CN118147115B - 一种草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物与基因工程技术领域，具体涉及一种草酸青霉16的β‑葡萄糖苷酶突变体V3‑4‑H6及其应用。该草酸青霉16的β‑葡萄糖苷酶突变体V3‑4‑H6的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。该突变体V3‑4‑H6在较低温度下具有较高有机酸耐受性，在10 mg/mL甲酸处理后，依然保持有72.7%相对活性，而且在10 mg/mL甲酸处理后情况下，突变体V3‑4‑H6酶解预处理后麸皮残渣产生的葡萄糖含量达到了原始16BGL的2.01倍，体现了其具有更高的有机酸耐受性，可应用于饲料、医药、食品、化工、能源等众多领域，为相关应用领域提供了更可靠、高效的酶催化剂。
Description
技术领域
本发明属于微生物与基因工程技术领域，具体涉及一种草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6及其应用。
背景技术
β-葡萄糖苷酶是一种将β-D-葡萄糖苷中非还原末端残基的β-1,4-糖苷键水解，同时释放葡萄糖的酶。但是由于原始β-葡萄糖苷的酶学特性较差，比如催化活性较低、有机酸耐受性差以及催化温度较高，这很难应用于饲料、医药、食品、化工、能源等众多领域。
草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶对呋喃衍生物和酚类化合物具有不受抑制的活性，并且对高浓度的KCl、NaCl和乙醇具有极好的耐受性，然而，野生型16BGL活性较差，对甲酸耐受性极差，因此，提高草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶在甲酸条件下的酶活在生物能源领域具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6及其应用，具体采用以下的技术方案：
本发明的第一方面，提供了一种草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6，所述草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
SEQ ID NO：2：
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上述草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6的氨基酸序列为SEQ ID NO：2是由SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第676位组氨酸突变为丝氨酸进化而来。
SEQ ID NO：1：
KDLAYSPPFYPSPWATGEGEWAEAYKKAVDFVSGLTLAEKVNITTGAGWEQERCVGETGGVPRLGMWGMCMQDSPLGVRNADYSSAFPAGVNVAATWDRRLAYQRGTAMGEEHRDKGVDVQLGPVAGPLGKNPDGGRGWEGFSPDPVLTGVMMAETIKGIQDAGVIACAKHFIMNEQEHFRQAGEAQGYGFNISQSLSSNVDDKTMHELYLWPFVDSVRAGVGSVMCSYNQINNSYGCSNSYTLNKLLKGELGFQGFVMSDWGAHHSGVGDALAGLDMSMPGDVILGSPYSFWGTNLTVSVLNSTIPEWRLDDMAVRIMAAYYKVGRDRHRTPPNFSSWTRDKYGYEHFIVQENYVKLNERVNVQRDHANVIRKIGSDSIVMLKNNGGLPLTHQERLVAILGEDAGSNAYGANGCSDRGCDNGTLAMGWGSGTANFPYLITPEQAIQNEVLNYGNGDTNVFAVTDNGALSQMAALASTASVALVFVNADSGEGYISVDGNEGDRKNMTLWKNGEELIKTATANCNNTIVIMHTPNAVLVDSWYDNENITAILWAGMPGQESGRSLVDVLYGRTNPGGKTPFTWGKERKDWGSPLLTKPNNGHGAPQDDFTDVLIDYRRFDKDNVEPIFEFGFGLSYTKFEFSDIQVKALNHGEYNATVGKTKPAPSLGKPGNASDHLFPSNINRVRQYLYPYLNSTDLKASANDPDYGMNASAYIPPHATDSDPQDLLPASGPSGGNPGLFEDLIEVTATVTNTGSVTGDEVPQLYVSLGGADDPVKVLRAFDRVTIAPGQKLRWTATLNRRDLSNWDVPSQNWIISDAPKKVWVGNSSRKLPLSADLPKVQ。
本发明通过分子改造技术获得了上述草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6，该突变体V3-4-H6反应温度为65℃，未加酸时的比活为0.0165 IU/mg，加入10 mg/mL甲酸处理后的比活为0.012 IU/mg，尽管其催化活性仅为原始16BGL（草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶）的0.43倍，但V3-4-H6的甲酸耐受性却显著增强，达到了原始16BGL的1.64倍，10 mg/mL甲酸抑制强度K m/K I值为1.17×10-2，具体来说，突变体16BGL的K m/K I值是突变体V3-4-H6的1.9倍，体现了突变体V3-4-H6在甲酸处理中的表现更为出色，为相关应用领域提供了更可靠、高效的酶催化剂。
本发明的第二方面，提供了一种所述草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6的基因，该基因序列如SEQ ID NO：3所示。
SEQ ID NO：3：
AAGGATCTTGCCTACTCTCCCCCCTTCTATCCTTCTCCATGGGCAACCGGTGAAGGTGAATGGGCCGAGGCCTACAAGAAGGCTGTGGACTTTGTTTCTGGTCTGACTCTTGCCGAGAAGGTCAACATCACGACCGGTGCTGGATGGGAACAGGAGCGTTGTGTGGGTGAGACCGGCGGTGTCCCTCGACTTGGAATGTGGGGAATGTGCATGCAAGATTCTCCTCTCGGCGTTCGTAATGCCGACTACAGCTCTGCCTTCCCCGCCGGTGTGAATGTGGCTGCCACCTGGGACCGACGACTCGCGTACCAGCGTGGTACGGCCATGGGCGAGGAGCATCGCGACAAGGGTGTCGACGTGCAGCTTGGCCCCGTCGCTGGTCCATTGGGCAAGAACCCCGACGGTGGTCGTGGCTGGGAAGGCTTTTCTCCCGATCCGGTTCTGACCGGTGTTATGATGGCCGAGACAATCAAGGGTATCCAAGATGCTGGTGTCATTGCTTGCGCCAAGCACTTCATCATGAATGAGCAGGAGCACTTCCGCCAGGCGGGTGAAGCCCAGGGATACGGATTCAATATTTCTCAGAGTTTGAGCTCCAACGTCGATGACAAGACCATGCACGAGCTGTACTTGTGGCCGTTTGTCGATTCGGTTCGGGCCGGTGTGGGTTCCGTCATGTGCTCTTACAACCAGATCAACAACAGCTACGGGTGCTCCAACAGCTACACGCTCAACAAATTGCTCAAGGGCGAGCTCGGCTTTCAGGGCTTCGTCATGAGCGACTGGGGTGCGCACCACAGCGGTGTCGGTGACGCCCTTGCCGGTCTCGACATGTCTATGCCCGGTGATGTGATTCTTGGTAGCCCCTACTCCTTCTGGGGAACTAACTTGACCGTCTCTGTGCTGAACAGCACCATCCCCGAATGGCGTCTGGATGACATGGCCGTTCGTATCATGGCTGCCTACTACAAGGTCGGCAGAGATCGTCATCGCACTCCTCCCAACTTCAGCTCCTGGACCCGCGATAAGTACGGCTACGAGCACTTTATTGTCCAGGAGAACTATGTCAAGCTCAACGAGCGTGTCAATGTTCAACGTGATCATGCCAACGTCATCCGCAAGATTGGCTCCGACAGTATCGTGATGCTCAAGAACAACGGGGGTCTGCCTTTGACTCATCAAGAGCGTCTGGTGGCTATCTTGGGCGAGGATGCTGGTTCCAACGCCTACGGCGCCAACGGCTGCAGTGACCGAGGCTGTGACAACGGTACCTTGGCCATGGGCTGGGGCAGTGGAACGGCCAACTTCCCCTACCTGATCACTCCCGAGCAAGCCATTCAGAATGAGGTTCTCAACTACGGCAACGGTGACACCAACGTCTTTGCTGTCACAGACAACGGTGCCCTCAGCCAAATGGCTGCCCTTGCTTCAACCGCAAGTGTTGCATTGGTGTTCGTCAACGCTGATTCGGGCGAGGGCTACATCAGTGTGGACGGCAACGAGGGCGATCGCAAGAACATGACCCTGTGGAAGAACGGCGAGGAGCTGATCAAGACCGCCACTGCCAACTGCAACAACACCATCGTCATCATGCACACCCCCAACGCCGTCCTGGTCGATTCATGGTACGACAATGAGAACATCACTGCCATTCTGTGGGCTGGTATGCCCGGCCAAGAGAGTGGTCGTAGCTTGGTTGATGTTCTCTACGGCCGCACGAACCCTGGTGGCAAGACCCCCTTCACCTGGGGTAAGGAGCGCAAGGATTGGGGATCTCCTCTTCTGACTAAACCCAACAACGGCCACGGTGCTCCTCAGGATGACTTCACCGATGTTCTGATTGACTATCGCCGTTTCGACAAGGACAACGTGGAGCCCATCTTCGAGTTCGGCTTCGGTCTGAGCTACACCAAATTTGAGTTCTCTGACATCCAGGTCAAGGCGCTGAATCACGGCGAGTACAACGCCACCGTGGGCAAGACCAAGCCTGCCCCTTCGTTGGGCAAGCCTGGTAATGCCTCCGATAGTCTGTTCCCCAGCAACATCAACCGTGTGCGCCAGTACCTTTACCCTTACCTGAACTCGACCGATCTGAAGGCGTCTGCCAACGACCCTGACTATGGCATGAATGCATCGGCGTACATTCCTCCCCATGCCACCGACAGCGACCCACAGGACCTTCTCCCCGCCAGCGGACCTTCCGGTGGCAACCCTGGTTTGTTTGAGGATCTTATTGAGGTGACTGCTACTGTCACCAACACCGGCTCAGTTACTGGTGACGAGGTTCCCCAGCTGTATGTTTCGCTTGGCGGTGCCGATGACCCCGTTAAGGTCCTCCGTGCCTTCGACCGTGTCACGATCGCCCCTGGTCAGAAGCTCCGGTGGACAGCAACCCTCAACCGTCGTGATCTGTCCAACTGGGATGTCCCATCACAGAACTGGATCATCTCAGACGCCCCCAAGAAGGTGTGGGTGGGCAACTCGTCGCGCAAGCTGCCTCTTTCAGCCGATCTGCCCAAGGTGCAG。
本发明的第三方面，还提供了一种制备上述草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6的方法，包括以下步骤：
将草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶基因进行易错PCR，然后PCR产物与载体pYAT22利用无缝克隆试剂盒进行连接，然后通过酵母转化试剂盒转化到表达宿主酿酒酵母BY4741中，得到含有草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组菌株；最后将所述重组菌株置于培养基中进行培养，表达，筛选，最终得到草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6。
本发明的第四方面，提供了上述草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6在酶解麸皮生成葡萄糖中的应用，该草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6通过甲酸处理后将麸皮酶解得到葡萄糖。
本发明的第五方面，还提供了一种酶解麸皮生成葡萄糖的方法，包括以下步骤：
将甲酸置于草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6中，在37℃的条件下孵育，孵育结束后加入NaOH溶液将pH调至5.0，然后加入里氏木霉残渣酶液和麸皮残渣，水浴反应，得到葡萄糖。
本发明的有益效果为：
本发明通过定向进化技术进行分子改造技术获得了草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6基因，通过基因工程技术在酿酒酵母BY4741中进行了重组和表达得到草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6，该突变体V3-4-H6在较低温度下具有较高有机酸耐受性，在10 mg/mL甲酸处理后，依然保持有72.7%相对活性，而且在10 mg/mL甲酸处理后情况下，突变体V3-4-H6酶解预处理后麸皮残渣产生的葡萄糖含量达到了原始16BGL的2.01倍，体现了其具有更高的有机酸耐受性，可应用于饲料、医药、食品、化工、能源等众多领域，为相关应用领域提供了更可靠、高效的酶催化剂。
附图说明
图1所示为原始16BGL和突变体V3-4-H6在不同温度下的相对比活；
图2所示为原始16BGL和突变体V3-4-H6在未加酸的相对比活和加10 mg/mL甲酸孵育后的相对比活；
图3所示为原始16BGL和突变体V3-4-H6在未加酸与加10 mg/mL甲酸孵育后，酶解预处理后麸皮残渣的葡萄糖含量。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
制备草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6
1、获得草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶基因
以草酸青霉16为材料，对其进行接种、诱导培养、收集菌丝体；先Tarkara公司的Trizol试剂通过Trizol法提取总RNA，然后采用Tarkara公司的反转录试剂盒进行反转录获得cDNA，采用常规PCR方法，通过两个特异性引用物（其序列分别为SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5所示）以cDNA为模板扩增β-葡萄糖苷酶的基因（其序列为SEQ ID NO：8所示）。
SEQ ID NO：4：5’-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAGGATCTTGCCTACTCTCCCCCCTTCTATCC-3’。
SEQ ID NO：5：5’-CATTTAAATTAGTGATGGTGATGGTGATGCTGCACCTTGGGCAGATCGGCTGAAAGAGG-3’。
SEQ ID NO：8：
AAGGATCTTGCCTACTCTCCCCCCTTCTATCCTTCTCCATGGGCGACCGGTGAAGGTGAATGGGCCGAGGCCTACAAGAAGGCTGTGGACTTTGTTTCTGGTCTGACTCTTGCCGAGAAGGTCAACATCACGACCGGTGCTGGATGGGAACAGGAGCGTTGTGTGGGTGAGACCGGCGGTGTCCCTCGACTTGGAATGTGGGGAATGTGCATGCAAGATTCTCCTCTCGGCGTTCGTAATGCCGACTACAGCTCTGCCTTCCCCGCCGGTGTGAATGTGGCTGCCACCTGGGACCGACGACTCGCGTACCAGCGTGGTACGGCCATGGGCGAGGAGCATCGCGACAAGGGTGTCGACGTGCAGCTTGGCCCCGTCGCTGGTCCATTGGGCAAGAACCCCGACGGTGGTCGTGGCTGGGAAGGCTTTTCTCCCGATCCGGTTCTGACCGGTGTTATGATGGCCGAGACAATCAAGGGTATCCAAGATGCTGGTGTCATTGCTTGCGCCAAGCACTTCATCATGAATGAGCAGGAGCACTTCCGCCAGGCGGGTGAAGCCCAGGGATACGGATTCAATATTTCTCAGAGTTTGAGCTCCAACGTCGATGACAAGACCATGCACGAGCTGTACTTGTGGCCGTTTGTCGATTCGGTTCGGGCCGGTGTGGGTTCCGTCATGTGCTCTTACAACCAGATCAACAACAGCTACGGGTGCTCCAACAGCTACACGCTCAACAAATTGCTCAAGGGCGAGCTCGGCTTTCAGGGCTTCGTCATGAGCGACTGGGGTGCGCACCACAGCGGTGTCGGTGACGCCCTTGCCGGTCTCGACATGTCTATGCCCGGTGATGTGATTCTTGGTAGCCCCTACTCCTTCTGGGGAACTAACTTGACCGTCTCTGTGCTGAACAGCACCATCCCCGAATGGCGTCTGGATGACATGGCCGTTCGTATCATGGCTGCCTACTACAAGGTCGGCAGAGATCGTCATCGCACTCCTCCCAACTTCAGCTCCTGGACCCGCGATAAGTACGGCTACGAGCACTTTATTGTCCAGGAGAACTATGTCAAGCTCAACGAGCGTGTCAATGTTCAACGTGATCATGCCAACGTCATCCGCAAGATTGGCTCCGACAGTATCGTGATGCTCAAGAACAACGGGGGTCTGCCTTTGACTCATCAAGAGCGTCTGGTGGCTATCTTGGGCGAGGATGCTGGTTCCAACGCCTACGGCGCCAACGGCTGCAGTGACCGAGGCTGTGACAACGGTACCTTGGCCATGGGCTGGGGCAGTGGAACGGCCAACTTCCCCTACCTGATCACTCCCGAGCAAGCCATTCAGAATGAGGTTCTCAACTACGGCAACGGTGACACCAACGTCTTTGCTGTCACAGACAACGGTGCCCTCAGCCAAATGGCTGCCCTTGCTTCAACCGCAAGTGTTGCATTGGTGTTCGTCAACGCTGATTCGGGCGAGGGCTACATCAGTGTGGACGGCAACGAGGGCGATCGCAAGAACATGACCCTGTGGAAGAACGGCGAGGAGCTGATCAAGACCGCCACTGCCAACTGCAACAACACCATCGTCATCATGCACACCCCCAACGCCGTCCTGGTCGATTCATGGTACGACAATGAGAACATCACTGCCATTCTGTGGGCTGGTATGCCCGGCCAAGAGAGTGGTCGTAGCTTGGTTGATGTTCTCTACGGCCGCACGAACCCTGGTGGCAAGACCCCCTTCACCTGGGGTAAGGAGCGCAAGGATTGGGGATCTCCTCTTCTGACTAAACCCAACAACGGCCACGGTGCTCCTCAGGATGACTTCACCGATGTTCTGATTGACTATCGCCGTTTCGACAAGGACAACGTGGAGCCCATCTTCGAGTTCGGCTTCGGTCTGAGCTACACCAAATTTGAGTTCTCTGACATCCAGGTCAAGGCGCTGAATCACGGCGAGTACAACGCCACCGTGGGCAAGACCAAGCCTGCCCCTTCGTTGGGCAAGCCTGGTAATGCCTCCGATCATCTGTTCCCCAGCAACATCAACCGTGTGCGCCAGTACCTTTACCCTTACCTGAACTCGACCGATCTGAAGGCGTCTGCCAACGACCCTGACTATGGCATGAATGCATCGGCGTACATTCCTCCCCATGCCACCGACAGCGACCCACAGGACCTTCTCCCCGCCAGCGGACCTTCCGGTGGCAACCCTGGTTTGTTTGAGGATCTTATTGAGGTGACTGCTACTGTCACCAACACCGGCTCAGTTACTGGTGACGAGGTTCCCCAGCTGTATGTTTCGCTTGGCGGTGCCGATGACCCCGTTAAGGTCCTCCGTGCCTTCGACCGTGTCACGATCGCCCCTGGTCAGAAGCTCCGGTGGACAGCAACCCTCAACCGTCGTGATCTGTCCAACTGGGATGTCCCATCACAGAACTGGATCATCTCAGACGCCCCCAAGAAGGTGTGGGTGGGCAACTCGTCGCGCAAGCTGCCTCTTTCAGCCGATCTGCCCAAGGTGCAG。
2、制备草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6
将以上获得的16BGL基因序列（SEQ ID NO：8）利用易错PCR（3 µL的10×PCRBuffer，3 µL的dNTP，0.5 mmol/L的MnCl2，0.3 µM的上游引物SP（其序列为SEQ ID NO：4所示），0.3 µM的下游引物XM（其序列分别为SEQ ID NO：5所示），5 U的Taq DNA聚合酶，5 ng的β-葡萄糖苷酶DNA模板，加灭菌去离子水至30 µL；PCR条件为94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72度延伸2分40秒，40个循环，最后延伸10分钟去随机诱变序列，接着使其与组成型表达载体pYAT22（通过两个特异性引物扩增，其序列为SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：7所示）利用无缝克隆试剂盒连接，再使用酵母转化试剂盒转化到表达宿主酿酒酵母BY4741中，再涂布到含有15mg/mL甲酸钠和0.5%水杨苷且不含尿嘧啶和葡萄糖的SD培养基，30℃培养48-60 h，通过菌落大小进行平板筛选。
SEQ ID NO：6：5’-CCTCTTTCAGCCGATCTGCCCAAGGTGCAGCATCACCATCACCATCACTAATTTAAATG-3’。
SEQ ID NO：7：5’-AGAAGGGGGGAGAGTAGGCAAGATCCTTAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAGAGATACC-3’。
从以上第一轮筛选中筛选出的阳性突变体，用于第二轮筛选；将选择的阳性突变体接种到含有200 µL不含尿嘧啶的液体基础培养基的96孔板中，在30℃下培养60 h；将菌液10000 rpm离心5分钟，并分别保存其上清液和沉淀物；取50 µL稀释上清液加入5.5 μL100 mg/mL甲酸（甲酸终浓度为10 mg/mL），37℃水浴孵育1 h，加入5 μL 2 mol/L NaOH，与39.5 µL 0.1%水杨苷（溶于50 mM柠檬酸盐缓冲液，pH 5）在50℃下于96孔板中混合30分钟；然后，添加100 µL DNS到混合物中以终止反应；再将反应混合物煮沸10分钟，然后在室温下冷却，最后，使用酶标仪测定混合物在540 nm的OD值。
从第二轮筛选中选择具有较高OD值的阳性突变体进行进一步筛选，并接种到装有25 mL不含尿嘧啶的液体基础培养基中，于30℃培养2天。然后，将菌液在10000g下离心15分钟，以获得上清液，根据DNS法，筛选具有较高活性和高有机酸耐受性的突变体V3-4-H6，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其DNA序列如SEQ ID NO：3所示。
实施例2
草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6的酶学性质检测
酶活的测定：取50 µL稀释两倍后的酶液（原始16BGL和突变体V3-4-H6），加入450µL 0.1 %水杨苷（水杨苷事先溶于pH 5.0，50 mM柠檬酸缓冲液中)，混匀后，于50℃反应30min，最后加入500 µL DNS试剂终止反应，并立即将反应物于沸水中煮沸10 min，待冷却至室温后，采用分光光度计于540 nm处检测OD值，其结果如表1所示。
表1原始酶和突变体V3-4-H6的OD540
最适温度的测定：将β-葡萄糖苷酶及其突变体V3-4-H6分别与含有水杨苷的50 mM柠檬酸缓冲液，pH 5在不同温度下（35-80℃下持续30分钟）反应，并通过DNS方法测定其活性，其结果如图1所示，且由图1可知，β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6反应温度为65℃；由图2和表2可知，未加酸时的比活为0.0165 IU/mg，加入10 mg/mL甲酸孵育后的比活为0.012IU/mg，尽管其催化活性仅为原始16BGL的0.43倍，但V3-4-H6的甲酸耐受性却显著增强，达到了原始16BGL的1.64倍。
表2原始酶和突变体V3-4-H6未加酸的相对比活和10 mg/mL甲酸孵育后的相对比活
| 酶 | 比活(IU/mg) | 甲酸孵育后比活(IU/mg) |
| 16BGL | 0.0386 | 0.0073 |
| V3-4-H6 | 0.0165 | 0.012 |
有机酸耐受性的测定：取50 µL稀释后的酶液加入5.5 μL 100 mg/mL甲酸（甲酸终浓度为10 mg/mL），37℃水浴孵育1 h，加入5 μL 2 mol/L NaOH，再加入439.5 μL不同浓度的水杨苷（水杨苷事先溶于pH 5.0，50 mM柠檬酸盐缓冲液中)。在50℃下反应30 min后，向混合物中加入500 µL DNS试剂终止反应，并在540 nm处获得混合物的OD值，其中，水杨苷的终浓度分别为0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L和1.5 mmol/L。根据Lineweaver-Burk倒数图，使用（1）Michaelis-Menten方程和（2）非竞争性抑制方程计算V max，K m和K I（甲酸抑制常数）。
（1）
（2）
其结果见表3所示，甲酸抑制强度K m/K I值为1.17×10-2（甲酸终浓度10 mg/mL），具体来说，16BGL的K m/K I值是V3-4-H6的1.9倍，这一数据反映了V3-4-H6在甲酸环境下的耐受性优于16BGL。说明了在高有机酸浓度的生产环境中，其能够保持较好的稳定性和活性，从而提高生产效率和产品质量。
表3分子动力学常数和甲酸抑制分子动力学常数
实施例3
草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6用于生产葡萄糖的测定
未加酸情况下，酶解预处理后麸皮残渣的葡萄糖含量测定：取3.8 mg蛋白酶液，加入250 µL 里氏木霉残渣酶液和0.2 g预处理后的麸皮残渣，50℃水浴2 h，最后加入500 µLDNS，沸水浴10 min终止反应。待冷却至室温后，采用分光光度计于540 nm处检测OD值。
10 mg/mL甲酸孵育后，酶解预处理后麸皮残渣的葡萄糖含量测定：取3.8 mg酶液，加入27.5 µL 100 mg/mL甲酸，37℃孵育1 h，再加入25 µL 2mol/L NaOH调至pH约5.0。随后加入250 µL 里氏木霉残渣酶液和0.2g预处理后的麸皮残渣，50℃水浴2 h，最后加入500 µL DNS，沸水浴10 min终止反应。待冷却至室温后，采用分光光度计于540 nm处检测OD值。
其检测结果如图3所示，且由图3可知，β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6未加酸时产生的葡萄糖含量为687.3 µg，加入10 mg/mL甲酸处理后产生的葡萄糖含量为511.2 µg，尽管其酶解预处理后麸皮残渣产生葡萄糖含量仅为原始16BGL的0.69倍，但突变体V3-4-H6的加入甲酸处理后产生的葡萄糖含量达到了原始16BGL的2.01倍。这说明了其在工业生产酒精或葡萄糖的酸环境、果汁制备、酿酒工艺和饲料添加剂等领域具有潜在应用价值。
尽管本发明的描述已经相当详尽且特别对几个所述实施例进行了描述，但其并非旨在局限于任何这些细节或实施例或任何特殊实施例，而是应当将其视作是通过参考所附权利要求考虑到现有技术为这些权利要求提供广义的可能性解释，从而有效地涵盖本发明的预定范围。此外，上文以发明人可预见的实施例对本发明进行描述，其目的是为了提供有用的描述，而那些目前尚未预见的对本发明的非实质性改动仍可代表本发明的等效改动。
Claims (4)
1.一种草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6，其特征在于，所述草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种权利要求1所述的草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6的基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO：3所示。
3.权利要求1所述的草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6在酶解麸皮生成葡萄糖中的应用，其特征在于，所述草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6通过甲酸处理后将麸皮酶解得到葡萄糖。
4.一种酶解麸皮生成葡萄糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将甲酸置于草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6中，在37℃的条件下孵育，孵育结束后加入NaOH溶液将pH调至5.0，然后加入里氏木霉残渣酶液和麸皮残渣，水浴反应，得到葡萄糖；所述草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶突变体V3-4-H6的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |