CN118126079B - 硒磷脂化合物及合成方法与脂质体制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了硒磷脂化合物及合成方法与脂质体制剂，其硒磷脂化合物结构式如式(I)所示：本发明的硒磷脂化合物以硒元素作为抗氧化功能核心，天然磷脂分子充当主体模板，使得其在水溶液中可以自组装形成脂质体结构，极大地提高了水溶性和稳定性。同时，其亲水的含硒头部易于暴露在脂质体表面，能够与周围的活性氧自由基快速接触，从而达到高效的抗氧化效果。

Description

硒磷脂化合物及合成方法与脂质体制剂

技术领域

本发明涉及制药领域，具体涉及一种硒磷脂化合物及合成方法与脂质体制剂。

背景技术

氧化应激是生物体代谢过程中产生的活性氧和活性氮超过机体本身抗氧化能力的结果，而氧化应激压力导致的氧化损伤是许多疾病(包括心血管疾病、组织器官损伤、感染以及排斥反应等)发生或发展的根本原因。抗氧化治疗是维持机体抗氧化平衡、治疗氧化损伤的主要手段。然而，抗氧化小分子药物为非可逆的化合物，一旦被氧化便失去了继续调节氧化应激的能力；天然抗氧化酶虽然可以通过催化循环长效清除活性氧，但是其稳定性差、生产和纯化成本高以及低的细胞膜穿透性严重限制了其在生物医学上的应用。谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是天然抗氧化防御体系中的重要组成部分，其催化中心为天然存在的“第二十一种氨基酸”——硒代半胱氨酸。这种有机硒的高催化活性赋予了GPx高效的抗氧化能力。由此，开发含有硒元素的天然GPx仿生药物引起了科学家们的广泛兴趣，多种含硒有机化合物被合成出来。但是，这些小分子含硒化合物的抗氧化效率并不理想，水溶性差，成药性低。因此，制备一种抗氧化活性高、水溶性以及成药性好的含硒药物已成为相关领域的研究热点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供硒磷脂化合物。

本发明的另一目的在于提供上述硒磷脂化合物的合成方法。

本发明的第三个目的是提供上述硒磷脂化合物的脂质体制剂。

本发明的第四个目的是提供上述硒磷脂化合物的脂质体制剂的制备方法。

本发明的第五个目的是提供上述硒磷脂化合物的脂质体制剂在制备抗氧化类药物中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

硒磷脂化合物，其特征是结构式如式I所示：

其中：

R₁为C₄～C₁₈的饱和烷基或C₁₆～C₂₂不饱和烷基；

R₂为C₄～C₁₈的饱和烷基或C₁₆～C₂₂不饱和烷基；

X为氢、钠、钾，铵或钙。

上述硒磷脂化合物的合成方法，包括如下步骤：

1)溴乙酸与Na₂Se₂反应生成2,2’-二硒二乙酸II；

2)将2,2’-二硒二乙酸(II)分散在惰性溶剂中，在碱性条件下加入缩合剂和1-羟基苯并三唑(HOBT)之后，再加入磷脂酰乙醇胺(III)发生酰化反应，生成硒磷脂前体IV；

3)用过氧化氢氧化所述硒磷脂前体IV，生成硒磷脂化合物I；

其中：

R₁为C₄～C₁₈的饱和烷基或C₁₆～C₂₂不饱和烷基；

R₂为C₄～C₁₈的饱和烷基或C₁₆～C₂₂不饱和烷基；

X为氢、钠、钾，铵或钙。

惰性溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、甲苯和N,N-二甲基甲酰胺中至少一种。

碱性条件为加入三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶和N,N-二异丙基乙胺中至少一种。

缩合剂为碳二亚胺类缩合剂、鎓盐类缩合剂或有机磷类缩合剂。

硒磷脂化合物的脂质体制剂。

上述硒磷脂化合物的脂质体制剂的制备方法，包括如下步骤：

1)将硒磷脂化合物(I)、胆固醇和甲氧基-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺溶解于混合溶剂中，所述混合溶剂是由体积比为3：1的氯仿和甲醇组成；

2)减压蒸发除去所述溶剂，形成均匀的脂膜，真空干燥；

3)加入水或pH＝7-8的磷酸盐缓冲液，25-50℃，使真空干燥后的脂膜完全溶解，生成硒磷脂化合物的脂质体制剂。

上述硒磷脂化合物的脂质体制剂在制备抗氧化类药物中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明的硒磷脂化合物以硒元素作为抗氧化功能核心，天然磷脂分子充当主体模板，使得其在水溶液中可以自组装形成脂质体结构，极大地提高了水溶性和稳定性。同时，其亲水的含硒头部易于暴露在脂质体表面，能够与周围的活性氧自由基快速接触，从而达到高效的抗氧化效果。

附图说明

图1为检测分析2,2’-二硒二乙酸(II)的核磁谱图；

图2为检测分析2,2’-二硒二乙酸(II)的质谱图；

图3为检测分析硒磷脂前体IV-1的质谱图；

图4为检测分析硒磷脂化合物I-1的质谱图；

图5为检测分析硒磷脂化合物I-2的质谱图；

图6为检测分析硒磷脂化合物I-3的质谱图；

图7为硒磷脂化合物I-1脂质体制剂透射电子显微镜表征结果；

图8为硒磷脂化合物I-1脂质体制剂的粒径分布和表面电势测定结果；

图9为硒磷脂化合物I-1脂质体制剂抗氧化活性测定结果；

图10为硒磷脂化合物I-1脂质体制剂对细胞内活性氧的清除效果；

图11为硒磷脂化合物I-1脂质体制剂对活性氧损伤细胞的保护作用；

图12为硒磷脂化合物I-1脂质体制剂的生物安全性。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

硒磷脂化合物，结构式如式I所示：

其中：

R₁为C₄～C₁₈的饱和烷基或C₁₆～C₂₂不饱和烷基；

饱和烷基如丁酸(C4:0)，戊酸(C5:0)，己酸(C6:0)，庚酸(C7:0)，辛酸(C8:0)，壬酸(C9:0)，癸酸(C10:0)，十一烷酸(C11:0)，十二烷酸(C12:0)，十三烷酸(C13:0)，十四烷酸(C14:0)，十五烷酸(C15:0)，棕榈酸(C16:0)，十七烷酸(C17:0)，硬脂酸(C18:0)；

不饱和烷基如棕榈油酸(C16:1)，油酸(C18:1)，芥酸(C22:1)等。

R₂为C₄～C₁₈的饱和烷基或C₁₆～C₂₂不饱和烷基；

饱和烷基如丁酸(C4:0)，戊酸(C5:0)，己酸(C6:0)，庚酸(C7:0)，辛酸(C8:0)，壬酸(C9:0)，癸酸(C10:0)，十一烷酸(C11:0)，十二烷酸(C12:0)，十三烷酸(C13:0)，十四烷酸(C14:0)，十五烷酸(C15:0)，棕榈酸(C16:0)，十七烷酸(C17:0)，硬脂酸(C18:0)；

不饱和烷基如棕榈油酸(C16:1)，油酸(C18:1)，芥酸(C22:1)等。

X为氢、钠、钾，铵或钙。

实施例1

二硒化钠(Na₂Se₂)的制备，包括如下步骤：

氩气保护下，向硒粉(0.79g,1.0eq)与硼氢化钠(0.76g,2.0eq.)混合物中加入1,4-二氧六环20mL，置于冰水浴中，用注射器慢慢滴加10mL去离子水，慢慢变成混悬液，除去冰水浴，再加入10mL去离子水，成透明溶液，反应1h，快速加入硒粉(0.79g,1.0eq.)并且搅拌均匀，溶液成棕红色，50℃反应3h，得Na₂Se₂溶液备用。

实施例2

硒磷脂化合物I-1(式I所示化合物中的R₁和R₂均为油酸，X为氢)的合成方法，包括如下步骤：

1)将溴乙酸(2.92g，2.1eq.)溶于40mL水，用碳酸氢钠(1.85g,2.2eq.)中和，加热到50℃，将实施例1制备的Na₂Se₂溶液加入到反应瓶中，保温反应过夜(>4h)，溶液呈现金黄色，降温到室温，用1M HCl调节pH＝2(也可以是2-3中任意值)，用乙酸乙酯50mL萃取2次，合并有机相，用饱和食盐水50mL洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤过程中黄色样品会有变红现象；浓缩得到黄色油状液体，用少许石油醚洗涤3次(也可以是4次)，除去其中硼酸酯和剩余的乙酸乙酯。用体积比为8：1的乙酸乙酯和正戊烷的混合溶剂重结晶(除去单硒二酸分子，由于单硒二酸在该混合溶液中溶解度较大)，继续抽干4h后得到产物，呈黄色固体2,2’-二硒二乙酸(II)；见图1和图2。

2)将2,2’-二硒二乙酸(II)(14mg,1.0eq.)分散在20mL二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙胺(46mg,7.0eq.)，碳二亚胺类缩合剂(EDC·HCl，22mg,2.2eq.)和与之相配合使用的1-羟基苯并三唑(HOBT，15mg,2.2eq.)，加入磷脂酰乙醇胺III-1(即式III所示化合物中的R₁和R₂均为油酸，X为氢，74mg,2.0eq.)，室温下反应48h，先后加入20mL二氯甲烷和40mL去离子水，萃取洗涤，静置，分离有机相，重复2次。有明显乳化象，可通过再次加入40mL去离子水，用1M HCl调节pH为2(也可以是2-3中任意值)洗涤的方式分离有机相，再用饱和食盐水40mL反复洗涤，至基本无乳化现象；无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，剩余物干燥得到产物硒磷脂前体(IV-1)(即式IV所示化合物中的R₁和R₂均为油酸，X为氢)，见图3。

EDC·HCl为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的缩写。

HOBt为1-羟基苯并三唑的缩写。

3)将硒磷脂前体IV-1(51mg,1.0eq.)溶于30mL四氢呋喃，加入H₂O₂ 30μL，反应5h，直接减压浓缩，干燥得到硒磷脂化合物I-1(即式I所示化合物中的R₁和R₂均为油酸，X为氢)，见图4。

实验证明：用X为钠、钾，铵或钙分别替代本实施例中式III所示化合物中X为氢，其它同本实施例，可以分别得到硒磷脂化合物。

实验证明：用四氢呋喃、乙腈或体积比为1：1的甲苯和N,N-二甲基甲酰胺组成的混合溶剂分别替代本实施例中的二氯甲烷，其它同本实施例，分别得到硒磷脂化合物I-1。

实验证明：用三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶分别替代本实施例的N,N-二异丙基乙胺，其它同本实施例，分别得到硒磷脂化合物I-1。

实验证明：用2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU，鎓盐类缩合剂)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU，鎓盐类缩合剂)或二苯基磷酰氯(DPP-Cl，有机磷类缩合剂)、二(2-氧-3-唑烷基)磷酰氯(BOP-Cl，有机磷类缩合剂)，替代本实施例中的碳二亚胺类缩合剂EDC·HCl，其它同本实施例，分别得到硒磷脂化合物I-1。

参考文献：J.Org.Chem.1994,59,4805，公开了磷脂酰乙醇胺类化合物(式III)的合成通用方法，说明R₁和R₂所述的C₄～C₁₈的饱和烷基或C₁₆～C₂₂不饱和烷基是可以合成的；参考文献：SN Appl.Sci.2020,2,1229，公开了磷脂酰乙醇胺上的氨基反应并不会受到R1和R2部分烷基的影响，其与羧酸分子连接成酰胺的反应是成熟工艺。

实施例3：

硒磷脂化合物I-2(式I所示化合物中的R₁和R₂均为硬脂酸，X为氢)的合成方法：

用磷脂酰乙醇胺III-2(即式III所示化合物中的R₁和R₂均为硬脂酸，X为氢)(2.0eq.)替换实施例2中的磷脂酰乙醇胺III-1，其它同实施例2，得到硒磷脂化合物I-2，见图5。

实施例4：

硒磷脂化合物I-3(式I所示化合物中的R₁和R₂均为十四烷酸，X为氢)的合成方法：

用磷脂酰乙醇胺III-3(即式III所示化合物中的R₁和R₂均为十四烷酸，X为氢)(2.0eq.)替换实施例2中的磷脂酰乙醇胺III-1，其它同实施例2，得到硒磷脂化合物I-3，见图6。

实施例5：

硒磷脂化合物I-4(式I所示化合物中的R₁和R₂均为丁酸，X为氢)的合成方法：

用磷脂酰乙醇胺III-4(即式III所示化合物中的R₁和R₂均为丁酸，X为氢)(2.0eq.)替换实施例2中的磷脂酰乙醇胺III-1，其它同实施例2，得到硒磷脂化合物I-4。

实施例6：

硒磷脂化合物I-5(式I所示化合物中的R₁和R₂均为棕榈油酸，X为氢)的合成方法：

用磷脂酰乙醇胺III-5(即式III所示化合物中的R₁和R₂均为棕榈油酸，X为氢)(2.0eq.)替换实施例2中的磷脂酰乙醇胺III-1，其它同实施例2，得到硒磷脂化合物I-5。

实施例7：

硒磷脂化合物I-6(式I所示化合物中的R₁和R₂均为芥酸，X为氢)的合成方法：

用磷脂酰乙醇胺III-6(即式III所示化合物中的R₁和R₂均为芥酸，X为氢)(2.0eq.)替换实施例2中的磷脂酰乙醇胺III-1，其它同实施例2，得到硒磷脂化合物I-6。

实施例8：

硒磷脂化合物的脂质体制剂的制备方法，包括如下步骤：

1)按摩尔比20:4:1将实施例2制备的硒磷脂化合物I-1、胆固醇和甲氧基-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺溶解于混合溶剂中，所述混合溶剂是由体积比为3：1的氯仿和甲醇组成；

2)减压蒸发除混合溶剂，在圆底烧瓶中形成均匀的薄膜，真空干燥除尽混合溶剂；

3)加入10mL水(也可以选用10mL pH＝7.5的磷酸盐缓冲液、pH＝7的磷酸盐缓冲液或pH＝8的磷酸盐缓冲液)，在37℃下振荡2h(也可以选用25-50℃之间的任意值，如25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)，使真空干燥后的脂膜完全溶解，短时间超声处理30S，完全悬浮并用0.45微米过滤膜过滤，得到硒磷脂化合物I-1的脂质体制剂。

实施例3-实施例7制备的硒磷脂化合物按本实施例的方法分别制备得到硒磷脂化合物的脂质体制剂。

实施例9

硒磷脂化合物I-1脂质体制剂(实施例8获得的)的理化性质

采用透射电子显微镜对硒磷脂化合物(I-1)脂质体制剂的微观形貌进行了分析，根据图7所示，其直径为40-100nm；采用动态光散射对硒磷脂化合物I-1脂质体制剂进一步分析，根据图8所示，其表面电势在-30mV左右，粒径分布在40-100nm，与图7的表征结果一致。

实验证明，硒磷脂化合物I-2脂质体制剂～硒磷脂化合物I-6脂质体制剂的微观形貌和粒径分布、表面电势与硒磷脂化合物I-1脂质体制剂结果相似。

实施例10

硒磷脂化合物I-1脂质体制剂抗氧化活性测试

通过使用间接酶测定法评价硒磷脂化合物I-1脂质体制剂的抗氧化活性。

向比色皿中分别加入谷胱甘肽(GSH 1mM)、还原型辅酶II(NADPH 0.4mM)、谷胱甘肽还原酶(1.7U)；

再将硒磷脂化合物I-1脂质体制剂添加到上述比色皿中，配制终浓度分别是0.36μM、3.6μM和7.2μM，溶剂是1×PBS(pH＝7.4)为样品组；空白对照组不加硒磷脂化合物I-1脂质体制剂；

在37℃下保温3分钟，然后向样品组和空白对照组(总体积为0.5mL)中加入50μL过氧化氢(0.5mM)开始反应。反应进行后观察到在340nm处NADPH吸收值的减少。根据对照实验中记录的值校正活性。一个酶活性单位(U)定义为每分钟消耗1μmol NADPH的模拟量。NADPH的摩尔消光系数ε＝6220M^-1cm^-1。

检测结果参见图9中，黑色曲线为不含有硒磷脂化合物I-1脂质体制剂的空白对照组；红色、蓝色和绿色曲线则分别为添加0.36μM、3.6μM和7.2μM硒磷脂脂质体的样品组。

根据图9可知，样品组中NADPH的消耗速度相对于空白对照组有明显的提升，且该提升速度与加入的硒磷脂化合物I-1脂质体制剂浓度呈正相关。通过拟合曲线得出的斜率值计算，硒磷脂化合物I-1脂质体制剂的抗氧化活性达到约16.5U/μmol。该活性达到了目前商品化含硒药物ebselen活性(约0.99U/μmol)的16倍以上。

实验证明，硒磷脂化合物I-2脂质体制剂～硒磷脂化合物I-6脂质体制剂的抗氧化活性与硒磷脂化合物I-1脂质体制剂结果相似。

实施例11：硒磷脂化合物(I-1)脂质体制剂对成纤维细胞(L929)(商品)内活性氧的清除效果

实验分为5组，即正常细胞(阴性对照)、细胞+H₂O₂(阳性对照)、细胞+H₂O₂+30μM样品、细胞+H₂O₂+45μM样品、细胞+H₂O₂+60μM样品。其中样品为制备好的硒磷脂化合物(I-1)脂质体制剂。

细胞铺板后培养48h，加入硒磷脂化合物(I-1)脂质体制剂，继续培养30min，加入H₂O₂(300μM)继续培养3h，最后进行活性氧探针染色并用激光共聚焦显微镜观察结果。

根据图10所示，阴性对照组细胞内绿色荧光非常弱，代表细胞内活性氧的含量非常少。阳性对照组细胞内绿色荧光很强，代表存在大量活性氧。而加入了硒磷脂化合物(I-1)脂质体制剂的样品组可减少细胞内活性氧含量，并且减少的程度与所加入的浓度呈现正相关。

实验证明，硒磷脂化合物I-2脂质体制剂～硒磷脂化合物I-6脂质体制剂的抗氧化活性与硒磷脂化合物I-1脂质体制剂结果相似。

实施例12：磷脂化合物(I-1)脂质体制剂对活性氧损伤的成纤维细胞(L929)的保护作用

实验分为5组，即正常细胞(阴性对照)、细胞+H₂O₂(阳性对照)、细胞+H₂O₂+30μM样品、细胞+H₂O₂+45μM样品、细胞+H₂O₂+60μM样品。其中样品为制备好的磷脂化合物(I-1)脂质体制剂。

细胞铺板后培养48h，加入硒磷脂化合物(I-1)脂质体制剂，继续培养30min，加入H₂O₂(300μM)继续培养3h，最后进行细胞死活染色并用激光共聚焦显微镜观察结果。

根据图11所示，阴性对照组细胞呈现绿色，说明细胞正常存活。阳性对照组中大多数细胞呈现红色，说明H₂O₂诱导细胞大量死亡。而加入了磷脂化合物(I-1)脂质体制剂的样品组可降低细胞死亡率，并且存活率与所加入的浓度呈现正相关。

实验证明，硒磷脂化合物I-2脂质体制剂～硒磷脂化合物I-6脂质体制剂的对活性氧损伤成纤维细胞(L929)的保护作用与硒磷脂化合物I-1脂质体制剂结果相似。

实施例13：磷脂化合物(I-1)脂质体制剂的生物安全性

以每孔0.8×10⁴个细胞的浓度将L929细胞种于48孔板，孵育24h后，将不同浓度(0、10、20、30、40、50、60μM)的磷脂化合物(I-1)脂质体制剂分散于细胞培养液中，继续孵育72h。用无菌PBS洗涤细胞，然后用200μL含CCK-8(10％)的细胞培养液处理细胞，再孵育2h。通过测量450nm处吸光度值来定量细胞活力。结果表明，磷脂化合物(I-1)脂质体制剂并没有展示出细胞毒性，说明其具有非常好的生物安全性。见图12。

实验证明，硒磷脂化合物I-2脂质体制剂～硒磷脂化合物I-6脂质体制剂的生物安全性与硒磷脂化合物I-1脂质体制剂结果相似。

Claims (8)

1.硒磷脂化合物，其特征是结构式如式(I)所示：

其中：

R₁为C₄～C₁₈的饱和烷基或C₁₆～C₂₂不饱和烷基；

R₂为C₄～C₁₈的饱和烷基或C₁₆～C₂₂不饱和烷基；

X为氢、钠、钾或铵。

2.权利要求1的硒磷脂化合物的合成方法，其特征是包括如下步骤：

1)溴乙酸与Na₂Se₂反应生成2,2’-二硒二乙酸(II)

2)将2,2’-二硒二乙酸(II)分散在惰性溶剂中，在碱性条件下加入缩合剂和1-羟基苯并三唑之后，再加入化合物(III)发生酰化反应，生成硒磷脂前体(IV)

3)用过氧化氢氧化所述硒磷脂前体(IV)，生成硒磷脂化合物(I)

其中：

R₁为C₄～C₁₈的饱和烷基或C₁₆～C₂₂不饱和烷基；

R₂为C₄～C₁₈的饱和烷基或C₁₆～C₂₂不饱和烷基；

X为氢、钠、钾或铵。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征是所述惰性溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、甲苯和N,N-二甲基甲酰胺中至少一种。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征是所述碱性条件为加入三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶和N,N-二异丙基乙胺中至少一种。

5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征是所述缩合剂为2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、二苯基磷酰氯、二(2-氧-3-唑烷基)磷酰氯或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。

6.包含权利要求1的硒磷脂化合物的脂质体制剂。

7.权利要求6的包含硒磷脂化合物的脂质体制剂的制备方法，其特征是包括如下步骤：

1)将硒磷脂化合物(I)、胆固醇和甲氧基-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺溶解于混合溶剂中，所述混合溶剂是由体积比为3：1的氯仿和甲醇组成；

2)减压蒸发除去所述溶剂，形成均匀的脂膜，真空干燥；

3)加入水或pH＝7-8的磷酸盐缓冲液，25-50℃，使真空干燥后的脂膜完全溶解，生成硒磷脂化合物的脂质体制剂。

8.权利要求6的包含硒磷脂化合物的脂质体制剂在制备抗氧化类药物中的应用。