CN118161490B - 一种去泛素化酶抑制剂在制备预防或者治疗炎症药物中的应用 - Google Patents
一种去泛素化酶抑制剂在制备预防或者治疗炎症药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种去泛素化酶抑制剂在制备预防或者治疗炎症药物中的应用。本发明所提供的四氢‑β‑咔啉类小分子有机化合物通过对去泛素化酶BAP1的酶活性的抑制进而抑制BAP1在生物体内功能，抑制BAP1在生物体内的底物蛋白的含量。与现有BAP1抑制剂相比，本发明所提供的化合物对BAP1酶活性的抑制能力更强，并且有更好的水溶性；此外，所述化合物对炎症也具有较好的预防或治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种去泛素化酶抑制剂在制备预防或者治疗炎症药物中的应用。
背景技术
炎症是一种生物防御，作为保护身体不受到可能由外部物理刺激、化学刺激(例如暴露在多种过敏原下)或包括细菌、真菌及病毒在内的微生物的入侵造成的对生物组织的损伤的手段。炎症类疾病给患者带来巨大痛苦并严重影响了他们的生活质量，对整个社会经济造成了严重的负担。炎症会导致一些心脑血管疾病、糖尿病，甚至诱发癌症。慢性炎症产生的炎症因子持续过量存在时，可导致机体功能下降，比如导致机体出现慢性炎症衰老的状况，它们可以加速人的衰老，诱发中老年疾病，如若帕金森、老年痴呆、骨质疏松等。
人BRCA1相关蛋白(BRCA1 assocⅠated proteⅠn 1) BAP1通过调控趋化因子和细胞因子的表达激活与先天免疫相关的炎症。BAP1酶活性被抑制后减弱炎症反应，因此，BAP1可以作为预防或治疗炎症的靶标。
目前，BAP1抑制剂（简称BAP1i）有如结构式II所示的化合物II，但其水溶性差，活性低，难以广泛应用，成药难度大。
II
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种去泛素化酶抑制剂在制备预防或者治疗炎症药物中的应用。本发明提供的四氢-β-咔啉类小分子有机化合物对人去泛素化酶BAP1的酶活性具有抑制作用，可以用于制备抑制去泛素化酶活性药物；另外该化合物对免疫细胞释放的炎症因子有显著抑制作用，因此可作为抗炎药物用于炎症类疾病的治疗。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种四氢-β-咔啉类小分子有机化合物或其药学上可接受的盐在制备去泛素化酶BAP1抑制剂中的应用，所述化合物的结构如式I：
I
另外，本发明还提供所述四氢-β-咔啉类小分子有机化合物或其药学上可接受的盐在抑制去泛素化酶BAP1底物的去泛素化水平和底物蛋白含量中的应用。
第三方面，本发明还提供所述四氢-β-咔啉类小分子有机化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防炎症的药物中的应用。
作为对上述方案的进一步补充，所述炎症由去泛素化酶BAP1引起。
作为对上述方案的进一步补充，所述化合物单独使用或与其他药物联合使用。
本发明的特点如下：本发明检测了四氢-β-咔啉类小分子有机化合物与去泛素化酶BAP1的结合能力，证明所述化合物与BAP1之间存在很强的结合能力，结合信号随着所述化合物的摩尔浓度的增加而增加。所述化合物抑制BAP1的酶活性，相同浓度下，所述化合物对BAP1的酶活性抑制能力强于现有化合物II。四氢-β-咔啉类化合物抑制去泛素化酶BAP1催化底物KLF5蛋白的泛素化水平，降低KLF5的蛋白含量，证明四氢-β-咔啉类化合物通过对BAP1的去泛素化酶活性的抑制进而抑制BAP1在生物体内功能，抑制BAP1在生物体内的底物蛋白的含量。突变BAP1酶活口袋的关键氨基酸CYS91后，四氢-β-咔啉类化合物不再影响BAP1酶活性。四氢-β-咔啉类化合物的抗炎活性体现在：脂多糖LPS处理免疫细胞后诱导炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α的表达水平升高，四氢-β-咔啉类化合物处理免疫细胞后显著降低LPS诱导的炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α的表达水平，证明四氢-β-咔啉类具有抗炎作用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明所提供的四氢-β-咔啉类小分子有机化合物（化合物I）通过对BAP1的酶活性的抑制进而抑制BAP1蛋白在生物体内功能，抑制BAP1在生物体内的底物蛋白的含量。与化合物II相比，本发明所提供的化合物I对BAP1酶活性的抑制能力更强，并且有更好的水溶性，并且对炎症具有较好的预防或治疗作用。
附图说明
图1为本发明化合物I与BAP1酶直接结合的测定结果；
图2为本发明化合物I和化合物II抑制BAP1的EC50的测定结果；
图3为本发明化合物I抑制BAP1酶活性的测定结果；
图4为本发明化合物I在细胞内抑制BAP1酶底物KLF5泛素化水平的测定结果；
图5为本发明化合物I在细胞内抑制BAP1酶底物KLF5蛋白含量的测定结果；
图6为本发明化合物I抗炎活性测定结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。以下实施例中涉及到的英文对应的中文含义如表1所示。
表1中英文对照
以下实施例提及的化合物I如下式所示，化合物I按照CN202210301004.8专利实施例方法制备得到。
I
实施例1 化合物Ⅰ与BAP1酶直接结合的测定
使用Biacore S200仪器测试，将BAP1酶偶联到CM5芯片上，偶联缓冲液为醋酸钠缓冲液pH=4.5；偶联蛋白的响应值为23337 RU；使用化合物I浓度分别为0 µM、3.13 µM、6.25µM、12.5 µM、25 µM、50 µM、100 µM，与偶联后BAP1蛋白进程结合的试验。
实验结果：如图1所示，3.13 µM的化合物I开始具有与BAP1蛋白的结合能力（RU>0，图1中纵坐标代表化合物I与BAP1酶的结合能力，数值越大，表示结合能力越强，横坐标表示反应时间），结合信号随着化合物I的摩尔浓度的增加而增加，根据结果显示化合物I与去泛素化酶BAP1结合的最大解离常数为KD= 21.9 µM。结果说明化合物I与去泛素化酶BAP1可以直接结合。
实施例2 利用Ub-AMC检测去EC50试验
为了评估化合物I和已有的BAP1抑制剂BAP1i（化合物II，购买于MCEMedChemExpress，HY-W327122）对BAP1酶活性的影响，使用Ub-AMC进行了酶活性测定试验，去泛素化酶会催化Ub-AMC形成游离的AMC，AMC会激发荧光，AMC的激发波长是345 nM，发射波长是445 nM，使用荧光酶标仪检测AMC的荧光强度就能测出去泛素化酶BAP1的催化活性。
酶活缓冲液配制：50 mM Tris-HCl，100μg/ml ovalbumin，10 mM dithiothreitol（pH 7.4），96孔酶标板每孔100 ng Ub-AMC蛋白，50 ng BAP1蛋白，每孔含有化合物是DMSO或者10 μM化合物I或者10 μM 化合物II，BAP1和Ub-AMC蛋白使用酶活缓冲液稀释，每孔总体积100 μL，化合物I和II均梯度稀释到0 µM、10-3µM、10-2µM、10-1µM、100µM、101µM等浓度加入各孔，首先化合物I、II分别和BAP1蛋白加到一起在37℃孵育20 min，然后每孔加入Ub-AMC摇匀。摇匀后开始使用酶标仪进行检测初始值A0，以及2 min后测一次末反应值A1，单位反应值ΔA为A1-A0。酶标仪检测激发波长是345 nM，发射波长是445 nM，检测温度是37℃。图2以0 µM的反应值进行比值分析，DUB activity（BAP1酶活）（%）=ΔAc/ΔA0表示化合物加入后还没有被抑制Ub-AMC的量，这个值越大说明抑制酶活作用越弱。图2中的EC50值为GraphPad 9.0计算后的化合物半数抑制酶活有效浓度。
试验结果：图2 A-B所示，化合物I的EC50值为0.2366 µM（图2 A）优于化合物II的EC50值为0.3317 µM（图2 B）。
实施例3 利用Ub-AMC检测去泛素化酶活追踪试验
为了评估化合物I和已有的BAP1抑制剂化合物II对BAP1酶活性的影响，使用Ub-AMC进行了酶活性测定试验，去泛素化酶会催化Ub-AMC形成游离的AMC，AMC会激发荧光，AMC的激发波长是345 nM，发射波长是445 nM，使用荧光酶标仪检测AMC的荧光强度就能测出去泛素化酶BAP1的催化活性。
酶活缓冲液配制：50 mM Tris-HCl，100 μg/ml ovalbumin，10 mMdithiothreitol（pH 7.4），96孔酶标板每孔100 ng Ub-AMC蛋白，50 ng BAP1蛋白，每孔含有化合物是DMSO或者10 μM化合物I或者10 μM 化合物II，BAP1和Ub-AMC蛋白使用酶活缓冲液稀释，每孔总体积100 μL，化合物I和II均用DMSO稀释到1 µM加入各孔，首先化合物I、II分别和BAP1蛋白加到一起在37℃孵育20 min，然后每孔加入Ub-AMC摇匀。摇匀后开始使用酶标仪进行检测（每隔2 min测一次，检测50 min）。酶标仪检测激发波长是345 nM，发射波长是445 nM，检测温度是37℃。DMSO是对照组。
试验结果：图3所示，与对照组DMSO相比，化合物I或者化合物II都能显著抑制BAP1酶活性（图3中纵坐标表示荧光强度，代表BAP1酶活性，横坐标表示反应时间）。其中，化合物I比化合物II具有更强的BAP1酶抑制活性。
实施例4 化合物I在细胞内抑制BAP1酶底物KLF5泛素化水平（KLF5-Ub）的测定
合成BAP1基因的编码区序列，然后使用BamHⅠ和SalⅠ酶对pGEX-6p-1-GST质粒（购买自Amersham，货号：27-4597-01）和BAP1编码区片段进行切割，接着通过T4连接酶将获得的BAP1和切割后的pGEX-6p-1-GST质粒连接构建成pGEX-6p-1-GST-BAP1（简称GST-BAP1）。随后，通过点突变将BAP1突变为BAP1C91S，构建成pGEX-6p-1-GST-BAP1C91S（简称GST-BAP1C91S）。质粒GST-BAP1和GST-BAP1C91S由北京擎科生物科技股份有限公司合成。
KLF5-Ub蛋白是BAP1酶的催化底物，BAP1酶催化KLF5-Ub发生去泛素化，使KLF5-Ub断裂为KLF5和Ub，因此检测KLF5-Ub的水平反映了BAP1的酶活水平。另外，CYS91氨基酸是BAP1起催化活性的关键氨基酸位点，突变CYS91后会导致BAP1失活。为了进一步检测化合物I抑制BAP1酶活后是否影响BAP1催化底物KLF5蛋白泛素化水平，执行以下试验：将构建好的GST-BAP1质粒、GST-BAP1C91S（CYS91氨基酸突变）质粒，使用DH5α感受态细胞扩增，后使用BL21（DE3）感受态细胞转化后，第二天挑取3-5个单克隆37℃培养箱扩大培养，待菌液OD600值为0.6-0.8之间时进行IPTG诱导16℃培养箱过夜，后使用超声破碎发法破碎菌液，按照Sangon Biotech公司试剂盒（货号：C650033）说明书步骤提纯BAP1蛋白。此外使用HEK-293T细胞中转入KLF5-6×His质粒（北京擎科生物科技股份有限公司构建）46 h后使用MG132处理2 h，破碎细胞，按照Sangon Biotech公司试剂盒（货号：C650033）说明书提纯KLF5（Ub）蛋白。后将纯化BAP1蛋白与KLF5（Ub）放入37℃反应6 h，分为加化合物I和不加化合物I（DMSO组）处理。进行Western Blot检测Ub水平，使用ⅠmageJ对KLF5（Ub）进行灰度分析。
Western Blot试验方案如下：在实验条件下完成细胞培养后，用冷磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 进行洗涤后收集细胞。将细胞沉淀用2×蛋白样品缓冲液 (1M Tris-HCl pH=6.8，50％甘油，10％SDS，2-巯基乙醇，1％溴酚蓝) 溶解，并在100℃煮沸10 min。对所制备的蛋白质样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移至PVDF膜 (Millipore)上。在5％脱脂牛奶溶液中进行封闭，以用于PVDF膜上的蛋白质与抗体之间的特异性偶联反应。然后弃去脱脂牛奶溶液，并用PBST (PBS中加入0.5％吐温20) 对膜进行洗涤。膜上的蛋白质与抗体之间的偶联反应在4℃进行过夜，然后再次用PBST洗涤。最后，将缀合有辣根过氧化物酶 (HRP) 的二抗 (Cell signaling Technology) 稀释在PBST中，并在室温反应2小时。使用Luminata Forte HRP底物 (Millipore) 对膜上的蛋白质含量进行测定。
试验结果：图4所示，加入化合物I处理6 h后，BAP1酶底物KLF5的蛋白泛素化水平升高（图4中纵坐标表示泛素化修饰的KLF5的水平，横坐标表示处理条件，p<0.05代表统计上有显著差异，***代表p<0.001，**代表p<0.01，ns代表没有显著性差异）。突变BAP1酶活口袋的关键氨基酸CYS91后，化合物I不再影响BAP1酶活性。
实验结果：结果证明化合物I通过对BAP1的去泛素化酶活性的抑制进而抑制BAP1蛋白在生物体内的酶活功能，促进BAP1的底物蛋白的泛素化修饰。
实施例5 化合物I在细胞内抑制BAP1酶底物KLF5蛋白含量的测定
细胞内蛋白被泛素化修饰后会发生降解，化合物I通过抑制BAP1酶活性，导致BAP1酶底物KLF5的蛋白泛素化水平升高，为了评估化合物Ⅰ对BAP1酶底物KLF5蛋白含量的影响，进行了蛋白含量变化的检测，首先分别用0 µM（DMSO）、1 µM、2 µM、4 µM的化合物Ⅰ处理细胞HCC1806和SUM149PT各24 h，然后将细胞收集进行Western Blot试验。Western Blot试验方案与实施例3中的试验过程相同。图5以Vinculin作为内参进行统计分析（图5中纵坐标表示KLF5蛋白的表达水平，横坐标表示处理条件，***代表p<0.001，**代表p<0.01）
试验结果：图5 A所示，蛋白印迹试验结果显示与对照（0 µM）相比，化合物I显著降低KLF5蛋白的含量，并且随着化合物I的浓度增加，对KLF5蛋白的抑制效果逐渐增加。图5B-C，根据蛋白免疫印迹试验结果进行灰度分析结果进行统计分析的结果同样证明化合物I显著降低KLF5蛋白的含量，并且随着化合物I的浓度增加，对KLF5蛋白的抑制效果逐渐增加。本实施例中Vinculin是内参蛋白。
实施例6 化合物I抗炎活性测定
BAP1会诱发炎症，为了鉴定对化合物Ⅰ是否具有抗炎活性，进行如下试验：通过使用脂多糖LPS处理免疫细胞THP-1，将THP-1细胞转化为释放炎症因子的炎症细胞。具体步骤是LPS处理THP-1细胞24 h后，加入化合物Ⅰ处理6 h，提取RNA，后进行RT-qPCR，检测GAPDH、ⅠL-1、ⅠL-6、TNF-α的含量，GAPDH作为内参后统计分析（图6中纵坐标表示炎症因子的表达水平，横坐标表示处理条件，**代表p<0.01，***代表p<0.001）。
实验结果：IL-1在急性和慢性炎症的致病过程发挥重要作用，并与糖尿病、类风湿关节炎和牙周炎的病理过程密切相关。图6 A所示脂多糖LPS处理THP-1细胞后诱导炎症因子IL-1的表达水平升高，化合物Ⅰ显著降低LPS诱导的炎症因子IL-1。IL-6在炎症反应中是早期炎症的标志物，IL-6与多种自身免疫疾病相关，如类风湿性关节炎、银屑病和系统性红斑狼疮等患者的血清中IL-6的水平通常较高。图6 B所示脂多糖LPS处理THP-1细胞后诱导炎症因子IL-6的表达水平升高，化合物Ⅰ显著降低LPS诱导的炎症因子IL-6。TNF-α在许多病理状态下产生增多，包括败血症、恶性肿瘤、心脏衰竭和慢性炎性疾病。在重症类风湿关节炎患者的血液及关节中都可发现肿瘤坏死因子增多。图6 C所示脂多糖LPS处理THP-1细胞后诱导炎症因子TNF-α的表达水平升高，化合物Ⅰ显著降低LPS诱导的炎症因子TNF-α。总之，化合物Ⅰ显著降低LPS诱导的炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α的表达水平，证明化合物I可以抑制炎症因子的表达，具有抗炎作用。
以上所述是本发明的较佳实施例，并不是对本发明作的限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (2)
1.一种四氢-β-咔啉类小分子有机化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防炎症的药物中的应用，其特征在于，所述化合物的结构式如式I：
I 。
2.根据权利要求1所述的四氢-β-咔啉类小分子有机化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防炎症的药物中的应用，其特征在于，所述化合物单独使用或与其他药物联合使用。
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