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CN118139880A - O-连接的n-乙酰葡糖胺水解酶(oga)抑制剂联合治疗 - Google Patents

O-连接的n-乙酰葡糖胺水解酶(oga)抑制剂联合治疗 Download PDF

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CN118139880A
CN118139880A CN202280070979.2A CN202280070979A CN118139880A CN 118139880 A CN118139880 A CN 118139880A CN 202280070979 A CN202280070979 A CN 202280070979A CN 118139880 A CN118139880 A CN 118139880A
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A·S·弗莱舍
D·J·梅戈特
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Abstract

本发明提供了治疗和/或预防以淀粉样蛋白β沉积为特征的疾病和/或以淀粉样蛋白β沉积和异常tau聚集为特征的疾病和/或减缓其进展的方法。此类方法包括向需要此类治疗的患者施用有效量的抗N3pG Aβ抗体和有效量的OGA抑制剂。

Description

O-连接的N-乙酰葡糖胺水解酶(OGA)抑制剂联合治疗
本公开涉及一种或多种O-连接的N-乙酰葡糖胺水解酶(O-GlcNAcase,“OGA”)抑制剂和一种或多种抗N3pGlu淀粉样蛋白β(抗N3pG Aβ)抗体的组合，以及使用其治疗以i)淀粉样蛋白β(Aβ)沉积和/或ii)淀粉样蛋白β(Aβ)沉积和tau介导的神经变性的组合为特征的障碍的方法。本公开的一些方面涉及治疗阿尔茨海默病(AD)。
阿尔茨海默病是一种毁灭性的神经退行性疾病，其病理学特征是淀粉样蛋白β沉积和/或异常的tau蛋白聚集。AD影响着全世界数百万人，AD的治疗是社会最重要的未满足需求之一。AD的神经病理学标志是存在含有过度磷酸化tau蛋白的细胞内神经原纤维缠结。AD的另一个病理标志是存在淀粉样蛋白β(Aβ)沉积。tau蛋白和Aβ病理学之间的相互作用仍在破译中。Aβ可能会触发tau病理学，Aβ和tau之间会在后期表现出更复杂和协同的相互作用，并推动疾病进展(Busche等人,Nature Neuroscience 23:1183-93(2020))。
脑渗透的OGA抑制剂被期望为tau介导的神经变性障碍例如阿尔茨海默病提供治疗。靶向Aβ的抗体(例如抗N3pGlu Aβ抗体)已显示出去除个体脑中淀粉样蛋白沉积的前景，并被用作/开发作为阿尔茨海默病的治疗剂。本公开提供了i)与抗N3pGlu Aβ抗体组合的作为OGA抑制剂的某些化合物，和ii)治疗由异常tau和/或淀粉样蛋白沉积介导的疾病(例如AD)的相关方法。
微管相关蛋白tau寡聚化成丝状结构，例如成对螺旋丝(PHF)和直丝或扭曲丝，从而产生神经原纤维缠结(NFT)和神经纤维丝(NT)，是阿尔茨海默病和其它tau蛋白病(tauopathies)的典型病理特征之一。患有阿尔茨海默病的个体的脑中NFT的数量与疾病的严重程度密切相关。这表明tau在神经元功能障碍和神经变性中具有关键作用(Nelson等人,J Neuropathol Exp Neurol.,71(5),362-381(2012))。Tau病理学已被证明与PSP的病程相关；病程较严重的病例比进展较慢的病例具有更高的tau负荷(Williams等人,Brain,130,1566-76(2007))。最近的研究(Yuzwa等人,Nat Chem Biol,4(8),483-490(2008))支持O-GlcNAcase(OGA)抑制剂限制tau蛋白过度磷酸化和聚集成病理性tau的治疗潜力，用于治疗阿尔茨海默病和相关的tau蛋白介导的神经变性障碍。具体而言，OGA抑制剂Thiamet-G与减缓JNPL3 tau小鼠模型中的运动神经元损失有关(Yuzwa等人,Nat Chem Biol,8,393-399(2012))，并与Tg4510 tau小鼠模型中的tau病理学和营养不良性神经突的减少有关(Graham等人,Neuropharmacology,79,307-313(2014))。因此，OGA抑制剂被认为是减少tau过度磷酸化病理形式(例如NFT和NT)的积累的有效治疗方法。美国专利号9,120,781公开了具有OGA抑制活性的六氢苯并噁唑和六氢苯并噻唑衍生物，并进一步公开了可用于治疗与OGA缺乏或过度表达和/或2-乙酰氨基-2-脱氧-5β-D-吡喃葡糖苷(O-GlcNAc)积累或缺乏相关的疾病和障碍。此外，US2016/0031871公开了用于治疗阿尔茨海默病的某些糖苷酶抑制剂。
淀粉样蛋白β肽以脑淀粉样蛋白沉积的形式积累是阿尔茨海默病的早期和重要事件，导致神经变性并因此导致临床症状的发作，例如认知和功能障碍((Selkoe,JAMA 283:1615-7(2000)；Hardy等人,Science 297:353-6(2002)；Masters等人,Nat.Rev.Dis.Primers 1:15056(2015)；and Selkoe等人,EMBO Mol.Med.8:595-608(2016))。淀粉样蛋白β是由称为淀粉样前体蛋白(APP)的较大糖蛋白经蛋白水解裂解形成的。APP是一种内在膜蛋白，在许多组织中表达，尤其是在神经元突触中。APP被γ分泌酶裂解，释放出Aβ肽，其中包含一组大小为37-49个氨基酸残基的肽。Aβ单体聚集成各种类型的高级结构，包括寡聚物、原纤维和淀粉样原纤维。淀粉样蛋白寡聚物是可溶的，并且可能会扩散到整个大脑，而淀粉样蛋白原纤维较大且不溶，并且可以进一步聚集形成淀粉样蛋白沉积或斑块。在人类患者中发现的淀粉样蛋白沉积包括Aβ肽的异质混合物，其中一些包括N末端截断，并且还可能包括N末端修饰，例如N末端焦谷氨酸残基(pGlu)。在人类患者中发现的淀粉样蛋白沉积包含Aβ肽的异质混合物。N3pGlu Aβ(也称为N3pG Aβ、N3pE Aβ、AβpE3-42或Aβp3-42)是Aβ肽的截断形式，并仅存在于淀粉样蛋白沉积中。N3pGlu Aβ在人Aβ的N末端缺乏前两个氨基酸残基，并且在Aβ的第三个氨基酸位置有一个由谷氨酸衍生的焦谷氨酸。尽管N3pGlu Aβ肽是大脑中沉积Aβ的次要成分，但研究表明N3pGlu Aβ肽具有积极的聚集特性，并在沉积级联的早期积累。
N3pGlu Aβ的抗体是本领域已知的。例如，美国专利号8,679,498；美国专利号8,961,972；美国专利号10,647,759；和美国专利号11,078,261(其全部内容通过引用并入本文)公开了抗N3pGluAβ抗体、制备抗体的方法、抗体制剂，以及用此类抗体治疗疾病例如阿尔茨海默病的方法。
在各种动物模型中，通过长期慢性施用抗Aβ的抗体(包括N3pGlu Aβ)的被动免疫，已被证明破坏Aβ聚集并促进大脑中沉积的清除。Donanemab(美国专利号8,679,498中公开)是针对仅存在于脑淀粉样蛋白沉积中的淀粉样蛋白β(N3pGlu Aβ)表位的第三个氨基酸的焦谷氨酸修饰的抗体。
Donanemab的治疗和预防策略包括靶向存在脑淀粉样蛋白负载的早期症状性AD患者群体中淀粉样蛋白沉积特异性的N3pGlu Aβ。这种理论基础是基于AD的淀粉样蛋白假说，其说明Aβ的产生和沉积是AD发病机理的早期和必需事件。参见例如Selkoe,JAMA 283:1615-1617(2000)，其全部内容通过引用并入本文。Donanemab最近显示出在去除淀粉样蛋白沉积和减缓AD进展方面的功效/效力。参见例如Mintun等人,New England Journal ofMedicine 384.18:1691-1704(2021)，其全部内容通过引用并入本文。
特异性结合抗N3pG Aβ并减少人类个体脑中淀粉样蛋白β的抗体与OGA抑制剂的组合被期望为疾病例如AD提供治疗。这种组合可以减少致病性tau种类和tau聚集体，并减少淀粉样蛋白β(Aβ)。这种组合还可以优选地比单独的任一分子更有效。例如，与单独使用每种分子相比，用这种组合进行治疗可以允许使用较低剂量的任一或两种分子，从而可能导致较低的副作用(或一种或另一种治疗的持续时间较短)，同时保持功效。据信，本文提供的组合将不仅减少淀粉样蛋白β，而且还减少异常tau、tau聚集成病理性tau及其传播，以用于治疗疾病，例如AD。
一方面，本公开涉及一种治疗患有以淀粉样蛋白β(Aβ)沉积为特征的疾病的患者的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有以淀粉样蛋白β沉积和异常tau聚集为特征的疾病的患者的方法。该方法包括向有需要的患者施用有效量的抗N3pG Aβ抗体与有效量的OGA抑制剂的组合，其中所述OGA抑制剂是下式的化合物：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，OGA抑制剂2位上的甲基相对于哌啶环4位上的氧呈顺式构型：
在一些实施方案中，OGA抑制剂是N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。在一些实施方案中，OGA抑制剂是结晶的。在一些实施方案中，N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]-1-[哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺的特征在于X射线粉末衍射光谱中衍射角2-θ为12.1°的峰与选自15.3°、21.6°、22.2°、22.7°、23.5°、24.3°和26.8°的一个或多个峰的组合，衍射角误差为0.2度。本公开的另一方面涉及治疗患有以淀粉样蛋白β(Aβ)沉积为特征的疾病的患者的方法，该方法包括向有需要的患者施用有效量的抗N3pG Aβ抗体与有效量的OGA抑制剂的组合，其中所述OGA抑制剂是下式的化合物：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有以淀粉样蛋白β沉积和异常tau聚集为特征的疾病的患者的方法。在一些实施方案中，OGA抑制剂2位上的甲基相对于哌啶环4位上的氧呈顺式构型：
在一些实施方案中，OGA抑制剂2位上的甲基相对于哌啶环4位上的氧呈反式构型：
在一些实施方案中，OGA抑制剂是N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。在一些实施方案中，OGA抑制剂是N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。在一些实施方案中，OGA抑制剂是结晶的。在一些实施方案中，OGA抑制剂的特征在于X射线粉末衍射光谱中衍射角2-θ为13.5°的峰与选自5.8°、13.0°、14.3°、17.5°、20.4°、21.4°和22.2°的一个或多个峰组合，衍射角误差为0.2度。
本公开的另一方面涉及治疗患有以淀粉样蛋白β(Aβ)沉积为特征的疾病的患者的方法，该方法包括向有需要的患者施用有效量的抗N3pG Aβ抗体与有效量的OGA抑制剂的组合，其中所述OGA抑制剂是下式的化合物：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本公开涉及治疗患有以淀粉样蛋白β沉积和异常tau聚集为特征的疾病的患者的方法。在一些实施方案中，OGA抑制剂5位上的甲基相对于哌啶环3位上的氧呈顺式构型：
在一些实施方案中，OGA抑制剂5位上的甲基相对于哌啶环3位上的氧呈反式构型：
在一些实施方案中，OGA抑制剂是1-(2-(((3R,5S)-1-((6-氟-2-甲基苯并[d]噻唑-5-基)甲基)-5-甲基吡咯烷-3-基)氧基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)乙-1-酮。在一些实施方案中，OGA抑制剂是结晶的。
本公开的又一个方面涉及治疗患有以淀粉样蛋白β沉积和/或异常tau聚集为特征的疾病的患者的方法，包括向有需要的患者施用有效量的抗N3pG Aβ抗体与有效量的OGA抑制剂的组合，其中所述OGA抑制剂是下式的化合物：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，OGA抑制剂2位上的甲基相对于哌啶环4位上的氧呈顺式构型：
在一些实施方案中，OGA抑制剂是N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。在一些实施方案中，OGA抑制剂是结晶的。在一些实施方案中，N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]-1-[哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺的特征在于X射线粉末衍射光谱中衍射角2-θ为12.1°的峰与选自15.3°、21.6°、22.2°、22.7°、23.5°、24.3°和26.8°的一个或多个峰的组合，衍射角误差为0.2度。
本公开的又一个方面涉及治疗患有以淀粉样蛋白β沉积和/或异常tau聚集为特征的疾病的患者的方法，包括向需要这种治疗的患者施用有效量的抗N3pG Aβ抗体与有效量的OGA抑制剂的组合，其中所述OGA抑制剂是下式的化合物：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，OGA抑制剂2位上的甲基相对于哌啶环4位上的氧呈顺式构型：
在一些实施方案中，OGA抑制剂2位上的甲基相对于哌啶环4位上的氧呈反式构型：
在一些实施方案中，OGA抑制剂是N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。在一些实施方案中，OGA抑制剂是N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。在一些实施方案中，OGA抑制剂是结晶的。在一些实施方案中，OGA抑制剂的特征在于X射线粉末衍射光谱中衍射角2-θ为13.5°的峰与选自5.8°、13.0°、14.3°、17.5°、20.4°、21.4°和22.2°的一个或多个峰的组合，衍射角误差为0.2度。
本公开的又一个方面涉及治疗患有以淀粉样蛋白β沉积和/或异常tau聚集为特征的疾病的患者的方法，包括向需要这种治疗的患者施用有效量的抗N3pG Aβ抗体与有效量的OGA抑制剂的组合，其中所述OGA抑制剂是下式的化合物：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，OGA抑制剂5位上的甲基相对于哌啶环3位上的氧呈顺式构型：
在一些实施方案中，OGA抑制剂5位上的甲基相对于哌啶环3位上的氧呈反式构型：
在一些实施方案中，OGA抑制剂是1-(2-(((3R,5S)-1-((6-氟-2-甲基苯并[d]噻唑-5-基)甲基)-5-甲基吡咯烷-3-基)氧基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)乙-1-酮。在一些实施方案中，OGA抑制剂是结晶的。
本发明还提供了一种治疗认知或神经变性疾病的方法，包括向有需要的患者施用包含有效量的抗N3pGlu Aβ抗体与有效量的OGA抑制剂的组合的治疗。本发明还提供了一种治疗临床或临床前AD的方法，包括向有需要的患者施用包含有效量的抗N3pGlu Aβ抗体与有效量的OGA抑制剂的组合的治疗。本发明还提供了一种治疗前驱AD(有时也称为轻度认知障碍或MCI)、轻度AD痴呆、中度AD痴呆和/或重度AD痴呆的方法，包括向有需要的患者施用包含有效量的抗N3pGlu Aβ抗体与有效量的OGA抑制剂的组合的治疗。
在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗、预防或减缓被诊断患有临床前阿尔茨海默病(AD)(也称为症状前AD)、临床AD、前驱AD、轻度AD痴呆、中度AD痴呆、重度AD痴呆、唐氏综合征、临床脑淀粉样血管病或临床前脑淀粉样血管病的患者的功能/认知衰退的方法。此类方法包括向需要此类治疗的患者施用有效量的抗N3pG Aβ抗体与有效量的本文公开的OGA抑制剂的组合。本发明还提供了一种预防脑脊液(CSF)中Aβ1-42水平低或极低和/或脑中Aβ沉积低或极低的临床无症状个体记忆丧失、认知衰退或功能衰退的方法，包括施用有效量的抗N3pG Aβ抗体和有效量的本文公开的OGA抑制剂的组合。在一些实施方案中，已知临床上无症状的个体具有致阿尔茨海默病遗传突变。在本公开中，“已知具有致阿尔茨海默病遗传突变的临床无症状个体”包括已知具有PSEN1 E280A致阿尔茨海默病遗传突变(Paisa突变，一种引起常染色体显性阿尔茨海默病的遗传突变)的患者，或由于携带一个或两个APOE e4等位基因而处于发生AD的较高风险中的患者。在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗、预防或减缓已知具有PSEN1 E280A致阿尔茨海默病遗传突变(Paisa突变，一种引起常染色体显性阿尔茨海默病的遗传突变)的患者或携带一个或两个APOE e4等位基因的患者的认知/功能衰退的方法，包括向需要这种治疗的患者施用有效量的抗N3pG Aβ抗体与有效量的本文公开的OGA抑制剂的组合。
在一些实施方案中，本公开还提供了一种治疗、预防或减缓被诊断患有临床前阿尔茨海默病(AD)、临床AD、前驱AD、轻度AD痴呆、中度AD痴呆和重度AD痴呆的患者的认知/功能衰退的方法，包括向需要这种治疗的患者施用有效量的抗N3pG Aβ抗体与有效量的本文公开的OGA抑制剂的组合。本发明还提供了一种预防脑中NFT水平低和/或脑中淀粉样蛋白沉积水平低的临床无症状患者的记忆丧失或认知/功能衰退的方法，包括施用有效量的抗N3pG Aβ抗体与有效量的本文公开的OGA抑制剂的组合。
本发明的另一个实施方案提供了一种预防轻度认知障碍进展为AD的方法，包括向需要这种治疗的患者施用有效量的抗N3pG Aβ抗体与有效量的OGA抑制剂的组合。
本实施方案还提供了一种抗N3pG Aβ的抗体，其与OGA抑制剂同时、单独或顺序组合用于治疗。
本发明进一步提供了一种包含抗N3pG Aβ抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物，其与包含OGA抑制剂和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物组合。
另外，本发明提供了一种试剂盒，其包含抗N3pG Aβ抗体和OGA抑制剂。本发明进一步提供了一种试剂盒，其包含含抗N3pG Aβ抗体的药物组合物(具有一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂)和包含OGA抑制剂的药物组合物(具有一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、或赋形剂)。如本文所用，“试剂盒”包括位于单一包装中的包含各单个组分的单独容器，其中一种组分是抗N3pG Aβ抗体，并且另一种组分是OGA抑制剂。“试剂盒”还可以包括位于单独包装中的各单个组分的单独容器，其中一种组分是抗N3pG Aβ抗体，另一种组分是OGA抑制剂，所述单独包装具有将各单个组分作为组合施用的说明书。
本发明还提供了抗N3pG Aβ抗体在制备用于治疗AD、轻度AD、前驱AD或用于预防轻度认知障碍进展为AD的药物中的用途，其中所述药物是用于与OGA抑制剂同时、单独或顺序施用的。
在本公开的一些实施方案中，抗N3pG Aβ抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其中HC包含重链可变区(HCVR)并且LC包含轻链可变区(LCVR)，所述HCVR包含互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述LCVR包含CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，本发明的抗N3pG Aβ抗体具有由SEQ ID NO.5给出的LCDR1的氨基酸序列、由SEQ ID NO.6给出的LCDR2的氨基酸序列、由SEQ ID NO.7给出的LCDR3的氨基酸序列、由SEQ ID NO.8给出的HCDR1的氨基酸序列、由SEQ ID NO.9给出的HCDR2的氨基酸序列和由SEQ ID NO.10给出的HCDR3的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了包含LCVR和HCVR的抗N3pG Aβ抗体，其中LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO.1给出，并且HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO.2给出。在进一步的实施方案中，本发明提供了包含轻链(LC)和重链(HC)的抗N3pG Aβ抗体，其中LC的氨基酸序列由SEQ ID NO.3给出，并且HC的氨基酸序列由SEQ ID NO.4给出。
在一些实施方案中，本发明的抗N3pG Aβ抗体具有由SEQ ID NO.15给出的LCDR1的氨基酸序列、由SEQ ID NO.16给出的LCDR2的氨基酸序列、由SEQ ID NO.17给出的LCDR3的氨基酸序列、由SEQ ID NO.18给出的HCDR1的氨基酸序列、由SEQ ID NO.19给出的HCDR2的氨基酸序列和由SEQ ID NO.20给出的HCDR3的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了包含LCVR和HCVR的抗N3pG Aβ抗体，其中LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO.11给出并且HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO.12给出。在另一个实施方案中，本发明提供了一种抗N3pGAβ抗体，其包含轻链(LC)和重链(HC)，其中LC的氨基酸序列由SEQ ID NO.13给出，并且HC的氨基酸序列由SEQ ID NO.14给出。
本发明的抗N3pG Aβ抗体可以使用已知的方法来制备和纯化。例如，可以将编码抗N3pG Aβ抗体的HC的cDNA序列和编码抗N3pG Aβ抗体的LC的cDNA序列克隆并工程化至GS(谷氨酰胺合成酶)表达载体中。然后可以将工程化的免疫球蛋白表达载体稳定转染至CHO细胞中。本领域技术人员将理解，哺乳动物抗体的表达将导致糖基化，通常在Fc区中高度保守的N-糖基化位点处。可以验证稳定克隆是否表达与淀粉样蛋白沉积或N3pG Aβ特异性结合的抗体。阳性克隆可以扩展到无血清培养基中，用于在生物反应器中生产抗体。已分泌抗体的培养基可通过常规技术纯化。例如，培养基可方便地应用于已用相容缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)平衡的Protein A或G Sepharose FF柱。可以洗涤柱以除去非特异性结合成分。结合的抗体可以例如通过pH梯度洗脱，并且抗体级分可以使用诸如通过SDS-PAGE的技术来检测，并且随后合并。可以使用常用技术浓缩和/或无菌过滤抗体。可溶性聚集体和多聚体可以通过常用技术，包括尺寸排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石层析有效去除。产品可以立即冷冻，例如在-70℃下冷冻，或者可以冻干。
本发明的抗N3pG Aβ抗体结合人N3pG Aβ(也称为N3pGlu Aβ)。在一个实施方案中，本发明的抗N3pG Aβ抗体结合人N3pG Aβ的构象表位。
如本文所用，“抗体”是包含通过二硫键互连的两条重链(HC)和两条轻链(LC)的免疫球蛋白分子。每个LC和HC的氨基末端部分包括负责通过其中包含的互补决定区(CDR)负责抗原识别的可变区。CDR散布着更保守的区域，称为框架区。本发明抗体的LCVR和HCVR区域内的氨基酸对CDR结构域的分配基于以下：Kabat编号惯例(Kabat等人,Ann.NYAcad.Sci.190:382-93(1971)；Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242(1991)),和North编号惯例(North等人,A New Clustering ofAntibody CDR Loop Conformations,Journal of Molecular Biology,406:228-256(2011))。按照上述方法，测定了本发明的抗体的CDR。
本发明的抗N3pGlu Aβ抗体包括κLC和IgG HC。在一个具体的实施方案中，本发明的抗N3pGlu Aβ抗体是人IgG1同种型。
本发明的抗体是单克隆抗体(“mAb”)。单克隆抗体可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如CDR移植或此类技术的组合来产生，或通过本领域已知的其他技术来产生。本发明的单克隆抗体是人的或人源化的。人源化抗体可被工程化以包含围绕衍生自非人抗体的CDR的一个或多个人框架区(或基本上人的框架区)。人框架种系序列可以通过其网站imgt.cines.fr从ImMunoGeneTics获得或从Marie-PauleLefranc和Gerard Lefranc著的免疫球蛋白概况手册(Immunoglobulin FactsBook,Academic25Press,2001,ISBN 012441351)获得。在本发明的另一个实施方案中，抗体或编码该抗体的核酸以分离的形式提供。如本文所用，术语“分离的”是指在自然界中未发现的蛋白质、肽或核酸，并且不含或基本上不含在细胞环境中发现的其它大分子种类。如本文所用，“基本上不含”是指感兴趣的蛋白质、肽或核酸包含存在的大分子种类超过80％(以摩尔计)，优选超过90％，并且更优选超过95％。
本发明的抗N3pGlu Aβ抗体或其与OGA抑制剂的组合以药物组合物的形式施用。本发明的药物组合物可以通过肠胃外途径(例如皮下、静脉内、腹膜内、肌内)施用于处于本文所述的疾病或障碍的风险或表现出本文所述的疾病或障碍的患者。优选皮下和静脉内途径。在一些实施方案中，本发明的药物组合物通过静脉内输注施用。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“治疗(to treat)”等包括抑制、减缓或停止患者中现有症状、病症、疾病或障碍的进展或严重性。术语“患者”或“个体”是指人类。
术语“预防”是指向无症状患者或患有临床前阿尔茨海默病的患者预防性施用本发明的抗体以预防该疾病的发作或进展。
术语“以Aβ沉积(deposition)为特征的疾病”或“以Aβ沉积(deposits)为特征的疾病”可互换使用，并且指在病理学上以个体的脑中或脑脉管系统中的Aβ沉积为特征的疾病。这包括阿尔茨海默病(AD)、唐氏综合症(DS)和脑淀粉样血管病(CAA)等疾病。阿尔茨海默病的临床诊断、分期或进展可以由作为本领域技术人员的主治诊断医生或保健专业人员通过使用已知技术并通过观察结果容易地确定。这通常包括某种形式的脑斑块成像、精神或认知评估(例如，临床痴呆评定–方框摘要(Clinical Dementia Rating–summary of boxes,CDR-SB)、简易精神状态检查(Mini-Mental State Exam,MMSE)或阿尔茨海默病评估量表(Alzheimer’s Disease Assessment Scale-Cognitive,ADAS-Cog)或功能评估(例如，阿尔茨海默病合作研究-日常生活活动(ADCS-ADL)。认知和功能评估可用于确定患者认知的变化(例如，认知衰退)和功能的变化(例如，功能衰退)。本文所用的“临床阿尔茨海默病”是确诊的阿尔茨海默病的阶段。它包括诊断为前驱阿尔茨海默病、轻度阿尔茨海默病痴呆、中度阿尔茨海默病痴呆和重度阿尔茨海默病痴呆的病症。“临床前阿尔茨海默病”一词是指向临床阿尔茨海默病进展的临床阿尔茨海默病之前的一个阶段，其中生物标志物(例如CSF Aβ42水平或淀粉样蛋白PET沉积的脑斑块)的可测量变化表明阿尔茨海默病患者的病理学最早迹象。这通常发生在记忆丧失和意识模糊等症状出现之前。临床前阿尔茨海默病还包括症状前常染色体显性遗传携带者，以及由于携带一个或两个APOE e4等位基因而具有较高患AD风险的患者。术语“临床AD”是指可检测到认知迹象和症状的疾病阶段。
在一些实施方案中，当通过诸如用放射性标记的PET化合物进行淀粉样蛋白成像或使用检测Aβ或Aβ生物标志物的诊断剂的方法在脑中检测到淀粉样蛋白时，个体对于淀粉样蛋白沉积呈阳性。可以在本公开中使用以测量脑淀粉样蛋白负载/负荷的示例性方法包括，例如，氟贝他吡(Florbetapir)(Carpenter等人,“The Use of the Exploratory INDin the Evaluation and Development of18F-PET Radiopharmaceuticals for AmyloidImaging in the Brain:A Review of One Company's Experience,”The QuarterlyJournal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 53.4:387(2009)，其全部内容通过引用并入本文)；和氟美他酚(Flutemetamol)(Heurling等人,“Imagingβ-amyloid Using[18F]Flutemetamol Positron Emission Tomography:From Dosimetry to ClinicalDiagnosis,”European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 43.2:362-373(2016)，其全部内容通过引用并入本文)。
[18F]-氟贝他吡可以对患者(包括患有前驱AD或轻度AD痴呆的患者)的脑斑块负载进行定性和定量测量。例如，视觉读数中不存在显著的[18F]-氟贝他吡信号表明临床上表现出认知障碍的患者具有稀疏甚至没有淀粉样斑块。因此，[18F]-氟贝他吡也提供了淀粉样蛋白病理学的确认。[18F]-氟贝他吡PET还提供了脑中原纤维淀粉样斑块的定量评估，并且在一些实施方案中，可用于评估由本公开的抗体引起的脑中淀粉样斑块的减少。
用放射性标记的PET化合物进行的淀粉样蛋白成像还可用于确定人类患者脑中的Aβ沉积是否减少或增加(例如，计算治疗后Aβ沉积的减少百分比或评估AD的进展)。本领域技术人员可以将从淀粉样蛋白成像(用放射性标记的PET化合物)获得的标准化摄取值比率(SUVr)值关联起来，以计算治疗前后患者脑中Aβ沉积的％减少。SUVr值可以转换为标准化centiloid单位，其中100是AD的平均值，并且0是年轻对照的平均值，这允许淀粉样蛋白PET示踪剂之间进行比较，并根据centiloid单位计算减少量(Klunk等人,“The CentiloidProject:Standardizing Quantitative Amyloid Plaque Estimation by PET,”Alzheimer’s&Dementia 11.1:1-15(2015)和Navitsky等人,“Standardization ofAmyloid Quantitation with Florbetapir Standardized Uptake Value Ratios to theCentiloid Scale,”Alzheimer's&Dementia 14.12:1565-1571(2018)，其全部内容通过引用并入本文)。在一些实施方案中，脑淀粉样蛋白斑块沉积相对于基线的变化通过[18F]-氟倍他吡PET扫描来测量。
出于本公开的目的，还可以使用基于脑脊液或血浆的β-淀粉样蛋白分析来测量淀粉样蛋白负载/负荷。例如，Aβ42可用于测量脑淀粉样蛋白(Palmqvist,S.等人,“Accuracyof Brain Amyloid Detection in Clinical Practice Using Cerebrospinal FluidBeta-amyloid 42:a Cross-validation Study Against Amyloid Positron EmissionTomography.JAMA Neurol 71,1282-1289(2014)，其全部内容通过引用并入本文)。在一些实施方案中，Aβ42/Aβ40或Aβ42/Aβ38的比率可以用作淀粉样蛋白β的生物标志物(Janelidze等人,“CSF Abeta42/Abeta40 and Abeta42/Abeta38 Ratios:BetterDiagnostic Markers of Alzheimer Disease,”Ann Clin Transl Neurol 3,154-165(2016)，其全部内容通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，沉积的脑淀粉样蛋白斑块或CSF或血浆中的Aβ可用于将个体分组并鉴定哪组个体对使用本文所述的抗体或方法治疗/预防疾病(如本文所述)有反应。
人类个体脑中的Tau水平可以使用诸如用放射性标记的PET化合物进行的tau成像等方法来确定(Leuzy等人,“Diagnostic Performance of RO948 F18 Tau PositronEmission Tomography in the Differentiation of Alzheimer Disease from OtherNeurodegenerative Disorders,”JAMA Neurology 77.8:955-965(2020)；Ossenkoppele等人,“Discriminative Accuracy of[18F]-flortaucipir Positron Emission Tomographyfor Alzheimer Disease vs Other Neurodegenerative Disorders,”JAMA 320,1151-1162,(2018)，其全部内容通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，作为PET配体的生物标志物[18F]-florbtaucipir可用于本公开的目的。PET tau图像可例如通过公开的方法(Pontecorvo等人,“AMulticentreLongitudinal Study of Flortaucipir(18F)in Normal Ageing,Mild CognitiveImpairment and Alzheimer's Disease Dementia,”Brain 142:1723-35(2019)；Devous等人,“Test–Retest Reproducibility for the Tau PET Imaging Agent FlortaucipirF18,”Journal of Nuclear Medicine 59:937-43(2018)；Southekal等人,“FlortaucipirF18 Quantitation Using Parametric Estimation of Reference Signal Intensity,”J.Nucl.Med.59:944-51(2018)，其全部内容通过引用并入本文)进行定量评估，以估计SUVr(标准化摄取值比率)和/或通过视觉评估患者，例如，以确定患者是否患有AD模式(Fleisher等人,“Positron Emission Tomography Imaging With[18F]-flortaucipir andPostmortem Assessment of Alzheimer Disease Neuropathologic Changes,”JAMANeurology 77:829-39(2020)，其全部内容通过引用并入本文)。较低的SUVr值表示较少的tau负荷，而较高的SUVr值表示较高的tau负荷。在一个实施方案中，通过flortaucipir扫描的定量评估是通过自动化图像处理途径完成的，如Southekal等人,“Flortaucipir F18Quantitation Using Parametric Estimation of Reference Signal Intensity,”J.Nucl.Med.59:944–951(2018)中所述，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，将脑中感兴趣的特定靶向区域内的计数(例如，多块重心判别分析或MUBADA，参见Devous等人,“Test-Retest Reproducibility for the Tau PET Imaging AgentFlortaucipir F18,”J.Nucl.Med.59:937–943(2018)，其全部内容通过引用并入本文)与参考区域进行比较，其中参考区域是例如整个小脑(wholeCere)、小脑GM(cereCrus)、基于图谱的白质(atlasWM)、个体特定WM(ssWM，例如，使用参考信号强度的参数估计(PERSI)，参见Southekal等人,“Flortaucipir F18Quantitation Using Parametric Estimation ofReference Signal Intensity,”J.Nucl.Med.59:944–951(2018)，其全部内容通过引用并入本文)。确定tau负荷的优选方法是报告为标准化摄取值比率(SUVr)的定量分析，其表示与参考区域(例如，使用PERSI)相比脑中感兴趣的特定靶向区域内的计数(例如，MUBADA)。
在一些实施方案中，出于本公开的目的，磷酸化tau(P-tau；在苏氨酸181或217处磷酸化)可用于测量tau负载/负荷(Barthelemy等人,“Cerebrospinal Fluid Phospho-tauT217 Outperforms T181 as a Biomarker for the Differential Diagnosis ofAlzheimer's Disease and PET Amyloid-positive Patient Identification,”Alzheimer’s Res.Ther.12,26(2020)；Mattsson等人,“AβDeposition is Associatedwith Increases in Soluble and Phosphorylated Tau that Precede a Positive TauPET in Alzheimer’s Disease,”Science Advances 6(16),(2020)；其全部内容通过引用并入本文)。在一个具体实施方案中，出于本公开的目的，针对在残基217处的苏氨酸磷酸化的人tau的抗体可以用于测量个体中的tau负载/负荷(参见国际专利申请公开号WO 2020/242963，其全部内容通过引用并入)。在一些实施方案中，本公开包括使用WO 2020/242963中公开的抗tau抗体来测量个体中的tau负载/负荷。WO 2020/242963中公开的抗tau抗体针对在CNS中表达的人tau同工型(例如，识别在CNS中表达的同工型并且不识别仅在CNS外表达的人tau同工型)。此类针对在CNS中表达的人tau同工型的抗体可用于鉴定/选择作为以下一项或多项的患者的方法：(i)患有本文公开的疾病；(ii)处于患有本文公开的疾病的风险中；(iii)需要治疗本文公开的疾病；或(iv)需要神经成像。
认知衰退的减少或减缓可以通过认知评估例如简易精神状态检查(MMSE)或阿尔茨海默病评估量表(ADAS-Cog)来测量。功能衰退的减少或减缓可以通过功能评估例如阿尔茨海默病合作研究-日常生活活动(ADCS-ADL)来测量。功能和认知衰退的减少或减缓可以通过综合测量例如临床痴呆评定-方框摘要(CDR-SB)或综合阿尔茨海默病评级量表(iADRS)来测量。
如本文所用，“mg/kg”是指基于患者体重(以千克计)向患者施用的抗体或药物的毫克量。一次给予一剂量。例如，对于体重70kg的患者，10mg/kg剂量的抗体将是在单次施用中给予的单次700mg剂量的抗体。对于体重70kg的患者，20mg/kg剂量的抗体将是在单次施用中给予的单次1400mg剂量的抗体。类似地，对于体重80kg的患者，40mg/kg剂量的抗体将是在单次施用中给予的3200mg剂量的抗体。
如本文所用，短语“组合”是指本发明的抗N3pGlu Aβ抗体与另一种分子(“组合分子”，例如OGA抑制剂、对症药物或Aβ抗体)同时或以任何顺序依次施用，或以其任何组合施用。在一些实施方案中，短语“组合”是指本发明的抗N3pGlu Aβ抗体与OGA抑制剂同时或以任何顺序依次施用，或以其任何组合施用。这两种分子可以作为同一药物组合物的一部分或在单独的药物组合物中施用。抗N3pGlu Aβ抗体可以在施用OGA抑制剂之前、与其同时或在其之后施用，或以这些方式的某些组合施用。当以重复间隔(例如，在标准治疗过程中)施用组合时，可以在每次施用OGA抑制剂之前、与其同时或在其之后或以这些方式的某些组合施用抗N3pGlu Aβ抗体，或在与用OGA抑制剂治疗相关的不同间隔施用抗N3pGlu Aβ抗体，或在用OGA抑制剂治疗过程之前、期间任何时间或之后以单剂量或系列剂量施用抗N3pGlu Aβ抗体。
在本发明的具体实施方案中，抗体和抗体片段(例如，抗N3pG Aβ抗体)或编码其的核酸可以以分离的形式提供。如本文所用，术语“分离的”是指在自然界中未发现的蛋白质、肽或核酸，并且不含或基本上不含在细胞环境中发现的其它大分子种类。如本文所用，“基本上不含”是指感兴趣的蛋白质、肽或核酸包含存在的大分子种类超过80％(以摩尔计)，优选超过90％，并且更优选超过95％。
在一些实施方案中，本发明的抗体在细胞培养物中表达。在表达和/或分泌本发明的抗体和抗体片段后，澄清培养基以除去细胞，并使用许多常用技术中的任何一种来纯化澄清的培养基。纯化的抗体和抗体片段可以根据用于配制用于肠胃外施用、特别是用于皮下、鞘内或静脉内施用的蛋白质和抗体的公知方法配制为药物组合物。抗体和抗体片段可以与适当的药学上可接受的赋形剂一起冻干，并且随后在使用前用基于水的稀释剂重构。或者，可以在使用前将抗体和抗体片段配制在水溶液中并储存。在任一情况下，抗体和抗体片段的药物组合物的储存形式和注射形式将含有药学上可接受的一种或多种赋形剂，其是除抗体和抗体片段之外的成分。成分是否是药学上可接受的取决于其对安全性和有效性的影响或者对药物组合物的安全性、纯度和效力的影响。如果一种成分被判断为对安全性或有效性(或对安全性、纯度或效力)具有足够不利的影响，从而有理由认为其不能用于向人类施用的组合物中，则其对于用于抗体和抗体片段的药物组合物就是在药学上不可接受的。
本发明的新组合和方法包括脑渗透性OGA抑制剂。在本发明的新组合和方法的一些实施方案中，OGA抑制剂包含式I的化合物：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明的新组合和方法的OGA抑制剂是式Ia的化合物：
或其药学上可接受的盐。
式I的某些构型，其包含本发明的新组合和方法的OGA抑制剂的实施方案，进一步包括：
及其药学上可接受的盐。
式I的5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基化合物，其中哌啶环上的甲基和氧取代基为顺式或反式构型，或其药学上可接受的盐，包括在本发明新组合的OGA抑制剂的范围内。本发明的新组合还考虑了本发明的5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基化合物的所有单独的对映异构体和非对映异构体，以及对映异构体的混合物，包括外消旋体。本文提供的新组合和方法的5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基化合物的绝对构型包括：
N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺及其药学上可接受的盐；并且
特别优选N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。
本发明的5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基OGA抑制剂化合物或其盐可以通过本领域普通技术人员已知的多种方法来制备。本领域普通技术人员认识到，所描述的每一种途径的具体合成步骤可以以不同方式组合，或者与来自不同方案的步骤结合，以制备本发明的化合物或其盐。以下各步骤的产物可以通过本领域熟知的常规方法回收，包括萃取、蒸发、沉淀、色谱、过滤、研磨和结晶。在下面的方案中，除非另有说明，所有取代基均如先前所定义。试剂和起始材料对于本领域普通技术人员来说是容易获得的。在不限制本发明范围的情况下，提供以下制备方法和实施例来进一步说明本发明。另外，本领域普通技术人员理解，式Ia、Ib、Ic和Id的化合物可以通过使用可以由本领域技术人员制备的具有相应立体化学构型的起始材料来制备。例如，以下制备例使用具有最终对应于式Ia的构型的起始材料。
以下制备例和实施例旨在说明但不限制本发明，并且本领域普通技术人员可以进行各种修改。以下实施例和测定证明本发明的抗N3pG Aβ抗体可用于治疗以Aβ沉积为特征的疾病，例如阿尔茨海默病、唐氏综合症和CAA。
制备例1：N-(4-氟-5-甲酰基-噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯的合成。
在室温下，将氟化铯(227g，1480mmol)添加至N-(4-氯-5-甲酰基-噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(38.8g，148mmol；关于N-(4-氯-5-甲酰基-噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯的制备，参见例如，N.Masuda等人,Bioorg Med Chem,12,6171-6182(2004))在二甲基亚砜(DMSO，776mL)中的溶液中。将反应混合物在145℃加热块中搅拌48小时，内部温度为133℃，并将混合物在冰水浴中冷却。向混合物中加入饱和碳酸氢钠水溶液(500mL)、饱和NaCl水溶液(500mL)和乙酸乙酯(500mL)。将混合物在室温下搅拌10分钟，并通过硅藻土过滤，用乙酸乙酯(500mL)洗涤。将滤液转移至分液漏斗并分离各层，然后用乙酸乙酯(1L)萃取水层。将合并的有机物用饱和NaCl水溶液(1L)洗涤，然后用乙酸乙酯(300mL)萃取饱和NaCl水溶液层。将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到残余物。将残余物通过硅胶垫(330g)，用5％乙酸乙酯的二氯甲烷溶液(1.5L)洗脱，并将滤液减压浓缩，得到残余物(24.2g)。
将残余物(合并批次32.7g，133mmol)溶解于异丙醇(303mL)中，过滤，并通过SFC(超临界流体色谱法)纯化，使用IC柱(纤维素多糖衍生物：三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯，30×250mm，5μm)与10％异丙醇(无添加剂)以180mL/分钟进行，3mL进样量。将含有产物的级分浓缩，得到标题化合物(16.1g，48％收率)。MS m/z 247.0(M+H)。
制备例2：N-(4-氟-5-甲酰基-噻唑-2-基)乙酰胺的合成(方法A)。
在带夹套的容器中，在室温下，将溴化锌(91.9g，408mmol)一次性加入到N-(4-氟-5-甲酰基-噻唑-2-基)氨基甲酸叔丁酯(33.5g，136mmol)和二氯甲烷(503mL)的混合物中。将反应混合物在37℃的内部温度下搅拌过夜，然后将夹套温度设定为-10℃并在15分钟内逐滴加入四氢呋喃(111mL)，保持内部温度低于6℃。然后将夹套温度设定为-30℃，并在5分钟内逐滴加入吡啶(110mL，1360mmol)，保持内部温度低于5℃。将夹套温度设定为0℃并在5分钟内逐滴加入乙酸酐(116mL，1220mmol)。将反应混合物在37℃的内部温度下搅拌过夜，冷却至室温，并通过硅藻土短垫，用四氢呋喃(500mL)洗脱。将滤液转移至烧瓶中，并将混合物减压浓缩，得到残余物，将其再次从甲苯(50mL)中浓缩。向残余物中添加柠檬酸一水合物(57.2g，272mmol)在水(400mL)和2-甲基四氢呋喃(400mL)中的溶液，并将混合物在40℃搅拌5分钟。使混合物通过硅藻土短垫，用2-甲基四氢呋喃(100mL)洗脱。将滤液转移至分液漏斗并分离各层。水层用2-甲基四氢呋喃(2×250mL)萃取，并将合并的有机萃取物用水(500mL)稀释。在5分钟内向混合物中分批添加固体碳酸氢钠，同时搅拌直至气体逸出停止。将混合物转移至分液漏斗并分离各层；将水层用2-甲基四氢呋喃(200mL和100mL)萃取。将合并的有机萃取物经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物，将其用2-甲基四氢呋喃(100mL)稀释，并将混合物通过硅胶短垫(250g)，用2-甲基四氢呋喃(2.5L)洗脱。减压浓缩滤液，得到残余物，将其悬浮于二氯甲烷和庚烷的1:1混合物(202mL)中。将混合物在室温下搅拌30分钟并过滤。收集过滤的固体并在40℃下真空干燥2小时，得到标题化合物(18.0g，70％收率)。MS m/z189.0(M+H)。
N-(4-氟-5-甲酰基-噻唑-2-基)乙酰胺的替代合成(方法B)。
将二氯甲烷(1325g，15.6mol)添加到2-氨基-4-氯噻唑-5-甲醛(100g，0.61mol)和吡啶(194.6g，2.46mol)中，并冷却至0-5℃。逐滴加入乙酸酐(188.4g，1.85mol)，保持温度在0-5℃。添加完成后，调节温度至20-25℃并搅拌41小时。减压浓缩，随后添加35％HCl水溶液(200mL)和水(1.5L)，保持温度低于40℃。冷却至20-25℃并搅拌18小时。过滤所得混合物并用水洗涤收集的固体。将固体在60-65℃下干燥24小时，得到N-(4-氯-5-甲酰基噻唑-2-基)乙酰胺(75g，66％收率)。
在惰性气氛下，将环丁砜(1000mL)添加至N-(4-氯-5-甲酰基噻唑-2-基)乙酰胺(50g，0.24mol，以上直接制备)、四甲基氯化铵(107.1g，0.98mol)和氟化铯(370.6g，2.4mol)中。加热至130℃并搅拌23小时。HPLC分析显示标题化合物的转化率为75％，原位收率为45％。
N-(4-氟-5-甲酰基-噻唑-2-基)乙酰胺的替代合成(方法C)。
将2-丙醇(150mL)添加至四甲基氟化铵四水合物(10.2g，109.0mmol)中，并在真空下将混合物浓缩至约一半体积(内部温度维持在70℃)以除去水。添加2-丙醇(200mL)并在真空下将混合物浓缩至约一半体积。再重复两次。添加二甲基甲酰胺(DMF，200mL)并在真空下浓缩至约一半体积。添加四氢呋喃(THF，200mL)并浓缩至约一半体积。再重复两次。加入N-(4-氯-5-甲酰基噻唑-2-基)乙酰胺(1.22g，6.0mmol，在以上方法B中制备)和DMF(12mL)。加热至110℃并搅拌12小时。将反应混合物冷却至25℃。添加2-甲基四氢呋喃(40mL)和水(40mL)。分离所得层并用2-甲基四氢呋喃(40mL)萃取水层。分离各层，并用水(20mL)洗涤合并的有机层。分离各层，并将有机层减压浓缩。添加乙酸乙酯(20mL)和水(5mL)，分离所得各层，并将有机层浓缩以除去溶剂。添加乙酸乙酯(2mL)和庚烷(2mL)，并过滤所得混合物。将过滤的固体在55℃下真空干燥18小时，得到标题化合物，其为93％的与N-(4-氯-5-甲酰基噻唑-2-基)乙酰胺的混合物。
制备例3：(2S,4S)-4-羟基-2-甲基-哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成。
向烧瓶中添加(2S)-2-甲基-4-氧代-哌啶-1-甲酸叔丁酯(50g，234.4mmol)和四氢呋喃(500mL)。将混合物在氮气气氛下冷却至-65℃，并在45分钟内逐滴加入1M三(仲丁基)硼氢化锂在四氢呋喃中的溶液(304.77mL，304.8mmol)，保持内部温度低于-60℃。将反应混合物在室温下搅拌1小时并冷却至-30℃。向反应混合物中添加水(25.3mL)和四氢呋喃(100.2mL)的混合物，保持内部温度低于-20℃。在1小时内逐滴加入30％重量/重量过氧化氢(118.9mL，1.2mol)在水(126.70mL)中的水溶液，保持内部温度低于10℃。向混合物中加入5M HCl水溶液(46.9mL，234.4mmol)和甲基叔丁基醚(1L)，并将混合物加热至室温。分离各层，并将有机相与焦亚硫酸钠(222.8g，1.17mol)在水(500mL)中的溶液在室温下搅拌10分钟。分离各层，并将有机相经硫酸镁干燥并减压浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱纯化，用0-50％甲基叔丁基醚/异己烷洗脱，合并含有产物的级分并减压浓缩，得到标题化合物(40.4g，78％收率)。ES/MS m/z 238(M+Na)。(2S,4S)-4-羟基-2-甲基-哌啶-1-甲酸叔丁酯的替代合成。
在20℃下，向含有去离子水(460L)和磷酸二氢钾(6.5kg，0.41当量)的玻璃衬里反应器中加入DMSO(27.4kg，1.0vol)和D-(+)-葡萄糖一水合物(28.9kg，1.25当量)。将内部温度调节至30℃，并通过添加8％氢氧化钠水溶液(15L，0.3当量)将反应物的pH调节至6.9。向反应器中加入(2S)-2-甲基-4-氧代-哌啶-1-甲酸叔丁酯(24.9kg，1.0当量(99.1％ee))，并将混合物在30℃搅拌15分钟。酮还原酶(KRED-130，250g，1％重量/重量)、葡萄糖脱氢酶(GDH-101，250g，1％重量/重量)和NADP钠盐(63g，0.25％重量/重量)通过开口直接加入到反应混合物中。通过添加8％NaHCO3水溶液将混合物维持在30℃的温度和pH 7.0±0.2。搅拌16.5小时后，向反应物中加入硅藻土(12.5kg，50％重量/重量)和甲苯(125L，5vol)。在30℃下搅拌30分钟后，在1小时内通过串联GAF过滤器(4个管座(socket))将混合物转移至另一个2000L反应器中。使混合物在不搅拌的情况下静置30分钟，分离各层，并用甲苯(2×125L)反萃取水层。过滤合并的有机层(串联GAF过滤器)，并在25℃下用25％氯化钠水溶液(125L，5vol)洗涤甲苯混合物。将所得甲苯溶液共沸干燥(部分真空，内部温度<60℃)至0.10重量/重量％的水并冷却至20℃。在正氮气压力下，混合物通过筒式过滤器从反应器过滤到干净的桶中。然后将反应混合物从桶转移至500L玻璃衬里容器中并在真空(<60℃)下浓缩至约56L(2.25vol)的目标残余体积。在40℃下加入正庚烷(169kg，10vol)，并向混合物中加入25g(2S,4S)-4-羟基-2-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯。将所得粘稠浆液用另外的正庚烷(25L，1vol)稀释并在4小时内冷却至16℃。通过离心分离产物，用正庚烷洗涤(每次甩干25L；需要4次甩干)，在30℃下于盘式干燥机中干燥11小时后，得到20.3kg(81％收率；>99.9％ee)。ES/MS m/z 238(M+Na)。
制备例4：(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成。
在室温下，将3-(氯甲基)-5-甲基-1,2,4-噁二唑(43.5g，301mmol)添加到(2S,4S)-4-羟基-2-甲基-哌啶-1-甲酸叔丁酯(29.5g，137mmol)在乙腈(590mL)中的溶液中。将反应混合物在冰水浴中搅拌并在10分钟内分批添加叔丁醇钠(54.3g，548mmol)，保持内部温度低于10℃。将反应混合物在冰水浴中搅拌9小时(内部温度5℃)，缓慢加热至室温，并搅拌过夜。将反应混合物在冰水浴中冷却并在5分钟内添加饱和氯化铵水溶液(200mL)，在添加期间保持内部温度低于10℃。然后将混合物用水(100mL)稀释并加热至室温。用甲基叔丁基醚(2×300mL)萃取混合物，并用饱和氯化钠水溶液(300mL)洗涤合并的有机萃取物。将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到残余物。将残余物快速通过硅胶垫(300g)，用甲基叔丁基醚(1L)洗脱，并将滤液减压浓缩，得到标题化合物(46.5g，>99％收率)。MS m/z 334.0(M+Na)。
(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]哌啶-1-甲酸叔丁酯的替代合成。
在氮气、0℃下，向(2S,4S)-4-羟基-2-甲基-哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.25g，1.16mmol)和3-(氯甲基)-5-甲基-1,2,4-噁二唑(308mg，2.3mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中在5分钟内分批添加叔丁醇钠(0.35g，3.5mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟并在40℃下搅拌12小时。将反应混合物冷却至室温并用水(10mL)淬灭。分离各层，并用甲基叔丁基醚(2×10mL)萃取水相。将合并的有机萃取物用5％氯化锂水溶液洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，并减压浓缩，得到标题化合物(0.49g，81％收率，60％纯度)，为棕色油状物。MS m/z 334.0(M+Na)。
制备例5：5-甲基-3-[[(2S,4S)-2-甲基-4-哌啶基]氧基甲基]-1,2,4-噁二唑盐酸盐的合成。
将含有(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(4.0g,12.9mmol)的烧瓶浸没在冰水浴中。在搅拌下，在5分钟内向该烧瓶中逐滴加入4M盐酸在1,4-二噁烷中的溶液(25.9mL，104mmol)，在添加期间保持内部温度低于20℃。将反应混合物在室温下搅拌1小时并减压浓缩，得到标题化合物(3.5g，通过1HNMR测量，以83％纯度为基准，92％收率)。MS m/z 212.0(M+H)。
5-甲基-3-[[(2S,4S)-2-甲基-4-哌啶基]氧基甲基]-1,2,4-噁二唑盐酸盐的替代合成。
将甲醇(50mL)添加至(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(12.9g，0.04mol)中。将混合物冷却至0℃。将4M盐酸在甲醇中的溶液(80mL)逐滴加入到冷却的混合物中，保持内部温度低于20℃。将反应混合物在室温下搅拌18小时。浓缩混合物以除去溶剂。添加丙酮(10mL)，并将混合物搅拌20分钟。添加四氢呋喃(40mL)，并将混合物搅拌3小时。在氮气下通过过滤收集固体，并用四氢呋喃冲洗滤出的固体滤饼。将过滤的固体在45℃真空干燥2小时，得到标题化合物，纯度为90％。使用丙酮重结晶可以将标题化合物的纯度提高至95％。
制备例6：5-甲基-3-[[(2S,4S)-2-甲基-4-哌啶基]氧基甲基]-1,2,4-噁二唑的合成。
在氮气下，向(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.49g，1.6mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入三氟乙酸(1.8mL，23mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时。将混合物减压浓缩，得到黄色油状物。将残余物溶解在甲醇(5mL)中并倒在阳离子交换柱上，依次用甲醇(2×10mL)和2M氨在甲醇中的溶液(10mL)洗脱。将滤液减压浓缩，得到标题化合物(0.3g，91％收率)。MS m/z 212.0(M+H)。
在本发明的新组合和方法的其他实施方案中，OGA抑制剂是式X的化合物：
或其药学上可接受的盐。
另外，本发明提供式Xa的化合物：
或其药学上可接受的盐。
式X的某些构型，其包含本发明的新组合和方法的OGA抑制剂的实施方案，进一步包括：
及其药学上可接受的盐。
式X的5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基化合物，其中哌啶环上的甲基和氧取代基为顺式或反式构型，或其药学上可接受的盐，包括在本发明新组合的OGA抑制剂的范围内。本发明的新组合还考虑了本发明的5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基化合物的所有单独的对映异构体和非对映异构体，以及对映异构体的混合物，包括外消旋体。本文提供的新组合和方法的5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基化合物的绝对构型包括：
N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺及其药学上可接受的盐，包括游离碱，并且包括结晶形式。
本发明的新组合和方法的5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基化合物或其盐可以通过本领域普通技术人员已知的多种方法来制备，其中一些在以下方案、制备例和实施例中说明。本领域普通技术人员认识到，所描述的每一种途径的具体合成步骤可以以不同的方式组合，或者与来自不同方案的步骤结合，以制备本发明的化合物或其盐。以下各步骤的产物可以通过本领域熟知的常规方法回收，包括萃取、蒸发、沉淀、色谱、过滤、研磨和结晶。在下面的方案中，除非另有说明，所有取代基均如先前所定义。试剂和起始材料对于本领域普通技术人员来说是容易获得的。在不限制本发明范围的情况下，提供以下方案、制备例和实施例来进一步说明本发明。另外，本领域普通技术人员理解，式Xa、Xb、Xc和Xd的化合物可以通过使用可以由本领域技术人员制备的具有相应立体化学构型的起始材料来制备。例如，以下制备例使用具有最终对应于式Xa的构型的起始材料。
制备例7：2-[[(2S,4S)-1-叔丁氧基羰基-2-甲基-4-哌啶基]氧基]乙酸的合成。
在室温下，将2-氯-1-吗啉代-乙酮(59.4g，363mmol)添加到(2S,4S)-4-羟基-2-甲基-哌啶-1-甲酸叔丁酯(52.1g，242mmol)在乙腈(521mL)中的溶液中。将反应混合物在冰水浴中搅拌并在10分钟内分批添加叔丁醇钠(48.0g，484mmol)，保持内部温度低于15℃。将反应混合物在室温下搅拌2小时，并在5分钟内添加到另一个含有饱和氯化铵水溶液(250mL)和水(250mL)的烧瓶中，同时用冰水浴冷却，在添加期间保持内部温度低于15℃。将混合物加热至室温并用甲基叔丁基醚(2×500mL)萃取，并将合并的有机萃取物用饱和氯化钠水溶液(300mL)洗涤。将合并的有机物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到残余物，将其在室温下与2-丙醇(414mL)和2M氢氧化钠水溶液(303mL，605mmol)合并。将反应混合物在47℃加热块中搅拌过夜，内部温度为45℃。将反应混合物冷却至室温并浓缩以除去2-丙醇，并将混合物用水(50mL)稀释。将混合物用甲基叔丁基醚(250mL)萃取，并将水层在冰水浴中冷却并用乙酸(55.6mL，968mmol)酸化。用乙酸乙酯(4×250mL)萃取水性混合物；将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤；并浓缩，得到残余物，将其从甲苯(3×100mL)中浓缩，得到标题化合物(79.8g，>99％收率)。MS m/z 272.0(M-H)。
制备例8：(2S,4S)-4-[2-(2-乙酰肼基)-2-氧代-乙氧基]-2-甲基-哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成。
将四氢呋喃(798mL)添加至含有2-[[(2S,4S)-1-叔丁氧基羰基-2-甲基-4-哌啶基]氧基]乙酸(79.8g，224mmol)的烧瓶中，并将混合物在冰水浴中搅拌(内部温度为5℃)。向混合物中一次性加入1,1'-羰基二咪唑(43.5g，268mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌2小时。添加另一份1,1'-羰基二咪唑(7.25g，44.7mmol)并将反应混合物在室温下搅拌30分钟。将反应混合物浸入冰水浴中并一次性加入乙酰肼(21.5g，291mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在冰水浴中搅拌冷却并在2分钟内添加饱和碳酸氢钠水溶液(500mL)，保持内部温度低于15℃。将混合物用水(300mL)稀释并将所得混合物减压浓缩以除去四氢呋喃。所得水性混合物用2-甲基四氢呋喃(4×500mL)萃取。合并的有机萃取物经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物，将其与乙酸乙酯(200mL)和庚烷(200mL)合并。将混合物在室温下搅拌30分钟，用庚烷(200mL)稀释，在室温下再剧烈搅拌30分钟，并过滤。将过滤的固体在40℃下真空干燥2小时，得到第一批标题化合物(71.5g)。将滤液再过滤并将滤出的固体在氮气流下于室温干燥15分钟，得到第二批标题化合物(1.98g)。将大部分第一批产物(71.1g，216mmol)和第二批产物(1.97g，5.98mmol)与叔丁基甲基醚(731mL)合并，并将混合物在45℃加热块中搅拌30分钟，内部温度为40℃，在搅拌下于1小时内冷却至室温，并过滤。将过滤的固体在氮气流下于室温真空干燥30分钟，得到标题化合物(53.7g，71％收率)。MS m/z 352.0(M+Na)。
制备例9：(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成。
在氮气、室温下，向(2S,4S)-4-羟基-2-甲基-哌啶-1-甲酸叔丁酯(0.5g，2mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中的溶液中分批添加叔丁醇钠(920mg，9.3mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌40分钟。将反应混合物冷却至0℃并添加2-(氯甲基)-5-甲基-1,3,4-噁二唑(416mg，3.1mmol)。将所得溶液在室温下搅拌过夜。将反应混合物减压浓缩并将所得残余物用水稀释。将混合物用3份乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩，得到粗油状物。
将残余物溶解于二甲基亚砜(至总体积2mL)中，并通过制备型HPLC(PhenomenexGemini-NX 10Micron 30x100mm C-18)纯化，用15％(CH3CN&水(含有10mM碳酸氢铵)，用氢氧化铵调节至pH9)至100％CH3CN的梯度洗脱7分钟(50mL/分钟，1次进样，204nm)，得到标题化合物(28mg，4％收率)。MS m/z 312(M+H)。
(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]哌啶-1-甲酸叔丁酯的替代合成。
向烧瓶中添加(2S,4S)-4-[2-(2-乙酰肼基)-2-氧代-乙氧基]-2-甲基-哌啶-1-甲酸叔丁酯(53.7g，163mmol)和乙腈(537mL)并在室温下搅拌浆液。在水浴冷却下，在5分钟内向混合物中一次性加入N,N-二异丙基乙胺(114mL，652mmol)和分三次加入对甲苯磺酰氯(77.7g，408mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后在冰水浴中冷却。在10分钟内逐滴加入N',N'二甲基乙烷-1,2-二胺(21.8g，245mmol)，保持内部温度低于15℃。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，并在室温下用饱和柠檬酸水溶液(50mL)、乙酸乙酯(500mL)和水(450mL)稀释。分离各层，并用饱和柠檬酸水溶液(50mL)和水(450mL)的混合物洗涤有机层。将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(500mL)洗涤，然后将水层用乙酸乙酯(500mL)萃取。合并的有机萃取物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到残余物，将其通过硅胶短垫(400g)，依次用25％乙酸乙酯的庚烷溶液(2×500mL)和乙酸乙酯(5×500mL)洗脱。将含有产物的级分浓缩，得到标题化合物(53.3g，>99％收率)。MS m/z 312.2(M+H)。
制备例10：5-甲基-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-哌啶基]氧基甲基]-1,3,4-噁二唑2,2,2-三氟乙酸的合成。
在氮气下，向(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(27.5mg，0.09mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液中加入三氟乙酸(0.035mL，0.45mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物减压浓缩，得到标题化合物(0.04g，84％收率)。MS m/z 212.0(M+H)。
制备例11：2-甲基-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-哌啶基]氧基甲基]-1,3,4-噁二唑的合成。
在室温下，向烧瓶中添加(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]哌啶-1-甲酸叔丁酯(52.9g，170mmol)和二氯甲烷(265mL)。将反应混合物在冰水浴中搅拌(内部温度为5℃)，并在5分钟内逐滴加入三氟乙酸(265mL，3500mmol)，保持内部温度低于10℃。将反应混合物在室温下搅拌15分钟并浓缩，得到残余物，将其用水(300mL)和甲基叔丁基醚(300mL)稀释。分离各层，并将水层在冰水浴中搅拌并用50％氢氧化钠水溶液(20mL)碱化，在添加期间保持内部温度低于10℃。将混合物用二氯甲烷(4×300mL)萃取，并将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到标题化合物(30.5g，85％收率)。MSm/z212.2(M+H)。
在本发明的新组合和方法的其他实施方案中，OGA抑制剂是式XX的化合物：
或其药学上可接受的盐。
另外，本发明提供了式XXa的化合物：
或其药学上可接受的盐。
式X的某些构型，其包含本发明的新组合和方法的OGA抑制剂的实施方案，进一步包括：
及其药学上可接受的盐。
式XX的5-(甲基吡咯烷-3-基)氧基化合物，其中吡咯烷环上的甲基和氧取代基为顺式或反式构型，或其药学上可接受的盐，包括在本发明新组合的OGA抑制剂的范围内。本发明的新组合还考虑了本发明的5-(甲基吡咯烷-3-基)氧基化合物的所有单独的对映异构体和非对映异构体，以及对映异构体的混合物，包括外消旋体。本文提供的新组合和方法的5-(甲基吡咯烷-3-基)氧基化合物的绝对构型包括：
1-(2-(((3R,5S)-1-((6-氟-2-甲基苯并[d]噻唑-5-基)甲基)-5-甲基吡咯烷-3-基)氧基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)乙烷-1-酮及其药学上可接受的盐，包括游离碱，并包括结晶形式。
本发明的新组合和方法的5-(甲基吡咯烷-3-基)氧基化合物或其盐可以通过本领域普通技术人员已知的多种方法来制备，其中一些在以下方案、制备例和实施例中说明。本领域普通技术人员认识到，所描述的每一种途径的具体合成步骤可以以不同的方式组合，或者与来自不同方案的步骤结合，以制备本发明的化合物或其盐。以下各步骤的产物可以通过本领域熟知的常规方法回收，包括萃取、蒸发、沉淀、色谱、过滤、研磨和结晶。在下面的方案中，除非另有说明，所有取代基均如先前所定义。试剂和起始材料对于本领域普通技术人员来说是容易获得的。在不限制本发明范围的情况下，提供以下方案、制备例和实施例来进一步说明本发明。另外，本领域普通技术人员理解，式XXa、XXb、XXc和XXd的化合物可以通过使用可以由本领域技术人员制备的具有相应立体化学构型的起始材料来制备。例如，以下制备例使用具有最终对应于式XXa的构型的起始材料。
制备例12：1-(2-氯-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)乙烷-1-酮
将N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，3.6mL，21mmol)和乙酰氯(0.4mL，6mmol)逐滴加入到2-氯-6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-b]吡啶盐酸盐(1.0g，5.2mmol)在二氯甲烷(DCM，13mL)中的0℃溶液中。将反应混合物在室温下搅拌24小时。将所得混合物用DCM(20mL)和饱和NaHCO3水溶液(30mL)稀释。用DCM(2X30mL)萃取水层。将合并的有机萃取物经MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。将所得残余物溶解在DCM中，吸附到硅藻土上，通过快速色谱法在硅胶上纯化，用50-100％丙酮在己烷中的梯度洗脱，蒸发所需色谱级分的溶剂后得到标题化合物(0.95g，收率92％)。ES/MS m/z：197(M+H)。
制备例13：(2S,4R)-4-((6-乙酰基-6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-b]吡啶-2-基)氧基)-2-甲基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
在室温(RT)下，向(2S,4R)-4-羟基-2-甲基-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(0.41g，2.03mmol)、1-(2-氯-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)乙烷-1-酮(0.47g，2.36mmol)和四氢呋喃(THF，8mL)的溶液中分批添加叔丁醇钾(KO-t-Bu，0.45g，4mmol)并将混合物在50℃搅拌4.5小时。将反应混合物用水(50mL)和乙酸乙酯(EtOAc，50mL)稀释。将水层用EtOAc(2X50mL)萃取，并将合并的有机萃取物经MgSO4干燥，过滤，并在减压下浓缩。将所得残余物溶解在DCM中并通过快速色谱法在硅胶上纯化，用40-100％丙酮在己烷中的梯度洗脱，蒸发所需色谱级分的溶剂后得到标题化合物(0.34g，47％收率)。ES/MS m/z：262(M+HC4H9)。
制备例14：1-(2-(((3R,5S)-5-甲基吡咯烷-3-基)氧基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)乙烷-1-酮盐酸盐。
向(2S,4R)-4-((6-乙酰基-6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-b]吡啶-2-基)氧基)-2-甲基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(0.34g，0.94mmol)在DCM(5.0mL)中的溶液中添加4MHCl在1,4-二噁烷中的溶液(1.2mL，4.8mmol)。将所得混合物在室温下搅拌3小时。将所得悬浮液减压浓缩，并将所得残余物置于真空下1小时，得到标题化合物(0.28g，>99％收率)。ES/MS m/z：262(M+H)。
制备例15：N-(5-溴-2,4-二氟-苯基)乙酰胺。
在约61℃(内部温度60℃)的加热块中，在搅拌的同时向烧瓶中加入乙酸酐(Ac2O，389mL)。在30分钟内向烧瓶中分批添加5-溴-2,4-二氟苯胺(77.7g，374mmol)，在添加期间保持内部温度低于65℃。将反应混合物在加热块中于约61℃搅拌10分钟并冷却至室温，得到残余物，将其从甲苯(4×200mL)中浓缩，得到浅棕色/粉色固体。将浓缩的固体悬浮在庚烷(80mL)中，并将混合物在旋转蒸发器上在50℃水浴中在大气压下搅拌15分钟，冷却至RT，并过滤。收集过滤的固体并在40℃下真空干燥2小时，得到标题化合物(89.6g，95％收率)，为灰白色固体。ES/MS m/z：250(M+H)。
制备例16：N-(5-溴-2,4-二氟-苯基)硫代乙酰胺。
在室温下，向N-(5-溴-2,4-二氟-苯基)乙酰胺(89.6g，358mmol)在无水乙腈(ACN，896mL)中的溶液中添加吡啶-1-鎓-1-基-[吡啶-1-鎓-1-基(硫桥)硫代膦酰基]硫烷基-硫桥-硫代-膦(68.2g,179mmol,J.Org.Chem.76,1546–1553(2011))。将浆液在85℃加热块中搅拌过夜(内部温度80℃)，冷却至RT，并倒入冰(200g)和饱和NaCl水溶液(700mL)的混合物中。将混合物用EtOAc(900mL)稀释，在室温下搅拌10分钟，分离各层，并另外用EtOAc(900mL)萃取水层。将合并的有机萃取物用饱和NaCl水溶液(900mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并减压浓缩，得到标题化合物，为深棕色油状物，将其在RT下溶解于DMF(953mL)中，并且无需额外纯化即可使用。
制备例17：5-溴-6-氟-2-甲基-1,3-苯并噻唑。
在搅拌下，在20分钟内向N-(5-溴-2,4-二氟-苯基)硫代乙酰胺的DMF溶液中分批添加叔丁醇钠(NaO-t-Bu，42.6g，430mmol)，同时保持内部温度低于30℃。将反应混合物在RT搅拌5分钟，在42℃加热块(内部温度40℃)中搅拌过夜，并冷却至RT。将反应混合物在5分钟内逐滴加入至冰(250g)和H2O(700mL)的混合物中，保持内部温度低于20℃。将混合物在RT下搅拌10分钟并过滤。将过滤的固体在40℃下真空干燥过夜，并悬浮于50％MeOH/H2O(480mL)中。将混合物在45℃加热块中搅拌15min，冷却至RT，并过滤。将过滤的固体在40℃下真空干燥72小时，得到浅棕色固体。将物质与EtOAc(700mL)合并并将混合物在RT搅拌10分钟，添加H2O(700mL)，并分离各层。用EtOAc(700mL)萃取水层，然后用饱和NaCl水溶液(700mL)洗涤合并的有机萃取物，经MgSO4干燥，并减压浓缩，得到标题化合物(62.7g，71％收率)，为棕色固体。1H NMR(d6-DMSO)δ:2.82(s,3H),7.57(m,1H),8.12(m,1H)。制备例18：6-氟-2-甲基-1,3-苯并噻唑-5-甲醛。
在室温、搅拌下，将在DMF(1009mL)中的5-溴-6-氟-2-甲基-1,3-苯并噻唑(100.9g，410mmol)用N2鼓泡5分钟。添加甲酸钾(52.3g，615.0mmol)、乙酸钯(II)(2.82g，12.30mmol)、2-(二叔丁基膦基)联苯(5.19g，17.2mmol)和1,1,3,3-四甲基丁基异氰化物(90.8mL，492.0mmol)，并将混合物在室温、搅拌下用N2鼓泡30分钟。将反应混合物在65℃的内部温度下搅拌过夜，冷却至20-25℃，并在30分钟内逐滴加入2M HCl水溶液(820mL)，保持内部温度低于30℃。将所得混合物在20-25℃搅拌2小时并用EtOAc(1.5L)和H2O(1L)稀释。分离各层，并将有机层用10％N-乙酰基-半胱氨酸水溶液(2×1L)、饱和Na2CO3水溶液(750mL×2)和饱和NaCl水溶液(750mL)洗涤；将有机萃取物经MgSO4干燥并减压浓缩以得到第一批粗物质。将来自第一次萃取的HCl水层进一步用EtOAc(1L，然后500mL)萃取，并将合并的有机萃取物用饱和NaCl水溶液(500mL)洗涤，经MgSO4干燥，并在减压下浓缩以得到第二批粗物质。然后将合并的N-乙酰基-半胱氨酸水层用EtOAc(1L，然后500mL)萃取，并将合并的有机萃取物依次用饱和Na2CO3水溶液(500mL)和饱和NaCl水溶液(500mL)洗涤；将合并的有机萃取物经MgSO4干燥并减压浓缩以得到第三批粗物质。将三批粗物质合并在甲基叔丁基醚(MTBE，250mL)和庚烷(250mL)中，并将所得浆液在RT下搅拌20分钟。过滤所得沉淀并用庚烷(250mL)洗涤。将过滤的固体在45℃下真空干燥以得到第一批产物。浓缩滤液并通过硅胶柱色谱法纯化残余物，用0-100％EtOAc/庚烷的梯度洗脱。将含有产物的级分合并并浓缩至约400mL的体积，将所得浆液在RT下搅拌15分钟，过滤，并用庚烷(200mL)洗涤过滤的固体，得到第二批产物。将第一批和第二批产物与庚烷(500mL)合并，在室温下浆化，过滤，并用庚烷(250mL)洗涤过滤的固体。将过滤的固体在45℃下真空干燥过夜，得到标题化合物(63.5g，79％收率)。ES/MS m/z:196(M+H)。
应当理解，本文中作为本发明的新组合和方法的一部分提供的OGA抑制剂化合物的各个异构体、对映异构体和非对映异构体可以由本领域普通技术人员在任何方便的点，通过诸如选择性结晶技术或手性色谱的方法(参见例如，J.Jacques,等人,“Enantiomers,Racemates,and Resolutions,”John Wiley and Sons,Inc.,1981,and E.L.Eliel andS.H.Wilen,“Stereochemistry of Organic Compounds,”Wiley-Interscience,1994)分离或拆分。
本发明的OGA抑制剂化合物的药学上可接受的盐可以例如通过本发明化合物的适当游离碱与适当的药学上可接受的酸在适当的溶剂中在本领域熟知的标准条件下反应来形成。此类盐的形成是本领域公知和理解的。参见，例如，Gould,P.L.,“Salt selectionfor basic drugs,”International Journal of Pharmaceutics,33:201-217(1986)；Bastin,R.J.等人,“Salt Selection and Optimization Procedures forPharmaceutical New Chemical Entities,”Organic Process Research andDevelopment,4:427-435(2000)；和Berge,S.M.等人,“Pharmaceutical Salts,”Journalof Pharmaceutical Sciences,66:1-19,(1977)。
实施例1：OGA抑制剂N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺(式Ia)的合成。
该化合物及其合成公开于美国专利号US10,081,625中，该专利的全部内容通过引用并入本文。
在室温下，将N-(4-氟-5-甲酰基-噻唑-2-基)乙酰胺(28.3g，150mmol)添加至在乙酸乙酯(707mL)中的5-甲基-3-[[(2S,4S)-2-甲基-4-哌啶基]氧基甲基]-1,2,4-噁二唑盐酸盐(48.7g，185mmol，94％纯度)中。将反应混合物在室温下搅拌，并在1分钟内逐滴加入N,N-二异丙基乙胺(34.1mL，195mmol)，并一次性添加三乙酰氧基硼氢化钠(98.5g，451mmol)。将反应混合物在31℃加热块中搅拌过夜，内部温度为30℃，并在冰水浴中冷却至内部温度5℃。在15分钟内向混合物中添加2M盐酸水溶液(226mL)，保持内部温度低于10℃。向混合物中加入水(250mL)并将混合物在室温下搅拌5分钟。分离各层，并用2M盐酸水溶液(28mL)在水(50mL)中的混合物萃取有机层。将第一水层在冰水浴中搅拌，并在10分钟内逐滴加入50％氢氧化钠水溶液(25.7mL)，保持内部温度低于10℃。将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)稀释，在室温下搅拌10分钟，并用乙酸乙酯(3×400mL)萃取。将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到残余物。用盐酸水溶液萃取得到的第二水层用2-甲基四氢呋喃(200mL)稀释，并使混合物通过硅藻土短垫。将滤液转移至分液漏斗并分离各层。将水层在冰水浴中搅拌并在5分钟内逐滴加入50％氢氧化钠水溶液(3.15mL)，保持内部温度低于10℃。将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)稀释，在室温下搅拌5分钟，并依次用乙酸乙酯(3×40mL)和10％异丙醇的乙酸乙酯溶液(100mL)萃取。将合并的有机萃取物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到残余物，将其与来自后处理的第一部分的残余物合并。将合并的残余物通过硅胶垫(350g)，用乙酸乙酯(3.5L)洗脱，并将滤液浓缩，得到残余物(45.8g)。将残余物(47.5g合并批次，123.9mmol)通过快速色谱法在硅胶上纯化，用50-100％在庚烷中的乙酸乙酯洗脱。将含有产物的级分浓缩得到残余物，将其悬浮于甲基叔丁基醚和庚烷的1:1混合物(448mL)中。将混合物在46℃加热块中在45℃内部温度下搅拌30分钟，并在搅拌下在2小时内冷却至室温。过滤混合物，用甲基叔丁基醚和庚烷的1:1混合物(30mL)洗涤收集的固体。将过滤的固体在40℃下真空干燥过夜，得到标题化合物(28.5g，49％收率)。MS m/z384.0(M+H)。旋光度：[α]D 20＝+33.4°(C＝0.26，甲醇)。
N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺的替代合成。
在氮气下，向N-(4-氟-5-甲酰基-噻唑-2-基)乙酰胺(50mg，0.28mmol)和5-甲基-3-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[哌啶基]氧基甲基]-1,2,4-噁二唑(40mg，0.19mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(0.1mL，0.57mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(120mg，0.57mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物倒入饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)中。分离各层，并用二氯甲烷(2×10mL)萃取水相。将合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩，得到橙色油状物。将残余物溶解在甲醇中(至总体积为9.8mL)，过滤，并通过制备型HPLC(Phenomenex Gemini-NX 10Micron 50x 150mm C-18)纯化，用15％(CH3CN&水(含有10mM碳酸氢铵)，用氢氧化铵调节至pH9)至100％CH3CN的梯度洗脱10分钟(110mL/min，1次进样，271/204nm)，得到标题化合物(20mg，28％收率)。MS m/z 384.2(M+H)。
实施例1A：结晶N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。
在46℃下，将粗品N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺(29.9g)悬浮于448mL 50％甲基叔丁基醚的庚烷溶液中30分钟。搅拌混合物并在两小时内冷却至19℃，然后过滤，随后用30mL 50％甲基叔丁基醚的庚烷溶液洗涤，得到标题化合物(28.5g，95％收率)。
实施例1A的X射线粉末衍射(XRPD)。
结晶固体的XRPD图谱是在配备有CuKa源和Vantec检测器、在35kV和50mA下运行的Bruker D4 Endeavor X-射线粉末衍射仪上获得的。以2θ为4至40°扫描样品，2θ的步长为0.0087°，扫描速率为0.5秒/步，且发散角为0.6mm，固定防散射长度为5.28mm，且检测器狭缝为9.5mm。将干粉末装在石英样品架上，并使用载玻片获得光滑的表面。晶体学领域众所周知，对于任何给定的晶体形式，衍射峰的相对强度可能由于诸如晶体形态和习性等因素产生的优选取向而变化。当存在择优取向效应时，峰强度发生改变，但多晶型物的特征峰位置不变。(参见，例如，The U.S.Pharmacopeia 38-National Formulary35Chapter 941Characterization of crystalline and partially crystalline solidsby X-ray powder diffraction(XRPD)Official May 1,2015)。此外，晶体学领域还众所周知，对于任何给定的晶体形式，角峰位置可能略有不同。例如，峰位置可能由于分析样品的温度或湿度的变化、样品位移、或内标的存在或不存在而发生变化。在本例中，2θ中±0.2的峰位置变化将考虑这些潜在的变化，而不会妨碍所示晶体形式的明确识别。晶体形式的确认可以基于区分峰(以°2θ为单位)的任何独特组合，通常是更突出的峰。在环境温度和相对湿度下收集的晶体形式衍射图基于8.85和26.77度2θ处的NIST 675标准峰进行调整。
制备的结晶N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺样品通过使用CuKa辐射的XRPD图谱来表征，具有如下表1中所述的衍射峰(2-θ值)。具体地，该图谱包含12.1°的峰与选自15.3°、21.6°、22.2°、22.7°、23.5°、24.3°和26.8°的一个或多个峰的组合，并且衍射角误差为0.2度。
表1：实施例1A的结晶N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺的X射线粉末衍射峰。
实施例2：OGA抑制剂N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺(式Xa)的合成。
该化合物及其合成公开于美国专利号US10,081,625中，该专利的全部内容通过引用并入本文。
在氮气下，向2-甲基-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-哌啶基]氧基甲基]-1,3,4-噁二唑2,2,2-三氟乙酸(160mg，0.7mmol)在乙酸乙酯(1mL)中的溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(210mL，0.12mmol)并将溶液搅拌5分钟。加入N-(4-氟-5-甲酰基-噻唑-2-基)乙酰胺(40mg，0.12mmol)并搅拌5分钟，加入三乙酰氧基硼氢化钠(55mg，0.25mmol)，并将反应混合物加热至40℃并搅拌过夜。将混合物减压浓缩，得到棕色固体。将残余物溶解在二甲基亚砜中(至总体积为1mL)并通过制备型HPLC(Phenomenex Gemini-NX 10Micron 30x 100mm C-18)纯化，用15％(CH3CN&水(含有10mM碳酸氢铵)，用氢氧化铵调节至pH9)至100％CH3CN的梯度洗脱12分钟(100mL/min，1次进样，271/204nm)，得到标题化合物(7mg，14％收率)。MS m/z384.2(M+H)。
结晶N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺的替代合成。
在室温下，将三乙酰氧基硼氢化钠(59.1g，279mmol)添加至2-甲基-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-哌啶基]氧基甲基]-1,3,4-噁二唑(23.3g，93.0mmol)、乙酸乙酯(438mL)和N,N-二异丙基乙胺(32.4mL，186mmol)的混合物中。将反应混合物在31℃加热块中搅拌15分钟，内部温度为30℃，然后在5分钟内分批添加N-(4-氟-5-甲酰基-噻唑-2-基)乙酰胺(17.5g，93.0mmol)。将反应混合物在31℃加热块中搅拌过夜，内部温度为30℃，并在冰水浴中冷却至内部温度5℃。在15分钟内向混合物中添加2M盐酸水溶液(140mL)，保持内部温度低于10℃。将混合物在室温下搅拌15分钟，用水(50mL)和乙酸乙酯(20mL)稀释，并分离各层。将有机层用2M盐酸水溶液(35mL)在水(100mL)中的混合物萃取。将合并的水层在冰水浴中搅拌，并在10分钟内逐滴加入50％氢氧化钠水溶液(19.5mL)，保持内部温度低于10℃。将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)稀释并用2-甲基四氢呋喃(3×200mL)萃取。合并的有机萃取物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到残余物，将其通过快速色谱在硅胶上纯化，用0-15％2-丙醇的二氯甲烷溶液洗脱。将含有产物的级分浓缩，得到残余物，将其从庚烷(100mL)中浓缩。将浓缩的物质与40％乙酸乙酯的庚烷溶液(457mL)合并，并将混合物在50℃加热块中搅拌1小时，冷却至室温，并过滤。将过滤的固体在40℃下真空干燥1小时，得到第一批产物(22.9g)。浓缩滤液，得到残余物，将其与40％乙酸乙酯的庚烷溶液(50mL)合并，并将混合物在50℃加热块中搅拌30分钟，冷却至室温，并过滤。将过滤的固体与50％乙酸乙酯的庚烷溶液(33mL)合并，并将混合物在50℃加热块中搅拌1小时，冷却至室温，并过滤。将过滤的固体在40℃下真空干燥1小时，得到第二批产物(2.50g)。
在室温下，将包括第一批和第二批产物(29.3g)的批次组合与乙酸乙酯(117mL)和庚烷(117mL)合并。将混合物在51℃加热块中搅拌30分钟，内部温度为50℃，随后冷却至室温并过滤。将过滤的固体在40℃下真空干燥过夜，得到标题化合物(26.7g，75％收率)，为结晶固体。MS m/z 384.0(M+H)。旋光度：[α]D 20＝+39°(C＝0.2，甲醇)。
结晶N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺的X射线粉末衍射(XRPD)。
在60℃下，将结晶N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺(218mg)溶解在1.25mL甲醇中5分钟。将溶液冷却至环境温度并搅拌20分钟。通过真空过滤分离所得固体。最终固体产物为163mg或75％收率。
结晶固体的XRPD图谱是在配备有CuKa源和Vantec检测器、在35kV和50mA下运行的Bruker D4 Endeavor X-射线粉末衍射仪上获得的。以2θ为4至40°扫描样品，2θ的步长为0.0087°，扫描速率为0.5秒/步，且发散角为0.6mm，固定防散射长度为5.28mm，且检测器狭缝为9.5mm。将干粉末装在石英样品架上，并使用载玻片获得光滑的表面。晶体学领域众所周知，对于任何给定的晶体形式，衍射峰的相对强度可能由于诸如晶体形态和习性等因素产生的优选取向而变化。当存在择优取向效应时，峰强度发生改变，但多晶型物的特征峰位置不变。参见，例如，The U.S.Pharmacopeia 38-National Formulary35Chapter<941>Characterization of crystalline and partially crystallinesolids by X-ray powder diffraction(XRPD)Official May 1,2015。此外，晶体学领域还众所周知，对于任何给定的晶体形式，角峰位置可能略有不同。例如，峰位置可能由于分析样品的温度或湿度的变化、样品位移、或内标的存在或不存在而发生变化。在本例中，2θ中±0.2的峰位置变化将考虑这些潜在的变化，而不会妨碍所示晶体形式的明确识别。晶体形式的确认可以基于区分峰(以°2θ为单位)的任何独特组合，通常是更突出的峰。在环境温度和相对湿度下收集的晶体形式衍射图基于8.85和26.77度2θ处的NIST 675标准峰进行调整。
因此，结晶N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺通过使用CuKa辐射的XRPD图谱来表征，具有如表2中所述的衍射峰(2-θ值)。更具体地，该图谱优选地包含在13.5°的峰与选自5.8°、13.0°、14.3°、17.5°、20.4°、21.4°和22.2°的一个或多个峰的组合，衍射角误差为0.2度。
表2：结晶N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺的X射线粉末衍射峰。
体外人OGA酶测定
OGA蛋白的产生
将编码全长人O-GlcNAc-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NM_012215)的核苷酸序列插入带有N末端多组氨酸(HIS)标签的pFastBac1(Invitrogen)载体中。根据Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen)方案进行杆状病毒生成。每升培养物使用10mL P1病毒以1.5×106个细胞/mL感染Sf9细胞，并在28℃下孵育48小时。将细胞离心，用PBS冲洗，并将沉淀物在-80℃储存。
上述OGA蛋白(His-OGA)的纯化如下：在4℃下，将4L细胞于200mL含有50mM Tris、pH 8.0、300mM NaCl、10％甘油、10mM咪唑、1mM二硫苏糖醇(DTT)、0.1％TritonTM X-100、4片蛋白酶抑制剂(完整不含EDTA，Roche)的缓冲液中裂解45分钟。然后将该细胞裂解液在4℃下以16500rpm的转速旋转40分钟，并将上清液与6mL Ni-NTA树脂(镍-次氮基三乙酸)在4℃下孵育2小时。
然后将树脂填充到柱子上，并用50mM Tris、pH8.0、300mM NaCl、10％甘油、10mM咪唑、0.1％TritonTM X-100、1mM DTT洗涤，随后用50mM Tris、pH8.0、150mM NaCl、10mM咪唑、10％甘油、1mM DTT洗涤。用50mM Tris、pH8.0、150mM NaCl、300mM咪唑、10％甘油、1mM DTT洗脱蛋白质。合并的含有His-OGA的级分浓缩至6mL并加载到Superdex75(16/60)上。用50mMTris、pH8.0、150mM NaCl、10％甘油、2mM DTT洗脱蛋白质。合并含有His-OGA的级分，并用BCA(Bradford比色测定法)测量蛋白质浓度。
OGA酶测定
OGA酶催化从核细胞质蛋白中去除O-GlcNAc。为了测量该活性，使用荧光素二-N-乙酰基-β-N-乙酰基-D-氨基葡糖苷(FD-GlcNAc，Kim等人,Carbohydrate Research(2006),341(8),971-982)作为底物，终浓度为10μM(96孔测定格式)或6.7μM(384孔测定格式)。这种荧光底物在被OGA切割后会发出荧光，因此可以通过在535nm处(在485nm处激发)检测到的荧光增加来测量酶活性。
配制测定缓冲液，得到在水中、pH7下的最终浓度为50mM的H2NaPO3-HNa2PO3、0.01％牛血清白蛋白和0.01％TritonTM X-100。最终酶浓度为3nM(在96孔测定形式中)或3.24nM(在384孔测定形式中)。两种测定形式产生基本上相同的结果。
使用十点浓度响应曲线将待测化合物在纯二甲基亚砜(DMSO)中稀释。反应混合物中的最大化合物浓度为30μM。将适当浓度的化合物与OGA酶预孵育30分钟，然后通过添加底物开始反应。反应在室温下进行60分钟。然后，在不停止反应的情况下读取荧光。IC50值通过绘制归一化数据vs.化合物的对数曲线并使用四参数逻辑方程拟合数据来计算。
实施例1的化合物基本上如上所述进行测试并且表现出1.97nM±1.22(n＝9)的IC50。该数据证明实施例1的化合物在体外抑制OGA酶活性。
实施例2的化合物也基本上如上所述进行测试并且表现出2.13nM±0.89(n＝5)的IC50。该结果证明实施例2的化合物在体外抑制OGA酶活性。
用于测量OGA酶活性抑制的全细胞测定
细胞铺板：
利用本领域已知的标准条件，产生经修饰以可诱导表达微管相关蛋白tau的P301S-1N4R形式的TRex-293细胞并维持在由DMEM高葡萄糖(Sigma#D5796)组成的生长培养基中，补充有10％不含四环素的胎牛血清(FBS，Sigma F2442)、20mM HEPES、5μg/mL杀稻瘟菌素(Life Technologies#A11139-03)和200μg/mL Zeocin(Life Technologies#R250-01)。在实验中，将细胞以每孔10,000-14,000个细胞的密度铺板于包被有聚D-赖氨酸的Corning Biocoat(356663)384孔板中，并在细胞培养箱中于37℃/5％CO2下孵育20-24小时。实验在不诱导Tau表达的情况下进行。
化合物处理：
使用十点浓度响应曲线将待测化合物在纯DMSO中连续稀释1/3，并在生长培养基中进一步稀释。铺板后20-24小时，用在生长培养基中的测试化合物处理细胞；最大化合物浓度为15μM(0.15％DMSO)。最大抑制是通过15μM Thiamet G的重复测量来定义的，最小抑制是通过0.15％DMSO处理的重复测量来定义的。将细胞放回到37℃/5％CO2的培养箱中20-24小时。在每个板中对化合物进行重复测试。
免疫染色：
化合物处理20-24小时后，从测定板中除去培养基，并将25μL在DPBS(Sigma#D8537；Dulbecco磷酸盐缓冲盐水)中的3.7％甲醛溶液(Sigma#F1635)添加到每个孔中并孵育30分钟。然后用DPBS洗涤细胞一次，然后用0.1％TritonTM X-100(Sigma#T9284)透化。30分钟后，用DPBS洗涤细胞两次，然后将封闭液(1％BSA/DPBS/0.1％TritonTM X-100)加入到每孔中并孵育60分钟。除去封闭液，并将0.40-0.33μg/mL O-GlcNAc蛋白抗体(RL2克隆，Thermo，MA1072)在封闭液中的溶液添加到细胞中，并在2-8℃下静置过夜。第二天，用DPBS洗涤细胞两次，并将在DPBS中的2μg/mL的二抗Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(LifeTechnologies#A11001)添加到每个孔中，并在室温下静置90分钟。除去二抗，将细胞用DPBS洗涤两次，并将浓度为1和50μg/mL的DAPI(Sigma#D9564；4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二乳酸)和RNase(Sigma，R6513)在DPBS中的溶液分别添加到每个孔中。将板密封，孵育一小时并在Acumen eX3 hci(TTP Labtech)上进行分析。除一抗外，上述所有孵育和洗涤步骤均在室温下进行。
分析与结果：
使用488和405nm激发激光器以及两个发射滤光片FL2(500-530nm)和FL1(420-490nm)在Acumen eX3仪器上对板进行分析。FL2过滤器是对应于O-GlcNAc蛋白抗体(RL2克隆)的信号，FL1过滤器是对应于细胞核(DAPI)的信号。总FL2/总FL1的比率(没有对象或群体选择的每个孔的总荧光)用于数据分析。将数据归一化为由15μM Thimamet G处理所参照的最大抑制和由0.15％DMSO处理所获得的最小抑制。使用非线性曲线拟合应用程序(4参数逻辑方程)对数据进行拟合，并计算和报告IC50值。
实施例1的化合物基本上如上所述进行测试并且表现出21.9nM±7.3(n＝5)的IC50。该数据证明实施例1的化合物在细胞测定中抑制OGA酶活性。
实施例2的化合物也基本上如上所述进行测试并且表现出22.6nM±7.3(n＝3)的IC50。该结果证明实施例2的化合物在细胞测定中抑制OGA酶活性。
在健康个体中进行的单次剂量递增研究以评估实施例1的化合物的安全性和药代动力学
进行1期、单中心、个体和研究者盲、单次递增剂量、安慰剂对照、交叉、随机研究以评估实施例1的化合物在健康个体中的安全性、耐受性和药代动力学(PK)。该研究在2个交替组(组1和组2)中进行，最多3个研究期，涉及6个剂量水平。将个体随机分配至每个组中的3个治疗序列中的1个，每个序列包括2个剂量的实施例1的化合物和在3个研究期间内以完全交叉的方式的1个安慰剂剂量。临床研究设计总结于表3中。
表3.临床研究设计。
第1组 第2组
第1期 0.15mg实施例1的化合物或安慰剂 ---
第1期 ≥7天清洗 0.6mg实施例1的化合物或安慰剂
第2期 2mg实施例1的化合物或安慰剂 ≥7天清洗
第2期 ≥7天清洗 5mg实施例1的化合物或安慰剂
第3期 10mg实施例1的化合物或安慰剂 ≥7天清洗
第3期 --- 16mg实施例1的化合物或安慰剂
禁食至少8小时过夜后，在每个给药日的早晨以坐姿服用约240mL室温水施用口服胶囊。与口服胶囊给药类似，通过口服给药注射器用水以实施例1的化合物的口服溶液形式施用0.15mg至2mg的剂量。表4a和4b总结了治疗方案。
表4a.实施例1的化合物的治疗方案。
剂量强度(mg) 0.15至2 5至16
剂量制剂 口服溶液 胶囊
剂量 临时制剂 临时制剂
施用途径 口服 口服
剂量说明 单剂量 单剂量
表4b.安慰剂的治疗方案。
剂量强度(mg) 不适用 不适用
剂量制剂 口服溶液(载体) 胶囊(HPMC1)
剂量 匹配安慰剂 匹配安慰剂
施用途径 口服 口服
剂量说明 单剂量 单剂量
1HPMC＝羟丙甲纤维素
含有实施例1的化合物的胶囊是临时制备的。0.15mg至2mg的实施例1的化合物的口服剂量临时制备为溶液中的药物。对于任何特定组/给药期，施用的胶囊总数对于所有个体是相同的，无论分配给安慰剂还是实施例1的化合物。然而，胶囊的数量在给药期和组之间可以变化。这与临时制备口服给药溶液以维持盲法的情况类似。实施例1的化合物以游离碱的形式提供，不含用于临时制备的非活性成分。使用匹配体积的不含实施例1的化合物的口服溶液载体作为0.15mg至2mg剂量的安慰剂。
收集约3mL的静脉血样品以确定实施例1的化合物的血浆浓度。使用经验证的液相色谱法和串联质谱法方法测定实施例1的化合物的浓度。使用标准非区室分析方法计算实施例1的化合物的PK参数估计值。实施例1的化合物的血浆浓度通过实施例1的化合物的施用剂量和PK血样采集的大致时间来总结。基本上按照如上所述的方法，实施例1的化合物在健康个体中的单次递增剂量的PK数据列于表5和表6中。
表5.在健康个体中口服施用实施例1的化合物后单次递增剂量研究的平均血浆浓度。
表6.在健康个体中口服施用后实施例1的化合物的PK参数1。
1除非另有说明，数据以几何平均值(％CV几何平均值)表示
2实施例1的化合物的施用量
3N＝个体数量
4CL/F＝口服施用后计算的表观清除率
5AUC(0-∞)＝从时间零到无穷大的浓度与时间曲线下的面积
6Cmax＝观察到的最大药物浓度
7Vz/F＝口服施用后表观分布容积
8t1/2＝终末半衰期(几何平均值(min-max))
9tmax＝观察到的最大药物浓度的时间；中位数(min-max)
10Ae0-24＝给药后直至24小时尿液中排泄的实施例1的化合物的量
11CLr＝肾清除率
12N＝5
13N＝3
14NC＝未计算
数据公开了实施例1的化合物在0.6mg至16mg剂量范围内AUC(0-∞)和Cmax大约与剂量成比例地增加。对于实施例1的化合物，中位tmax为约1小时并且t1/2为约6小时。
在健康个体中通过正电子发射断层扫描用放射性配体[18F]LSN3316612测量实施例1的化合物的单次口服剂量后脑O-GlcNAcase酶占有率的评估
由本领域普通技术人员基本上如下所述进行单中心、开放标签、非随机、正电子发射断层扫描(PET)研究，证明0.25mg、1mg和5mg N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺(式I的化合物)的单次口服剂量后脑O-GlcNAcase(OGA)的脑渗透和靶点接合。[18F]LSN3316612是用于脑中OGA的体内成像的正电子发射放射性药物，并且用于评价抑制OGA的化合物的靶点接合。18F-LSN3316612作为PET放射性配体的制备和用途是本领域已知的，例如如S.Lu等人,ScienceTranslational Medicine,12,(2020)中所述。使用[18F]LSN3316612示踪剂的这种单剂量PET研究评估了在已证明是安全和良好耐受的剂量的合适范围内的脑OGA酶占有率(EO)。
健康个体被分配至4个组中的1个，每个组中有4名个体完成研究。所有个体均接受一次基线PET扫描和两次给药后PET扫描。在给予实施例1的化合物之前最多大约14天进行基线PET扫描。总之，每个个体接受单剂量的实施例1的化合物和3次施用的[18F]LSN3316612PET示踪剂。实施例1的化合物的给药在基线PET扫描完成后进行。对于0.25mg和5mg剂量的实施例1的化合物，在给药后约2小时和24小时进行扫描，对于1mg剂量的实施例1的化合物，在给药后约2小时和24小时或30小时和54小时进行扫描。示踪剂注射后立即在120min内采集大脑的动态PET数据。EO通过实施例1的化合物剂量和近似扫描时间来总结。
对于≥3mg的剂量，将实施例1的化合物以胶囊制剂的形式口服给药。对于低于3mg的剂量，将实施例1的化合物称重放入合适的容器中并溶解在适当体积的脱气或稀释剂中。
[18F]LSN3316612是在每次PET扫描当天在临床现场放射化学设施中由非放射性前体产生的。[18F]LSN3316612注射液是一种用于静脉注射的澄清溶液，由含有乙醇、无菌注射用水和抗坏血酸钠的生理盐水配制而成。[18F]LSN3316612以配制的生理盐水(0.9％NaCl)形式递送，目的是含有约3.3％(v/v)乙醇(EtOH)和抗坏血酸钠(4.67mg/mL)。将[18F]LSN3316612使用输液泵在3分钟输注期间静脉内施用，然后用10mL盐水冲洗。在PET成像之前，根据标准临床实践为个体插入静脉导管(用于放射性示踪剂输注)。每个个体在每次成像访视时接受一次[18F]LSN3316612注射。静脉注射放射性药物的剂量约为5mCi(不超过6mCi)，最大质量剂量为10μg，最大体积为10mL。
对于每次PET扫描，放射化学实验室根据本领域已知的PET单元生产方案从前体合成放射性配体，例如由Lee,J.,Liow,J.,Paul,S.等人,“PET Quantification of Brain O-GlcNAcase With[18F]LSN3316612in Healthy Human Volunteers,”EJNMMI Res 10,20(2020)中所述。
每次PET扫描期间都会收集所有个体的动脉血样本，以测量放射性，从而为PET示踪剂动力学分析提供输入。在给予实施例1的化合物后收集静脉血样品，以使用经验证的液相色谱法和串联质谱法分析测量实施例1的化合物的血浆浓度。
[18F]LSN3316612 PET的主要成像结果是在OGA存在的区域中确定的总分布体积(VT)，所述区域包括皮层区、基底神经节区域、丘脑和小脑。分析使用不同脑区域中的衰减校正的时间活动数据。用具有动脉输入功能的2-组织区室模型分析成像数据以确定VT。根据占有率图使用图形分析获得单剂量的实施例1的化合物后的OGA EO：
VT(基线)-VT(给药)＝占有率*(VT(基线)-VND),
其中VT(基线)和VT(给药)分别是在基线和实施例1的化合物施用后获得的几个区域中的总分布体积。占有率被确定为曲线的线性回归的斜率，而不可分割的分布体积VND作为x截距。
基本上按照上述方法，0.25mg、1mg和5mg实施例1的化合物的单次口服剂量后脑OGA的靶点接合如表7a-7c所示。
表7a：0.25mg剂量的实施例1的化合物的脑OGA占有率。
表7b：1mg剂量的实施例1的化合物的脑OGA占有率。
表7c：5mg剂量的实施例1的化合物的脑OGA占有率。
表7a-7c中提供的数据公开了脑OGA EO的血浆浓度依赖性变化，其中5mg剂量的实施例1的化合物在给药后24小时EO超过90％EO。发现1mg剂量的实施例1的化合物在给药后24小时为80.6％EO，在给药后54小时为30.3％EO。发现0.25mg剂量的实施例1的化合物在给药后24小时为46％EO。
利用来自实施例1的化合物在健康个体中的单次递增剂量研究的PK数据和证明在如上所述的实施例1的化合物的单次口服剂量后脑OGA的脑渗透和靶点接合的PET研究，下面列出了用实施例1的化合物治疗神经变性疾病，包括AD和其他神经变性tau蛋白病的低剂量和剂量方案：
实施例1的化合物的总剂量为0.25mg/天至5mg/天。
实施例1的化合物的总剂量为0.1mg/天至3mg/天。
实施例1的化合物的总剂量为0.25mg/天至3mg/天。
实施例1的化合物的总剂量为0.1mg/天至2mg/天。
实施例1的化合物的总剂量为0.25mg/天至2mg/天。
实施例1的化合物的总剂量为0.1mg/天至1mg/天。
实施例1的化合物的总剂量为0.25mg/天至1mg/天。
实施例1的化合物的总剂量为5mg/天。
实施例1的化合物的总剂量为3mg/天。
实施例1的化合物的总剂量为2mg/天。
实施例1的化合物的总剂量为1mg/天。
实施例1的化合物的总剂量为0.25mg/天。
实施例1的化合物的总剂量为0.1mg/天。
优选实施例1的化合物的每日总剂量为一个单位剂量。
进一步优选施用的实施例1的化合物的每日总剂量为两个单位剂量。优选地，实施例1的化合物的每日总剂量以两个单位剂量施用，其中每个剂量含有等量的实施例1的化合物。优选地，当实施例1的化合物的每日总剂量以两个单位剂量施用时，每个单位剂量的施用间隔至少8小时。
另外，实施例1的化合物在药物组合物中的总剂量如下：
实施例1的化合物的总剂量为0.25mg至5mg。
实施例1的化合物的总剂量为0.1mg至3mg。
实施例1的化合物的总剂量为0.25mg至3mg。
实施例1的化合物的总剂量为0.1mg至2mg。
实施例1的化合物的总剂量为0.25mg至2mg。
实施例1的化合物的总剂量为0.1mg至1mg。
实施例1的化合物的总剂量为0.25mg至1mg。
实施例1的化合物的总剂量为3mg。
实施例1的化合物的总剂量为2mg。
实施例1的化合物的总剂量为1mg。
实施例1的化合物的总剂量为0.25mg。
另外，优选包含实施例1的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的总剂量包含在一个单位剂量中。
进一步优选包含实施例1的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的总剂量包含在一个单位剂量中，其中该单一单位剂量每天施用一次。
还优选包含实施例1的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的总剂量包含在两个单位剂量中。
优选包含实施例1的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的总剂量包含在两个单位剂量中，每个单位剂量含有等量的实施例1的化合物。
进一步优选包含实施例1的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的总剂量包含在两个单位剂量中，其中每个剂量在一天内施用。
进一步优选包含实施例1的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的总剂量包含在两个单位剂量中，每个单位剂量包含等量的实施例1的化合物，其中每个剂量在一天内施用，优选间隔至少8小时。
实施例3：工程化抗N3pGlu Aβ抗体的表达和纯化
N3pGlu Aβ的抗体是本领域已知的。例如，美国专利号8,679,498；美国专利号8,961,972；美国专利号10,647,759；和美国专利号11,078,261(其全部内容通过引用并入本文)公开了抗N3pGlu Aβ抗体、制备抗体的方法、抗体制剂以及用此类抗体治疗疾病例如阿尔茨海默病的方法。下表8中提供了示例性抗N3pG Aβ抗体的氨基酸序列。
表8：抗N3pGlu Aβ抗体SEQ ID NOs。
抗体 轻链 重链 LCVR HCVR
I 3 4 1 2
II 13 14 11 12
本发明抗N3pGlu Aβ抗体可以基本上如下制备和纯化。对于抗体I，使用最佳预定HC：LC载体比或同时编码HC如SEQ ID NO：22和LC如SEQ ID NO：21的单一载体系统，用分泌抗体的表达系统瞬时或稳定转染适当的宿主细胞，例如HEK 293EBNA或CHO。使用许多常用技术中的任何一种来纯化已分泌有抗体的澄清培养基。例如，培养基可以方便地应用于已用相容缓冲液(如磷酸盐缓冲盐水(pH7.4))平衡的Protein A或G Sepharose FF柱。洗涤柱以除去非特异性结合成分。例如通过pH梯度(例如0.1M磷酸钠缓冲液pH6.8至0.1M柠檬酸钠缓冲液pH2.5)洗脱结合的抗体。例如通过SDS-PAGE检测抗体级分，然后合并。根据预期用途，进一步纯化是可选的。可以使用常用技术浓缩和/或无菌过滤抗体。可溶性聚集体和多聚体可以通过常用技术，包括尺寸排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石层析有效去除。经过这些层析步骤后，抗体I的纯度大于99％。该产品可以立即在-70℃下冷冻或冻干。
抗体II基本上可以如下表达和纯化。使用含有编码SEQ ID NO:24的HC氨基酸序列的DNA序列和编码SEQ ID NO:23的LC氨基酸序列的DNA序列的谷氨酰胺合成酶(GS)表达载体通过电穿孔转染中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)。表达载体编码SV Early(猿猴病毒40E)启动子和GS基因。转染后，细胞用0-50μM L-蛋氨酸亚砜亚胺(MSX)进行批量选择。然后将选定的大量细胞或主孔在无血清悬浮培养物中放大以用于生产。将已分泌抗体的澄清培养基上样到已用相容缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水(pH7.4))平衡的Protein A亲和柱上。用1M NaCl清洗柱子以除去非特异性结合成分。将结合的N3pGlu Aβ抗体洗脱，例如用pH(约)3.5的柠檬酸钠洗脱，并用1M Tris缓冲液中和级分。检测抗N3pGlu Aβ抗体级分，例如通过SDS-PAGE或分析尺寸排阻层析并合并。抗N3pGlu Aβ抗体II在pH7.4的PBS缓冲液中浓缩，或在pH约为6的10mM柠檬酸钠缓冲液、150mM NaCl中浓缩。最终材料可以使用常用技术进行无菌过滤。抗N3pGlu Aβ抗体II的纯度大于95％。本发明的抗N3pGlu Aβ抗体II可以立即在-70℃冷冻或在4℃保存几个月。
实施例4：抗N3pGlu Aβ抗体的结合亲和力和动力学。
本发明的抗N3pGlu Aβ抗体(抗体I或抗体II)与pE3-42 Aβ肽的结合亲和力和动力学使用BIACORE3000(GE Healthcare)通过表面等离子体共振来测量。通过在CMS芯片上固定化蛋白A捕获抗N3pGlu Aβ抗体，并流动pE3-42 Aβ肽(从100nM开始，2倍连续稀释至3.125nM)来测量结合亲和力。实验在25℃在HBS-EP缓冲液(GE HealthcareBR100669；10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20，pH7.4)中进行。
对于每个循环，以10μL/min的流速注射5μL浓度为10μg/mL的抗体溶液来捕获抗体。以50μL/min注射250μL来结合肽，然后解离10分钟。通过以10μL/mL流速注射5μL pH1.5的甘氨酸缓冲液再生芯片表面。将数据拟合到1:1Langmiur结合模型以导出kon、koff并计算KD。基本上按照如上所述的方法，观察以下参数(表9中所示)。
表9：结合亲和力和动力学。
抗体 kon(x1051/Ms) koff(x10-41/s) KD(nM)
I 3.62 2.7 0.75
II 1.64E+03 6.98E-05 4.57
这些数据证明本发明的抗体结合pE3-42 Aβ。
实施例5：离体靶点接合
为了确定来自固定PDAPP脑的脑切片上的离体靶点接合，用外源添加的本发明的抗N3pGlu Aβ抗体(抗体I或抗体II)进行免疫组织化学分析。将来自老年PDAPP小鼠(25个月大)的低温恒温器系列冠状切片与20μg/mL的本发明的示例性抗N3pGluAβ抗体一起孵育。使用对人IgG具有特异性的二级HRP试剂，并使用DAB-Plus(DAKO)使沉积的斑块可视化。使用生物素化的鼠3D6抗体，随后使用Step-HRP二抗作为阳性对照。阳性对照抗体(生物素化3D6)标记PDAPP海马中大量沉积的Aβ，抗N3pGlu Aβ抗体(抗体I或抗体II)标记沉积的子集。这些组织学研究证明，本发明的抗N3pGlu Aβ抗体在离体实验中与沉积的Aβ靶点接合。
实施例6：体内靶点接合研究
测量本公开的抗N3pGlu Aβ抗体在体内穿过血脑屏障并与沉积的斑块结合的能力。对年老的PDAPP转基因小鼠(18.5至32月龄)腹膜内注射抗N3pGlu Aβ抗体(例如抗体I或II)或阴性对照IgG。每组六只小鼠在第1天和第3天接受一次40mg/kg的抗体注射。在第6天处死小鼠并收集大脑进行组织化学分析，以确定体内靶点接合情况。
体内靶点接合的程度被量化为体内抗N3pGlu Aβ抗体接合的阳性面积百分比，其被归一化为通过姐妹切片上的外源对照抗体免疫染色所定义的总斑块面积(TE比率)。TE比率是通过测量抗体结合的面积百分比并将该值相对于可能靶点的总面积百分比归一化而产生的(通过在姐妹切片上使用阳性对照抗体(3D6)进行外源免疫组织化学可视化显示总沉积Aβ)。
基本上按照如上所述的方法，发现抗N3pGlu Aβ抗体I和II都与沉积的斑块接合。这些结果证明，当外周施用时，抗N3pGlu抗体I和II可以穿过血脑屏障并接合沉积的Aβ的预期靶点。
实施例7：OGA抑制剂1-(2-(((3R,5S)-1-((6-氟-2-甲基苯并[d]噻唑-5-基)甲基)-5-甲基吡咯烷-3-基)氧基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)乙烷-1-酮的制备。
该化合物及其合成公开于美国专利号US10,752,362中，该专利的全部内容通过引用并入本文。
向6-氟-2-甲基-1,3-苯并噻唑-5-甲醛(0.19g，0.95mmol)和1-(2-(((3R,5S)-5-甲基吡咯烷-3-基)氧基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)乙烷-1-酮盐酸盐(0.28g，0.94mmol)在DCM(9mL)中的溶液中添加DIPEA(0.45mL，2.6mmol)。将所得溶液在RT下搅拌40分钟。向该溶液中添加三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)3，0.65g，3.04mmol)。将所得溶液在RT下搅拌17小时。将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液(5mL)缓慢淬灭。用DCM(2×5mL)萃取水层。将合并的有机萃取物经MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。将所得残余物溶解在DCM中并通过快速色谱在硅胶上纯化，用40-100％丙酮的己烷溶液梯度洗脱，在将所需色谱级分的溶剂蒸发后得到标题化合物(0.27g，65％收率)。ES/MS m/z:441(M+H)；[α]D 20＝+101.4°(c＝0.2，MeOH)。
OGA抑制剂1-(2-(((3R,5S)-1-((6-氟-2-甲基苯并[d]噻唑-5-基)甲基)-5-甲基吡咯烷-3-基)氧基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)乙烷-1-酮的替代制备：4-甲基苯磺酸；(3R,5S)-5-甲基吡咯烷-3-醇的制备。
在室温下，向烧瓶中添加(2S,4R)-4-羟基-2-甲基-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(53.0g，263mmol)和2-丙醇(265mL)。将混合物在室温(内部温度20℃)下搅拌并一次性添加对甲苯磺酸一水合物(60.1g，316mmol)。将反应混合物在62℃加热块中搅拌过夜，然后冷却至室温并浓缩至约150mL总体积。将混合物用甲基叔丁基醚(MTBE，530mL)稀释并将混合物在室温下剧烈搅拌30分钟，然后在N2气流下过滤。将过滤的固体在40℃下真空干燥2小时，得到4-甲基苯磺酸；(3R,5S)-5-甲基吡咯烷-3-醇(67.6g，93％收率)，为白色固体。ES/MS m/z：102(M+H)。
(3R,5S)-1-[(6-氟-2-甲基-1,3-苯并噻唑-5-基)甲基]-5-甲基-吡咯烷-3-醇的制备。
在室温下，向烧瓶中加入4-甲基苯磺酸；(3R,5S)-5-甲基吡咯烷-3-醇(61.9g，226mmol)、EtOAc(850mL)和6-氟-2-甲基-1,3-苯并噻唑-5-甲醛(42.5g，216mmol)。将反应混合物在冰水浴(内部温度3℃)中搅拌并一次性添加三乙胺(60.1mL，431mmol)。将反应混合物在冰水浴中搅拌30分钟，然后一次性添加三乙酰氧基硼氢化钠(91.4g，431mmol)。将反应混合物在冰水浴中搅拌10分钟，然后在室温下搅拌2小时(内部温度20℃)。将反应混合物在冰水浴中搅拌并在5分钟内添加15％KHSO4水溶液(650mL)，在添加期间保持内部温度低于15℃。将混合物在室温下剧烈搅拌1小时，然后加入饱和柠檬酸水溶液(100mL)并将混合物在室温下搅拌5分钟，然后分层。将水层用EtOAc(400mL)洗涤，然后将水层在冰水浴中搅拌，并在10分钟内分批添加固体Na2CO3(80g)，同时剧烈搅拌直至pH＝10(通过pH试纸测量)。然后用EtOAc(3×400mL)萃取水层。将合并的有机物经Na2SO4干燥并浓缩以得到残余物，使用研杵和研钵将其粉碎成细粉，然后与25％MTBE/庚烷(280mL)合并。将混合物在45℃加热块中剧烈搅拌1小时，然后在室温下搅拌1小时，然后过滤，得到第一批过滤的固体。浓缩滤液，然后将残余物与25％MTBE/庚烷(40mL)合并，并将混合物在室温下剧烈搅拌30分钟，然后过滤，得到第二批过滤的固体。将第一批和第二批过滤的固体合并，并用抹刀研磨该混合物，然后在室温下真空干燥过夜，得到(3R,5S)-1-[(6-氟-2-甲基-1,3-苯并噻唑-5-基)甲基]-5-甲基-吡咯烷-3-醇(53.3g，87％收率)，为奶油色固体。ES/MS m/z：281(M+H)。
OGA抑制剂1-(2-(((3R,5S)-1-((6-氟-2-甲基苯并[d]噻唑-5-基)甲基)-5-甲基吡咯烷-3-基)氧基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)乙烷-1-酮的替代制备。
在室温下，向烧瓶中添加(3R,5S)-1-[(6-氟-2-甲基-1,3-苯并噻唑-5-基)甲基]-5-甲基-吡咯烷-3-醇(26.9g，95.0mmol)、1-(2-氯-5,7-二氢吡咯并[3,4-b]吡啶-6-基)乙酮(22.1g,109mmol)、碳酸铯(92.8g,285mmol)、MorDalPhos(1.76g，3.80mmol)、氯化钯(II)(π-肉桂基)二聚体(984mg，1.90mmol)和甲苯(538mL)。在室温下，在搅拌下向混合物中鼓泡N2气体30分钟，然后将反应混合物在86℃加热块中搅拌过夜(内部温度80℃)。将反应混合物冷却至室温并用EtOAc(269mL)稀释并添加硅藻土(27g)。将混合物在室温下搅拌5分钟，然后通过硅藻土过滤，用EtOAc(200mL)洗涤。浓缩滤液，得到残余物，将其溶解在EtOAc(100mL)中，并使混合物通过短硅胶垫(300g)，用EtOAc(2L)洗脱，然后用20％异丙醇/EtOAc(IPA/EtOAc，2L)洗脱。将IPA/EtOAc级分浓缩，得到残余物，将其在室温下真空干燥1小时，得到标题化合物(42.1g，88％收率，88％质量纯度)，为淡棕色泡沫。
在室温下，将泡沫与另一批类似纯度的物质合并，并将合并的材料(46.0g，92.3mmol)与MTBE(230mL)和庚烷(230mL)合并。将混合物在45℃加热块中剧烈搅拌1小时，然后在室温下搅拌30分钟，然后过滤。将过滤的固体与EtOAc(400mL)合并并添加硫醇(40g)。将混合物在旋转蒸发器上于室温搅拌1小时，然后过滤。浓缩滤液，得到残余物，将其与25％EtOAc/庚烷(400mL)混合，并将混合物在50℃加热块中剧烈搅拌1小时，然后在室温下搅拌10分钟，然后过滤，保留第一批滤液。将过滤的固体与35％EtOAc/庚烷(400mL)合并，并将混合物在50℃加热块中剧烈搅拌1小时，然后在室温下搅拌10分钟，然后过滤，保留第二批滤液。将过滤的固体与EtOAc(500mL)和15％KHSO4水溶液(500mL)合并。将混合物在室温下剧烈搅拌15分钟，然后转移至分液漏斗并分离各层，在有机物中留下残渣层。将有机层进一步用15％KHSO4水溶液(100mL)萃取，在有机物中留下残渣层。从有机物中除去残渣层并用CH2Cl2(100mL)和15％KHSO4水溶液(100mL)稀释并分离各层。将合并的水层在冰水浴中搅拌，并在搅拌下在5分钟内分批添加固体Na2CO3(100g)(通过pH试纸测量pH为10)。将混合物用CH2Cl2(2×500mL)萃取并将合并的有机物经Na2SO4干燥并浓缩以得到第一批粗产物。将来自过滤的第一批和第二批滤液合并并浓缩，然后将残余物与EtOAc(100mL)和15％KHSO4水溶液(100mL)合并。将混合物在室温下剧烈搅拌15分钟，然后转移至分液漏斗中并分离各层。将水层在冰水浴中搅拌，并在搅拌下在5分钟内分批添加固体Na2CO3(15g)(通过pH试纸测量pH为10)。将混合物用CH2Cl2(2×100mL)萃取并将合并的有机物经Na2SO4干燥并浓缩以得到残余物，将其与25％EtOAc/庚烷(80mL)合并并将混合物在50℃加热块中剧烈搅拌30分钟，然后在室温下搅拌10分钟，然后过滤，得到第二批粗产物。将两批粗产物与25％EtOAc/庚烷(400mL)合并，并将混合物在50℃加热块中剧烈搅拌30分钟，然后在室温下搅拌10分钟，然后过滤。将过滤的固体在室温下真空干燥3天，得到最终标题化合物(37.4g，90％收率)，为白色固体。ES/MS m/z:441(M+H)。旋光度[α]D20＝+104.0°(c＝0.2,MeOH)。
基本上如上所述测试实施例7的化合物的体外人OGA酶测定并表现出IC50为0.214nm±0.037(n＝4)。该数据证明实施例7的化合物在体外抑制OGA酶活性。基本上按照上述全细胞测定法测试实施例7的化合物以测量OGA酶活性的抑制，并表现出70.5nM±0.002(n＝2)的IC50。该数据证明实施例7的化合物在细胞测定中抑制OGA酶活性。
实施例8：体内组合研究
下面的实施例说明了如何设计一项研究，以验证本公开的OGA抑制剂与本发明的抗N3pGlu Aβ抗体的组合可用于治疗以淀粉样蛋白沉积和/或异常tau聚集为特征的疾病，例如AD。然而，应当理解，以下描述是通过说明而非限制的方式阐述的，并且本领域普通技术人员可以做出各种修改。
为了评估示例性OGA抑制剂对tau过度磷酸化和聚集减少的影响，以及示例性抗N3pGlu Aβ抗体对淀粉样蛋白β沉积减少的影响，在本文所述的联合疗法中，疾病进展的延迟可以通过生物标志物和/或使用经验证的评级量表的认知和功能下降评估来评估。
患者可分为由双盲安慰剂组和联合治疗组组成的治疗组。联合治疗组施用有效量的OGA抑制剂与有效量的抗N3pGlu Aβ抗体的组合。可以包括单药治疗组(与联合组中的OGA抑制剂剂量相同的OGA抑制剂单药治疗组；与联合治疗组中的抗N3pGlu Aβ抗体剂量相同的抗N3pGlu Aβ抗体单药治疗组)以进一步阐明每个单独分子对疾病改变的贡献。此外，治疗组的特征可以基于临床前或临床AD的诊断，或者基于患者(尽管没有AD症状)具有致AD疾病的基因突变的诊断。例如，组别可包括以下一项或多项：(a)无症状但导致AD的基因突变呈阳性；(b)前驱期AD；(c)轻度AD痴呆；(d)中度AD痴呆；(e)重度AD痴呆。每个治疗组可以接受相应的治疗(例如，抗N3pGlu Aβ抗体治疗每四周一次和OGA抑制剂治疗每天一次)，治疗期为9个月至18个月。
治疗期结束后，AD神经变性可通过以下一种或多种生物标志物评估进行评估：(a)淀粉样蛋白PET成像；(b)磷酸化tau(P-tau；在苏氨酸181或217处磷酸化)；(c)Tau PET成像(评估NFT积累)；(d)体积MRI(神经解剖学萎缩评估)；(e)FDG-PEG PET成像(代谢低下评估)；(f)氟倍他吡灌注PET成像(代谢低下评估)；(g)CSF tau浓度(神经变性评估)；和/或(i)CSF磷酸化Tau浓度(神经变性评估)。另外，可以应用评估每个治疗组的认知和功能下降的一种或多种经验证的评级量表，例如ADAS-cog、MMSE、CDR-SB、ADCS-ADL和功能活动问卷(FAQ)。
该研究可显示本发明的OGA抑制剂和本发明的抗N3pGlu Aβ抗体的联合治疗可导致Aβ斑块减少并限制tau过度磷酸化和神经内聚集成病理性tau，例如NFT，用于治疗疾病例如AD。
序列
序列ID NO:1抗体I的LCVR
序列ID NO:2抗体I的HCVR
序列ID NO:3抗体I的LC
序列ID NO:4抗体I的HC
序列ID NO:5抗体I的LCDR1
序列ID NO:6抗体I的LCDR2
序列ID NO:7抗体I的LCDR3
序列ID NO:8抗体I的HCDR1
序列ID NO:9抗体I的HCDR2
序列ID NO:10抗体I的HCDR3
序列ID NO:11抗体II的LCVR
序列ID NO:12抗体II的HCVR
序列ID NO:13抗体II的LC
序列ID NO:14抗体II的HC
序列ID NO:15抗体II的LCDR1
序列ID NO:16抗体II的LCDR2
序列ID NO:17抗体II的LCDR3
序列ID NO:18抗体II的HCDR1
序列ID NO:19抗体II的HCDR2
序列ID NO:20抗体II的HCDR3
序列ID NO:21抗体I的LC DNA序列
序列ID NO:22抗体I的HC DNA序列
序列ID NO:23抗体II的LC DNA序列
序列ID NO:24抗体II的HC DNA序列

Claims (40)

1.治疗患有以淀粉样蛋白β(Aβ)沉积为特征的疾病的患者的方法，包括向有需要的患者施用有效量的抗N3pG Aβ抗体与有效量的OGA抑制剂的组合，
其中所述OGA抑制剂是下式的化合物：
或其药学上可接受的盐。
2.权利要求1所述的方法，其中所述以淀粉样蛋白β(Aβ)沉积为特征的疾病选自临床前阿尔茨海默病(AD)、临床AD、前驱AD、轻度AD痴呆、中度AD痴呆、重度AD痴呆、唐氏综合症、临床脑淀粉样血管病和临床前脑淀粉样血管病。
3.权利要求1所述的方法，其中所述OGA抑制剂2位上的甲基相对于哌啶环4位上的氧呈顺式构型：
4.权利要求3所述的方法，其中所述OGA抑制剂是N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。
5.权利要求4所述的方法，其中所述OGA抑制剂是结晶的。
6.权利要求5所述的方法，其中所述化合物的特征在于X射线粉末衍射光谱中衍射角2-θ为12.1°的峰与选自15.3°、21.6°、22.2°、22.7°、23.5°、24.3°和26.8°的一个或多个峰的组合，衍射角误差为0.2度。
7.权利要求1所述的方法，其中所述抗N3pG Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3且HCVR包含CDRHCDR1、HCDR2和HCDR3，其中：
i)LCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.5给出，LCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.6给出，LCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.7给出，HCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.8给出，HCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.9给出且HCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.10给出；或者
ii)LCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.15给出，LCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.16给出，LCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.17给出，HCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.18给出、HCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.19给出且HCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.20给出。
8.权利要求7所述的方法，其中所述抗N3pG Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中：
i)LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:1给出且HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:2给出；或者
ii)LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:11给出且HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:12给出。
9.权利要求8所述的方法，其中所述抗N3pG Aβ抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中：
i)LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:3给出且HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:4给出；或者
ii)LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:13给出且HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:14给出。
10.治疗患有以淀粉样蛋白β(Aβ)沉积为特征的疾病的患者的方法，包括向需要这种治疗的患者施用有效量的抗N3pG Aβ抗体与有效量的OGA抑制剂的组合，其中所述OGA抑制剂是下式的化合物：
或其药学上可接受的盐。
11.权利要求10所述的方法，其中所述以淀粉样蛋白β(Aβ)沉积为特征的疾病选自临床前阿尔茨海默病、临床AD、前驱AD、轻度AD痴呆、中度AD痴呆、重度AD痴呆、唐氏综合征、临床脑淀粉样血管病或临床前脑淀粉样血管病。
12.权利要求10所述的方法，其中所述OGA抑制剂2位上的甲基相对于哌啶环4位上的氧呈顺式构型：
13.权利要求10所述的方法，其中所述OGA抑制剂2位上的甲基相对于哌啶环4位上的氧呈反式构型：
14.权利要求12所述的方法，其中所述OGA抑制剂是N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。
15.权利要求13所述的方法，其中所述OGA抑制剂是N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。
16.权利要求14所述的方法，其中所述OGA抑制剂是结晶的。
17.权利要求15所述的方法，其中所述OGA抑制剂的特征在于X射线粉末衍射光谱中衍射角2-θ为13.5°的峰与选自5.8°、13.0°、14.3°、17.5°、20.4°、21.4°和22.2°的一个或多个峰的组合，衍射角误差为0.2度。
18.权利要求10所述的方法，其中所述抗N3pG Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3且HCVR包含CDRHCDR1、HCDR2和HCDR3，其中：
i)LCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.5给出，LCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.6给出，LCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.7给出，HCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.8给出，HCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.9给出且HCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.10给出；或者
ii)LCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.15给出，LCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.16给出，LCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.17给出，HCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.18给出、HCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.19给出且HCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.20给出。
19.权利要求18所述的方法，其中所述抗N3pG Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中：
i)LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:1给出且HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:2给出；或者
ii)LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:11给出且HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:12给出。
20.权利要求19所述的方法，其中所述抗N3pG Aβ抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中：
i)LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:3给出且HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:4给出；或者
ii)LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:13给出且HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:14给出。
21.治疗患有以淀粉样蛋白β(Aβ)沉积和异常tau聚集为特征的疾病的患者的方法，包括向有需要的患者施用有效量的抗N3pG Aβ抗体与有效量的OGA抑制剂的组合，
其中所述OGA抑制剂是下式的化合物：
或其药学上可接受的盐。
22.权利要求21所述的方法，其中所述以淀粉样蛋白β(Aβ)沉积和异常tau聚集为特征的疾病选自临床前阿尔茨海默病(AD)、临床AD、前驱AD、轻度AD痴呆、中度AD痴呆、重度AD痴呆、唐氏综合症、临床脑淀粉样血管病和临床前脑淀粉样血管病。
23.权利要求21所述的方法，其中所述OGA抑制剂2位上的甲基相对于哌啶环4位上的氧呈顺式构型：
24.权利要求23所述的方法，其中所述OGA抑制剂是N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,2,4-噁二唑-3-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。
25.权利要求24所述的方法，其中所述OGA抑制剂是结晶的。
26.权利要求25所述的方法，其中所述化合物的特征在于X射线粉末衍射光谱中衍射角2-θ为12.1°的峰与选自15.3°、21.6°、22.2°、22.7°、23.5°、24.3°和26.8°的一个或多个峰的组合，衍射角误差为0.2度。
27.权利要求21所述的方法，其中所述抗N3pG Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3且HCVR包含CDRHCDR1、HCDR2和HCDR3，其中：
i)LCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.5给出，LCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.6给出，LCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.7给出，HCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.8给出，HCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.9给出且HCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.10给出；或者
ii)LCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.15给出，LCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.16给出，LCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.17给出，HCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.18给出、HCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.19给出且HCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.20给出。
28.权利要求27所述的方法，其中所述抗N3pG Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中：
i)LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:1给出且HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:2给出；或者
ii)LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:11给出且HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:12给出。
29.权利要求28所述的方法，其中所述抗N3pG Aβ抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中：
i)LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:3给出且HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:4给出；或者
ii)LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:13给出且HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:14给出。
30.治疗患有以淀粉样蛋白β(Aβ)沉积和异常tau聚集为特征的疾病的患者的方法，包括向需要这种治疗的患者施用有效量的抗N3pG Aβ抗体与有效量的OGA抑制剂的组合，其中所述OGA抑制剂是下式的化合物：
或其药学上可接受的盐。
31.权利要求30所述的方法，其中所述以淀粉样蛋白β(Aβ)沉积和异常tau聚集为特征的疾病选自临床前阿尔茨海默病、临床AD、前驱AD、轻度AD痴呆、中度AD痴呆、重度AD痴呆、唐氏综合症、临床脑淀粉样血管病和临床前脑淀粉样血管病。
32.权利要求30所述的方法，其中所述OGA抑制剂2位上的甲基相对于哌啶环4位上的氧呈顺式构型：
33.权利要求30所述的方法，其中所述OGA抑制剂2位上的甲基相对于哌啶环4位上的氧呈反式构型：
34.权利要求32所述的方法，其中所述OGA抑制剂是N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。
35.权利要求33所述的方法，其中所述OGA抑制剂是N-[4-氟-5-[[(2S,4S)-2-甲基-4-[(5-甲基-1,3,4-噁二唑-2-基)甲氧基]-1-哌啶基]甲基]噻唑-2-基]乙酰胺。
36.权利要求34所述的方法，其中所述OGA抑制剂是结晶的。
37.权利要求35所述的方法，其中所述OGA抑制剂的特征在于X射线粉末衍射光谱中衍射角2-θ为13.5°的峰与选自5.8°、13.0°、14.3°、17.5°、20.4°、21.4°和22.2°的一个或多个峰的组合，衍射角误差为0.2度。
38.权利要求30所述的方法，其中所述抗N3pG Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3且HCVR包含CDRHCDR1、HCDR2和HCDR3，其中：
i)LCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.5给出，LCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.6给出，LCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.7给出，HCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.8给出，HCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.9给出且HCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.10给出；或者
ii)LCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.15给出，LCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.16给出，LCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.17给出，HCDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO.18给出、HCDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO.19给出且HCDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO.20给出。
39.权利要求38所述的方法，其中所述抗N3pG Aβ抗体包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中：
i)LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:1给出且HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:2给出；或者
ii)LCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:11给出且HCVR的氨基酸序列由SEQ ID NO:12给出。
40.权利要求39所述的方法，其中所述抗N3pG Aβ抗体包含轻链(LC)和重链(HC)，其中：
i)LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:3给出且HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:4给出；或者
ii)LC的氨基酸序列由SEQ ID NO:13给出且HC的氨基酸序列由SEQ ID NO:14给出。
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