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CN118159559A - 一种抗b7-h4抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗b7-h4抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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CN118159559A
CN118159559A CN202280056352.1A CN202280056352A CN118159559A CN 118159559 A CN118159559 A CN 118159559A CN 202280056352 A CN202280056352 A CN 202280056352A CN 118159559 A CN118159559 A CN 118159559A
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CN
China
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seq
amino acid
antibody
acid sequence
polypeptide chain
Prior art date
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Application number
CN202280056352.1A
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吴晓东
王永强
贾鸽子
赵楚楚
陈飞
何云
戎一平
丁翌
李鹤
牛磊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harbour Biomed Shanghai Co Ltd
Original Assignee
Harbour Biomed Shanghai Co Ltd
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Publication date
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Abstract

提供了一种抗B7‑H4抗体，其包含VH；所述VH包含以下的CDR或其突变：如SEQ ID NO：4或5的氨基酸序列所示的CDR1，如SEQ ID NO：15的氨基酸序列所示的CDR2，和，如SEQ ID NO：24或25的氨基酸序列所示的CDR3；其中所述突变为在所述CDR的氨基酸序列上具有3、2或1个氨基酸的插入、缺失或替换。所述抗体具有与人B7‑H4和食蟹猴B7‑H4结合的活性。将所述抗体制备成B7‑H4×CD3双特异性抗体时，其仍旧保留了与人B7‑H4和食蟹猴B7‑H4结合的活性，且对肿瘤细胞具有较强的杀伤效果，诱导的非特异性细胞因子例如IL‑6和IFN‑γ的表达很低；并且显示出较强的体内抗肿瘤活性。

Description

一种抗B7-H4抗体及其制备方法和应用 技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种抗B7-H4抗体及其制备方法和应用，还涉及一种包含所述抗B7-H4抗体的双特异性抗体。
背景技术
乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜瘤为女性常见的恶性肿瘤，其中乳腺癌发病居女性癌症发病的首位，2018年国际癌症研究机构IARC的数据显示，乳腺癌在全球女性癌症中的发病率为24.2％。对于这些癌症的治疗，免疫治疗和靶向治疗是目前的热点。比如靶向Her2的赫赛汀在Her2阳性的乳腺癌上有很好的疗效。对于三阴性乳腺癌(TNBC)，由于缺乏相应的靶点，目前少有治疗手段，主要以化疗为主。2019年3月美国FDA批准PD-L1抑制剂Atezolizumab联合白蛋白结合型紫杉醇用于转移性三阴性乳腺癌(TNBC)的治疗，但PD-L1在三阴性乳腺癌上的表达并不高。对卵巢癌和子宫内膜瘤的治疗主要以手术和放化疗辅助治疗为主，对于复发或转移性的肿瘤，除上述手段以外，其它可用的靶点主要包括雌激素受体、HER2、VEGF以及PD1/PD-L1等，但治疗效果有限。
B7-H4是比较新的B7家族成员，其蛋白在正常组织中的表达非常有限，仅在机体的部分导管上皮细胞上如乳房导管和小叶、输卵管上皮、子宫内膜腺等组织有低水平表达。相反，B7-H4在多种肿瘤组织中大量表达，比如在乳腺癌特别是三阴性乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜瘤等细胞上，有将近一半的肿瘤高表达B7-H4。从表达谱这一点上来讲，B7-H4可以被认为是一个高特异性的肿瘤相关抗原。另一方面，B7-H4是一种新的免疫检查点分子，体外实验证明B7-H4通过与其未知的T细胞表面受体相互作用，抑制T细胞的增殖、活化以及细胞因子的产生。肿瘤细胞通过高表达B7-H4分子，以及肿瘤微环境里高表达B7-H4分子的抑制性巨噬细胞，抑制T细胞的活化从而实现免疫逃避。B7-H4在肿瘤上的表达谱与PD-L1不重叠。通过抗体靶向B7-H4的治疗，是一种有前景的治疗B7-H4表达阳性肿瘤的手段。
目前有多家制药公司在研发针对B7-H4的单克隆抗体，或与药物偶联物，或双特异性抗体。Genentech、BMS、Jounce、江苏豪森等都处于临床前开发，目前进展最快的是FivePrime和Nextcure的抗B7-H4单克隆抗体，目前处在临床I期，其机制主要通过ADCC以及阻断免疫检查点活化T细胞。构建包含抗肿瘤相关抗原与抗-CD3的双特异性抗体被称之为T细胞衔接器，具有很强的肿瘤相关抗原依赖的T细胞活化和杀伤肿瘤的作用，比普通单抗可能具有更强的疗效。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中抗B7-H4抗体的不足，提供了一种抗B7-H4抗体及其制备方法和应用，还提供了一种包含所述抗B7-H4抗体的双特异性抗体。
为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种抗B7-H4抗体，其包含重链可变区(VH)；其中，
所述VH包含以下的互补决定区(CDR)或其突变：如SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列所示的CDR1，如SEQ ID NO:15的氨基酸序列所示的CDR2，和，如SEQ ID NO:24或25的氨基酸序列所示的CDR3；
其中所述突变为在所述CDR的氨基酸序列上具有3、2或1个氨基酸的插入、缺失或替换。
本申请中，在类似“具有3、2或1个氨基酸的插入、缺失或替换”中“氨基酸突变”是指相较于原氨基酸序列而言，变体的序列存在氨基酸的突变，包括在原氨基酸序列的基础上发生氨基酸的插入、缺失或替换。示例性的解释是对CDR的突变可以包含3个、2个或1个氨基酸的突变，这些CDR之间可以任选地选择相同或不同数目的氨基酸残基进行突变，例如可以是对CDR1进行1个氨基酸的突变，对CDR2和CDR3不进行氨基酸突变。
本申请中，所述突变可以包括目前如本领域技术人员公知的突变，例如在抗体的生产或者应用过程中，可能会对抗体进行的一些突变，例如对可能存在的，特别是CDR区的转录后修饰(post-translational modifications，PTMs)的位点进行突变，包括抗体的聚集、脱酰胺基敏感(asparagine deamidation，位点(NG、NS、NH等)、 天冬氨酸异构(DG，DP)敏感位点、N糖基化(N-{P}S/T)敏感位点及氧化敏感位点等相关突变，或降低等电点进行的相关突变。
优选地，其在所述CDR2上的突变为在如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列上具有G2P、S4G和S5R/D/E/T中的2或1个氨基酸替换；其氨基酸序列优选如SEQ ID NO:11-14、SEQ ID NO:16-18任一所示。
以上所述的G2P一般是指如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的第二位氨基酸G突变为P，其他的氨基酸替换例如S4G、S5R/D/E/T等等以此类推，本领域人员都应当理解其含义。
优选地，所述的抗B7-H4抗体包含重链可变区(VH)；其中，所述VH包含以下的互补决定区(CDR)或其突变：如SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列所示的CDR1，如SEQ ID NO:11-18的氨基酸序列所示的CDR2，和，如SEQ ID NO:24或25的氨基酸序列所示的CDR3。
在某一实施方案中，所述抗B7-H4抗体中的所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、11和24所示。
在某一实施方案中，所述抗B7-H4抗体中的所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5、12和25所示。
在某一实施方案中，所述抗B7-H4抗体中的所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、17和24所示。
在某一实施方案中，所述抗B7-H4抗体中的所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5、18和25所示。
在某一实施方案中，所述抗B7-H4抗体中的所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、13和24所示。
在某一实施方案中，所述抗B7-H4抗体中的所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、14和24所示。
在某一实施方案中，所述抗B7-H4抗体中的所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、15和24所示。
在某一实施方案中，所述抗B7-H4抗体中的所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、16和24所示。
优选地，所述VH的框架区为人VH的框架区。在某一实施方案中，所述人VH的框架区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的FWR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:7-9任一所示的FWR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:20-22任一所示的FWR3和氨基酸序列如SEQ ID NO:26或27所示的FWR4。在某一实施方案中，所述VH包括如SEQ ID NO:36-45任一所示的氨基酸序列或其突变；所述突变为所述VH的氨基酸序列上发生了一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或添加，且所述突变的氨基酸序列与所述VH的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，并保持或改善了所述抗体与B7-H4的结合；所述至少85％序列同一性优选为至少90％序列同一性，更优选为至少95％序列同一性，最优选为至少99％序列同一性。
在某一较佳实施方案中，所述重链可变区VH包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链可变区VH包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链可变区VH包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链可变区VH包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链可变区VH包括如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链可变区VH包括如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链可变区VH包括如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链可变区VH包括如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链可变区VH包括如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链可变区VH包括如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
在本申请中，所列CDR的氨基酸序列均是按照Chothia定义规则所示出的。但是，本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则(参见Kabat等人，《免疫学的蛋白质序列》，第五版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))和基于结构环区域位置的Chothia定义规则(参见JMol Biol 273:927-48,1997)。在本发明的技术方案中，还可以使用包含了Kabat定义和Chothia定义的Combined定义规则来确定可变结构域序列中的氨基酸残基。其中Combined定义规则即是将Kabat定义和Chothia定义的范围相结合，基于此取了一个更大的范围，详见本申请中的表1-3。本领域技术人 员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”应了解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。虽然本发明中请求保护的范围是基于Chothia定义规则所示出的序列，但是根据其他CDR的定义规则所对应的氨基酸序列也应当落在本发明的保护范围中。
因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
优选地，所述的抗B7-H4抗体为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv优选scFv、双特异性抗体、多特异性抗体、重链抗体或单域抗体或者其他任何保留抗体特异性结合抗原的能力(可以是保留抗体的特异性结合抗原的部分能力)的抗体，或者由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。
优选地，所述的抗B7-H4抗体为重链抗体。在某一实施方案中，所述重链抗体包括如SEQ ID NO:48-57任一所示的氨基酸序列或其突变。所述突变为所述氨基酸序列上发生了一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或添加，且所述突变的氨基酸序列与所述氨基酸序列具有至少85％序列同一性，并保持或改善了所述抗体与B7-H4的结合；所述至少85％序列同一性优选为至少90％序列同一性；更优选为至少95％序列同一性；最优选为至少99％序列同一性。在某一较佳实施方案中，所述重链抗体包括如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链抗体包括如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链抗体包括如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链抗体包括如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链抗体包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链抗体包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链抗体包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链抗体包括如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链抗 体包括如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述重链抗体包括如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
本申请中，所述的“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab片段的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fc”区是含有抗体的CH2和CH3结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。所述的“Fab’片段”含有一条轻链和包含VH结构域、CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的区域，由此可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’) 2片段。所述的“F(ab’) 2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此F(ab’) 2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。所述的术语“Fv”意指向抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段，但缺少恒定区。
本申请中，所述的scFv(single chain antibody fragment，单链抗体)可为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的连接子短肽。其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接子配对形成单价分子[参见，例如，Bird等人，Science 242:423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)]。此类scFv分子可具有一般结构：NH 2-VL-接头-VH-COOH或NH 2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的G 4S氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(G 4S) 4(即SEQ ID NO:88)或(G 4S) 3接头，但也可使用其变体。
本申请中，术语“多特异性抗体”按其最广义使用，涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体，其中该VH-VL单元具有多表位特异性；具有两个或多个VL和VH区的抗体，每个VH-VL单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合；具有两个或更多个单可变区的抗体，每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合；全长抗体、抗体片段、双特异性抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、共价或非共价连接在一起的抗体片段等。
本申请中，所述的单克隆抗体或mAb或Ab，指由单一的克隆细胞株得到的靶 向单一抗原表位的抗体，所述的细胞株不限于真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。
本申请中，所述的单域抗体又称为“纳米抗体”，指的是从重链抗体中克隆出来的VHH结构，是已知的可结合目标抗原的最小单位。
本申请中，所述的“重链抗体”指的是只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3结构域的抗体，又称为HCAb。
为了解决上述技术问题，本发明第二方面提供了一种双特异性抗体，其含有蛋白功能区A和蛋白功能区B；所述蛋白功能区A和所述蛋白功能区B靶向不同的抗原，其中所述蛋白功能区B靶向B7-H4，所述蛋白功能区A靶向非B7-H4；所述的双特异性抗体选自如下a)或b)：
a)所述蛋白功能区B选自如本发明第一方面所述的抗B7-H4抗体；或所述蛋白功能区B包含如SEQ ID NO:72所示的HCDR1，SEQ ID NO:74所示的HCDR2，SEQ ID NO:76所示的HCDR3，SEQ ID NO:78所示的LCDR1，SEQ ID NO:80所示的LCDR2，SEQ ID NO:82所示的LCDR3。
优选地，所述双特异性抗体的结构包含多肽链1、多肽链2和多肽链3，所述多肽链1如式：N’-VL_A-CL-C’所示；所述多肽链2如式：N’-VH_A-CH1-铰链区-CH2-CH3-C’所示；所述多肽链3如式：N’-VH_B1-连接子-VH_B2-铰链区(也可为连接肽)-CH2-CH3-C’、或如式：N’-VH_B-铰链区(也可为连接肽)-CH2-CH3-C’所示；其中，所述的VL_A和VH_A分别为所述蛋白功能区A的VL和VH，所述的VH_B1和VH_B2为所述蛋白功能区B的VH，且VH_B1和VH_B2的序列可以相同或者不同，VH_B1和VH_B2之间可以通过连接肽链接。其中，VH_A和VL_A分别为蛋白功能区A的重链可变区和轻链可变区，VH_B和VL_B为蛋白功能区B的重链可变区和轻链可变区；CL是轻链恒定区结构域；CH1、CH2和CH3分别是重链恒定区的第一、第二和第三结构域。
b)所述蛋白功能区B包含如SEQ ID NO:72所示的HCDR1，SEQ ID NO:74所示的HCDR2，SEQ ID NO:76所示的HCDR3，SEQ ID NO:78所示的LCDR1，SEQ ID NO:80所示的LCDR2，SEQ ID NO:82所示的LCDR3；
优选地，所述双特异性抗体的结构包含多肽链1、多肽链2和多肽链3，所述多 肽链1如式：N’-VL_A-CL-C’所示；所述多肽链2如式：N’-VH_A-CH1-铰链区-CH2-CH3-C’所示；所述多肽链3如式：N’-VL_B-连接子-VH_B-铰链区-CH2-CH3-C’；其中，所述的VL_A和VH_A分别为所述蛋白功能区A的VL和VH，所述的VL_B和VH_B为所述蛋白功能区B的VL和VH。
在一些优选的实施例中，所述蛋白功能区A为抗CD3抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH含有氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VH CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的VH CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的VH CDR3，所述VL含有氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的VL CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示的VL CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示的VL CDR3。在某一实施方案中，所述抗CD3抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示的VH和氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的VL。在某一实施方案中，所述抗CD3抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示的重链和氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的轻链。
在某一较佳实施方案中，所述蛋白功能区A包含轻链可变区和重链可变区；其轻链可变区VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:29、31和33所示的氨基酸序列；其重链可变区VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别为SEQ ID NO:3、10和23所示的氨基酸序列。所述蛋白功能区B包含重链可变区；其重链可变区VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别为SEQ ID NO:4、17和24所示的氨基酸序列。所列CDR的氨基酸序列按照Chothia定义规则所示。在某一较佳实施方案中，所述蛋白功能区A包含轻链可变区和重链可变区；其轻链可变区VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:29、31和33所示的氨基酸序列；其重链可变区VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别为SEQ ID NO:3、10和23所示的氨基酸序列。所述蛋白功能区B包含重链可变区；其重链可变区VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别为SEQ ID NO:5、18和25所示的氨基酸序列。所列CDR的氨基酸序列按照Chothia定义规则所示。在某一较佳实施方案中，所述蛋白功能区A包含轻链可变区和重链可变区；其轻链可变区VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:29、31和33所示的氨基酸序列；其重链可变区VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别为SEQ ID NO:3、10和23所示的 氨基酸序列。所述蛋白功能区B包含第一重链可变区和第二重链可变区；所述第一重链可变区VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别为SEQ ID NO:4、17和24所示的氨基酸序列；所述第二重链可变区VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别为SEQ ID NO:5、18和25所示的氨基酸序列。所列CDR的氨基酸序列按照Chothia定义规则所示。在某一较佳实施方案中，所述蛋白功能区A包含轻链可变区和重链可变区；其轻链可变区VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:29、31和33所示的氨基酸序列；其重链可变区VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别为SEQ ID NO:3、10和23所示的氨基酸序列。所述蛋白功能区B包含重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别为SEQ ID NO:72、74和76所示的氨基酸序列；所述轻链可变区VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别为SEQ ID NO:78、80和82所示的氨基酸序列。所列CDR的氨基酸序列按照Chothia定义规则所示。
在某一较佳实施方案中，所述蛋白功能区A包含轻链可变区和重链可变区；其轻链可变区VL包括如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；其重链可变区VH包括如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。所述蛋白功能区B包含重链可变区；其重链可变区VH包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述蛋白功能区A包含轻链可变区和重链可变区；其轻链可变区VL包括如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；其重链可变区VH包括如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。所述蛋白功能区B包含重链可变区；其重链可变区VH包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述蛋白功能区A包含轻链可变区和重链可变区；其轻链可变区VL包括如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；其重链可变区VH包括如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。所述蛋白功能区B包含第一重链可变区和第二重链可变区；所述第一重链可变区VH包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列；所述第二重链可变区VH包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。在某一较佳实施方案中，所述蛋白功能区A包含轻链可变区和重链可变区；其轻链可变区VL包括如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；其重链可变区VH包括如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。所述蛋白功能区B包含重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区VH包括如SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列；所述第二 重链可变区VH包括如SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列。
在某一较佳实施方案中，所述的双特异性抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的多肽链3。
在某一较佳实施方案中，所述的双特异性抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示的多肽链3。
在某一较佳实施方案中，所述的双特异性抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示的多肽链3。
在某一较佳实施方案中，所述的双特异性抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的多肽链3。
在某一较佳实施方案中，所述的双特异性抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示的多肽链3。
在某一较佳实施方案中，所述的双特异性抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示的多肽链3。
在某一较佳实施方案中，所述的双特异性抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:69所示的多肽链3。
在某一较佳实施方案中，所述的双特异性抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示的多肽链3。
在某一较佳实施方案中，所述的双特异性抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:86所示的多肽链3。
为了解决上述技术问题，本发明第三方面提供了一种分离的核酸，其编码如本发明第一方面所述的抗B7-H4抗体或如本发明第二方面所述的双特异性抗体。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述抗体的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述抗体的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述抗体的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该抗体序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
为了解决上述技术问题，本发明第四方面提供了一种重组表达载体，其包含如本发明第三方面所述的分离的核酸。
所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本申请所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。
优选地，所述表达载体包含真核细胞表达载体和/或原核细胞表达载体。
为了解决上述技术问题，本发明第五方面提供了一种转化体，其包含如本发明第四方面所述的重组表达载体。
所述转化体的制备方法可为本领域常规的制备方法，例如为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述转化体的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。优选地，所述宿主细胞为原核细胞和/或真核细胞，所述原核细胞优选E.coli细胞如TG1、BL21(表达单链抗体或Fab抗体)，所述真核细胞优选HEK293细胞或CHO细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法、热激法或电转法。
为了解决上述技术问题，本发明第六方面提供了一种嵌合抗原受体，其包含如本发明第一方面所述的抗B7-H4抗体或如本发明第二方面所述的双特异性抗体。
为了解决上述技术问题，本发明第七方面提供了一种基因修饰的细胞，其特征 在于，其包含如本发明第六方面所述的嵌合抗原受体。
优选地，所述基因修饰的细胞为真核细胞，优选分离的人细胞；更优选免疫细胞如T细胞，或NK细胞。
为了解决上述技术问题，本发明第八方面提供了一种抗B7-H4抗体或双特异性抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：培养如本发明第五方面所述的转化体，从培养物中获得抗B7-H4抗体或双特异性抗体。
为了解决上述技术问题，本发明第九方面提供了一种抗体药物偶联物，包括抗体部分和偶联部分，所述抗体部分包含如本发明第一方面所述的抗B7-H4抗体或如本发明第二方面所述的双特异性抗体，所述偶联部分包括可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合，所述抗体部分和偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
为了解决上述技术问题，本发明第十方面提供了一种药物组合物，其包含如本发明第一方面所述的抗B7-H4抗体、如本发明第二方面所述的双特异性抗体、如本发明第六方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第七方面所述的基因修饰的细胞和/或如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
更优选地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和/或上述的抗体药物偶联物，和0.01～99.99％的载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明所述的药物组合物的给药途径优选地为肠胃外施用、注射给药或口服给药。所述注射给药优选地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为液体剂型、气体剂型、固体剂型或半固体剂型的形式，即可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳的为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。更优选地为经由血管内、皮下、腹膜内或肌内施用。较佳地，所述药物组合物还可以作为气雾剂或喷雾剂施用，即经鼻施用；或者，鞘内、髓内或心室内施用。更优选地，所述的药物组合物还可以口服给药、注射给药、经鼻给药、经皮给药或粘膜给药。本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药 方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。
本发明所述的药物组合物的给药剂量水平可以根据达到所需诊断或治疗结果的组合物量而调整。施用方案也可以为单次注射或多次注射，或进行调整。所选择的剂量水平和方案依赖于包括所述药物组合物的活性和稳定性(即，半衰期)、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、待检测和/或治疗的疾病或病症、以及待治疗的受试者的健康状况和先前医疗史等各种因素而进行合理地调整。
优选地，所述药物组合物还可包含组合治疗剂以进行组合疗法，所述的组合治疗剂包括化学治疗剂、放射治疗剂、免疫抑制剂和/或细胞毒性药物。对于组合疗法，上述抗体、上述抗体药物偶联物和/或另外的治疗或诊断剂可以各自作为单一药剂，在适合于执行预期治疗或诊断的任何时间范围内进行使用。因此，这些单一药剂可以基本上同时(即作为单一制剂或在数分钟或数小时内)或以按顺序连续施用。
关于制剂、剂量、施用方案和可测量的治疗结果的另外指导，参见Berkow等人(2000)The Merck Manual of Medical Information(Merck医学信息手册)和Merck&Co.Inc.,Whitehouse Station,New Jersey；Ebadi(1998)CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology(临床药理学手册)等著作。
为了解决上述技术问题，本发明第十一方面提供了如本发明第一方面所述的抗B7-H4抗体、如本发明第二方面所述的双特异性抗体、如本发明第六方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第七方面所述的基因修饰的细胞、如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物和/或如本发明第十方面所述的药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物、试剂盒和/或给药装置中的应用；或提供了如本发明第一方面所述的抗B7-H4抗体、如本发明第二方面所述的双特异性抗体、如本发明第六方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第七方面所述的基因修饰的细胞、如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物和/或如本发明第十方面所述的药物组合物在治疗和/或预防癌症中的应用。
优选地，所述癌症选自肺癌、乳腺癌例如三阴性乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜瘤、胃癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、胆管癌、食道癌和骨肉瘤等组成的组。
为了解决上述技术问题，本发明第十二方面提供了试剂盒，其包括如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第二方面所述的双特异性抗体、如本发明第六方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第七方面所述的基因修饰的细胞、如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物和/或如本发明第十方面所述的药物组合物；以及任选地，说明书。
为了解决上述技术问题，本发明第十三方面提供了给药装置，所述给药装置包含：(1)用于对有需要的受试者施用如本发明第十方面所述的药物组合物的输注模块，以及(2)任选的药效监控模块。
为了解决上述技术问题，本发明第十四方面提供了一种检测B7-H4的方法，其包括使用如本发明第一方面所述的抗B7-H4抗体和/或如本发明第二方面所述的双特异性抗体进行检测的步骤。
优选地，所述方法为非诊断和/或治疗目的。非诊断、治疗目的例如在实验室检测样品中所包含的B7-H4；或研发中利用B7-H4进行药筛前对该B7-H4进行确认。
为解决上述技术问题，本发明还提供一种治疗和/或预防肿瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效剂量的如本发明第一方面所述的抗B7-H4抗体、如本发明第二方面所述的双特异性抗体、如本发明第六方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第七方面所述的基因修饰的细胞、如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物和/或如本发明第十方面所述的药物组合物。
对于本发明的所述药物组合物的治疗有效剂量可以最初在细胞培养实验或动物模型例如啮齿类动物、兔、犬、猪和/或灵长类动物中进行估计。动物模型也可以用于测定合适的施用浓度范围和途径。随后可以用于确定在人中施用的有用剂量和途径。一般地，施用有效量或剂量的确定和调整以及何时和如何进行此类调整的评估为本领域技术人员已知。
为了解决上述问题，本发明还提供一种治疗癌症的组合疗法，所述组合疗法包括向有需要的患者施用治疗有效剂量的药物组合物和组合治疗剂；所述药物组合物如本发明第十方面所述。
优选地，所述组合治疗剂如本发明第十方面所述。
在本申请中，除非另有说明，否则本申请中使用的科学和技术名词具有本领域 技术人员所通常理解的含义。并且，本申请中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在本申请中，术语“可变”通常是指这样的事实，即抗体的可变结构域的序列的某些部分变化强烈，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性并非均匀地分布在抗体的整个可变区中。它集中在轻链和重链可变区中的三个区段，被称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)。可变域中更高度保守的部分被称为框架(FWR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FWR区，大部分采用β-折叠构型，通过三个CDR连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FWR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点，恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
本申请所用氨基酸三字母代码和单字母代码如本领域技术人员知晓，或J.Biol.Chem,243,p3558(1968)中所述。
如本文使用的，术语“包括”或“包含”旨在表示组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素，但根据上下文的理解，也包括“由……组成”的情况。
本申请中，所述的HCAb可以是由一种携带人免疫球蛋白免疫库的转基因小鼠—HarbourHCAb小鼠(Harbour Antibodies BV，WO 2002/085945 A3)产生，仅含有“重链”的全人源抗体(Heavy Chain Only Antibody)，该抗体的大小只有传统IgG抗体的一半，其通常仅具有人的抗体“重链”可变结构域和小鼠Fc恒定结构域。
本申请所述的术语“抗体”可以是包括免疫球蛋白，其是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本申请中，本申请所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的 轻链恒定区包含人源的κ、λ链或其变体。在本申请中，本申请所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源的IgG1、2、3、4或其变体。
在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FWR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区4个FWR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4。轻链的3个CDR区指VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3；重链的3个CDR区指VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。
术语“人源抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本申请的人源抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。然而，术语“人源抗体”不包括这样的抗体，即其中已将衍生自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗体”)。
如本申请所用，关于抗体的术语“特异性”意指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或更多个物种的该抗原。但是，这种种间交叉反应性本身不改变抗体根据特异性的分类。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合该抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体根据特异性的分类。在一些情况下，术语“特异性”或“特异性结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，意味着该相互作用取决于化学物质上特定结构(例如， 抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体一般识别并结合特定的蛋白质结构，而不是蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有经标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A的分子(或游离的，未标记的A)的存在将减少结合于抗体的标记的A的量。
本申请中，术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗原结合片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗原结合片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗原结合片段保留至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗原结合片段实例包括但不限于：Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv片段、线性抗体(linear antibody)、单链抗体、纳米抗体、单域抗体和多特异性抗体。抗原结合片段可为工程改造的抗体变体。工程改造的抗体变体综述于Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23:1126-1136中。
本文中使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”(Chimeric antigen receptor)指：包含能够结合抗原的胞外域(胞外结合结构域)、铰链结构域、跨膜结构域(跨膜区)和使胞质信号传到结构域的多肽(即胞内信号域)。铰链结构域可以被认为是用于向细胞外抗原结合区提供柔性的一部分。胞内信号域指经由确定的信号传导途径通过产生第二信使而将信息传递到细胞内以调节细胞活性的蛋白质、或通过相应于此类信使而作为效应子发挥作用的蛋白质，产生可以促进CAR的细胞(例如CART细胞)的免疫效应子功能的信号。胞内信号域包含信号传导结构域，还可以包括源自共刺激分子的共刺激胞内结构域。
“同一性”、“突变”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同一性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同一性百分率时进行比较。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”(如果为单链)在本申请中互换地使用。术语“核酸”、“核酸序列”，“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”和“多核苷酸”互换使用。
本文使用的术语“载体”是包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的组合物。在本领域中已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
本申请使用的表述“细胞”、“细胞系”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌等原核细胞，如酵母细胞等的真菌细胞，或者如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
术语“转染”是指将外源核酸引入真核细胞。转染可以通过本领域已知的各种手段来实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹道技术(biolistics)。
术语“免疫细胞”指可以引发免疫应答的细胞，“免疫细胞”及其语法上的其他形式可以指任何来源的免疫细胞。“免疫细胞”包括例如衍生自在骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白细胞)、淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和骨髓来源的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)。术语“免疫细胞”也可以是人或非人的。例如，免疫细胞可以是来自血液的，如自体的T细胞、异体T细胞、自体NK细胞、异体NK细胞，也可以来源自细胞系，如利用EBV病毒感染来制备NK细胞系，从胚胎干细胞和iPSC诱导分化来的NK细胞以及NK92细胞系等。
如本申请使用的，术语“T细胞”是指在胸腺中成熟的一类淋巴细胞。T细胞在细胞介导的免疫中起重要作用，并且与与其他淋巴细胞(例如B细胞)的不同点在于细胞表面上存在T细胞受体。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、自然杀伤T细胞、T 调节细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。如本文使用的，术语“NK细胞”是指起源于骨髓并且在先天免疫系统中起重要作用的一类淋巴细胞。NK细胞提供针对病毒感染的细胞、肿瘤细胞或其他应激细胞的快速免疫反应，即使是细胞表面上不存在抗体和主要组织相容性复合体。
“任选”、“任一”、“任意”或“任一项”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。本发明所用，“一个”和“一种”在本发明中用来指的一个或多于一个的语法对象。除非内容明确提示，否则术语“或”在本发明中用来意指术语“和/或”并且与之互换使用。“约”和“大约”应当通常意指鉴于测量的性质或精度，所测量的量的可接受误差程度。示例性误差程度一般在其10％范围内和更一般在其5％范围内。本发明公开的方法和组合物涵盖这样的多肽和核酸，它们具有指定的序列，变异序列或与其基本上相同或相似的序列，例如，与序列指定至少85％、90％、95％、99％或更多相同的序列。在氨基酸序列的情况下，术语“基本上相同”在本发明中用来指第一氨基酸序列。
如发明所用，术语“药学上可接受的载体”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体，例如任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料，是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂、赋形剂、填充剂、表面活性剂、佐剂、离子强度增强剂、稀释剂、维持渗透压的试剂、延迟吸收的试剂、防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的 含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。本发明的药学上可接受的载体可为本领域常规的载体，所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料。
如本文中所使用的，术语EC 50是指半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect)，即能引起50％最大效应的浓度。
如本发明所用，术语“癌”、“癌症”、“肿瘤”意在包括全部类型的癌性生长物或致瘤过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭力阶段是什么。例子包括但不限于实体瘤、血液学癌、软组织肿瘤和转移性病灶。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1、本发明的抗体具有与人B7-H4和食蟹猴B7-H4结合的活性。在某一较佳实施例中，所述抗体可为一种全新的仅含“重链”的全人抗体，其大小只有传统IgG抗体的一半，由于不含轻链的这一特点，使得该抗体可以用于双特异性抗体，并解决了轻链错配和异源二聚化的问题。
2、将本发明的抗体制备成B7-H4×CD3双特异性抗体时，其仍旧保留了与人B7-H4和食蟹猴B7-H4结合的活性，且对肿瘤细胞具有较强的杀伤效果，诱导的非特异性细胞因子例如IL-6和IFN-γ的表达很低；并且显示出较强的体内抗肿瘤活性。在某一较佳实施例中，所述双特异性抗体带有人Fc片段的双特异性抗体结构，保留了Fc与FcRn的结合作用，从而具有较长的半衰期；同时优选突变的(AAA)Fc以降低与FcgR的结合，从而可降低因FcgR的交联作用而引起的非特异性T细胞活化；B7-H4端可采用串联的VHH形式，简化了轻重链的错配，同时还保留了很好的稳定性和亲水性；两价串联的VHH一方面增加了B7-H4的亲和力，另一方面增加了对高表达B7-H4的肿瘤细胞的选择性；优化了双特异性抗体中CD3端的活性，采用中等强度的抗CD3抗体，保证药效的前提下降低了毒性。
附图说明
图1的A～E为FACS检测抗人B7-H4的HCAb单抗细胞水平的结合。
图2为BLI方法测定亲和力。
图3的A～C为B7-H4×CD3双特异性抗体的结构。
图4的A～E为FACS检测B7-H4×CD3双特异性抗体在过表达人、食蟹猴和小鼠B7-H4的CHO-K1细胞株上的体外结合。
图5的A～F为FACS检测B7-H4×CD3双特异性抗体在内源表达B7-H4的肿瘤细胞以及T细胞上的体外结合。
图6的A～E为T细胞杀伤MDA-MB-468细胞的结果图。
图7的A～D为T细胞杀伤OVCAR-3细胞的结果图。
图8的A～C为T细胞杀伤DLD-1、MDA-MB-231细胞的结果图。
图9的A和B为诱导非特异性细胞因子IL-6的结果图。
图10的A和B为诱导非特异性细胞因子TNF-α的结果图。
图11的A和B为诱导非特异性细胞因子IFN-γ的结果图。
图12的A～C为小鼠肿瘤模型的体内药效实验。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1.抗B7-H4 HCAB抗体分子的获得
可以利用B7-H4抗原对实验动物进行免疫以获得针对B7-H4特异性结合的抗体分子，该实验动物可以是小鼠、大鼠、兔、羊、骆驼等。通常，其得到的抗体分子是非人源的。在获得非人源抗体后，需要对这些分子利用抗体工程技术进行人源化改造，以降低免疫原性并提高成药性。然而，抗体的人源化过程有其技术复杂性，经过人源化改造的分子往往会降低对抗原的亲和力。另一方面，转基因技术的进步 使得可以培育出基因工程化小鼠，其携带人免疫球蛋白免疫库并使其内源的鼠的免疫库缺失。这种转基因小鼠产生的抗体具有全人源的序列，因而无需再进一步做人源化改造，大大提高了治疗性抗体开发的效率。HarbourHCAb小鼠(HarbourAntibodies BV，WO 2002/085945A3)是一种携带人免疫球蛋白免疫库的转基因小鼠，能够产生全新的仅“重链”抗体，该抗体的大小只有传统IgG抗体的一半。其产生的抗体仅具有人的抗体“重链”可变结构域和小鼠Fc恒定结构域。由于不含轻链的这一特点，该抗体几乎解决了轻链错配和异源二聚化的问题，使得这一技术平台能够开发出传统抗体平台难以实现的产品。
1.1小鼠免疫
用过表达人B7-H4的HEK293T细胞(HEK293T/hu B7-H4，康源博创)免疫HCAB小鼠，每只小鼠每次免疫5×10 6细胞，通过腹腔注射。在每一轮免疫中，每只小鼠接受的总注射剂量是100微升。每轮增强免疫的间隔时间至少为两周，通常为6到7轮增强免疫。免疫时间为第0、14、28、42、56、70、84、96天；并且在第49、77天，检测小鼠血清抗体滴度。在进行HCAB小鼠脾B细胞分离前5天进行最后一次增强免疫。
1.2血清滴度检测
在特定的时间点，收取小鼠血清，用ELISA方法检测血清中抗体结合B7-H4蛋白的滴度以及用FACS方法检测血清中抗体结合过表达B7-H4的细胞的滴度。
在ELISA方法中，用1μg/mL的hB7-H4-ECD-his蛋白(Sino Biological，#10738-H08H)100μL/孔包被ELISA板(corning,9018)，4℃孵育过夜；漂洗2次后，用含1％BSA的PBST在37℃阻断2小时；加入100μL/孔梯度稀释的血清37℃孵育1小时；漂洗3次后，加入100μL/孔1:5000稀释的anti-mouse-HRP(Bethyl,Cat#A90-231P)，37℃孵育30分钟。漂洗3次后，加入100μL/孔TMB底物孵育约10分钟，加入50μL/孔1N HCl终止显色，读450nm的吸光度(Molecular Devices,Plus 384)。
在FACS方法中，梯度稀释的鼠血清与HEK293T/hu B7-H4细胞4℃孵育1小时；细胞洗2次后，加入二抗Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(Jackson,Cat#115-605- 062)4℃孵育1小时，洗2次后，重悬细胞用流式细胞仪检测(ACEA Novocyte3000)。HEK293T细胞作为本底对照。
1.3噬菌体展示技术获得HCAb单克隆和抗体序列
a.噬菌体文库构建
从实施例1.1免疫后的小鼠中收集脾细胞，并从中分离出脾脏B细胞，然后用TRIZOl提取RNA后，参照产品说明书(Thermofisher,Cat.No.15596018)，进行RT-PCR参照产品说明书(Thermofisher,Cat.No.11756500)。以cDNA为模板，通过PCR扩增出VHH片段。
PCR扩增体系如下表所示：
总RNA-cDNA 1μl/1μl H 2O作为阴性对照
5xQ5反应缓冲液 10μl
2.5mM dNTP 4μl
正向引物(10μM) 2μl
反向引物(10μM) 2μl
Q5DNA聚合酶 0.5μl
ddH 2O 30.5μl
总体积 50μl
PCR扩增程序如下表所示：
将所得的连接产物转化至SS320(Lucigen,Cat.No.60512-1)；然后制备噬菌体文库。进行三轮生物淘选(步骤如下所述)并用生物素化的B7-H4通过FACS进行筛选，将所有筛选出的候选物(hit)送去测序(步骤如下所述)并生产出特定的克隆。
b.生物淘选(Bio-Panning)
噬菌体文库(1E13噬菌体颗粒)用链霉亲和素(SA)包被的珠子(Thermofisher,Cat.No.11206)去除非特异性结合的分子，然后在室温下与SA-Bio-B7-H4珠(参照产品说明书)孵育1小时；然后用1×PBST洗涤10次。洗涤后，用pH3.0柠檬酸缓冲液加入磁珠噬菌体混合物室温孵育10分钟，再加入pH9.0Tris-HCl中和缓冲液，然后在37℃感染SS320细胞，感染时间为45分钟。然后在上述感染的细胞中加入50μl2E12/ml的M13K07辅助噬菌体(NEB,Cat.No.N0315S)，最后加入新鲜2×YT(含有100μg/ml Amp，50μg/ml Kan，1mM IPTG)，在30℃孵育过夜。将过夜培养物离心，收集上清，加入20％PEG6000/2.5M NaCl到上清液(1:5，体积比)中，然后在4℃，8000rpm离心20min。将离心后所得的噬菌体沉淀重悬于1ml 1×PBS中。将所得上清液(噬菌体颗粒)转移到新管中，并准备进行第2轮淘选。第2轮淘选和第3轮淘选的过程与前述步骤相同。
c.初步筛选
将菌落挑选到含有YT/Amp培养基(Sangon Biotech,Cat.No.A507016-0250)的96孔板中，并在37℃下生长3小时。加入IPTG至终浓度为1mM，并在30℃下诱导过夜。然后将上清液离心沉淀后取上清液进行FACS试验。对人和猴B7-H4结合较好的克隆被挑选出来进行测序。
1.4抗B7-H4 H2L2抗体分子的获得
利用B7-H4重组蛋白或过表达B7-H4的细胞对实验动物进行免疫以获得针对B7-H4特异性结合的抗体分子，该实验动物可以是小鼠、大鼠、兔、羊、骆驼等。通常，其得到的抗体分子是非人源的。在获得非人源抗体后，需要对这些分子利用抗体工程技术进行人源化改造，以降低免疫原性并提高成药性。然而，抗体的人源化过程有其技术复杂性，经过人源化改造的分子往往会降低对抗原的亲和力。另一方面，转基因技术的进步使得可以培育出基因工程化小鼠，其携带人免疫球蛋白免疫库并使其内源的鼠的免疫库缺失。Harbour H2L2小鼠(Harbour Antibodies BV)是一种携带人免疫球蛋白免疫库的转基因小鼠，这种转基因小鼠产生的抗体具有全人源的序列，因而无需再进一步做人源化改造，大大提高了治疗性抗体开发的效率。
接着，通过B细胞体外克隆技术筛选抗B7-H4的抗体，具体如下：
将小鼠的脾脏取出，研磨后用200目滤网进行过滤，单细胞悬液按照小鼠记忆性B细胞分选试剂盒(Miltenyi,#130-095-838)进行分选。分选得到的细胞进行免疫荧光染色。
在流式细胞分选仪S3e上对B200阳性(BioLegend,#103227)、IgM阴性(BioLegend,#406506)、B7-H4特异性阳性细胞(BioLegend,#405207)进行分选。分选获得的细胞按照每孔5个细胞的密度培养在细胞培养96孔板上，细胞培养板上预先铺好辐照过的EL4细胞作为饲养层细胞。
培养14天后收取培养上清进行ELISA检测，对于B7-H4蛋白有结合活性的孔，将细胞取出进行RT-PCR(SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing(#634892),I-5 TM 2×High-Fidelity Master Mix(#I5HM-5000)。扩增获得的轻、重链通过overlap PCR拼接成scFv，在E.coli中进行表达，表达上清进行ELISA检测，将阳性的克隆进行测序。
1.5抗B7-H4抗体的序列分析和序列优化
筛选获得的阳性克隆按照实施例1.6所述方法制备重组抗体PR006004和PR006008。在本实施例中，从免疫的HarbourHCAb小鼠得到的抗B7-H4单克隆抗体分子可变结构域的序列是人源抗体序列。表1-1列出其胚系基因分析和翻译后修饰位点(PTM)分析。
PR006004和PR006008在CDR2中含有一个可能的天门冬氨酸异构化位点(DG)，为了降低此潜在的翻译后修饰位点(PTM)的风险，将其DG突变为DS，分别得到新分子PR007440和PR007441(表1-2)。
进一步地，为了降低PR006004的等电点，根据抗体序列分析，选择CDR区域的碱性氨基酸进行随机突变。然后，使用FACS结合实验进行筛选；筛选出的候选分子再表达纯化及鉴定。表1-2列出了对抗体PR006004的序列进行氨基酸突变得到的新的抗体分子序列。
表1-1初始抗体
克隆号 VH胚系V基因 VH PTM 重组抗体 重组抗体亚型
R7004M1A2 VH3-74*01 DG(HCDR2) PR006004 IgG1
R7004M6D4 VH3-74*01 DG(HCDR2) PR006008 IgG1
表1-2PTM和电荷突变
初始抗体 变体 可变区突变 重组抗体亚型
PR006004 PR007440 G55S IgG1
PR006008 PR007441 G55S IgG1
PR006004 PR007195 V46E,G55S,R56D,A61E IgG1
PR006004 PR007196 V46E,G55S,R56E IgG1
PR006004 PR007200 V46E,G55S,R56S IgG1
PR006004 PR007201 V46E,G55S,R56S,A61E IgG1
PR006004 PR007202 V46E,G55S,R56T IgG1
PR006004 PR007203 V46E,G55S,R56T,A61E IgG1
1.6制备抗B7-H4全人重组抗体
将编码抗体重链的质粒转染哺乳动物宿主细胞(如人胚肾细胞HEK293)，利用常规的重组蛋白表达和纯化技术，可以得到纯化的抗B7-H4重组重链抗体。具体说来，将HEK293细胞在FreeStyle TM F17 Expression Medium培养基(Thermo,A1383504)扩培。瞬时转染开始之前，调节细胞浓度至6×10E+05细胞/ml，于37℃8％CO 2摇床中培养24小时，细胞浓度在1.2×10E+06细胞/ml。准备30ml培养的细胞，将上述编码重链的质粒30μg质粒溶解于1.5ml Opti-MEM减血清培养基(Thermo,31985088)，再取1.5ml Opti-MEM溶入1mg/ml PEI(Polysciences,Inc,Cat#23966-2)120μl，静置5分钟。把PEI缓慢加入质粒中，室温孵育10分钟，边摇晃培养瓶边缓慢滴入质粒PEI混合溶液，于37℃8％CO 2摇床中培养5天。5天后观测细胞活率。收集培养物，以3300G转速离心10分钟后取上清；然后将上清高速离心去除杂质。用PBS(pH7.4)平衡含有MabSelect TM(GE Healthcare Life Science,Cat#71-5020-91 AE)的重力柱(Bio-Rad,#7311550)，2-5倍柱体积冲洗。将上清样品过柱。用5-10倍柱体积的PBS冲洗柱子。再用pH3.5的0.1M甘氨酸洗脱目的蛋白，后用pH 8.0的Tris-HCl调节至中性，最后用超滤管(Millipore,UFC901024)浓缩换液至PBS缓冲液，得到纯化的抗B7-H4重链抗体溶液。
1.7利用SEC-HPLC分析蛋白纯度和聚体
本实施例使用分析型分子尺寸排阻层析色谱法(SEC)来分析蛋白样品的纯度和聚体形式。将分析型色谱柱TSKgel G3000SWxl(Tosoh Bioscience,#08541,5μm,7.8mm×30cm)连接到高压液相色谱仪HPLC(Agilent Technologies,Agilent 1260 Infinity II)，用PBS缓冲液室温下平衡至少1小时。适量蛋白样品(至少10μg)用0.22μm滤膜过滤后注射入系统，并设定HPLC程序：用PBS缓冲液将样品以1.0ml/分钟的流速流过色谱柱，最长时间为25分钟。HPLC将生成分析报告，报告出样品内不同分子尺寸组份的滞留时间。
1.8利用HPLC-HIC分析蛋白纯度和疏水性
使用分析型疏水相互作用层析色谱法(HIC)来分析蛋白样品的纯度和疏水性。将分析型色谱柱TSKge1 Buty1-NPR(Tosoh Bioscience,14947,4.6mm×3.5cm)连接到高压液相色谱仪(HPLC)(型号：Agilent Technologies,Agilent 1260 Infinity II)，用PBS缓冲液室温下平衡至少1小时。设定方法由16分钟内从100％流动相A(20mM组氨酸，1.8M硫酸铵，pH 6.0)至100％流动相B(20mM组氨酸，pH 6.0)的线性梯度，流速设定为0.7ml/min，蛋白样品浓度1mg/ml，进样体积20μl，检测波长280nm。采集后用ChemStation软件对色谱图进行积分并计算相关数据，生成分析报告，报告出样品内不同分子尺寸组份的滞留时间。
1.9利用DSF或UNcle测定蛋白分子的热稳定性
差示扫描荧光法(Differential Scanning Fluorimetry,DSF)是一种常用的高通量的测定蛋白质热稳定性的方法。它使用实时荧光定量PCR仪器通过监测与去折叠的蛋白分子结合的染料的荧光强度的变化，来反映蛋白质的变性的过程，从而反映出蛋白分子的热稳定性。本实施例利用DSF方法来测定蛋白分子热变性温度(Tm)。10μg蛋白加入96-孔PCR板(Thermo,#AB-0700/W)，接着加入2μl 100×稀释的染料SYPROTM(Invitrogen,#2008138)，然后加入缓冲液使得终体积为40μl每孔。将PCR板密封，放置于实时荧光定量PCR仪器(Bio-Rad CFX96 PCR System)， 先于25℃孵育5分钟，然后以0.2℃/0.2分钟的梯度逐渐从25℃升温至95℃，在测试结束时将温度降至25℃。使用FRET扫描模式并使用Bio-Rad CFX Maestro软件进行数据分析并计算出样品的Tm。
Uncle(Unchained Labs)是一个多功能一站式的蛋白稳定性分析平台，它通过全荧光，静态光散射(SLS)和动态光散(DLS)检测方法来表征蛋白质的稳定性。同一组样品可同时得到熔解温度(Tm)，聚集温度(Tagg)和粒径(diameter)等参数。在本实施例中，选择Uncle的“Tm&Tagg with optional DLS”应用程序进行操作，取9μL样品加入Uni管中，设置以0.3℃/分钟的梯度逐渐从25℃升温至95℃。进行初始和最终DLS测量四次采集，每次采集5秒。实验运行结束后，Uncle分析软件采用重心均值(BCM)公式来计算每个样品的Tm值。
所得抗体的表达信息和理化性质如表1-3所示。
表1-3抗体的表达和理化性质
1.10抗B7-H4抗体序列与编号
在本发明中，所列CDR的氨基酸序列均是按照Chothia定义规则所示出的。但是，本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则(参见，Kabat等人，免疫学的蛋白质序列，第五版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))和基于结构环区域位置的Chothia定义规则(参见JMol Biol 273:927-48,1997)。在本发明的技术方案中，还可以使用包含了Kabat定义和Chothia定义的Combined定义规则来确定可变结构域序列中的氨基酸残基。其中Combined定义规则即是将Kabat定义和Chothia定义的范围相结合，基于此取了一个更大的范围，详见表4。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”应了解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。虽然本发明中请求保护的范围是基于Chothia定义规则所示出的序列，但是根据其他CDR的定义规则所对应的氨基酸序列也应当落在本发明的保护范围中。
表1-4本申请抗体CDR定义方法
Kabat Chothia Combined
HCDR1 H31--H35 H26--H32 H26-H35
HCDR2 H50--H65 H52--H56 H50-H65
HCDR3 H95--H102 H95--H102 H95-H102
其中，Haa-Hbb可以指从抗体重链的N端开始，第aa位(Chothia编码规则)至第bb位(Chothia编码规则)的氨基酸序列。例如，H26-H35可以指从抗体重链N端开始，按照Chothia编码规则的从第26位至第35位的氨基酸序列。本领域技术人员应当知晓的是，在用Chothia编码CDR时，有些位置会有插入位点的情况(可参见http://bioinf.org.uk/abs/)。
表1-5、表1-6、表1-7和表1-8列出了本发明的抗B7-H4抗体的序列所对应的序列编号。
表1-5
表1-6
表1-7
表1-8抗B7-H4抗体PR003366的序列所对应的序列及序列编号
实施例2.FACS检测抗人B7-H4的HCAb单抗细胞水平的结合能力
本实施例是为了研究抗人B7-H4的HCAb单抗体外结合人B7-H4的活性，采用过表达人B7-H4的CHO-K1细胞株(CHO-K1/huB7-H4，和铂医药)、HEK293细胞株(HEK293/huB7-H4，和铂医药)，过表达食蟹猴B7-H4的CHO-K1细胞株(CHO-K1/cynoB7-H4，和铂医药)，过表达小鼠B7-H4的CHO-K1细胞株(CHO-K1/mB7-H4，和铂医药)以及内源性高表达B7-H4的MDA-MB-468乳腺癌细胞进行细胞水平上的抗体结合实验。简言之，消化细胞，并用含2％FBS的PBS重悬，将细胞密度分别调整为1×10 6细胞/mL。以100μL细胞/孔接种于96孔V底板(Corning,Cat#:3894)，随后加入100μL/孔，2倍于终浓度的3倍浓度梯度稀释的 待测抗体。将细胞放置于4℃，避光孵育2小时。之后，加入100μL/孔预冷PBS漂洗细胞两次，于500g、4℃下离心5分钟，弃上清。再加入100μL/孔荧光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,FcγFragment Specific,Jackson,Cat#:109-545-06,1:500稀释)，4℃，避光孵育60分钟。用100μL/孔预冷PBS洗涤细胞两次，于500g、4℃下离心5分钟，弃上清。最后，200μL/孔预冷PBS重悬细胞，使用ACEA Novocyte3000读取荧光发光信号值。
抗体结合细胞表面的人B7-H4的结果见表2-1，2-2，2-3，图1的A～E。结果显示，PR006004与PR006008对人、食蟹猴B7-H4和肿瘤细胞MDA-MB-468都有较好的结合，其中PR006008有更强的细胞结合，且同小鼠B7-H4有交叉反应。PR006004的降等电点突变抗体对人B7-H4的结合相较PR006004本身有轻微的降低，其中PR007196的结合能力最弱。PR006004与PR006008的翻译后修饰位点(PTM)突变体PR007440与PR007441的结合活性与母本相比没有明显变化。
表2-1
表2-2
表2-3
实施例3.用BLI方法测定亲和力
将10×动力学缓冲液(ForteBio，#18-1105)稀释至1×，用于亲和力测试以及抗原、抗体的稀释。通过生物膜干涉(BLI)技术，使用Octet Red 96e(Fortebio)分子相互作用分析仪来进行抗原抗体之间的结合动力学分析。
测定抗原和抗体的亲和力时，传感器转动速度为1000转/分钟。先将置于一列的AHC传感器(Fortebio，#18-5060)在测试缓冲液中平衡10分钟，然后用AHC传感器捕获B7-H4抗体，捕获高度0.7nm；AHC传感器在缓冲液中平衡120s后与2倍梯度稀释的人或猴B7-H4(浓度为100-3.75nM以及0nM)结合180s，解离300s。最后将AHC传感器浸入10mM甘氨酸-盐酸pH 1.5溶液进行再生，以洗脱结合在传感器上的蛋白。
使用Octet Data Analysis软件(Fortebio，版本11.0)进行数据分析时，以0nM为参照孔，扣除参照信号(reference subtraction)，选择“1:1 Global fitting”方法进行数据拟合，计算出抗原与抗原结合蛋白结合的动力学参数，得到k on(1/Ms)值、k dis(1/s)值和K D(M)值(见表3，图2)，结果显示，PR006004和PR006008在蛋白水平的亲和力均较佳，其中PR006004在蛋白水平的亲和力比PR006008略高。抗体经过氨基酸突变增加TM值以后，PR007077、PR007078与其相对应的母本PR006391，PR006407在B7-H4亲和力方面没有明显改变。
表3
实施例4.B7-H4×CD3双特异性抗体的结构和设计
B7-H4×CD3双特异性抗体可以同时结合两个靶点，其中一端可以识别肿瘤细胞表面特异表达的B7-H4，而另一端可以结合T细胞上的CD3分子。当B7-H4×CD3双抗分子结合到肿瘤细胞表面后，可以招募并激活肿瘤细胞附近的T细胞，从而杀死肿瘤细胞。
本实施例利用实施例1所得到的抗B7-H4抗体和抗CD3抗体PR003886(来源于专利申请WO2021/063330，序列列于表4-1)来制备B7-H4×CD3双特异抗体。所述双特异抗体具有如图3的A～C所示的结构。所述结构包含三个多肽链：多肽链1或第一多肽链，从氨基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽链-2或第二多肽链，从氨基末端到羧基末端，VH_A-CH1-h-CH2-CH3；多肽链-3或第三多肽链，从氨基末端到羧基末端，其包含VH_B-L-VH_B-h-CH2-CH3或VH_B-h-CH2-CH3。其中，VH_A和VL_A分别为抗体A的重链可变区和轻链可变区，VH_B为重链抗体B的重链可变区；CL是轻链恒定区结构域；CH1、CH2和CH3分别是重链恒定区的第一、第二和第三结构域；L是连接肽，h是IgG抗体的铰链区或衍生序列。
表4-2中的B7-H4×CD3双抗分子RP007354、PR007355有相同的分子结构，多肽链1和多肽链-2的组成靶向CD3的Fab部分，多肽链-3包含一个靶向B7-H4的VH部分(VH_B)。
表4-2中的其它B7-H4×CD3双抗分子(PR006391、PR006407、PR006840、PR007077、PR007078、PR007168)都有相同的分子结构，多肽链1和多肽链-2的组成靶向CD3的Fab部分，多肽链-3包含两个靶向B7-H4的VH部分(VH_B)。其中，两个VH_B的序列可以相同或者不同，且两个VH_B之间通过连接肽GS_15(SEQ ID NO:66)联结。此外，PR005885为“1+1”Fab-Fc-scFv非对称结构分子，结构涉及三条蛋白链，其分别包含相应抗B7-H4抗体的scFv多肽链，以及上述抗CD3抗体的重链及轻链。
为了防止由Fcγ受体结合引起的交联和降低效应子功能，在多肽链-2和多肽链-3的重链恒定区引入“AA”双突变(L234A和L235A)或者“AAA”三突变体(L234A，L235A和G237A)。而且，为了减少同源重链二聚体的产生，在两条重链的恒定区分别引入了不同的氨基酸突变，使其携带“knob-hole”突变和改造的二硫键。靶向CD3的多肽链-2引入突变T366W和S354C；同时，靶向B7-H4的多肽链-3引入突变T366S、L368A、Y407V和Y349C。多肽链-2的Fc恒定区序列如SEQ ID NO:68所示序列，多肽链-3的Fc恒定区序列如SEQ ID NO:67所示序列。进一步地，为了提高抗体分子的热稳定性，根据专利WO2012100343A1在抗B7-H4的VH结构域中引入一个额外的二硫键；具体的说，将抗B7-H4的VH结构域中Kabat编号为49和69位的两个氨基酸变为Cys，使它们形成二硫键；即，各自引入突变S49C和I70C。表4-2列出了本发明的B7-H4×CD3双抗分子及其CD3端的亲本单抗和B7-H4端的亲本单抗；表4-3列出了本发明的B7-H4×CD3双特异抗体的多肽链序列所对应的序列编号。
利用实施例1.5所述方法，将编码三条多肽链的表达载体共转染至哺乳动物宿主细胞进行重组表达，并得到纯化的抗体蛋白分子。
其稳定性Tm，溶解性HIC，一步纯化后副产物分析等数据如表1-3所示。
表4-1列出了本发明使用的抗CD3抗体PR003886的序列所对应的序列编号
表4-2列出了本发明的B7-H4×CD3双抗分子及其亲本单抗
双抗分子 CD3抗体 B7-H4抗体
PR007354 PR003886 一价PR007440
PR007355 PR003886 一价PR007441
PR006391 PR003886 二价PR007440
PR006407 PR003886 二价PR007441
PR006840 PR003886 PR007440和PR007441
PR007077 PR003886 二价PR007440,增加(S49C,I70C)
PR007078 PR003886 二价PR007441,增加(S49C,I70C)
PR007168 PR003886 PR007440和PR007441,各增加(S49C,I70C)
PR005885 PR003886 PR003366
表4-3列出了本发明的B7-H4×CD3双特异抗体的多肽链序列所对应的序列编号
实施例5.FACS检测B7-H4×CD3双特异性抗体在过表达人、食蟹猴和小鼠B7-H4的CHO-K1细胞株的体外结合
本实施例是为了研究B7-H4的CD3双特异性抗体体外结合人、食蟹猴和小鼠B7-H4的活性。采用过表达人B7-H4的CHO-K1细胞株(CHO-K1/huB7-H4，和铂医药)、过表达食蟹猴B7-H4的CHO-K1细胞株(CHO-K1/cynoB7-H4，和铂医药)过表达小鼠B7-H4的CHO-K1细胞株(CHO-K1/mB7-H4，和铂医药)进行细胞水平上的抗体结合实验。简言之，消化细胞，并用含2％FBS的PBS重悬，将细胞密度分别调整为1×10 6细胞/mL。以100μL细胞/孔接种于96孔V底板(Corning,Cat#:3894)，随后加入100μL/孔，2倍于终浓度的3倍浓度梯度稀释的待测抗体。将细胞放置于4℃，避光孵育2小时。之后，加入100μL/孔预冷PBS漂洗细胞两次，于500g、4℃下离心5分钟，弃上清。再加入100μL/孔荧光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,FcγFragment Specific,Jackson,Cat#:109-545-06,1:500稀释)，4℃，避光孵育60分钟。用100μL/孔预冷PBS洗涤细胞两次，于500g、4℃下离心5分钟，弃上清。最后，200μL/孔预冷PBS重悬细胞，使用ACEA Novocyte3000读取荧光发光信号值。
抗体结合细胞表面的人B7-H4、食蟹猴B7-H4和小鼠B7-H4的汇总见表5，图4的A～E。结果显示，双抗分子PR006391、PR006407和PR005885与人、食蟹猴B7-H4的结合均较佳；其中，双抗分子PR006407与人、食蟹猴B7-H4的结合与PR006391相比有更强的结合，这一结合趋势与其母本B7-H4分子PR006008、PR006004的结合能力一致，而PR005885有更高的最大MFI值。PR006407与小鼠B7-H4有交叉反应，PR006391与小鼠B7-H4没有结合，PR005885与小鼠B7-H4有 较弱的交叉反应。其它抗体PR007354、PR007355、PR007077、PR007078、PR007168的结合趋势也与其母本B7-H4分子PR006008、PR006004的结合能力一致。其中PR007355和PR007078与小鼠B7-H4有交叉反应。
表5
实施例6.FACS检测B7-H4×CD3双特异性抗体在内源表达B7-H4的肿瘤细胞以及T细胞上的体外结合
采用内源表达B7-H4的肿瘤细胞或表达CD3的原代T细胞进行细胞水平上的抗体结合实验。用含2％BSA的PBS重悬MDA-MB-468细胞或人T细胞。将细胞密度分别调整为1×10 6细胞/mL。以100μL细胞/孔接种于96孔V底板(Corning,#3894)，随后加入100μL/孔，2倍于终浓度的3倍浓度梯度稀释的待测抗体。将细胞放置于4℃，避光孵育2小时。之后，加入100μL/孔预冷含2％BSA的PBS漂洗细胞两次，于500g、4℃下离心5分钟，弃上清。再加入100μL/孔荧光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG,FcγFragment Specific,Jackson,#109-545-098,1：500稀释)，4℃，避光孵育1小时。用100μL/孔预冷含2％BSA的PBS洗涤细胞两次，于500g、4℃下离心5分钟，弃上清。最后，200μL/孔预冷含2％BSA的PBS重悬细胞，使用ACEA Novocyte3000流式细胞仪读取荧光发光信号值。
结果见表6-1、6-2、6-3、图5的A～F。结果显示，这些双抗分子均表现出与MDA-MB-468较佳的结合能力，其中双抗分子PR006407与MDA-MB-468的结合比PR006391更强，结果与CHO-K1/hu B7-H4的结合趋势一致；而PR006840有更高的最大MFI。抗体经过氨基酸突变增加Tm值以后，PR007077、PR007078、PR007168与其母本PR006391、PR006407、PR006840相比，与MDA-MB-468的结合能力保持一致。一价B7-H4的双抗分子RP007354、PR007355与二价B7-H4的双抗分子PR007077、PR007078在结合上没有明显差异。PR005885与MDA-MB-468的结合曲线与PR006391相似。由于抗CD3端采用了亲和力较弱的抗CD3，这些抗体与T细胞的结合都比较弱，其中PR007354与其它抗体相比与T细胞的结合有所增强。
表6-1
表6-2
表6-3
实施例7.T细胞杀伤实验
本实验采用人原代T细胞作为效应细胞，高表达B7-H4的细胞MDA-MB-468，B7-H4低表达的细胞OVCAR-3，B7-H4极低表达的细胞DLD-1或完全阴性的细胞MDA-MB-231作为靶细胞。使用ACEA公司的RTCA仪器检测靶细胞的电导率反映杀伤效率。96孔板e-plate先用50μl完全培养基平衡。消化靶细胞，重悬于含10％胎牛血清的RPM1640完全培养基中，稀释至4×10 5/mL，铺板50μl/孔于e-plate 96板中，即2×10 4/孔、37℃培养过夜。次日使用美天妮T细胞分离试剂盒(Miltenyi，#130-096-535)按说明书的方法分离原代T细胞。每孔加入新鲜50μl含2×10 5T细胞的培液，随后加入50μl 4×的浓度梯度稀释的抗体，抗体最高终浓度为10nM，每个抗体共8个浓度，设置两个重复。实时检测靶细胞的电导率，一般情况取24小时时间点的数据计算靶细胞杀伤效率＝(1-样品/空白对照)×100％。24小时收上清，ELISA方法检测IFN-γ的浓度。ELISA检测方法参照IFN gamma Human Uncoated ELISA Kit(Thermo，#88-7316-77)试剂盒操作说明。
结果见图6的A～E、图7的A～D和图8的A～C。结果显示，所有的双抗分子均对表达B7-H4的肿瘤细胞有明显的杀伤作用。其中，同样的B7-H4二价的双抗分子PR007077、PR007078或比一价的双抗分子PR007354、PR007355有显著增强的杀伤效果。双抗分子PR006407与PR006391相比，在高表达B7-H4的MDA-MB-468细胞或中表达B7-H4的OVCAR-3细胞上具有较高的杀伤效果，较低的细胞因子IFN-gamma表达；在不表达B7-H4的MDA-MB-231细胞上没有杀伤效果。与之类似，经过氨基酸突变增加TM值以后的双抗分子PR007078比PR007077在MDA-MB-468和OVCAR-3细胞上具有较高的杀伤效果，较低的细胞因子IFN-gamma表达；在极低表达B7-H4的DLD-1细胞上没有杀伤。PR006840双抗同时具有较强的杀伤效果和细胞因子分泌。
实施例8.诱导非特异性细胞因子实验
本实验检测双抗分子在没有靶细胞存在下诱导PBMC产生非特异性细胞因子的情况，以此可以初步判断药物的安全性。人PBMC重悬于含10％胎牛血清的 RPM1640完全培养基中，稀释至2×10 6/mL，铺板100μl/孔于96孔板(Corning，3599)中，即2×10 5/孔，加入100ul 2×抗体，37℃培养过夜。24小时收上清，ELISA方法检测IL-6，TNF-α，IFN-γ的浓度。ELISA检测方法参照TNF-αhuman Uncoated ELISA Kit(Thermo，#88-7346-88)试剂盒、IL-6 human Uncoated ELISA Kit(Thermo，#88-7066-88)试剂盒、IFN gamma Human Uncoated ELISA Kit(Thermo，#88-7316-77)试剂盒操作说明。
结果见图9的A和B、图10的A和B，以及图11的A和B。结果显示，双抗分子PR007077、PR007078、PR007168诱导的IL-6和IFN-γ表达很低，但有一定的TNF-α的表达。不同的供体反应性差异较大。PR005885与其它分子相比具有最低的细胞因子表达，提示可能具有较低细胞因子风暴的风险。
实施例9.NCG小鼠重建人PBMC免疫系统的肿瘤模型的体内药效实验
在OVCAR-3模型中，细胞接种当天每只NCG小鼠皮下接种5×10 6OVCAR3肿瘤细胞，细胞重悬在PBS与Matrigel(1:1)混合液中(0.1mL/只)，皮下接种。当小鼠平均瘤体积在110mm 3进行分组，18只小鼠被分为3组，每只小鼠静脉接种5×10 6人的PBMC，细胞重悬在200μl PBS中。次日开始给药，给药周期为一周一次，共进行了3次给药，静脉给药。开始给药后，每周称量体重及瘤体积两次，瘤体积计算方式为：肿瘤体积(mm 3)＝0.5×肿瘤长径×肿瘤短径 2。给药后第23天结束实验观察，随后所有小鼠进行安乐处理。
结果见图12A。溶媒对照组小鼠在给药后第23天平均肿瘤体积为1612mm 3。测试药PR006391(0.2mg/kg)治疗组在给药后第23天平均肿瘤体积为1054mm 3，相较溶媒对照组差异显著(p值为0.04)，肿瘤抑制率TGI(％)为34.6％。测试药PR006407(0.2mg/kg)治疗组在给药后第23天平均肿瘤体积为770mm 3，相较溶媒对照组有显著性差异(p值为0.001)，肿瘤抑制率TGI(％)为52.2％。测试药PR005885(0.2mg/kg)治疗组在给药后第23天平均肿瘤体积为681mm 3，相较溶媒对照组差异显著(p值为0.001)，肿瘤抑制率TGI(％)为57.77％。
在MDA-MB-468模型中，细胞接种当天每只NCG小鼠皮下接种5×10 6MDA-MB-468肿瘤细胞，细胞重悬在PBS与Matrigel(1:1)混合液中(0.1mL/只)，皮下接种。当小鼠平均瘤体积在150mm 3进行分组，42只小鼠被分为7组，每只小鼠静脉接种5×10 6人的PBMC，细胞重悬在200μl PBS中。次日开始给药，给药周期为一周一次，共进行了4次给药，静脉给药。开始给药后，每周称量体重及瘤体积两次，瘤体积计算方式为：肿瘤体积(mm 3)＝0.5×肿瘤长径×肿瘤短径 2。给药后第23天结束实验观察，随后所有小鼠进行安乐处理。
结果见图12B。溶媒对照组小鼠在给药后第23天平均肿瘤体积为893mm 3。测试药PR007077(0.1mg/kg)治疗组在给药后第23天平均肿瘤体积为507mm 3，相较溶媒对照组差异显著(p值为0.01)，肿瘤抑制率TGI(％)为43.16％。测试药PR007077(0.5mg/kg)治疗组在给药后第23天平均肿瘤体积为343mm 3，相较溶媒对照组有显著性差异(p值为0.0009)，肿瘤抑制率TGI(％)为61.6％。测试药PR007078(0.1mg/kg)治疗组在给药后第23天平均肿瘤体积为464mm 3，相较溶媒对照组差异显著(p值为0.0067)，肿瘤抑制率TGI(％)为47.9％。测试药PR007078(0.5mg/kg)治疗组在给药后第23天平均肿瘤体积为390mm 3，相较溶媒对照组有显著性差异(p值为0.0022)，肿瘤抑制率TGI(％)56.2％。测试药PR007168(0.1mg/kg)治疗组在给药后第23天平均肿瘤体积为446mm 3，相较溶媒对照组差异显著(p值为0.0092)，肿瘤抑制率TGI(％)为50.1％。测试药PR007168(0.5mg/kg)治疗组在给药后第23天平均肿瘤体积为275mm 3，相较溶媒对照组有显著性差异(p值为0.0009)，肿瘤抑制率TGI(％)69.2％。
在CT26-B7-H4模型中，细胞接种当天每只BALB/c-hCD3EDG knock in小鼠皮下接种5×10 5CT26-B7-H4肿瘤细胞，细胞重悬在PBS中(0.1mL/只)，皮下接种。当小鼠平均瘤体积在84mm 3进行分组，24只小鼠被分为4组，分组当天开始给药，给药周期为一周一次，共进行了3次给药，静脉给药。开始给药后，每周称量体重及瘤体积两次，瘤体积计算方式为：肿瘤体积(mm 3)＝0.5×肿瘤长径×肿瘤短径 2。给药后第20天结束实验观察，随后所有小鼠进行安乐处理。
结果见12C，溶媒对照组小鼠在给药后第20天平均肿瘤体积为2043mm 3。测试药PR007077(0.5mg/kg)治疗组在给药后第20天平均肿瘤体积为1007mm 3，相 较溶媒对照组差异显著(p值为0.024)，肿瘤抑制率TGI(％)为50.4％。测试药PR007078(0.5mg/kg)治疗组在给药后第20天平均肿瘤体积为1069mm 3，相较溶媒对照组有显著性差异(p值为0.031)，肿瘤抑制率TGI(％)为45.5％。测试药PR007168(0.5mg/kg)治疗组在给药后第20天平均肿瘤体积为1155mm 3，相较溶媒对照组有显著性差异(p值为0.05)，肿瘤抑制率TGI(％)为39.9％。
实施例10.在BALB/c nude小鼠体内的药代动力学
选取体重18～22克的雌性BALB/c nude小鼠6只，按2.5mg/kg的剂量通过尾静脉注射给与药物；一组3只于给药前以及给药后5分钟、24小时(1天)、第4天、和第10天采集全血，另一组3只于只于给药前以及给药后5小时、第2天、第7天、和第14天采集全血。将全血静置30分钟使其凝固，随后在4℃下以2,000rpm离心5分钟并将分离的血清样品在-80℃下冻存直至分析。本实施例采用ELISA方法来定量测定小鼠血清中的药物浓度。ELISA Fc端总体检测方法，通过包被于96孔板的山羊抗人Fc多克隆抗体来捕获小鼠血清中的含有人Fc的融合蛋白，然后加入HRP标记的山羊抗人Fc第二抗体来检测。ELISA B7-H4端结合检测方法，通过包被于96孔板的重组人B7-H4蛋白(Sino Biological,10738-H08H)来捕获小鼠血清中的B7-H4 x CD3双抗，然后加入HRP标记的山羊抗人Fc第二抗体来检测。
使用Phoenix WinNonlin软件8.2版，选用非房室模型(NCA)对血药浓度数据进行分析以评价其药代动力学，结果见下表7。
结果表明，在Fc端总体检测方法下，从前14天的数据计算，PR006407在小鼠体内的半衰期约为6天，PR007078在小鼠体内的半衰期约为8天。而在B7-H4端结合的检测方法下，从前14天的数据计算，PR006407在小鼠体内的半衰期约只有1天，而PR007078在小鼠体内的半衰期约为12天。说明经过经过热稳定性改造，引入二硫键的抗体可以提高抗体在小鼠体内的稳定性。
表7 PR006407以及经过热稳定性改造，引入二硫键的相应抗体PR007078的药代动力学参数

Claims (20)

  1. 一种抗B7-H4抗体，其特征在于，所述抗B7-H4抗体包含重链可变区(VH)；其中，
    所述VH包含以下的互补决定区(CDR)或其突变：如SEQ ID NO:4或5的氨基酸序列所示的CDR1，如SEQ ID NO:15的氨基酸序列所示的CDR2，和，如SEQ ID NO:24或25的氨基酸序列所示的CDR3；
    其中所述突变为在所述CDR的氨基酸序列上具有3、2或1个氨基酸的插入、缺失或替换。
  2. 如权利要求1所述的抗B7-H4抗体，其特征在于，所述CDR2上的突变为在如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列上具有G2P、S4G和S5R/D/E/T中的2或1个氨基酸替换；所述CDR2的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:11-14、SEQ ID NO:16-18任一所示。
  3. 如权利要求1或2所述的抗B7-H4抗体，其特征在于，所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、11和24所示；或
    所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5、12和25所示；或
    所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、17和24所示；或
    所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5、18和25所示；或
    所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、13和24所示；或
    所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、14和24所示；或
    所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、15和24所示；或
    所述VH包含的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、16和24所示。
  4. 如权利要求1-3任一项所述的抗B7-H4抗体，其特征在于，所述VH的框架区为人VH的框架区；
    优选地，所述人VH的框架区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的FWR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:7-9任一所示的FWR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:20-22任一所示的FWR3和氨基酸序列如SEQ ID NO:26或27所示的FWR4；
    更优选地，所述VH包括如SEQ ID NO:36-45任一所示的氨基酸序列。
  5. 如权利要求1-4任一项所述的抗B7-H4抗体，其为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv优选scFv、双特异性抗体、多特异性抗体、重链抗体或单域抗体；优选地，当所述抗B7-H4抗体为重链抗体时，所述重链抗体包括如SEQ ID NO:48-57任一所示的氨基酸序列。
  6. 一种双特异性抗体，其特征在于，其含有蛋白功能区A和蛋白功能区B；其中所述蛋白功能区B靶向B7-H4，所述蛋白功能区A靶向非B7-H4；所述的双特异性抗体选自如下a)或b)：
    a)所述蛋白功能区B选自如权利要求1-5任一项所述的抗B7-H4抗体；
    优选地，所述双特异性抗体的结构包含多肽链1、多肽链2和多肽链3，所述多肽链1如式：N’-VL_A-CL-C’所示；所述多肽链2如式：N’-VH_A-CH1-铰链区-CH2-CH3-C’所示；所述多肽链3如式：N’-VH_B1-连接子-VH_B2-铰链区-CH2-CH3-C’或如式：N’-VH_B-铰链区-CH2-CH3-C’所示；其中，所述的VL_A和VH_A分别为所述蛋白功能区A的VL和VH，所述的VH_B1和VH_B2为所述蛋白功能区B的VH，且VH_B1和VH_B2可以相同或者不同；
    b)所述蛋白功能区B包含如SEQ ID NO:72所示的HCDR1，SEQ ID NO:74所示的HCDR2，SEQ ID NO:76所示的HCDR3，SEQ ID NO:78所示的LCDR1，SEQ ID NO:80所示的LCDR2，SEQ ID NO:82所示的LCDR3；
    优选地，所述双特异性抗体的结构包含多肽链1、多肽链2和多肽链3，所述多肽链1如式：N’-VL_A-CL-C’所示；所述多肽链2如式：N’-VH_A-CH1-铰链区-CH2-CH3-C’所示；所述多肽链3如式：N’-VL_B-连接子-VH_B-铰链区-CH2-CH3-C’；其中，所述的VL_A和VH_A分别为所述蛋白功能区A的VL和VH，所述的VL_B和VH_B为所述蛋白功能区B的VL和VH。
  7. 如权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，所述蛋白功能区A为抗CD3抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH含有氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VH CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的VH CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的VH CDR3，所述VL含有氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的VL CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示的VL CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示的VL CDR3；
    优选地，所述抗CD3抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示的VH和氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的VL；
    更优选地，所述抗CD3抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示的重链和氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的轻链。
  8. 如权利要求6或7所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体包括：
    氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的多肽链3；
    或，氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示的多肽链3；
    或，氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示的多肽链3；
    或，氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的多肽链3；
    或，氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示的多肽链3；
    或，氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示的多肽链3；
    或，氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:69所示的多肽链3；
    或，氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示的多肽链3；
    或，所述的双特异性抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的多肽链1，氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的多肽链2，氨基酸序列如SEQ ID NO:86所示的多肽链3。
  9. 一种分离的核酸，其编码如权利要求1-5任一项所述的抗B7-H4抗体或如权利要求6-8任一项所述的双特异性抗体。
  10. 一种重组表达载体，其包含如权利要求9所述的分离的核酸；
    优选地，所述表达载体包含真核细胞表达载体和/或原核细胞表达载体。
  11. 一种转化体，其包含如权利要求10所述的重组表达载体；
    优选地，所述转化体的宿主细胞为原核细胞和/或真核细胞，所述原核细胞优选E.coli细胞例如TG1、BL21细胞，所述真核细胞优选HEK293细胞或CHO细胞。
  12. 一种嵌合抗原受体，其包含如权利要求1-5任一项所述的抗B7-H4抗体或如权利要求6-8任一项所述的双特异性抗体。
  13. 一种基因修饰的细胞，其特征在于，其包含如权利要求12所述的嵌合抗原受体；
    优选地，所述基因修饰的细胞为真核细胞，优选分离的人细胞；更优选免疫细胞如T细胞，或NK细胞。
  14. 一种抗B7-H4抗体或双特异性抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：培养如权利要求11所述的转化体，从培养物中获得抗B7-H4抗体或双特异性抗体。
  15. 一种抗体药物偶联物，包括抗体部分和偶联部分，所述抗体部分包含如权利要求1-5任一项所述的抗B7-H4抗体或如权利要求6-8任一项所述的双特异性抗体，所述偶联部分包括可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合，所述抗体部分和偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
  16. 一种药物组合物，其包含如权利要求1-5任一项所述的抗B7-H4抗体、如权利要求6-8任一项所述的双特异性抗体、如权利要求12所述的嵌合抗原受体、如权利要求13所述的基因修饰的细胞和/或如权利要求15所述的抗体药物偶联物；
    优选地，所述药物组合物为液体剂型、气体剂型、固体剂型和半固体剂型，和/或，所述药物组合物可通过口服给药、注射给药、经鼻给药、经皮给药或粘膜给药；
    进一步优选地，所述的药物组合物还包含组合治疗剂，所述的组合治疗剂包括化学治疗剂、放射治疗剂、免疫抑制剂和/或细胞毒性药物。
  17. 如权利要求1-5任一项所述的抗B7-H4抗体、如权利要求6-8任一项所述的双特异性抗体、如权利要求12所述的嵌合抗原受体、如权利要求13所述的基因修饰的细胞、如权利要求15所述的抗体药物偶联物和/或如权利要求16所述的药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物、试剂盒和/或给药装置中的应用；
    优选地，所述癌症选自肺癌、乳腺癌例如三阴性乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜瘤、胃癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、胆管癌、食道癌和骨肉瘤组成的组。
  18. 试剂盒，其包括如权利要求1-5任一项所述的抗体、如权利要求6-8任一项所述的双特异性抗体、如权利要求12所述的嵌合抗原受体、如权利要求13所述的基因修饰的细胞、如权利要求15所述的抗体药物偶联物和/或如权利要求16所述的药物组合物；以及任选地，说明书。
  19. 给药装置，其特征在于，所述给药装置包含：(1)用于对有需要的受试者施用权利要求16所述的药物组合物的输注模块，以及(2)任选的药效监控模块。
  20. 一种检测B7-H4的方法，其特征在于，其包括使用如权利要求1-5任一项所述的抗B7-H4抗体和/或如权利要求6-8任一项所述的双特异性抗体进行检测的步骤；优选地，所述方法为非诊断和/或治疗目的。
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GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
EP2224958A2 (en) * 2007-11-30 2010-09-08 Bristol-Myers Squibb Company Anti-b7h4 monoclonal antibody-drug conjugate and methods of use
US9371371B2 (en) 2011-01-28 2016-06-21 National Research Council Of Canada Engineering of immunoglobulin domains
US10626176B2 (en) * 2014-10-31 2020-04-21 Jounce Therapeutics, Inc. Methods of treating conditions with antibodies that bind B7-H4
CN108148137B (zh) * 2017-12-29 2021-03-23 中国人民解放军第四军医大学 一种b7h4/1e10单克隆抗体及其应用
EP4039707A4 (en) * 2019-09-30 2022-11-16 Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd Cd3-targeting antibody, bispecific antibody and use thereof
CN110981961B (zh) * 2019-11-28 2022-07-29 青岛大学 一种特异结合癌细胞蛋白b7-h4的纳米抗体h6的序列和应用
JP7620780B2 (ja) * 2020-06-30 2025-01-24 ノナ・バイオサイエンシーズ・（シャンハイ）・カンパニー・リミテッド Ｈ２Ｌ２とＨＣＡｂ構造を有する結合タンパク質
EP4155318A4 (en) * 2020-06-30 2024-06-05 Harbour Biomed US, Inc. BISPECIFIC ANTIBODY AND USE THEREOF
TWI833244B (zh) * 2021-06-18 2024-02-21 大陸商和鉑醫藥（上海）有限責任公司 一種雙抗組合及其應用

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