CN118146325A - 苏云金芽孢杆菌Cry毒素基因及其人工嵌合毒素杀虫活性与应用 - Google Patents
苏云金芽孢杆菌Cry毒素基因及其人工嵌合毒素杀虫活性与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及苏云金芽孢杆菌Cry毒素基因及其人工嵌合毒素杀虫活性与应用。本发明涉及四种苏云金芽孢杆菌Cry类杀虫毒素基因Cry1I‑like、Cry2Ab‑like、Cry9Eb‑like、Cry9Ee‑like，以及五种人工改造的嵌合体毒素基因Cry1I‑1、Cry1I‑3、Cry1I‑5、Cry2A‑2、Cry9E‑2，通过使用上述新型基因并依据本发明的嵌合改造方法，改造后的单基因表达产物对鳞翅目害虫表现出很强的杀虫活性，可通过将改造后的嵌合体毒素基因遗传转化植物，使其表现出对特定靶标昆虫的毒性，克服或延缓相关农业害虫对转基因植物的抗药性产生。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及苏云金芽孢杆菌Cry毒素基因及其人工嵌合毒素杀虫活性与应用。
背景技术
传统使用的化学农药对人畜具有不同程度的毒性，并且长期使用容易导致土壤及生态环境的污染，对非靶标生物也具有毒杀作用，对于生态平衡具有不同程度的影响。目前天敌防治及微生物源物质等生物防控备受关注，因其生产成本低，靶标性强，对人畜无害，环境低毒，具有广阔的发展和应用前景。
苏云金芽孢杆菌作为一类主要的昆虫病原体，其产生的各类杀虫毒素对一系列的昆虫如鳞翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、同翅目(Hemiptera)、双翅目(Diptera)等害虫具有毒杀活性，是迄今为应用最成功的生物防控病原体。目前已有诸多苏云金芽孢杆菌毒素蛋白的作物遗传转化事件，成功的应用于转基因作物和喷洒剂多年。经遗传工程改造获得产杀虫蛋白的重要农作物如玉米、水稻、大豆等对其特定的靶标昆虫产生抗性，已经逐步的替代化学杀虫剂，并且大大降低了人工以及管理成本。成为环境友好、经济高效的替代方案。
苏云金芽孢杆菌在芽孢期可产生伴胞晶体，其中包含多种杀虫毒素，例如最早开始应用的Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab等。此外，陆续挖掘的Bt菌株中发现了多种新型的杀虫毒素，例如Cry3、Cry4、Cry7、Cry8、Vip3A等。通常，Cry1家族蛋白靶标为鳞翅目，Cry3、Cry8等毒素靶标鞘翅目，Vip3A靶标鳞翅目,Cry4、Cry11等毒素靶标双翅目昆虫。不同毒素组合共同转化作物，可使作物对多种靶标害虫产生抗性，并且有些毒素还能起到协同杀虫作用。
尽管转Bt杀虫蛋白作物的商业化应用很成功，但前期大量且长期的使用转单一抗虫基因的作物，目前已有许多昆虫产生了抗性。产生抗性的昆虫也对同一分类家族的蛋白产生了交叉抗性，目前急需挖掘新颖的杀农业害虫蛋白基因，经理论指导对已有蛋白进行人工改造，以缓解目前的田间抗性问题。
发明内容
本发明提供五种苏云金芽孢杆菌Cry类杀虫毒素基因Cry1Ia35-like、Cry1Ia-like、Cry2Ab-like、Cry9Eb-like、Cry9Ee-like，其特征在于所述五种Cry类杀虫毒素基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO19、SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6所示。
本发明的另一实施方案提供五种杀虫毒素蛋白Cry1Ia35-like、Cry1Ia-like、Cry2Ab-like、Cry9Eb-like、Cry9Ee-like，其特征在于所述五种杀虫毒素蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO20、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8所示。
本发明的另一实施方案提供上述五种Cry类杀虫毒素基因或五种杀虫毒素蛋白在防治农业病虫害中的应用，尤其是在毒杀或抑制小菜蛾、水稻二化螟、玉米螟、桃蛀螟中的应用。所述应用是指五种杀虫蛋白作为杀虫剂的主要成分或抗虫转基因作物的基因种质资源以用于防治农业病虫害，尤其是毒杀小菜蛾、玉米螟、桃蛀螟、水稻二化螟。
本发明的另一实施方案提供一种杀虫药物组合物，其特征在于该药物组合物以上述五种杀虫蛋白作为有效成分。该药物组合物还可包括其他抗虫活性物质。
本发明的另一实施方案提供一种防治农业病虫害的方法，其特征在于将上述五种Cry类杀虫毒素基因作为抗虫转基因作物的基因种质资源以用于毒杀小菜蛾、玉米螟、桃蛀螟、水稻二化螟。
本发明的另一实施方案提供五种人工改造后的嵌合体毒素蛋白Cry1I-1、Cry1I-3、Cry1I-5、Cry2A-2、Cry9E-2，其特征在于所述五种人工改造后的嵌合体毒素蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18所示。
本发明的另一实施方案提供五种杀虫基因Cry1I-1、Cry1I-3、Cry1I-5、Cry2A-2、Cry9E-2，其特征在于所述五种杀虫基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17所示。
本发明的另一实施方案提供上述五种杀虫基因或五种人工改造后的嵌合体毒素蛋白在防治农业病虫害中的应用，尤其是在毒杀或抑制小菜蛾、水稻二化螟、玉米螟、桃蛀螟中的应用。所述应用是指五种人工改造后的嵌合体毒素蛋白作为杀虫剂的主要成分或抗虫转基因作物的基因种质资源以用于防治农业病虫害，尤其是毒杀小菜蛾、玉米螟、桃蛀螟、水稻二化螟。
本发明的另一实施方案提供一种杀虫药物组合物，其特征在于该药物组合物以上述五种人工改造后的嵌合体毒素蛋白作为有效成分。该药物组合物还可包括其他抗虫活性物质。
本发明的另一实施方案提供一种防治农业病虫害的方法，其特征在于将上述五种杀虫基因作为抗虫转基因作物的基因种质资源以用于毒杀小菜蛾、玉米螟、桃蛀螟、水稻二化螟。
与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明以Cry1Ia35-like毒素基因和Cry1I-like为模板，依据Cry类毒素的三个功能结构域的构造，设计了3个人工嵌合体毒素，分别命名为Cry1I-1、Cry1I-3、Cry1I-5；这三个嵌合体毒素的特征分别具有如SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11所示的核苷酸序列和SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14所示的氨基酸序列。(2)本发明以Cry2Ab17(参见：GeneBank:AAA22342.1)和Cry2Ab-like为模板，依据Cry类毒素三个功能结构域构造，设计了1个人工嵌合体毒素并命名为Cry2A-2；其特征为具有如SEQ ID NO15所示的核苷酸序列，该嵌合体基因编码的蛋白质具有如SEQID NO16所示的氨基酸序列。(3)本发明以cry9Eb-like和cry9Ee-like为模板，依据Cry类毒素三个功能结构域构造，设计了1个人工嵌合体毒素并命名为Cry9E-2；其特征为具有如SEQID NO17所示的核苷酸序列，该嵌合体基因编码的蛋白质具有如SEQ ID NO18所示的氨基酸序列。上述杀虫基因或蛋白和改造后的嵌合体基因或蛋白在杀灭害虫方面性能优异，所述害虫为小菜蛾、玉米螟、水稻二化螟、桃蛀螟等。本发明Bt菌株SW412包含cry1Ia35-like毒素基因，HSY277包含cry1I-like毒素基因，HSY149包含cry2Ab-like毒素基因，HSY197包含cry9Eb-like和cry9Ee-like毒素基因。
附图说明
图1是Cry1Ia-like(A)、Cry2Ab-like(B)、Cry9Eb-like(C)、Cry9Ee-like(D)、Cry1Ia-like(E)毒素PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
图2是Cry1Ia35-like与Cry1Ia35(GenBank:CAA44633.1)蛋白氨基酸序列多重比对结果图。
图3是Cry1Ia-like与Cry1Ia35(GenBank:CAA44633.1)蛋白氨基酸序列多重比对结果图。
图4是Cry2Ab-like与Cry2Ab1(GenBank:AAA22342.1)蛋白氨基酸序列多重比对结果图。
图5是Cry9Eb-like和Cry9Eb1(GenBank:CAC50780.1)蛋白氨基酸序列多重比对结果图。
图6是Cry9Ee-like和Cry9Ee1(GenBank:ADE60738.1)蛋白氨基酸序列多重比对结果图。
图7是Cry1Ia-like(A)、Cry2Ab-like(B)、Cry9Eb-like(C)、Cry9Ee-like(D)、Cry1Ia35-like(E)毒素在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达SDS-PAGE电泳图。
图8是Cry1Ia35-like及Cry1Ia-like结构域互换方案示意图。
图9是Cry1I-1(A)、Cry1I-3(B)、Cry1I-5(C)、Cry2A-2(D)、Cry9E-2(E)嵌合体毒素基因片段的PCR结果图。
图10是Cry1I-1、Cry1I-3、Cry1I-5(A)、Cry2A-2(B)、Cry9E-2(C)嵌合体毒素在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达SDS-PAGE电泳图。
图11是Cry2Ab1及Cry2Ab-like结构域互换方案示意图。
图12是Cry9Eb-like及Cry9Ee-like结构域互换方案示意图。
具体实施方式
实施例1
1.cry1Ia35-like、cry1I-like、cry2Ab-like、cry9Eb-like、cry9Ee-like基因的克隆与序列分析
分别设计从Bt菌株SW412、HSY277、HSY149、HSY197基因组DNA(序列表)中扩增cry1Ia35-like、cry1I-like、cry2Ab-like、cry9Eb-like、cry9Ee-like全长引物(表1)，方向为5’端→3’端：
表1.cry1Ia35-like、cry1Ia-like、cry2Ab-like、cry9Eb-like、cry9Ee-like PCR扩增引物
1.1毒素蛋白基因的克隆：
目的基因克隆使用Gibson克隆技术连接至大肠杆菌表达载体pET-28a(+)中，为方便后续双酶切验证，设计插入位点5’端为BamH I，3’端为Xho I。引物序列中小写序列为相应插入位点的互补序列。
具体操作如下：
(1)将Bt基因组DNA模板、引物对以及PCR反应预混液按照表2体系进行配制:
表2.PCR反应体系
(2)PCR反应程序按照表3进行设置，步骤2到步骤4做30个循环：
表3.PCR反应程序设置
(3)PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测(图1)
(4)毒素蛋白基因与载体连接
PCR产物经SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒纯化后，与PCR线性化的载体按照表4中的用量进行配比，再加入无缝克隆反应酶在50℃反应5min完成毒素基因与载体的连接。
表4.无缝克隆反应体系
(5)连接产物的转化
取10μl连接产物加入至100μl化冻的感受态细胞(DH5α)，充分混匀后冰浴30min，42℃热击40s，冰浴2min后加入800μl LB培养基，37℃培养45min，离心后保留100μl培养基重悬菌体并涂布至相应抗性平板。
1.2新基因的序列分析
使用软件对Cry1Ia-like蛋白进行理化性质分析(表5)：该基因全长2157bp，所编码的蛋白质氨基酸数目为719个，推算所编码的蛋白质相对分子质量约为80.6kDa，该蛋白质的理论等电点为5.381，为弱酸性蛋白。
对Cry2Ab-like蛋白进行理化性质分析(表6)：该基因全长1914bp，所编码的蛋白质氨基酸数目为638个，推算所编码的蛋白质相对分子质量约为71.3kDa，该蛋白质的理论等电点为7.496，为弱碱性蛋白。
对Cry9Eb-like蛋白进行理化性质分析(表7)：该基因全长3459bp，所编码的蛋白质氨基酸数目为1153个，推算所编码的蛋白质相对分子质量约为130.6kDa，该蛋白质的理论等电点为5.18，为弱酸性蛋白。
对Cry9Ee-like蛋白进行理化性质分析(表8)：该基因全长3471bp，所编码的蛋白质氨基酸数目为1157个，推算所编码的蛋白质相对分子质量约为129.8kDa，该蛋白质的理论等电点为4.945，为弱酸性蛋白。
表5.Cry1Ia-like蛋白理化性质分析
表6.Cry2Ab-like蛋白理化性质分析
表7.Cry9Eb-like蛋白理化性质分析
表8.Cry9Ee-like蛋白理化性质分析
将Cry1Ia35-like蛋白氨基酸序列与Cry1Ia35(GenBank:CAA44633.1)进行多重序列比对，结果显示Cry1Ia35-like毒素与Cry1Ia35两者序列相似度为99.3％，根据最新的芽孢杆菌毒素分类标准，该毒素可命名为Cry1Ia41，属第三级新类型毒素，比对结果如附图2所示。
将Cry1Ia-like蛋白氨基酸序列与Cry1Ia35(GenBank:CAA44633.1)进行多重序列比对，结果显示Cry1Ia-like毒素比Cry1Ia35少1个氨基酸，两者序列相似度为78.2％，根据最新的芽孢杆菌毒素分类标准，该毒素可命名为Cry1Ih1，属第三级新类型毒素，比对结果如附图3所示。
将Cry2Ab-like蛋白氨基酸序列与Cry2Ab1(GenBank:AAA22342.1)进行多重序列比对，结果显示Cry2Ab-like毒素比Cry2Ab1多4个氨基酸，两者序列相似度为84.4％，根据最新的芽孢杆菌毒素分类标准，该毒素可命名为Cry2Am1，属第三级新类型毒素，比对结果如附图4所示。
将Cry9Eb-like蛋白氨基酸序列与Cry9Eb1(GenBank:CAC50780.1)进行多重序列比对，结果显示Cry9Eb-like毒素与Cry9Eb1氨基酸数目一致，两者序列相似度为98.3％，根据最新的芽孢杆菌毒素分类标准，该毒素可命名为Cry9Eb4，属第四级新类型毒素，比对结果如附图5所示。
将Cry9Ee-like蛋白氨基酸序列与Cry9Ee1(GenBank:ADE60738.1)进行多重序列比对，结果显示Cry9Ee-like毒素与Cry9Ee1氨基酸数目一致，两者序列相似度为99.7％，根据最新的芽孢杆菌毒素分类标准，该毒素可命名为Cry9Ee3，属第四级新类型毒素，比对结果如附图6所示。
2.毒素基因在大肠杆菌中的表达分析
2.1表达宿主菌的转化
将连接有毒素基因的pET-28a阳性重组子转入表达感受态BL21(DE3)中，挑取形态正确的单克隆于LB培养基中过夜活化，经PCR验证和测序验证后正确的进行诱导表达。
2.2毒素蛋白基因的诱导表达
挑取毒素蛋白表达工程菌过夜活化，次日按1％比例转接至LB培养基中，37℃培养2h左右至OD600约为0.5时，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度为0.5mM，16℃诱导表达18h后收集菌体，每100ml培养物加入5ml PBS缓冲液悬浮，加入PMSF(苯甲基磺酰氟)至终浓度为1mM，使用超声波破碎仪对悬浮菌体进行破碎，离心后取上清液和沉淀备样，SDS-PAGE凝胶电泳分析诱导表达结果。Cry1Ia35-like、Cry1Ia-like、Cry2Ab-like、Cry9Eb-like、Cry9Ee-like均以包涵体形式表达于大肠杆菌内，结果如附图7所示。
3.毒素蛋白的生物活性测定
小菜蛾：采用毒素蛋白混入人工饲料的方法，预先准备好破碎后的诱导蛋白，经SDS-PAGE电泳后使用梯度浓度的BSA(牛血清白蛋白)作为标准经光密度法测定蛋白液中目的蛋白的浓度。生测时按照一定的比例将蛋白加入完全碾碎的人工饲料中，使毒素蛋白在饲料中的浓度为Xμg/g。将毒素蛋白和人工饲料完全混匀后，加入至一次性灭菌后的酱料小盒中压平，阴干后每个酱料小盒挑入小菜蛾6只。记录7天内小菜蛾的死亡数，存活数目以及抑制数目。
其他：玉米螟、二化螟、桃蛀螟、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、黏虫、小地老虎等昆虫的生物活性测定方法同小菜蛾，差异为不同昆虫的人工饲料成分不同。
结果显示(表9)，Cry1Ia-like、Cry2Ab-like对玉米螟、二化螟、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、黏虫、小地老虎均无生物活性，仅对小菜蛾和桃蛀螟存在抑制活性。Cry1Ia35-like、Cry9Eb-like和Cry9Ee-like对玉米螟、二化螟、小菜蛾均具有较高的生物活性。
表9.毒素蛋白50μg/g浓度下对各类鳞翅目杀虫活性测定
注：A代表在该浓度下具有杀虫活性，NA代表无杀虫活性
表10.毒素蛋白50μg/g浓度下对玉米螟杀虫活性测定
表11.毒素蛋白50μg/g浓度下对小菜蛾杀虫活性测定
表12.毒素蛋白50μg/g浓度下对二化螟杀虫活性测定
表13.毒素蛋白50μg/g浓度下对桃蛀螟杀虫活性测定
实施例2
1.Cry1I、Cry2A嵌合体毒素基因的克隆及表达分析
依据对Cry1Ia-like毒素的结构域预测结果，设计了Cry1Ia-like毒素与Cry1Ia35-like的结构域互换的嵌合体毒素。
Cry1Ia35-like与Cry1Ia-like毒素均具有3D-Cry类毒素的三个结构域，分别是Pesticidal crystal protein,N-terminal(Pest_crys_N，IPR005639)、Pesticidalcrystal protein,central domain(Pest_cryst_cen_dom，IPR001178)、Pesticidalcrystal protein,C-terminal(Pest_crys_C，IPR005638)3个结构域。依据3D-Cry类毒素典型的三结构域特征将该类毒素分为7个部分(如图所示)，其中NR为蛋白N端首个氨基酸到Pest_crys_N结构域前氨基酸，N为Pest_crys_N结构域，MR1为Pest_crys_N和Pest_cryst_cen_dom结构域之间的氨基酸残基，M为Pest_cryst_cen_dom结构域，MR2为Pest_cryst_cen_dom和Pest_crys_C结构域之间的氨基酸残基，C为Pest_crys_C结构域，C为Pest_crys_C结构域后至C末端的氨基酸残基。
将Cry1Ia-like毒素和Cry1Ia35-like的结构域之间进行互换嵌合设计了三个嵌合体毒素，母版毒素的结构域氨基酸区域如表所示，三个嵌合体分别命名为Cry1I-1、Cry1I-3、Cry1I-5。其中Cry1I-1的构造为Cry1Ia35-like的NR+N与Cry1Ia-like的MR1+M+MR2+C+CR。Cry1I-3的构造为Cry1Ia35-like的NR+N和Cry1Ia-like的MR1+M+MR2和Cry1Ia35-like的C+CR。Cry1I-5的构造为Cry1Ia35-like的NR+N+MR1+M+MR2与Cry1Ia-like的C+CR，具体构造如图8和表14所示。
表14.Cry1Ia35及Cry1Ia-like各结构域氨基酸区域位置
参照多片段无缝克隆引物设计原则，嵌合体毒素分为几个片段，不同片段间具有同源臂序列，5’端具pET-28a载体插入位点(BamH I)上游同源臂序列，3’端具载体插入位点(Xho I)下游同源臂序列。cry1I嵌合体毒素引物如表15表所示：
表15.cry1I嵌合体基因片段引物表
所有片段以cry1Ia35-like和cry1Ia-like连接pET-28a的重组克隆质粒为模板，使用PCR方法扩增，具体方法参照实施例1中1.1所述PCR体系及扩增程序。反应完成后使用琼脂糖凝胶电泳对片段大小进行分析，使用胶回收试剂盒切除大小正确片段，结果如附图9。多片段克隆参照ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit使用说明书。连接产物转化DH5α，转化及阳性克隆验证参照实施例1中1.1所述。
将cry1I-1、cry1I-3、cry1I-5阳性重组载体转入表达感受态BL21(DE3)中，表达分析参照实施例1中2.2方法。Cry1I嵌合体毒素均能在大肠杆菌在实现异源表达，并且主要以包涵体形式存在，结果如附图9(A)所示。
cry2Ab-like与cry2Ab1(参见：GeneBank:AAA22342.1)嵌合体设计方法如图9所示，其中Cry2Ab-like和Cry2Ab1结构域氨基酸区域如表16所示，所设计嵌合体命名为cry2A-2。为Cry2Ab-like的NR+N+MR1和Cry2Ab1的M和Cry2Ab-like的MR2+C+CR。引物设计(表17)与克隆转化等方法同实施例2中1的cry1I嵌合体构造方法，片段扩增模板为cry2Ab1和cry2Ab-like连接pET-28a重组克隆质粒，扩展结果如附图9。
将cry2A-2阳性重组载体转入表达感受态BL21(DE3)中，表达分析参照实施例1中2.2方法。Cry2A-2嵌合体毒素均能在大肠杆菌在实现异源表达，并且主要以包涵体形式存在，结果如附图9(B)所示。
表16.Cry2Ab1及Cry2Ab-like各结构域氨基酸区域位置
表17.cry2A嵌合体基因片段引物表
2.Cry9E嵌合体毒素基因的克隆及表达分析
Cry9类毒素相比Cry1I和Cry2类毒素，其C端还具有一个Pesticidal crystalprotein Cry,domain V(Cry_V，IPR041587)结构域，帮助该类毒素在Bt中形成伴孢晶体。对Cry9Eb-like和Cry9Ee-like毒素进行嵌合改造，两毒素结构域氨基酸区域如表18所示，设计的嵌合体命名为Cry9E-2，嵌合方法如图所示，为Cry9Eb-like的NR+N和Cry9Ee-like的MR1+M+MR2+C+CR，其中CR包括Cry9Ee-like的Cry_V结构域。引物设计方法参照实施例2中多片段无缝克隆方法的片段扩增引物设计方法。cry9E-2各片段引物如表19所示。
表18.Cry9Ee-like及Cry9Eb-like各结构域氨基酸区域位置
表19.cry9E嵌合体基因片段引物表
以cry9Eb-like和cry9Ee-like连接pET-28a重组克隆质粒为模板进行两个片段的PCR扩增，扩增后续操作同实施例2中cry1I嵌合体克隆方法。将cry9E-2阳性重组载体转入表达感受态BL21(DE3)中，表达分析参照实施例1中2.2方法。Cry9E-2嵌合体毒素均能在大肠杆菌在实现异源表达，并且主要以包涵体形式存在，结果如附图9(C)所示。
3.嵌合体毒素生物活性测定
对所有嵌合体进行了小菜蛾、二化螟、玉米螟的定性生物活性测定，蛋白准备及生物活性测定方法参照实施例1中3方法。结果(表20-22)显示Cry1I-1、Cry9E2、Cry2A-2对小菜蛾均具有很强的生物活性，Cry9E-2还对玉米螟和二化螟具有很强的杀虫活性，Cry2A-2主要对小菜蛾具有活性，对玉米螟仅具有较强的抑制活性，昆虫未死亡但维持较小的个体。
表20.嵌合体毒素50μg/g浓度下对小菜蛾处理3天生物活性测定
表21.嵌合体毒素50μg/g浓度下对二化螟处理3天生物活性测定
表22.嵌合体毒素50μg/g浓度下对亚洲玉米螟处理3天生物活性测定
Claims (9)
1.五种苏云金芽孢杆菌Cry类杀虫毒素基因Cry1Ia35-like、Cry1Ia-like、Cry2Ab-like、Cry9Eb-like、Cry9Ee-like，其特征在于所述五种Cry类杀虫毒素基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO19、SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6所示。
2.五种杀虫毒素蛋白Cry1Ia35-like、Cry1Ia-like、Cry2Ab-like、Cry9Eb-like、Cry9Ee-like，其特征在于所述五种杀虫毒素蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO20、SEQID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8所示。
3.五种杀虫基因Cry1I-1、Cry1I-3、Cry1I-5、Cry2A-2、Cry9E-2，其特征在于所述五种杀虫基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO15、SEQID NO17所示。
4.五种人工改造后的嵌合体毒素蛋白Cry1I-1、Cry1I-3、Cry1I-5、Cry2A-2、Cry9E-2，其特征在于所述五种人工改造后的嵌合体毒素蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO12、SEQID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18所示。
5.权利要求1所述的Cry类杀虫毒素基因、权利要求3所述的杀虫基因、权利要求2所述的杀虫毒素蛋白和/或权利要求4所述的嵌合体毒素蛋白在防治农业病虫害中的应用。
6.权利要求5所述的应用，其特征在于在毒杀或抑制小菜蛾、水稻二化螟、玉米螟和/或桃蛀螟中的应用。
7.一种杀虫药物组合物，其特征在于该药物组合物以权利要求2所述的杀虫毒素蛋白和/或权利要求4所述的嵌合体毒素蛋白作为有效成分。
8.权利要求7所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物还可包括其他抗虫活性物质。
9.一种防治农业病虫害的方法，其特征在于将权利要求1所述的Cry类杀虫毒素基因和/或权利要求3所述的杀虫基因作为抗虫转基因作物的基因种质资源以用于毒杀小菜蛾、玉米螟、桃蛀螟、水稻二化螟。
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Legal Events
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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