)-N-甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-羧酸酯(化合物A6)
室温下把(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-d3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺(150毫克，0.295毫摩尔)加入二氯甲烷(10毫升)，室温下下加入氯甲酸庚酯(105毫克，0.600毫摩尔)，三乙胺(120毫克，1.20毫摩尔)，接着25度下搅拌12小时。
反应完毕，加水(10毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(10毫升×3)，合并有机相，依次用水(10毫升)、饱和食盐水(10毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈∶水5∶95到60∶40)得到150毫克庚基(3R，5S)-5-氰基-1-(S)-3-环丙基-2-(S)-N-甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-羧酸酯。
LC-MS：[M-H]+＝650。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.60(d，J＝6.9Hz，1H)，8.32(d，J＝5.1Hz，1H)，7.70(d，J＝7.5Hz，1H)，7.25(t，J＝6.2Hz，1H)，5.14(t，J＝7.1Hz，2H)，4.67(q，J＝7.1Hz，1H)，4.34(t，J＝6.5Hz，2H)，4.01(d，J＝10.8Hz，1H)，3.80(d，J＝10.9Hz，1H)，2.81(dd，J＝13.7，9.2Hz，1H)，2.69(dd，J＝13.8，5.2Hz，1H)，1.65(dtd，J＝43.2，13.9，6.8Hz，4H)，1.55-1.20(m，9H)，1.07(d，J＝7.0Hz，2H)，0.88(t，J＝6.6Hz，3H)，0.58(d，J＝7.8Hz，1H)，0.39(s，1H)，0.31(d，J＝8.4Hz，1H)，0.08(s，2H).
实施例31
合成(3R，5S)-5-氰基-1-(（S）-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-基)甲基环戊基碳酸酯(化合物A7)
0℃下，将(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-1′-(羟甲基)-2′-氧代-1′-，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺(158毫克，0.29毫摩尔)和三乙胺(119毫克，0.1.18毫摩尔)溶于二氯甲烷(10毫升)中，反应半小时，再滴加溶有氯甲酸环戊酯(109毫克，0.74毫摩尔)的二氯甲烷溶液，保持冰浴反应2小时。
反应结束，加入H2O(20毫升)淬灭反应，分液，水相用乙酸乙酯(20毫升×3)萃取。合并有机相，用无水硫酸钠干燥后浓缩至干得到残余，残余物用C18反相柱柱层析纯化(流动相：ACN/H2O，60％ACN)，得到61毫克(3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-基)甲基环戊基碳酸酯。
LC-MS：[M+H]+＝652。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.60(d，J＝6.9Hz，1H)，8.32-8.22(m，1H)，7.67(dd，J＝7.4，1.5Hz，1H)，7.18(dd，J＝7.4，5.3Hz，1H)，5.84-5.62(m，2H)，5.16(td，J＝6.7，5.4，2.8Hz，2H)，5.06(td，J＝5.6，2.7Hz，1H)，4.67(p，J＝7.2Hz，1H)，3.98-3.76(m，2H)，2.80(dd，J＝13.6，9.1Hz，1H)，2.60(dd，J＝13.5，5.7Hz，1H)，1.84(dt，J＝12.9，6.5Hz，2H)，1.76-1.48(m，8H)，1.05(d，J＝7.0Hz，3H)，0.65-0.51(m，1H)，0.46-0.24(m，2H)，0.14-0.02(m，2H).
实施例32
合成(3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟-N-(甲氧基甲基)乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-基)甲基异丙基碳酸酯(化合物A8)
0℃下，将(3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-基)碳酸甲酯异丙酯(145毫克，0.23毫摩尔)溶于四氢呋喃(5毫升)，再加氢化钠(23毫克，0.58毫摩尔，60％Wt)，保持冰浴，反应半小时，然后滴加溶有溴甲基甲醚(29毫克，0.46毫摩尔)的四氢呋喃溶液，自然升至室温，反应2小时。
反应结束，加入H2O(20毫升)淬灭反应，水相用乙酸乙酯(20毫升×3)萃取。合并有机相，用无水硫酸钠干燥后浓缩至干得到残余，残余物用C18反相柱柱层析纯化(流动相：ACN/H2O，65％ACN)，得到24.3毫克(3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-（S）-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟-N-(甲氧基甲基)乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-基)甲基异丙基碳酸酯。
LC-MS：[M+H]+＝670。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.28(dd，J＝5.4，1.5Hz，1H)，7.63(d，J＝7.4Hz，1H)，7.18(dd，J＝7.4，5.2Hz，1H)，5.74(s，2H)，5.18(dd，J＝8.9，6.1Hz，1H)，5.06(dt，J＝14.1，7.1Hz，2H)，4.82(p，J＝6.2Hz，1H)，4.64(d，J＝13.8Hz，2H)，3.92(s，2H)，3.17(s，3H)，2.78(dd，J＝13.5，9.0Hz，1H)，2.59(dd，J＝13.5，6.1Hz，1H)，1.62(q，J＝6.7Hz，2H)，1.24(d，J＝6.2Hz，6H)，1.10(d，J＝7.0Hz，3H)，0.59(s，1H)，0.43-0.27(m，2H)，0.15-0.03(m，2H).
实施例33
(3R，5S)-5-氰基-1-(S)-3-环丙基-2-(S)-N-甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-甲基庚基碳酸酯(化合物A9)
步骤A：合成(S)-N-(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-1′-羟甲基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙基-2-基-N-甲基-d3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺
室温下把(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-d3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺(170毫克，0334毫摩尔)加入吡啶(10毫升)，室温下下加入多聚甲醛(600毫克，6.68毫摩尔)接着90度下搅拌20小时。
反应完毕，反应液过滤，滤饼用吡啶洗两次(1毫升×2)，滤液浓缩得到粗品170毫克直接往后做。LC-MS：[M-H]+＝538。
步骤B：合成(3R，5S)-5-氰基-1-(S)-3-环丙基-2-(S)-N-甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-甲基庚基碳酸酯
室温下把(S)-N-(S)-1-(3R，5v)-5-氰基-1′-羟甲基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙基-2-基-N-甲基-d3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺(170毫克，0.315毫摩尔)加入二氯甲烷(10毫升)，室温下下加入氯甲酸庚酯(112毫克，0.630毫摩尔)，三乙胺(127毫克，1.26毫摩尔)，接着25度下搅拌12小时。
反应完毕，加水(10毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(10毫升×3)，合并有机相，依次用水(10毫升)、饱和食盐水(10毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈∶水5∶95到70∶30)得到165毫克(3R，5S)-5-氰基-1-(S)-3-环丙基-2-(S)-N-甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-甲基庚基碳酸酯。
LC-MS：[M-H]+＝680。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.60(d，J＝7.0Hz，1H)，8.27(d，J＝5.2Hz，1H)，7.67(d，J＝7.4Hz，1H)，7.21-7.17(m，1H)，5.75(S，2H)，5.16(t，J＝7.5Hz，2H)，4.75-4.57(m，1H)，4.13(t，J＝6.6Hz，2H)，3.93(d，J＝10.8Hz，1H)，3.82(d，J＝108Hz，1H)，2.80(dd，J＝13.6，9.2Hz，1H)，2.64-2.57(m，1H)，1.64-1.57(m，4H)，1.27(s，9H)，1.05(d，J＝7.0Hz，2H)，0.86(t，J＝6.4Hz，3H)，0.58(s，1H)，0.38(s，1H)，0.30(s，1H)，0.07(s，2H).
实施例34
戊基3R，5S-5-氰基-1-(S)-3-环丙基-2-(S)-N-甲基-d3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-羧酸酯(化合物A10)
室温下把(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-d3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺(140毫克，0.275毫摩尔)加入二氯甲烷(10毫升)，室温下下加入氯甲酸正戊酯(83毫克，0.55毫摩尔)，三乙胺(111毫克，110毫摩尔)，接着25度下搅拌12小时。
反应完毕，加水(10毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(10毫升×3)，合并有机相，依次用水(10毫升)、饱和食盐水(10毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈∶水5∶95到60∶40)得到90毫克戊基3R，5S-5-氰基-1-(S)-3-环丙基-2-(S)-N-甲基-d3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-羧酸酯。
LC-MS：[M-H]+＝622。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.60(d，J＝6.9Hz，1H)，8.35-8.30(m，1H)，7.73-7.67(m，1H)，7.25(dd，J＝7.5，5.1Hz，1H)，5.14(dd，J＝8.9，5.7Hz，2H)，4.69(q，J＝6。9Hz，1H)，4.34(t，J＝6.5Hz，2H)，4.01(d，J＝10.9Hz，1H)，2.81(dd，J＝13.8，9.2Hz，1H)，2.69(dd，J＝13.8，5.2Hz，1H)，1.66(ddq，J＝37.6，14.1，7.0Hz，4H)，1.39(dh，J＝29.2，7.0Hz，4H)，1.07(d，J＝7.0Hz，3H)，0.90(t，J＝7.2Hz，3H)，0.59(s，1H)，0.38(q，J＝5.1Hz，1H)，0.30(q，J＝4.0，3.6Hz，1H)，0.10-0.05(m，2H).
实施例35
合成((3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-基)碳酸甲基已酯(化合物A11)
0℃下，将(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-1′-(羟甲基)-2′-氧代-1′-，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺粗品(200毫克，0.33毫摩尔)和三乙胺(134毫克，1.33毫摩尔)溶于二氯甲烷(20毫升)中，滴加溶有氯甲酸已酯(109毫克，0.66毫摩尔)的二氯甲烷溶液，保持冰浴反应2小时。
反应结束，加入H2O(20毫升)淬灭反应，分液，水相用乙酸乙酯(20毫升×3)萃取。合并有机相，用无水硫酸钠干燥后浓缩至干得到残余，残余物用C18反相柱柱层析纯化(流动相：ACN/H2O，65％ACN)，得到83.3毫克白色产物((3R，5S)-5-氰基-1-(（S）-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-基)碳酸甲基已酯(收率34％)，LC-MS：[M+H]+＝668。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.60(s，1H)，8.27(s，1H)，7.67(s，1H)，7.30-7.03(m，1H)，5.75(s，2H)，5.33-5.01(m，2H)，4.82-4.52(m，1H)，4.24-4.05(m，2H)，3.99-3.73(m，2H)，2.80(t，J＝11.0Hz，1H)，1.79-1.46(m，4H)，1.44-1.15(m，7H)，1.05(d，J＝6.8Hz，3H)，0.86(s，3H)，0.58(s，1H)，0.34(d，J＝32.9Hz，2H)，0.07(s，2H).
实施例36
合成仲丁基((3R，5S)-5-氰基-1-(S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-甲基)碳酸酯(化合物A12)
室温下把(S)-N-(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-1′-羟甲基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙基-2-基-N-甲基-d3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺(80毫克，0.148毫摩尔)加入二氯甲烷(10毫升)，室温下下加入氯甲酸仲丁酯(40.5毫克，0.296毫摩尔)，三乙胺(60毫克，0.888毫摩尔)，接着25度下搅拌12小时。
反应完毕，加水(10毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(10毫升×3)，合并有机相，依次用水(10毫升)、饱和食盐水(10毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈∶水5∶95到70∶30)得到50毫克白色固体仲丁基((3R，5S)-5-氰基-1-(S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-甲基)碳酸酯(收率：52％)。LC-MS：[M-H]+＝638。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.59(d，J＝5.6Hz，1H)，8.27(d，J＝5.2Hz，1H)，7.67(d，J＝7.4Hz，1H)，5.74(s，2H)，5.18-5.14(m，2H)，4.67(q，J＝6.2Hz，2H)，3.93(d，J＝10.8Hz，1H)，3.82(d，J＝10.8Hz，1H)，2.81(dd，J＝13.4，9.3Hz，1H)，2.60(dd，J＝13.6，5.4Hz，1H)，1.66-1.55(m，4H)，1.22(d，J＝6.3Hz，4H)，1.05(d，J＝7.0Hz，2H)，0.86(t，J＝7.5Hz，3H)，0.58(s，1H)，0.38(s，1H)，0.30(s，1H)，0.07(s，2H).
实施例37
合成(3R，5S)-5-氰基-1-(S)-3-环丙基-2-(S)-N-甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-甲基已烷-2-基碳酸酯(化合物A13)
室温下把(S)-N-(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-1′-羟甲基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙基-2-基-N-甲基-d3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺(80毫克，0.148毫摩尔)加入二氯甲烷(10毫升)，室温下下加入已烷-2-基氯甲酸酯(40.5毫克，0.296毫摩尔)，三乙胺(60毫克，0.888毫摩尔)，接着25度下搅拌12小时。
反应完毕，加水(10毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(10毫升×3)，合并有机相，依次用水(10毫升)、饱和食盐水(10毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈∶水5∶95到70∶30)得到50毫克白色固体(3R，5S)-5-氰基-1-(S)-3-环丙基-2-(S)-N-甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-甲基已烷-2-基碳酸酯(收率：52％)。LC-MS∶[M-H]+＝666。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.60(d，J＝6.9Hz，1H)，8.27(d，J＝5.1Hz，1H)，7.67(d，J＝7.3Hz，1H)，7.19(t，J＝6.4Hz，1H)，5.74(s，2H)，5.17(d，J＝8.3Hz，2H)，4.70(dq，J＝15.0，6.7Hz，2H)，3.93(d，J＝10.8Hz，1H)，3.82(d，J＝10.9Hz，1H)，2.80(t，J＝11.6Hz，1H)，2.68-2.55(m，1H)，1.77-1.42(m，4H)，1.29-1.20(m，7H)，1.05(d，J＝7.1Hz，3H)，0.86(d，J＝6.9Hz，3H)，0.58(S，1H)，0.34(d，J＝32.0Hz，2H)，0.07(s，2H).
实施例38
合成仲丁基-5-氰基-1-(S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-羧酸酯(化合物A14)
室温下把(S)-1-(3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙烷-2-基)-N-甲基-D3-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺(100毫克，0.196毫摩尔)加入二氯甲烷(10毫升)，室温下下加入氯甲酸仲丁酯(54毫克，0.392毫摩尔)，三乙胺(80毫克，0.784毫摩尔)，接着25度下搅拌12小时。
反应完毕，加水(10毫升)淬灭，二氯甲烷萃取(10毫升×3)，合并有机相，依次用水(10毫升)、饱和食盐水(10毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残余物过反向柱(乙腈∶水5∶95到60∶40)得到70毫克白色固体仲丁基-5-氰基-1-(S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰氨基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-羧酸酯(收率：58.8％)。LC-MS：[M-H]+＝608。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.61(s，1H)，8.33(s，1H)，7.70(s，1H)，7.25(s，1H)，5.15(s，2H)，4.99(s，1H)，4.68(s，1H)，4.16-3.94(m，1H)，3.82(s，1H)，2.96-2.65(m，2H)，1.64(d，J＝35.2Hz，4H)，1.35(s，4H)，1.03(d，J＝27.4Hz，5H)，0.59(s，1H)，0.35(d，J＝35.6Hz，2H)，0.08(s，2H).
实施例39
合成(3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-基)碳酸甲酯丙酯(化合物A15)
将(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′-，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺(150毫克，0.30毫摩尔)溶于3毫升丙酮中，然后加入碳酸钾(61.1毫克，0.44毫摩尔)和氯甲基丙基碳酸酯(67.5毫克，0.44毫摩尔)，升温至60℃反应3小时。
将反应液用氯化铵水溶液淬灭，用二氯甲烷(10毫升×3)萃取，合并有机相，干燥，旋干。所得物用反相制备色谱纯化，得到10毫克白色固体化合物(3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-基)碳酸甲酯丙酯(收率：5.4％)。
LCMS：Rt＝1.509min，[M+H]+＝626.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.63(d，J＝7.0Hz，1H)，8.30(dd，J＝5.2，1.4Hz，1H)，7.69(dd，J＝7.4，15Hz，1H)，7.21(dd，J＝7.4，5.3Hz，1H)，5.81-5.74(m，2H)，5.22-5.15(m，2H)，4.70(p，J＝7.0Hz，1H)，4.12(t，J＝6.6Hz，2H)，3.95(d，J＝10.8Hz，1H)，3.84(d，J＝10.8Hz，1H)，2.83(dd，J＝13.6，9.1Hz，1H)，2.62(dd，J＝13.6，5.6Hz，1H)，1.63(p，J＝6.9Hz，4H)，1.07(d，J＝7.0Hz，3H)，0.91(t，J＝7.4Hz，3H)，0.60(s，1H)，0.43-0.29(m，2H)，0.09(s，2H).
实施例40
合成1-(((3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-((S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-基)甲基)5-(1，3-二羟基丙-2-基)3-甲基戊二酸酯(化合物A16)
步骤1：3-甲基-5-氧代-5-[(2-苯基-1，3-二氧杂环-5-基)氧基]戊酸
25℃下，将3-甲基戊二酸(8.00g，54.7mmol，3.08eq)，2-苯基-1，3-二恶烷-5-醇(3.20g，17.8mmol，1.00eq)和4-二甲胺基吡啶(6.51g，53.3mmol，3.00eq)溶解在二氯甲烷(50mL)中，向反应液中加入EDCI(17.0g，88.8mmol，5.00eq)，加完后保温反应2小时。
TLC(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)显示原料反应完毕。LCMS检测到产物MS值。
将反应液用二氯甲烷(200mL)稀释，然后用饱和NaHCO3水溶液(50mL*2)和饱和食盐水(50mL*2)洗涤，硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗品。粗品通过反向纯化(碱性条件)，随后通过反相制备(柱：Waters Xbridge 150*25mm*5um；流动相：[水(氢氧化铵v/v)-ACN]；10min梯度：5％-35％B)得到产物3-甲基-5-氧代-5-[(2-苯基-1，3-二氧杂环-5-基)氧基]戊酸(1.00g，18.3％收率)为一个黄色油状物。RT＝0.377min，MS(ESI)，[M-1]+m/z＝307.1。
步骤2：O1-苄基O5-(2-苯基-1，3-二氧杂环-5-基)3-甲基戊二酸酯
20℃下，将3-甲基-5-氧代-5-[(2-苯基-1，3-二氧杂环-5-基)氧基]戊酸(1.00g，3.24mmol，1.00eq)，碳酸钾(896.49mg，6.49mmol，2.00eq)和溴化苄(832mg，4.86mmol，1.50eq)溶解在DMF(7mL)中搅拌12小时。
TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)显示原料消耗完毕。
反应液用水(50mL)稀释，随后用乙酸乙酯(20mL*3)萃取。集中的有机相用饱和食盐水(30mL*2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗品。粗品通过柱层析纯化(SiO2，石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1to 1∶1)拿到产物O1-苄基O5-(2-苯基-1，3-二氧杂环-5-基)3-甲基戊二酸酯(900mg，2.26mmol，69.6％收率)
步骤3：01-苄基O5-[2-羟基-1-(羟甲基)乙基]3-甲基戊二酸酯
20℃下，将O1-苄基O5-(2-苯基-1，3-二氧杂环-5-基)3-甲基戊二酸酯(800mg，2.01mmol，1.00eq)和盐酸(2M，8.00mL，7.97eq)溶解在甲醇(9mL)中搅拌1小时。
TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1)显示原料反应完毕。
将反应液用水(100mL)稀释，随后用二氯甲烷(30mL*3)萃取。集中的有机相用饱和食盐水(30mL*2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗品。粗品通过柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝100∶1to 5∶1)纯化拿到产物O1-苄基O5-[2-羟基-1-(羟甲基)乙基]3-甲基戊二酸酯(350mg，56.2％收率)。
步骤4：O1-苄基O5-[2-[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧代-1-[[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧甲基]乙基]3-甲基戊二酸酯
20℃下，将O1-苄基O5-[2-羟基-1-(羟甲基)乙基]3-甲基戊二酸酯(350mg，1.13mmol，1.00eq)，咪唑(307mg，4.51mmol，4.00eq)和TBSCl(510mg，3.38mmol，3.00eq)溶解在DMF(3mL)中，搅拌12小时。
TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)显示原料消耗完毕.
将反应液用水(100mL)稀释，随后用乙酸乙酯(30mL*3)萃取。集中的有机相用饱和食盐水(40mL*2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗品。粗品通过pre-TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)纯化拿到产物O1-苄基O5-[2-[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧代-1-[[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧甲基]乙基]3-甲基戊二酸酯(350mg，57.6％收率)。
步骤5：5-[2-[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧代-1-[[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧甲基]乙氧基]-3-甲基-5-氧代-戊酸
25℃下，将O1-苄基O5-[2-[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧代-1-[[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧甲基]乙基]3-甲基戊二酸酯(300mg，1.006eq)q和Pd(OH)2(0.1g)溶解在甲醇(2mL))中，随后用氢气置换3次，随后在氢气(15PSI)氛围下反应12小时。
反应结束后，过滤，将滤饼放置在专门的固废桶中；滤液浓缩得到粗品
粗品通过反相制备(柱：Waters Xbridge 150*25mm*5um；流动相：[水（NH4HCO3)-ACN]；梯度：9min 45％-75％B)拿到产物5-[2-[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧代-1-[[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧甲基]乙氧基]-3-甲基-5-氧代-戊酸(150mg，60.0％收率)。MS(ESI)m/z[M+H]+＝447.2
步骤6：氯(氯磺酰氧基)甲烷O1-[2-[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧代-1-[[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧甲基]乙基]O5-(氯甲基)3-甲基戊二酸酯
20℃下，将5-[2-[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧代-1-[[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧甲基]乙氧基]-3-甲基-5-氧代-戊酸(120mg，1.00eq)和NaHCO3(89.8mg，1.07mmol，4.00eq)溶解在水(1mL)和二氯甲烷(1mL)中，随后加入四丁基硫酸氢胺(90.80mg，267.42μ mol，1eq)和氯磺酰氧基氯甲烷(44.1mg，1.00eq)，加完后保温反应16小时。
将反应液用二氯甲烷(50mL)稀释，随后用饱和食盐水(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗品。拿到产物氯(氯磺酰氧基)甲烷O1-[2-[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧代-1-[[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧甲基]乙基]O5-(氯甲基)3-甲基戊二酸酯(133mg，crude)。MS(ESI)m/z[M+H]+＝497.2
步骤7：O1-[2-[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧代-1-[[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧甲基]乙基]O5-[[(2S，4R)-2-氰基-1-[(2S)-3-环丙基-2-[三氘甲基-[(2S)-2-[(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]丙酰基]氨基]丙酰基]-2′-氧代-螺[吡咯烷-4，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′-基]甲基]3-甲基戊二酸酯
将O1-[2-[叔丁基(二甲基)硅基]氧代-1-[[叔丁基(二甲基)硅基]氧甲基]乙基]O5-(氯甲基)3-甲基戊二酸酯(132mg，1.50eq)，碳酸钾(48.8mg，2.00eq)和(2S)-N-[(1S)-2-[(2′S，3R)-2′-氰基-2-氧代-螺[1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3，4′-吡咯烷]-1′-基]-1-(环丙基甲基)-2-氧代-乙基]-N-(三氘甲基)-2-[(2，2-三氟乙酰基)氨基]丙酰胺(90mg，176.65μ mol，1eq)溶解在丙酮(1mL)，用氮气置换3次，随后升温至60℃，反应6小时。
将反应液浓缩，然后用水(20mL)和二氯甲烷(50mL)稀释，分液，水相用二氯甲烷(30mL)萃取。集中的有机相用饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗品。粗品合并，然后通过pre-TLC纯化(乙酸乙酯∶石油醚＝9∶1)拿到产物O1-[2-[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧代-1-[[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧甲基]乙基]O5-[[(2S，4R)-2-氰基-1-[(2S)-3-环丙基-2-[三氘甲基-[(2S)-2-[(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]丙酰基]氨基]丙酰基]-2′-氧代-螺[吡咯烷-4，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′-基]甲基]3-甲基戊二酸酯(105mg，61.3％收率)。RT＝0.768min，MS(ESI)m/z＝970.4[M+H]+
步骤8：1-(((3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-((S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-基)甲基)5-(1，3-二羟基丙-2-基)3-甲基戊二酸酯
0℃下，将O1-[2-[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧代-1-[[叔丁基(二甲基)硅烷基]氧甲基]乙基]O5-[[(2S，4R)-2-氰基-1-[(2S)-3-环丙基-2-[三氘甲基-[(2S)-2-[(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]丙酰基]氨基]丙酰基]-2′-氧代-螺[吡咯烷-4，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′-基]甲基]3-甲基戊二酸酯(60mg，1.00eq)溶解在四氢呋喃(20mL)，然后向上述溶液中加入HCl(92.6mg，36.5％纯度，15.0eq)(分批成3批加入，每一个小时加入一批，2小时加完)，加完后升温至20℃反应8小时。
将反应液用1N碳酸氢钠水溶液调节到7-8，随后用二氯甲烷(20mL*3)萃取。集中的有机相用饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗品。粗品通过反相制备(柱：Waters Xbridge 150*25mm*5um；流动相：[水(NH4HCO3)-ACN]；梯度9min∶25％-55％)，拿到产物1-(((3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-((S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-基)甲基)5-(1，3-二羟基丙-2-基)3-甲基戊二酸酯(25.0mg，54.5％收率)。RT＝0.463min，MS(ESI)m/z＝742.3[M+H]+。
1H NMR：(400MHz，CDCl3)δ8.33(d，J＝5.2Hz，1H)，7.48-7.35(m，1H)，7.23-7.17(m，1H)，7.08-7.02(m，1H)，5.95-5.86(m，2H)，5.11-5.03(m，1H)，4.96(t，J＝8.8Hz，1H)，4.84(quin，J＝7.2Hz，1H)，4.41-4.33(m，1H)，4.19-4.03(m，3H)，3.91-3.82(m，1H)，3.77-3.52(m，2H)，2.94(dd，J＝9.6，13.2Hz，1H)，2.79-2.45(m，3H)，2.43-2.34(m，4H)，1.87-1.77(m，2H)，1.29(td，J＝2.4，4.4Hz，3H)，1.11-1.02(m，3H)，0.74-0.65(m，1H)，0.62-0.54(m，2H)，0.25-0.14(m，2H)
实施例41
合成(3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-基)甲基戊基碳酸酯(化合物A17)
室温下，将(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′-，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺(130毫克，0.255微摩尔)混合于丙酮(8毫升)中，加入K2CO3(70.4毫克，0.510毫摩尔)和氯甲基碳酸戊基酯(69.2毫克，0.3825毫摩尔)，升温至60℃下反应搅拌8小时。
反应结束，过滤，用30毫升的二氯甲烷洗涤，减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱纯化得到56毫克白色产物(3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-基)甲基戊基碳酸酯(收率35％)。
LC-MS：[M-H]-＝652.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.60(d，J＝6.7Hz，1H)，8.27(d，J＝5.3Hz，1H)，7.67(d，J＝7.4Hz，1H)，7.18(q，J＝5.9Hz，1H)，5.97-5.57(m，2H)，5.30-5.03(m，2H)，4.68(q，J＝7.5，7.0Hz，1H)，4.13(t，J＝6.6Hz，2H)，4.01-3.79(m，2H)，2.81(dd，J＝13.5，9.2Hz，1H)，2.60(dd，J＝13.7，5.7Hz，1H)，1.62(dp，J＝14.8，7.9，7.5Hz，4H)，1.40-1.19(m，5H)，1.05(d，J＝6.7Hz，2H)，0.87(d，J＝6.4Hz，3H)，0.58(p，J＝6.2Hz，1H)，0.45-0.21(m，2H)，0.07(d，J＝4.5Hz，2H).
实施例42
合成已-2-基(3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-羧酸酯(化合物A18)
0℃下将(S)-N-((S)-1-((3R，5S)-5-氰基-2′-氧代-1′-，2′-二氢螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1-基)-3-环丙基-1-氧代丙-2-基)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺)丙酰胺(100毫克，0.196微摩尔)混合于DCM(8毫升)中，加入TEA(39.6毫克，0.392毫摩尔)和氯甲酸-1-甲基戊酯(48.5毫克，0.294毫摩尔)，然后0℃下翻译5h。
反应结束，过滤，用30毫升的二氯甲烷洗涤，减压浓缩至干得到残余。残余物通过反相柱纯化得到30毫克白色产物已-2-基(3R，5S)-5-氰基-1-((S)-3-环丙基-2-(S)-N-(甲基-d3)-2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)丙酰基)-2′-氧代螺[吡咯烷-3，3′-吡咯并[2，3-b]吡啶]-1′(2′H)-羧酸酯(收率24％)。
LC-MS：[M-H]-＝636.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.60(d，J＝6.9Hz，1H)，8.32(dd，J＝5.1，1.6Hz，1H)，7.68(dd，J＝7.6，1.7Hz，1H)，7.24(dd，J＝7.5，5.1Hz，1H)，5.14(dd，J＝8.8，5.9Hz，2H)，5.03(d，J＝6.3Hz，1H)，4.74-4.60(m，1H)，4.00(dd，J＝10.9，41Hz，1H)，3.81(dd，J＝10.9，7.0Hz，1H)，2.88-2.75(m，1H)，2.69(dd，J＝13.6，5.6Hz，1H)，1.64(tq，J＝20.8，7.5，7.0Hz，4H)，1.53-1.38(m，2H)，1.37-1.23(m，6H)，1.07(dd，J＝7.0，4.4Hz，2H)，0.90(t，J＝7.1Hz，3H)，0.59(s，1H)，0.43-0.27(m，2H)，0.14-0.02(m，2H).
实施例43化合物大鼠药代动力学研究
(1)实验材料
SD大鼠：雄性，180-250g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
试剂：DMSO(二甲亚砜)，PEG-400(聚乙二醇400)，生理盐水，肝素，乙腈，甲酸，普萘洛尔(内标)均为市售可得。
仪器：赛默飞LC-MS(U300 UPLC，TSQ QUANTUMN ULTRA三重四级杆质谱)。
(2)实验方法
称取化合物溶于DMSO-PEG-400-生理盐水(5：60：35，v/v/v)体系中，大鼠静脉或灌胃给药后，于15min、30min、1h、2h、5h、7h、24h(iv组加采5min)采集静脉血200μL于EDTA-K2抗凝EP管中，12000rpm离心2min，取血浆-80℃冻存待测。精密称取一定量供试品用DMSO溶解至2mg/mL，作为储备液。准确吸取适量的化合物储备液，加入乙腈稀释制成标准系列溶液。准确吸取上述标准系列溶液各20μL，加入空白血浆180μL，涡旋混匀，配制成相当于血浆浓度为1、3、5、10、30、100、300、1000、3000ng/mL的血浆样品，每一浓度进行双样本分析，建立标准曲线。取30μL血浆(静脉给药5min、15min、30min血浆稀释10倍)，加入内标普萘洛尔(50ng/mL)的乙腈溶液200μL，涡旋混匀后，加入100μL纯化水，再次涡旋混匀，4000rpm离心5min，取上清LC-MS分析。LC-MS检测条件如下：
色谱柱：赛默飞HYPERSIL GOLD C-18UPLC柱，100*2.1mm，1.7μm。
流动相：水(0.1％甲酸)-乙腈按下表进行梯度洗脱如下表。
表7.
时间(min) 水(含0.1％甲酸) 乙腈
0 90％ 10％
0.6 90％ 10％
1 10％ 90％
2.6 10％ 90％
2.61 90％ 10％
4 90％ 10％
3数据处理
LC-MS检测血药浓度后，采用WinNonlin 6.1软件，非房室模型法计算药动学参数，结果见下表。
表8.大鼠PK数据
结果显示：同等给药剂量下，化合物A1、A5、A6、A10、A11、A12和A17的口服PK效果相对于实施例3的化合物3(化合物A)有明显的提高，提高百分比如上表所示。
实施例44：本发明化合物CYP酶抑制考察
实验材料：
肝微粒体(150-donor，Coming，Cat.452117；Lot.38292)，NADPH
实验方法：
先配制0.2mg/mL微粒体体系，加入各测试物及底物，测试物终浓度为50uM，预孵8min后，加入10mMNADPH启动反应，NADPH最终浓度为1mM，孵育一段时间后加如甲醇内标终止反应。检测各反应孔中底物代谢物生成量。
数据处理：以空白孔代谢物生成量为100％，计算每个测试物孔中代谢物生成减少量，并计算抑制率。
表9：本发明化合物CYP酶抑制数据
结论：本发明化合物对主要CYP酶无抑制，DDI风险较小。
实施例45：本发明化合物hERG考察
实验材料：
HEK293-hERG稳转细胞系(invitrogen)。DMEM培养基(Gibco)，HEPES(invitrogen)，Blasticidin(invitrogen)
实验方法：
HEK293-hERG稳转细胞培养至40％-80％聚合度时用于实验，首先用空白溶媒应用到细胞中，建立基线。一旦发现hERG电流稳定5分钟后，开始测试化合物。在测试化合物存在下，记录大约5分钟的hERG电流以达到稳定状态，然后捕获5个扫频。为了保证培养细胞和操作的良好性能，同样使用阳性对照多非利酮对同一批次细胞进行检测。
数据处理：
Peak current inhibition＝(1-Peak tail current compound/Peak tailcurrent vehicle)*100
表10：本发明化合物hERG实验数据
实施例 hERG IC50[μM]
3 >100
结论∶本发明化合物对hERG电流IC50较高，心脏安全性较好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种通式(I)所示的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于：
A＝-C(O)-芳基，或者-C(O)-杂芳基，或者芳基或者杂芳基可以进一步被卤素、烷基所取代；
R1是氢、-CN、卤素、烷基或者卤代烷基；
R2是烷基、或者卤代烷基、或者芳基烷基、或者环烷基烷基；
R3是烷基或者卤代烷基；
R4是烷基、卤代烷基、环烷基或者环烷基烷基；
R5是烷基或者卤代烷基；
表示连接键。
2.根据权利要求1所述的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于，所述烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、仲戊基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、叔戊基、1，2-二甲基丙基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、仲己基、叔己基、新己基、2-甲基戊基、1，2-二甲基丁基、1-乙基丁基；
所述环烷基选自C3-6的环烷，C3-6的环烷选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基；
所述卤素选自氟、氯、溴、碘；
所述芳基选自苯；所述杂芳基选自吡唑、吲哚，芳基可以进一步被卤素所取代；
所述环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基。
3.根据权利要求1所述的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于，选自：
或者R1是氢；R2是环丙基甲基、叔丁基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基或R3是甲基、-CD3。
4.根据权利要求1所述的化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于，选自：
5.根据权利要求1-4任一项所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于，为所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐的前药，结构如下：Y选自-(CH2)m-(O)n-C(O)-(O)p-R6，R6是烷基、环烷基或者m、n、p独立地选自0、1、2。
6.根据权利要求5所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于，Y选自
优选化合物结构选自：
7.根据权利要求1-6任一项所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐，其特征在于，所述药学上可接受的盐是指化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐与药学上可接受的酸或碱制备。
8.一种药物组合物，其特征在于，包含治疗有效量的权利要求1-7任一项所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐和药物可接受的载体。
9.权利要求1-7任一项所述化合物，或其异构体、或其消旋体、或其可药用的盐的医药用途，具体地，在制备用于治疗疾病的药物中的用途，所述疾病为3C样蛋白酶抑制剂剂相关疾病，优选自新型冠状病毒感染等病症。
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