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CN118127069B - GhBC1基因在调控植物种子粒重、宽度以及育种中的应用 - Google Patents

GhBC1基因在调控植物种子粒重、宽度以及育种中的应用 Download PDF

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CN118127069B
CN118127069B CN202410390763.5A CN202410390763A CN118127069B CN 118127069 B CN118127069 B CN 118127069B CN 202410390763 A CN202410390763 A CN 202410390763A CN 118127069 B CN118127069 B CN 118127069B
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Abstract

本发明提供了GhBC1基因在调控植物种子粒重、宽度以及育种中的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明从陆地棉材料中克隆出棉花GhBC1基因，构建种子特异启动子驱动的过表达载体并转化拟南芥。转基因拟南芥T3代株系与野生型对照植株相比，表达量显著增加；与野生型对照相比，GhBC1转基因拟南芥种子长度变化不明显，但宽度明显增加，成熟的GhBC1转基因种子比野生型种子大，且GhBC1转拟南芥株系OE2的成熟种子比野生型种子重17％，达显著水平。

Description

GhBC1基因在调控植物种子粒重、宽度以及育种中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及GhBC1基因在调控植物种子粒重、宽度以及育种中的应用。
背景技术
棉花是我国重要的经济作物和油料作物。棉籽作为其最主要的副产品在棉花生产中的作用日益凸显。其产量为皮棉产量的1.5-2倍(陈娇等，2014)。去壳后的棉仁占种子重量的55％-60％，其中油分含量占30％-40％(王彦霞等，2011)。棉籽中含有丰富的脂肪酸和蛋白质，被广泛应用于加工食用油、工业原料和生物柴油。一直以来棉花育种研究主要集中在纤维的产量与品质研究方面，而对提高棉籽产量的研究严重滞后。在产量构成因素中，种子的大小和重量是构成产量的重要成分，由其决定的千粒重是一个具有较高遗传力的性状。因此，研究棉籽重量和大小对提高棉籽副产品加工具有重要意义。
异质型乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)是各种脂肪酸从头合成的限速酶和关键酶，它由生物素羧化酶(BC)、生物素羧基载体蛋白(BCCP)以及羧基转移酶(CT)的2个亚基α-CT和β-CT组成。其中BC是连接ACCase另外三个亚基的纽带和桥梁。植物的种子大小是标志产量最重要的特征之一，尽管人们在理解控制种子大小的分子机制方面取得一定进展，但发现的调控种子大小的关键基因并不多。未来的挑战仍需挖掘调控种子大小的关键基因。目前，虽然对调控种子大小有了认知，然而有关棉花BC基因与种子重量、种子性状的相关研究还未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供GhBC1基因在调控植物种子粒重、宽度以及育种中的应用。本发明通过对GhBC1基因进行克隆，并对其构建特异启动子驱动的过表达载体，同时将其转化至拟南芥中，发现成熟的GhBC1转基因种子比野生型种子大，且GhBC1转拟南芥株系OE2的成熟种子比野生型种子重17％，达显著水平。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供GhBC1基因在调控植物种子粒重中的应用。
作为优选，在植物中过表达GhBC1基因，植物种子粒重显著增加。
本发明提供了GhBC1基因在调控植物种子宽度中的应用。
作为优选，在植物中过表达GhBC1基因，植物种子的宽度显著增加。
作为优选，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为优选，所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
作为优选，在植物中过表达GhBC1基因的方法，包括以下步骤：
(1)提取棉花组织样品的总RNA后，反转录获得cDNA；
(2)以获得的cDNA为模板，以GhBC1基因的特异性引物进行PCR扩增获得扩增产物；
(3)将扩增产物与克隆载体连接后转化至克隆宿主中进行扩繁，然后提取扩繁的目的基因；
(4)将目的基因与表达载体连接后转化至农杆菌中获得转化体；
(5)用转化体对植物进行遗传转化，筛选阳性的植株即为过表达GhBC1基因的植物。
作为优选，所述GhBC1基因的特异性引物对包括正向引物和反向引物；
所述正向引物序列如SEQ ID NO.3所示；
所述反向引物序列如SEQ ID NO.4所示。
作为优选，所述植物为棉花或拟南芥。
本发明还提供了GhBC1基因在辅助植物育种中的应用，在育种过程中筛选GhBC1基因过表达的植株。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明从陆地棉材料中克隆出棉花GhBC1基因，并将该基因转化至拟南芥中，获得2个转基因拟南芥，2个转基因拟南芥T3代株系与野生型对照植株相比，表达量显著增加；与野生型对照相比，GhBC1转基因拟南芥种子长度变化不明显，但宽度明显增加，成熟的GhBC1转基因种子比野生型种子大，且GhBC1转拟南芥株系OE2的成熟种子比野生型种子重17％，达显著水平。
附图说明
图1为GhBC1基因克隆的电泳条带；
图2为T1代拟南芥抗性植株筛选的结果；
图3为T1代拟南芥抗性植株的PCR鉴定电泳图；
图4为T1代拟南芥抗性植株不同组织中GhBC1基因的表达量分析图；
图5为2个转基因拟南芥T3代植株角果中GhBC1表达图；
图6为GhBC1转基因拟南芥种子千粒重；
图7为GhBC1转基因拟南芥种子长度与宽度；
图8为GhBC1转基因拟南芥2个T3代纯系种子大小图。
具体实施方式
本发明提供GhBC1基因在调控植物种子粒重中的应用。
在本发明中，在植物中过表达GhBC1基因，植物种子粒重显著增加。
本发明提供了GhBC1基因在调控植物种子宽度中的应用。
在本发明中，在植物中过表达GhBC1基因，植物种子的宽度显著增加。
在本发明中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明中，在植物中过表达GhBC1基因的方法，包括以下步骤：
(1)提取棉花组织样品的总RNA后，反转录获得cDNA；
(2)以获得的cDNA为模板，以GhBC1基因的特异性引物进行PCR扩增获得扩增产物；
(3)将扩增产物与克隆载体连接后转化至克隆宿主中进行扩繁，然后提取扩繁的目的基因；
(4)将目的基因与表达载体连接后转化至农杆菌中获得转化体；
(5)用转化体对植物进行遗传转化，筛选阳性的植株即为过表达GhBC1基因的植物。
在本发明中，所述棉花组织样品为棉花开花后3天和5天的胚珠，所述总RNA提取采用常规市售试剂盒即可；所述总RNA为提取的各时期棉花胚珠RNA混合制得；所述反转录采用常规市售试剂盒即可；所述cDNA合成体系以20μL计，包括以下组分：0.1μg/μL RandomPrimer 1μL、2×TS Reaction Mix 10μL、TranScript RT/RI Enzyme Mix 1μL、200ng/μL总RNA5μL、gDNA Remover 1μL、0.5μg/μL Anchored Oilgo(dT)Primer 1μL、RNase-freeWater1μL。
在本发明中，所述GhBC1基因的特异性引物对包括正向引物和反向引物；
所述正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：
5′-ATGGGTATTTGCTATTGTAG-3’；
所述反向引物序列如SEQ ID NO.4所示，具体如下：
5′-CTAAGCAGTTGCACTTGTTAATTC-3’。
在本发明中，所述PCR扩增体系以50μL计，包括以下组分：10×PCR BufferforKOD-PLUS-Neo 5μL、KOD-Plus-Neo 1μL、cDNA模板2μL、10μM正向引物2μL、10μM反向引物2μL、2mM dNTPs 5μL、25mMMgSO43μL、dd H2O 30μL。所述PCR扩增的程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s，57℃退火30s，68℃延伸45s，共30个循环；68℃延伸5min；4℃保存。
在本发明中，所述扩增产物利用TaKaRa MiniBEST DNA FragmentPurificationKitver4.0进行目的片段的纯化回收；所述克隆载体为pEASY-T5；所述克隆宿主为大肠杆菌感受态DH5α；所述扩繁方式为，将连接有扩增产物与克隆载体的克隆宿主30-45℃过夜培养，优选为35-40℃，进一步优选为37℃，从kan抗性LB培养基上挑取单克隆，置于含有kan的300-700μLLB培养基中，优选为400-600μL，进一步优选为500μL，30-45℃摇菌过夜培养，优选为35-40℃，进一步优选为37℃；对菌液进行PCR验证，对含有目的基因片段大小条带的菌液进行测序，将测序正确的克隆命名为pEASY-GhBC1。
在本发明中，所述表达载体的构建方法为：(S1)选择p2301Mα质粒作为载体，根据载体上的多克隆位点设计XbaI-SacI为插入位点，并合成引物，所述引物序列为：GhBC1-XbaI-F：5′-GCTCTAGAATGGGTATTTGCTATTGTAG-3’，其中GCTCTAGA含有限制性内切酶XbaI的识别序列；GhBC1-SacI-R：5′-CGAGCTCCTAAGCAGTTGCACTTGTTAATTC-3’，其中CGAGCTC含有限制性内切酶SacI的识别序列；(S2)使用KOD-Plus-Neo高保真酶扩增得到含有XbaI和SacI酶切位点的GhBC1目的基因序列，其中扩增反应体系以50μL计，包括以下组分：25mM MgSO43μL、10×PCR Buffer for KOD-PLUS-Neo 5μL、KOD-Plus-Neo 1μL、pEASY-GhBC1质粒1μL、10μMGhBC1-XbaI-F 2μL、10μM GhBC1-SacI-R 2μL、2mM dNTPs 5μL、dd H2O31μL；所述扩增的程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸45s，30个循环；68℃延伸5min；(S3)用限制性内切酶XbaI和SacI酶切植物特异启动子表达载体p2301Mα，回收载体骨架；(S4)回收纯化含XbaI和SacI酶切位点的GhBC1扩增产物，并用限制性内切酶XbaI和SacI酶切该回收产物；(S5)将(S3)获得的载体骨架和(S4)获得的回收产物连接，即得表达载体。
在本发明中，所述植物为棉花或拟南芥。
本发明还提供了GhBC1基因在辅助植物育种中的应用，在育种过程中筛选GhBC1基因过表达的植株。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本实施例所用植物总RNA提取试剂盒(DP432)购自天根生化(科技)北京有限公司；RNA反转录试剂盒TransScript One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis SuperMix(AT311-02)、荧光定量酶TransStart Top Green qPCR SuperMix(AQ131-04)、克隆载体pEASY-T5 Zero Cloning Kit(CT501-01)和质粒提取试剂盒EasyPure HiPure PlasmidMiniPrep Kit(EM111-01)购自于北京全式金生物技术有限公司；高保真PCR扩增酶KOD-Plus-Neo(KOD-401)购自TOYOBO生物公司；DNAFragmentPurificationKit ver4.0胶回收试剂盒和DNAPurificationKitPCR产物纯化试剂盒均购自TaKaRa生物公司；infusion连接酶购于诺唯赞生物技术有限公司；大肠杆菌感受态菌体DH5α购自上海生工生物工程技术服务有限公司；限制性内切酶XbaI和SacI均购自NEB公司；琼脂糖购于北京全式金生物技术有限公司；蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯；氨苄青霉素(IA0340)、卡那霉素(YZ-130556)、利福平(IR0110)，链霉素(IS0360)等购自北京索莱宝科技有限公司；未列出的各种试剂均按《分子克隆实验指南》第三版上的方法配制，生化试剂为分析纯或以上级。
LB培养基：酵母提取物(Yeast extract)5g/L、胰蛋白胨(Tryptone)10g/L和氯化钠(NaCl)10g/L，最后用ddH2O定容至1L。
LB固体培养基：酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L、琼脂粉15g/L、胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，最后用ddH2O定容至1L。
后续实施例中用到的培养基均按照上述方法制备获得。
实施例1
用本地Blast方法从cotton functional genomic database(https://cottonfgd.org/)中调取GH_A02G1009(GhBC1)基因的CDS全长序列，利用primer 5.0软件设计引物序列，采用PCR(Polymerase Chain Reaction)技术从陆地棉TM-1的胚珠中扩增出完整开放阅读框ORF为1647bp，编码548个氨基酸残基。
其中，GhBC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
ATGGGTATTTGCTATTGTAGGCATTTTCTGTTTTTCTCAATGGCAATGGATGCTTCACTGACTATGTGCAAATCGGTCACATCACCTCCTGGCTTATTCTTGGGGAGAAGTAGAGTTATTAGGAGTTCCCAGTGTACCTTTATGGTGGGAAGCAGGATCAACTTTCCTAGGCAGAAAGCTCAGTCAACCCAAGTTAAATGTAAATCTAGCAGGTGTGGAGTAGCTCTTGGTGCTAAATGCCGTGCTGAGAAAATTTTGGTGGCAAATAGAGGAGAAATTGCTGTTCGTGTTATCCGAACAGCTCATGAGATGGGAATACCATGTGTTGCTGTTTACTCTACAATTGATAAGGATGCACTTCATGTGAAGCTGGCTGATGAATCAGTTTGCATAGGCGAAGCACCAAGCAGTCAATCGTATTTATTGATTCCAAATGTCCTATCTGCTGCAATTAGCCGTAACTGTACTATGCTTCATCCTGGGTATGGTTTCCTTGCTGAGAATGCGGTTTTTGTAGAAATGTGCAGAGATCACAGGATCAACTTTATTGGGCCTAACCCTGACAGTATTCGTGTTATGGGTGACAAATCAACTGCACGAGAAACAATGAAGAACGCGGGTGTTCCTACTGTTCCGGGAAGTGATGGATTGTTACAGAGTACAGAGGAAGCAATCAAGCTTGCCCATGAGATTGGCTTTCCTGTGATGATCAAGGCCACAGCCGGTGGTGGAGGGCGTGGAATGCGTCTTGCTAAAGAGCCTGATGAGTTTGTGAAGTTACTGCAGCAAGCCAAAAGTGAAGCTGCAGCTGCATTTGGAAATGATGGAGTTTATTTGGAGAAGTACATCCAAAATCCAAGGCACATTGAGTTCCAGGTTCTTGCGGATAAATATGGTAATGTTGTTCACTTTGGTGAGCGAGACTGCAGCATCCAGAGACGTAATCAAAAACTTCTTGAAGAGGCTCCTTCTCCAGCATTGACACCAGAGTTGCGGAAGGCCATGGGTGATGCAGCAGTAGCTGCAGCAGCATCTATTGGTTACATTGGTGTAGGAACTGTTGAGTTCCTATTGGATGAAAGAGGTTCCTTCTACTTCATGGAAATGAACACTAGAATCCAGGTGGAGCATCCTGTAACTGAAATGATTTCCTCTGTTGACTTGATTGAAGAACAAATTCGTGTAGCTATGGGGGAAAAACTGCGCTACAAACAGGAAGATATTGTGCTCAGAGGGCATTCCATTGAATGTCGTATCAATGCAGAAGATGCATTTAAAGGGTTCAGACCCGGACCAGGGAGAATAACATCGTACTTGCCATCTGGAGGCCCATTTGTTCGAATGGATAGCCATGTTTATTCTGATTATGTAGTTCCTCCAAGCTATGATTCATTACTTGGAAAGCTTATTGTATGGGCTCCAACAAGGGAAAAAGCAATTGAGCGCATGAAAAGGGCTCTTGATGACACTGTAATTACAGGGGTTCCTACAACAATTGAATACCATAAACTCATCCTTGATATTGAGGACTTCAGAAACGGAATAGTTGACACTGCTTTCATTCCAAAACATGAAGAAGAGTTGGCAGCACCACAGAAAATGTTAGTAGCAAGCCCAACCAAAGAATTAACAAGTGCAACTGCTTAG(SRQ ID NO.1)。
GhBC1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
MGICYCRHFLFFSMAMDASLTMCKSVTSPPGLFLGRSRVIRSSQCTFMVGSRINFPRQKAQSTQVKCKSSRCGVALGAKCRAEKILVANRGEIAVRVIRTAHEMGIPCVAVYSTIDKDALHVKLADESVCIGEAPSSQSYLLIPNVLSAAISRNCTMLHPGYGFLAENAVFVEMCRDHRINFIGPNPDSIRVMGDKSTARETMKNAGVPTVPGSDGLLQSTEEAIKLAHEIGFPVMIKATAGGGGRGMRLAKEPDEFVKLLQQAKSEAAAAFGNDGVYLEKYIQNPRHIEFQVLADKYGNVVHFGERDCSIQRRNQKLLEEAPSPALTPELRKAMGDAAVAAAASIGYIGVGTVEFLLDERGSFYFMEMNTRIQVEHPVTEMISSVDLIEEQIRVAMGEKLRYKQEDIVLRGHSIECRINAEDAFKGFRPGPGRITSYLPSGGPFVRMDSHVYSDYVVPPSYDSLLGKLIVWAPTREKAIERMKRALDDTVITGVPTTIEYHKLILDIEDFRNGIVDTAFIPKHEEELAAPQKMLVASPTKELTSATA(SRQ ID NO.2)。
实施例2GhBC1基因的克隆
(1)总RNA的提取：陆地棉材料‘中棉所24’种植于安阳工学院试验基地，按一般大田管理。所取组织为开花后3天和5天的胚珠，所取材料迅速放入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用，采用植物总RNA提取采用天根公司试剂盒。
(2)cDNA的获得：将1000ng RNA反转录为cDNA，将反转录产物cDNA溶液稀释5倍作为PCR反应模板。以提取的各时期棉花胚珠混合总RNA为模板，利用全式金的反转录试剂盒将其反转录为cDNA，cDNA合成体系见表1。
表1cDNA合成体系
RandomPrimer(0.1μg/μL) 1μL
2×TSReactionMix 10μL
TranScriptRT/RIEnzymeMix 1μL
总RNA(200ng/μL) 5μL
gDNARemover 1μL
AnchoredOilgo(dT)Primer(0.5μg/μL) 1μL
RNase-freeWater 1μL
总体积 20μL
其中，先在PCR仪器内42℃温育30min，最后85℃，5s失活。4℃保存备用。
(3)PCR反应扩增目的基因
采用如SRQ ID NO.3所示的正向引物GhBC1-F和如SRQ ID NO.4所示的反向引物GhBC1-R反转录步骤(2)得到的cDNA模板，对棉花GhBC1基因进行PCR扩增，PCR扩增体系如表2所示，扩增反应条件如表3所示。
表2PCR扩增体系
10×PCRBufferforKOD-PLUS-Neo 5μL
KOD-Plus-Neo 1μL
模板 2μL
正向引物GhBC1-F(10μM) 2μL
反向引物GhBC1-R(10μM) 2μL
2mMdNTPs 5μL
25mMMgSO4 3μL
ddH2O 30μL
总体积 50μL
其中，正向引物GhBC1-F的核苷酸序列为：
5′-ATGGGTATTTGCTATTGTAG-3’(SRQ ID NO.3)；
反向引物GhBC1-R的核苷酸序列为：
5′-CTAAGCAGTTGCACTTGTTAATTC-3’(SRQ ID NO.4)。
表3扩增反应条件
Step1 Predenature 94℃，2min
Step2 Denature 98℃，10s
Step3 Annealing 57℃，30s
Step4 Estension 68℃，45s
Step5 Estension 68℃，5min
其中，从Step2到Step4进行30次循环扩增。
(4)反应结束后，对扩增产物4℃保存，用0.8％的琼脂糖电泳对扩增产物进行检测，得到大小为1647bp的PCR扩增产物，结果如图1所示。
(5)对目的片段的反应产物利用TaKaRa MiniBEST DNA FragmentPurificationKit ver4.0进行目的片段的纯化回收。
(6)将胶回收产物连接克隆载体pEASY-T5克隆载体并转化大肠杆菌感受态DH5α。
(7)37℃过夜培养从kan抗性LB培养基上挑取单克隆到含有kan的500μL LB培养基中37℃摇菌过夜培养。
(8)菌液PCR验证：将含有目的基因片段大小条带的菌液测序，将测序正确的克隆命名为pEASY-GhBC1。
实施例3p2301Mα-GhBC1植物种子特异性表达载体构建
3.1质粒提取及酶切
p2301Mα质粒载体为本实验室保存，p2301Mα质粒载体的构建方法参照文献“刘正杰，张园，王彦霞，等.陆地棉异质型ACCase基因的种子特异表达载体构建与遗传转化[J].分子植物育种，2011，93)：8.DOI：10.3969/mpb.009.000270.”，该质粒提取采用全式金公司质粒提取试剂盒，质粒浓度经检测为189ng/μL，琼脂糖凝胶电泳检测，没有蛋白污染，达到试验要求，内切酶选用XbaI和SacI进行双酶切。
3.2p2301Mα-GhBC1表达载体的构建
(1)目的基因ORF序列扩增
根据终载体p2301Mα上的多克隆位点，设计XbaI-SacI为插入位点，并合成如SRQID NO.5所示的正向引物GhBC1-XbaI-F和如SRQ ID NO.6所示的反向引物GhBC1-SacI-R。
其中，正向引物GhBC1-XbaI-F的序列为：
GhBC1-XbaI-F：5′-GCTCTAGAATGGGTATTTGCTATTGTAG-3’(划线部分含有限制性内切酶XbaI的识别序列)(SRQ ID NO.5)；
反向引物GhBC1-SacI-R的序列为：
GhBC1-SacI-R：5′-CGAGCTCCTAAGCAGTTGCACTTGTTAATTC-3’(划线部分含有限制性内切酶SacI的识别序列)(SRQ ID NO.6)。
以pEASY-GhBC1质粒为模板，使用KOD-Plus-Neo高保真酶扩增得到含有XbaI和SacI酶切位点的GhBC1目的基因序列，反应体系见表4，反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸45s，30个循环；68℃延伸5min。
表4反应体系
(2)融合表达载体构建
1)用限制性内切酶XbaI和SacI酶切植物特异启动子表达载体p2301Mα，回收载体骨架。
2)回收纯化含XbaI和SacI酶切位点的GhBC1扩增产物，并用限制性内切酶XbaI和SacI酶切该回收产物。
3)将步骤1)获得的载体骨架和步骤2)获得的回收产物连接，构成植物特异启动子表达载体p2301Mα-GhBC1。
4)将步骤3)的连接产物热激转化大肠杆菌DH5α，37℃培养箱倒置过夜培养，挑阳性克隆测序；测序结果正确的命名为p2301Mα-GhBC1/DH5α。
3.3载体质粒的转化
(1)取100μL冰上融化的LBA4404感受态细胞，无菌条件下，向感受态细胞中加入p2301Mα-GhBC1/DH5α目的质粒2μg，轻轻混匀，冰水浴中静置5分钟；
(2)将离心管置于液氮中速冻5分钟；
(3)然后快速将离心管置于37℃水浴中孵育5分钟，将离心管放回冰水浴中，冰浴5分钟；
(4)取100μL菌液涂在含有卡那霉素、链霉素和利福平的LB筛选培养基上，28℃培养大约2-3d，挑选阳性克隆，在LB液体培养基上28℃培养48h，甘油终浓度在15％左右，-20℃保存备用。
实施例4p2301Mα-GhBC1种子特异性表达载体在拟南芥的遗传转化、鉴定及基因表达量分析
以哥伦比亚型拟南芥为受体，利用花浸蘸法(Feldmann KA,MarksMD.Agrobacterium-mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsisthaliana:A non-tissue culture approach[J].MGG-Molecular and General Genetics,1987,208(1):1-9.DOI:10.1007/BF00330414.)进行遗传转化，收获T0代转基因种子，在含有卡那霉素(50mg/L)MS培养基上筛选阳性转化子，结果如图2所示，获得T1代抗性植株，开花成熟后采集种子。待T1代抗性植株移栽后40天后，取拟南芥植株叶片提取DNA，PCR扩增抗性标记NPTII，进一步筛选阳性拟南芥植株。结果见图3。由结果可知，在琼脂糖凝胶电泳图的795bp附近均能获得目的条带，初步证明该基因的种子特异性表达载体转化成功。
同时在T1代抗性植株移栽后45天后，取拟南芥植株角果、叶片与茎的RNA，并合成cDNA，设计特异性引物(GhBC1-QRT-F：TCCTTGCTGAGAATGCGGTT(SRQ ID NO.7)和GhBC1-QRT-R：CCGGAACAGTAGGAACACCC(SRQ ID NO.8))，以上述载体的转化植株三种不同组织部位(角果、叶片与茎)的cDNA为模板，内参引物分别为AtactinqF：CCATGAACCCACCTATAACTCC(SRQID NO.9)和AtactinqR：TACTCTGCCTTTGCGATCCAC(SRQ IDNO.10)，进行荧光定量PCR。结果如图4所示，T1转化植株中GhBC1基因只能在角果中有较高的表达量，而在叶片与茎中GhBC1基因表达量很微弱或不表达。说明在拟南芥中转化的GhBC1基因能达到种子特异性表达的效果。
分别收获T1代单株种子，取约50-100粒种子布在MS+Kan(50mg/L)培养基上，待幼苗子叶完全展开后(约10天左右)，统计黄绿苗分离比，并进行卡方检验，将符合绿苗：黄苗＝3:1分离的植株初步预测是单拷贝插入株系，按株系分别收获种子用于后续分析。
实施例5称量种子重量、测量种子长度和种子宽度
挑选GhBC1基因在角果中表达量较高的2个单拷贝的T3代纯系在MS+Kan(50mg/L)培养基上生长(见图5)，这两个株系分别命名为分别GhBC1 OE1和OE2，每个株系移栽20棵植株。为了进行种子重量分析，在相同条件下，植株同时生长，每种基因型1000粒成熟种子在24℃下干燥7d并称重。数据以至少4个独立实验的平均值±SD表示。结果如图6所示，野生型拟南芥、T3代纯合转GhBC1拟南芥株系OE1和OE2的种子千粒重分别为18.05±1.1毫克、18.03±0.9毫克和21.13±1.82毫克，其中OE2株系的千粒重比对照增加17％，这个结果表明GhBC1过表达后能够显著增加种子千粒重。
用蔡司Axio ImagerA1显微镜拍摄种子的长度和宽度，然后用ImageJ软件测量。计算了种子的长宽比。结果如图7所示，与野生型对照相比，GhBC1 OE种子长度变化不明显，但宽度显著增加，成熟的GhBC1 OE干种子比野生型种子大(见图8)，该结果表明GhBC1过表达后能够显著增加种子的宽度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.GhBC1基因在调控植物种子粒重中的应用；
所述植物为拟南芥；
所述GhBC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在植物中过表达GhBC1基因，植物种子粒重显著增加。
3.GhBC1基因在调控植物种子宽度中的应用；
所述植物为拟南芥；
所述GhBC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在植物中过表达GhBC1基因，植物种子的宽度显著增加。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的应用，其特征在于，所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求2或4任意一项所述的应用，其特征在于，在植物中过表达GhBC1基因的方法，包括以下步骤：
(1)提取棉花组织样品的总RNA后，反转录获得cDNA；
(2)以获得的cDNA为模板，以GhBC1基因的特异性引物进行PCR扩增获得扩增产物；
(3)将扩增产物与克隆载体连接后转化至克隆宿主中进行扩繁，然后提取扩繁的目的基因；
(4)将目的基因与表达载体连接后转化至农杆菌中获得转化体；
(5)用转化体对植物进行遗传转化，筛选阳性的植株即为过表达GhBC1基因的植物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述GhBC1基因的特异性引物对包括正向引物和反向引物；
所述正向引物序列如SEQ ID NO.3所示；
所述反向引物序列如SEQ ID NO.4所示。
8.GhBC1基因在辅助植物育种中的应用，其特征在于，在育种过程中筛选GhBC1基因过表达的植株；
所述GhBC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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