[go: up one dir, main page]

CN118103140A - 分离不同分析物类的分析物 - Google Patents

分离不同分析物类的分析物 Download PDF

Info

Publication number
CN118103140A
CN118103140A CN202280068559.0A CN202280068559A CN118103140A CN 118103140 A CN118103140 A CN 118103140A CN 202280068559 A CN202280068559 A CN 202280068559A CN 118103140 A CN118103140 A CN 118103140A
Authority
CN
China
Prior art keywords
analyte
isolation
chamber
isolation structure
analytes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280068559.0A
Other languages
English (en)
Inventor
尼尔斯·帕斯特
彼得·尤尔格
扬·吕德克
托比亚斯·赫茨劳布
弗兰齐斯卡·施伦克
埃桑·马哈莫迪·阿杰曼德
古斯塔夫·格莱瑟
马克·卡勒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hann-Schickard-Gesellschaft fuer Angewandte Forschung eV
Original Assignee
Hann-Schickard-Gesellschaft fuer Angewandte Forschung eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hann-Schickard-Gesellschaft fuer Angewandte Forschung eV filed Critical Hann-Schickard-Gesellschaft fuer Angewandte Forschung eV
Publication of CN118103140A publication Critical patent/CN118103140A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502753—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by bulk separation arrangements on lab-on-a-chip devices, e.g. for filtration or centrifugation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F33/00—Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
    • B01F33/45—Magnetic mixers; Mixers with magnetically driven stirrers
    • B01F33/451—Magnetic mixers; Mixers with magnetically driven stirrers wherein the mixture is directly exposed to an electromagnetic field without use of a stirrer, e.g. for material comprising ferromagnetic particles or for molten metal
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/005—Pretreatment specially adapted for magnetic separation
    • B03C1/01—Pretreatment specially adapted for magnetic separation by addition of magnetic adjuvants
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/30—Combinations with other devices, not otherwise provided for
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0631—Purification arrangements, e.g. solid phase extraction [SPE]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0803—Disc shape
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0409—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces centrifugal forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/043—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces magnetic forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C2201/00—Details of magnetic or electrostatic separation
    • B03C2201/18—Magnetic separation whereby the particles are suspended in a liquid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C2201/00—Details of magnetic or electrostatic separation
    • B03C2201/26—Details of magnetic or electrostatic separation for use in medical or biological applications
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)

Abstract

从离心微流体系统中的生物样品的相同样品体积中分离第一分析物类分析物和第二分析物类分析物的方法，第一分析物类分析物是细胞外囊泡和/或循环肿瘤细胞，第二分析物类分析物是无细胞核酸，样品体积被引导到包含第一隔离结构的流体模块的第一隔离室中，使得第一分析物类分析物被第一隔离结构保留，而第二分析物类不被第一隔离结构保留并且作为残余液体的一部分通过第一隔离结构。将残余液体通入包含第二隔离结构的流体模块的第二隔离腔，使得第二分析物类的分析物被第二隔离结构保留。将第一分析物类和第二分析物类的分析物与各自的隔离结构分离，以提供分析物用于随后的分析。

Description

分离不同分析物类的分析物
技术领域
本发明涉及用于从相同的样品体积中分离不同分析物类的方法和装置，具体地，涉及用于从生物样品的相同样品体积中分离作为第一分析物类的细胞外囊泡(EV)和/或循环肿瘤细胞以及作为第二分析物类的无细胞核酸的方法和装置。
背景技术
疾病的早期诊断往往对患者的康复机会至关重要，这就是为什么迫切需要高诊断灵敏度的原因。此外，对疾病的具体的诊断是重要的，以便为了做出正确的治疗决定并最大限度地来减少假阳性结果，因为假阳性结果会给患者带来巨大负担，并因后续检查而给医疗系统带来高昂的额外成本。
因此，除了高敏感性之外，还需要高诊断的具体性。诊断测试的灵敏度和具体性通过确定共同的阈值来定义，共同的阈值将测试结果划分为阳性和阴性。这意味着只要诊断是基于单个分析物，灵敏度和具体性相互关联并且不能相互独立地优化。
提高诊断灵敏度和具体性的一种有前途的方法是分析一个患者样品中的几种分析物或分析物类，并且在一个时间点进行分析。然而，这通常需要将患者样本分成几个子体积或者收集更大的样本体积，这不仅会引起成本，例如几个血液管，而且还会增加患者的负担。这个问题由于以下事实而增加：利用目前已知的来自非侵入性或最低侵入性样品的疾病相关分析物，无论如何收集非常大量的样品，例如10mL全血，用于分析血浆中的无细胞脱氧核糖核酸(cfDNA)，这对于患者来说是麻烦的。这种背景通常是样品基质内分析物浓度非常低，特别是在疾病的早期阶段或治疗后(监测最小残留疾病，MRD)。
例如，离心微流体系统可用于提供分析物以用于来自生物样品的分析和/或分析分析物。这里的离心微流体系统是构造成在利用旋转过程中产生的离心力的同时处理液体的系统。离心微流体技术涉及在旋转系统中在皮升到毫升范围内的处理液体。这种系统通常是一次性聚合物筒，其用于离心机转子或代替离心机转子，目的是使实验室过程自动化。标准的实验室过程(如移液、离心、混合或等分)可以在微流盒中实施。为此目的，筒包含用于流体引导的通道和用于收集液体的腔室。通常，设计用于处理流体的这种结构可被称为流体结构。通常，这种筒可被称为流体模块。
筒可以经受预定的旋转频率序列，即频率方案，从而筒中的液体可以通过离心力而移动。离心微流体主要用于实验室分析和移动诊断。
现有技术
使用离心微流体系统从生物样品中分离分析物的方法和装置是已知的。
Chi-Ju Kim等人的“Fully automated,on-site isolation of cfDNA fromwhole blood for cancer therapy monitoring”，Lab Chip，2018，18，第1321-1329页公开了一种离心微流体芯片和相关装置，其可用于在不到30分钟的时间内完全自动地从全血中分离cfDNA。cfDNA与硅珠粒结合，洗涤和洗脱。流体技术基于通过柱塞打开或关闭的膜阀。
Hyun-Kyung Woo等人的“Exodisc for Rapid,Size-Selective,and EfficientIsolation and Analysis of Nanoscale Ex-tracellular Vesicles from BiologicalSample”，ACS Nano 2017，11，第1360-1370页，公开了一种具有流体结构的圆盘形式的流体模块，利用离心微流体技术以隔离细胞外囊泡(EV)。在流体模块中提供两个纳米过滤器，通过它们在30分钟内从生物样品中分离出尺寸范围为20nm至600nm的EV。首先，使用第一过滤器从样品中除去大颗粒，然后使用第二过滤器分离EV。然后洗涤并洗脱EV。流体技术基于通过柱塞打开或关闭的膜阀。
还存在从单个样品中分离两种或多种分析物类的方法。
EP 3167062B1公开了一种方法，其中，在分离和纯化和/或富集微泡之前，通过离心或过滤从生物样品中除去颗粒、细胞和/或细胞碎片或其它杂质。然后从微泡中提取高质量的核酸。在该方法中描述了，提供生物样品，并使其与捕获表面在足以在捕获表面上或捕获表面中从生物样品获得无细胞脱氧核糖核酸(DNA)和微泡的条件下接触。捕获表面与基于苯酚的裂解试剂接触，同时无细胞DNA和微泡位于捕获表面之上或之中，从而从样品中释放DNA和核糖核酸(RNA)并产生匀浆。然后从匀浆中提取DNA、RNA、或DNA和RNA两者。
从US10，808，240B2已知一种类似的从生物液体中分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA的方法。在足以将生物样品中的无细胞DNA和微泡保留在捕获表面上或捕获表面中的条件下，使生物样品与固体捕获表面接触。捕获表面与基于GTC的洗脱缓冲液接触，同时无细胞DNA和微泡位于捕获表面之上或之中，从而从样品中释放DNA和RNA并产生匀浆。从匀浆中提取DNA、RNA或DNA和RNA两者。
EP 2245458B1也公开了一种方法，其中产生了由来自细胞外囊泡的DNA和cfDNA组成的匀浆。
发明内容
已经认识到现有技术中已知的方法的主要缺点是，在进行这些方法之后，EV-DNA和cfDNA(或者RNA，根据方法)作为匀浆存在，并且不能以分化的方式进行分析。细胞外囊泡被破坏，即不能进一步分析特征如表面标记物，大小分布等。细胞外囊泡含有其它相关的分析物(例如蛋白质)。这些在制备匀浆的已知方法中丢失了。cfDNA的量已经代表生物标记。这个数量是由额外的EV-DNA伪造的。
还已经认识到，可以通过分析来自相同样品体积的不同分析物类来提供补救，其中，几种不同的分析物可以增加诊断灵敏度/具体性，但是迄今为止这需要大的样品体积。优选地，用于不同分析物类的预分析分离的所使用的方法是彼此相容的并且能够组合在集成的、自动化的加工链中。这可以提供经济上有吸引力的解决方案，因为可以避免由于手动中间步骤而导致的高成本和对用于隔离的几种不同实验室设备的需要。目前，没有能够从相同的样品体积中和在单个集成处理链中分离几种分析物类的方法，因为现有的方法将相互影响/干扰和/或基于不同原理而不能够容易地在一个实验室设备中组合。
本发明的目的是提供一种方法和装置，该方法和装置能够使不同分析物类的分析物，即一方面是细胞外囊泡和/或循环肿瘤细胞，另一方面是无细胞核酸，从相同的样品体积中以允许在集成的加工链中实施的方式分离。
目的通过根据权利要求1所述的方法和根据权利要求12所述的流体模块来实现。在从属权利要求中限定了本发明的进一步发展。
本申请的实施例提供了一种用于从离心微流体系统中的生物样品的相同样品体积中分离第一分析物类分析物和第二分析物类分析物的方法，所述第一分析物类分析物是细胞外囊泡和/或循环肿瘤细胞，所述第二分析物类分析物是无细胞核酸，所述离心微流体系统包括具有第一隔离室和第二隔离室的流体模块，所述第一隔离室包含第一隔离结构，所述第二隔离室包括第二隔离结构。样品体积被导入所述第一隔离室，使得所述第一分析物类的分析物被所述第一隔离结构保留，而所述第二分析物类的分析物不被所述第一隔离结构保留，并且作为残留液体的一部分通过所述第一隔离结构。残留液体被导入所述第二隔离室，使得所述第二分析物类的分析物被第二隔离结构保留。所述第一分析物类的分析物被从所述第一隔离结构分离，所述第二分析物类的分析物被从所述第二隔离结构分离，以彼此独立地提供所述第一分析物类的分析物和所述第二分析物类的分析物，用于随后的分析。
本申请的实施例提供了一种用于从离心微流体系统中的生物样品的相同样品体积中分离第一分析物类分析物和第二分析物类分析物的流体模块，所述第一分析物类分析物是细胞外囊泡和/或循环肿瘤细胞，所述第二分析物类分析物是无细胞核酸，所述离心微流体系统包括具有第一隔离室和第二隔离室的流体模块，所述第一隔离室包含第一隔离结构，所述第二隔离室包括第二隔离结构。样品体积被导入所述第一隔离室，使得所述第一分析物类的分析物被所述第一隔离结构保留，而所述第二分析物类的分析物不被所述第一隔离结构保留，并且作为残留液体的一部分通过所述第一隔离结构。残留液体被导入所述第二隔离室，使得所述第二分析物类的分析物被第二隔离结构保留。所述第一分析物类的分析物被从所述第一隔离结构分离，所述第二分析物类的分析物被从所述第二隔离结构分离，以彼此独立地提供所述第一分析物类的分析物和所述第二分析物类的分析物，用于随后的分析。
本申请的实施例提供了一种用于从离心微流体系统中的生物样品的相同样品体积中分离第一分析物类分析物和第二分析物类分析物的方法，所述第一分析物类分析物是细胞外囊泡和/或循环肿瘤细胞，所述第二分析物类分析物是无细胞核酸，所述离心微流体系统包括具有第一隔离室，第二隔离室，第一流体管线，第二流体管线，第一收集室和第二收集室的流体模块，所述第一隔离室包含第一隔离结构，所述第二隔离室包括第二隔离结构，第一流体管线设置用于将所述样品体积引导到所述第一隔离室，使得所述第一分析物类的分析物被所述第一隔离结构保留，而所述第二分析物类的分析物不被所述第一隔离结构保留，并且作为残留液体的一部分穿过所述第一隔离结构，第二流体管线设置用于将残留液体引导到第二隔离室，使得第二分析物类的分析物被第二隔离结构保留。第一收集室连接到所述第一隔离室，所述第一收集室用于接收从所述第一隔离结构分离的所述第一分析物类的分析物。第二收集室连接到所述第二隔离室，所述第二收集室用于接收从所述第二隔离结构分离的所述第二分析物类的分析物，或用于在所述第二分析物类的分析物已经从所述第二隔离结构分离后接收第二隔离结构。
根据本申请的实施例，不同分析物类的分析物因此从相同的样品体积中获得，并且彼此分开提供以供其进一步使用，例如对其进行分析或检查。由于从相同的样品体积中回收两种分析物，其中，从分离第一分析物类的分析物后剩余的残留液体中回收第二分析物类的分析物，因此可以从小的样品体积中分离两种分析物类。此外，已经认识到，可以在离心微流体系统中使用流体模块进行两个隔离，从而可以集成到单个处理链中。
附图说明
下面参考附图更详细地解释本发明的实施例，其中：
图1示出了根据本申请的实施例的流体模块的示意性表示；
图2示出了根据本申请的实施例的流体模块的组件的示意性表示；
图3示出了示意性地示出根据本申请的方法的图；和
图4示出了根据本申请的一个实施例的离心微流盒形式的流体模块的示意性表示；
图5A和图5B示出了利用这里描述的流体模块的装置的示意性表示。
具体实施方式
在下文中，使用附图详细描述本申请的实施例。应当注意，具有相同功能的相同元件或相同的元件具有相同或相似的附图标记，并且通常省略对具有相同或相似附图标记的元件的重复描述。具体地说，相同或类似的元件可以用具有相同数字和不同或没有小写字母的参考数字来标识。具有相同或相似附图标记的元件的描述可以互换。在下面的描述中，描述了许多细节，以便提供对本申请的实施例的更详细的解释。然而，对于本领域的技术人员显而易见的是，可以在没有这些具体细节的情况下实现其它实施例。所描述的各种实施例的特征可以彼此组合，除非相应组合的特征是互斥的，或者明确地排除这种组合。
在更详细地解释本申请的实施例之前，提供了本文使用的一些术语的定义。
本文所用的术语分离是指旨在除去样品基质的干扰组分(例如抑制剂或可错误分析的组分)和/或增加样品中分析物的浓度(例如通过降低样品的含水含量)的方法。可以通过富集分析物或通过耗尽非分析物物质来实现分离。术语“分离”的同义术语是“富集，提取和纯化”。
在本文中，样品是生物材料，其通常取自人并且使用非侵入式或最小侵入式技术收集。样品可以是液体样品(例如全血、血浆、血清、尿、唾液、泪液、脑脊液、精浆)或固体来源(例如粪便)的液化样品。该定义还包括基于人细胞样品产生的样品，例如细胞培养物上清液，即使原始细胞样品是侵入性地收集的。
样品基质是指样品中不进行分析的组分。基质可以使分析更加困难，例如，如果分析物仅以非常低的浓度存在，或者如果基质的组分干扰分析过程。
分析物是待分析的组分。溶解在样品基质中的分析物包括物质，分子，颗粒，其可以在与分离相关的分析过程中根据数量，浓度，生物标记特征等进行分析。在本文中，可能的分析物包括核酸、蛋白质、肽、代谢物、次级代谢物、维生素、细胞(人细胞以及真菌、细菌或支原体)、外来体和病毒。
这里使用术语分析物类来概括那些可以使用单一技术过程分离的分析物。在本文中，例如，各种形式的DNA和RNA被认为是一类分析物，即无细胞核酸(cfNA)。细胞外囊泡的异质亚型也被认为是一类分析物类，即细胞外囊泡(EV)。该分析物类可进一步或替代地包括循环肿瘤细胞。应当注意，根据感兴趣的分析物的性质，例如小EV对大EV，分离过程的参数可以变化，例如在过滤中改变孔径。根据该定义，进一步的分析物类可以是蛋白质，细胞和细胞片段。
术语无细胞核酸(cfNA)是指存在于人体细胞外的各种形式的DNA和RNA。目前，这包括核和线粒体来源的循环无细胞DNA(ccfDNA)，循环肿瘤DNA(ctDNA)，无细胞DNA(cfDNA)，细胞DNA，循环肿瘤RNA(ctRNA)，microRNA(miRNA)和非编码RNA(ncRNA)。
术语细胞外囊泡(EV)是指由细胞释放的颗粒。它们代表不同亚型的异质群体，其当前包括外来体、微泡、外来体和凋亡小体。颗粒的尺寸在几个10nm和几个1μm之间变化，这取决于亚型。各种分析物，例如蛋白质，核酸，脂质或代谢物，他们在EV内部和部分在EV的表面上都被发现。
蛋白质是由通过肽键连接的氨基酸组成的大分子。它们在人体中执行多种功能并且参与多种疾病相关的过程。因此，样品基质(例如血清)中的无细胞蛋白质的分析可单独或与其它分析物组合用于诊断。
本文所用的术语细胞或细胞片段是指所有人血细胞(红细胞，白细胞和血小板)和其它循环(例如在血液中)或运输(例如在粪便中)细胞。血液中循环细胞的实施例是循环肿瘤细胞(CTC)或肿瘤相关血小板(TEP)。
这里使用的术语流体模块是指具有构造成能够如这里所述进行流体处理的微流体结构的模块，例如筒。离心微流体模块(筒)是指能够经受旋转的相应模块，例如，以可插入旋转体或旋转体的流体模块的形式。
本发明的实施例可特别用于离心微流体领域，其包括在皮升至毫升范围内处理液体。因此，流体结构可以具有在微米范围内的合适尺寸，用于处理相应的液体体积。
如果在这里使用术语“径向”，这意味着相对于旋转中心的径向，流体模块或旋转体可围绕该旋转中心旋转。因此，在离心场中，远离旋转中心的径向方向径向减小，而朝向旋转中心的径向方向径向增大。因此，其起点比其端部更靠近旋转中心的流体通道径向减小，而其起点比其端部更远离旋转中心的流体通道径向增大。因此，具有径向增大部分的通道具有径向增大或径向向内延伸的定向分量。显然，这种通道不必精确地沿着径向线延伸，而是可以相对于径向线成一定角度延伸或弯曲。
除非本文另有说明，否则假定室温(20℃)用于温度依赖性变量。
一般而言，本申请的实施例涉及用于从样品体积中纯化多种分析物的方法和装置。本文的实施例涉及一种用于从单个样品体积中分离多种不同类型的分析物(例如无细胞核酸和细胞外囊泡(EV))的方法，其中样品通常来自人，并通过非侵入性或最小侵入性技术收集，样品例如是血液，尿液或粪便。实施例能够实现不将样品体积分成多个子体积，因为这样的分开将导致每次分析的绝对分析物体积的损失，这又导致可实现的灵敏度的损失。此外，可以避免将不同的分析物类分离在一起以形成单一的分离物，因为以这种方式，不同分析物的结构上相同的组分，例如无细胞核酸和EV相关核酸，不能以分化的方式进行分析。离心微流体加工链被确定为用于避免样品分裂的合适方法，这使得能够从相同的样品体积中分离几类分析物，其中，单独的分离方法彼此相容并且彼此不干扰。与先前的方法(其需要在分离之前分离样品或多个连续分离过程)相反，本文所述的方法能够在单个集成的过程链中自动分离多个分析物。该方法的产物是多种分离物，每种分离物仅含有一类定义的分析物。
因此，本申请的实施例提供了用于在离心微流体盒中的组合的集成过程中从单个样品体积中隔离两种或更多种分析物类的方法，以及以旋转体和装置的形式的流体模块，旋转体和装置被配置为执行这种方法。目的是节省样品材料和时间，并最小化手工和仪器工作，同时分离尽可能多的分析物以用于随后的分析。
图1示意性地示出了根据本申请的流体模块10的实施例，流体模块10被配置为执行如本文所述的用于分离两个分析物类的方法。流体模块10可以是例如可绕旋转中心R旋转的旋转体或可插入到这种旋转体中的流体模块。流体模块10具有包括第一隔离室12和第二隔离室14的流体力学结构。第一隔离室12包括第一隔离结构16。第二隔离室14包括第二隔离结构18。如图1中的箭头20所示，将样品体积导入第一隔离室12。为此目的，流体结构具有第一流体管线22。第一分析物类的分析物被第一隔离结构16保留，而第二分析物类的分析物不被第一隔离结构16保留，而是作为残余液体的一部分通过第一隔离结构16。如图1中的箭头26所示，残留液体通过将第一隔离室12连接到第二隔离室14的第二流体管线24被引导到第二隔离室14中。第二分析物类的分析物被第二隔离结构18保留。
第一分析物类的分析物与第一隔离结构16分离，第二分析物类的分析物与第二隔离结构18分离。这在图1中由箭头28和30示出。结果，第一分析物类的分析物和第二分析物类的分析物彼此分开提供，用于随后的分析。第一分析物类的分析物通过第一隔离结构的分离28可以例如包括将第一分析物类的分析物引导到第一收集室32中。为此目的，第一收集室32可以通过流体管线连接到第一隔离室12。将第二分析物类的分析物与第二隔离结构18分离30可以包括将第二分析物类的分析物引导到第二收集室中，该第二收集室经由流体管线连接到第一收集室。第一收集室32，第二收集室34和将其分别连接到第一隔离室12和第二隔离室14的流体管线可以是流体模块10的流体结构的一部分。因此，第一收集室32被配置成接收从第一隔离结构16分离的第一分析物类的分析物，并且第二收集室34被配置成接收从第二隔离结构18分离的第二分析物类的分析物。
在所述方法的实施例中，进行将第一分析物类的分析物与第一隔离结构分离并将残余液体导入第二隔离室的步骤的顺序是不相关的。在实施例中，在将第一分析物类的分析物与第一隔离结构分离之前，可以首先将残余液体引导到第二隔离室中。在本申请的实施例中，第一隔离结构被配置为基于尺寸差异执行过滤。在实施例中，第一隔离结构16是孔径在20纳米至200纳米范围内，优选在20纳米至45纳米范围内的过滤器。因此，第一隔离结构能够分离第一分析物类的分析物，即细胞外囊泡和/或循环肿瘤细胞。或者，也可以通过这种过滤分离血小板。
在实施例中，第一隔离结构具有经配置以结合第一分析物类的分析物的俘获结构。这种捕获结构可以例如是抗体或适体。或者，可以使用基于亲和力的方法，例如在可磁化颗粒上的肽，其结合EV膜的组分。在实施例中，第一隔离结构可经配置以引起聚合物沉淀。加入聚合物以形成其中捕获EV或循环肿瘤细胞(CTC)的晶格。然后可进行沉降以分离晶格，即将第一分析物类的分析物与第一隔离结构分离。
在实施例中，将第一分析物类的分析物与第一隔离结构分离可以包括使用洗涤溶液洗涤保留在第一隔离结构处的分析物，使用洗脱溶液从第一隔离结构洗脱分析物，以及将从第一隔离结构分离的分析物转移到第一收集室。因此，实施例允许以常规方式隔离和分离第一分析物类的分析物。
在实施例中，第一隔离结构具有用于沉淀第一分析物类的分析物的第一隔离室的体积限定的室几何形状。几何限定的室几何形状可以例如由在一定径向高度处通向第一隔离室的通道提供。旋转可引起第一隔离室中的沉淀，第一分析物类的分析物通过该第一隔离室进入室区域，该室区域径向地位于通向该室的通道的外部。然后，通过在指定的径向高度处经由通道开口将上清液排出到第一隔离腔中，可以将残余液体引导到第二隔离腔中。在这种情况下，第一隔离结构由第一隔离室的下部形成。在实施例中，EV可以沉淀在形成第一隔离结构的聚合物中，由此可以除去上清液，可以加入溶解缓冲液以重新溶解聚合物，然后可以转移含有EV的溶液。在这种情况下，用于取出上清液的通道可以位于第一隔离室的径向外端，以取出残留的液体，在第一隔离室中留下具有第一分析物类的分析物的聚合物。
在实施例中，隔离结构，特别是第二隔离结构，可以是用于结合分析物的表面。该表面可以由颗粒、柱、膜或流体模块的表面形成。这种隔离结构可以实现固相分离(结合，洗涤，洗脱)，这是由于对表面的受控结合条件，例如无细胞核酸的分离或蛋白质的分离。该表面可以是流体模块，药筒(例如通道或腔室)的一部分，或者可以是插入流体模块中的主体或插入流体模块中的多个主体，例如柱/膜或珠粒/纳米颗粒)。
在实施例中，第一或第二隔离结构可包括用于结合由颗粒(例如珠粒)形成的分析物的表面，颗粒是可磁化的，方法包括旋转流体模块以借助于处理装置的一个或多个固定或可移动磁体来移动第二隔离腔室中的可磁化颗粒，以帮助颗粒与相应腔室中的液体混合。例如使用残留的液体。在实施例中，磁体不仅可用于混合，而且还可构造成当洗脱液体与分析物一起转移到收集室时将颗粒保持在第二隔离室中。因此，在实施例中，一个或多个磁体可以是静止的或可移动的，以在第二分析物类的分析物被转移到第二收集室时帮助将可磁化颗粒保持在第二隔离室中。
本申请的实施例提供了一种离心微流体装置，其包括如本文所述的流体模块，以及被配置成将旋转赋予流体模块的处理装置。处理装置可以包括一个或多个固定或可移动的磁体，其在流体模块致动(即在其旋转)时，移动第二隔离室中的可磁化颗粒，以帮助颗粒在残留液体中混合。
在本文所公开的方法的实施例中，分离第二分析物类的分析物包括将样品体积与结合缓冲液混合，使所得混合物与表面接触以将第二分析物类的分析物结合到表面上，使用洗涤缓冲液用结合的分析物洗涤表面，使用洗脱缓冲液从表面洗脱分析物，并将从第二隔离结构分离的分析物转移到第二收集室。在实施例中，可以使用类似的方法将第一分析物类的分析物与样品体积分离，其中分离的分析物可以转移到第一收集室中。因此，实施例能够使用普通的结合-洗涤-洗脱方法分离第一和/或第二分析物类的分析物。
在本申请的实施例中，可以通过离心从样品体积中分离分析物。通过这种离心，可以在过滤之前，之间或之后实现基于不同密度的样品的进一步分离，例如用于血浆分离或用于血小板的分离。本申请的实施例被配置为从样品体积中提取两种或更多种分析物类的分析物。如果要分离三种或更多种分析物，则相应地配置流体结构并具有至少一个具有至少一个另外的隔离结构的另外的隔离室和至少一个另外的收集室。然后可以将各种分析物类从流体模块，微流体盒的各种收集室中取出，用于分析。
在实施例中，流体模块包括至少一个过滤器，该过滤器流体地连接到第一隔离室的输入侧，该过滤器对于第一分析物类的分析物和第二分析物类的分析物是可渗透的，并且该过滤器被配置成从样品体积中过滤细胞、细胞碎片、颗粒和杂质。因此，该方法的例子包括在将样品体积导入第一隔离室之前将样品体积导入相应的上游过滤器。因此，实施例能够制备用于随后从样品体积中分离第一分析物类和第二分析物类的分析物的样品体积。
在本申请的实施例中，制备生物样品包括以下方法中的一种或多种：
-进行生物样品的血浆分离，以获得从中回收样品体积的血浆。
-对凝结的生物样品进行血浆分离，以获得回收样品体积的血清。
-进行血浆的血小板分离以获得血小板贫乏的血浆，从中回收样品体积。
-进行血浆的血小板分离以获得富含血小板的血浆，从中回收样品体积。
-酶消化生物样品中的蛋白质和蛋白质聚集体，回收样品体积。
-对生物样品进行液化和/或均化以回收样品体积。
在实施例中，流体模块具有经配置以执行前述过程中的一者或一者以上的流体结构。
例如，血小板分离可以通过沉淀进行，其中，沉淀对应于富含血小板的血浆，而上清液对应于缺乏血小板的血浆。根据样品体积是通过沉积室的径向下端或径向横向端处的通道获取的，因此可以获得血小板贫乏的或血小板富集的血浆。此外，通过过滤可以实现血小板分离，因为流体模块具有过滤器，该过滤器的孔径被构造成保持血小板。然后滤液将是血小板贫乏的，随后从过滤器中分离的渗余物或洗脱液将是血小板富集的。血小板的大小是大约1至4μm。例如，已知使用具有相应孔径(例如孔径为600纳米)的过滤器来保留血小板。
在本申请的实施例中，第一隔离结构被配置为保持EV和/或CTC，其中将分析物与第一隔离结构分离包括将EV和/或CTC作为整体分离或从隔离结构分离成它们的组成部分。在实施例中，EV/CTC可以被分离，同时通过以下方法之一将cfDNA留在流通物中：-过滤，-使用例如抗体，适体或基于亲和力的方法，例如结合EV膜组分的可磁化颗粒上的肽来捕获分析物的方法；-聚合物沉淀，其中添加形成其中捕获EV/CTC的晶格的聚合物，然后沉降以分离晶格；-沉降以从样品体积中分离CTC。
通常，在这里描述的方法的实施例中，具有几微升到几毫升的体积的样品可以自动地或手动地转移到流体模块(微流体盒)中。然后在设备中自动地进一步处理流体模块。使用多种方法在单个过程中连续地从样品中分离几种分析物类的分析物。为此，该装置可构造成使流体模块旋转，通过该旋转，各种液体如本文所述地移动通过流体力学结构。在实施例中，流体模块可以经受相应的频率协议，使得筒中的液体可以通过离心力移动。流体力学结构还可以构造成支持通过其它过程(例如流体动力学过程)来处理液体。对于相应的分离方法，样品不被分开，而是通过微流体连接通道自动通过，从而将相应的分析物从整个样品体积中分离出来。
图2示意性地示出了根据本申请的实施例的流体模块的部件。这些部件包括代表第一隔离结构的第一过滤器结构40，代表第一收集室的第一捕获结构42，代表第二隔离结构的隔离结构44和代表第二收集室的第二捕获结构46。第一流体管线47通向第一过滤器结构40，第二流体管线48将过滤器结构40连接到隔离结构44，第三流体管线50将第一捕获结构42连接到过滤器结构40，而第四流体管线52将第二捕获结构46连接到隔离结构44。如图2所示，在实施例中，另一个过滤结构54可以任选地连接在上游，其具有允许细胞外囊泡、循环肿瘤细胞和无细胞核酸通过的孔径。第一过滤结构40被构造成保留细胞外囊泡并允许无细胞核酸通过。在实施例中，第一过滤结构可被构造成保留循环肿瘤细胞。在另一个实施例中，第一过滤结构可以被配置成通过沉淀保留循环肿瘤细胞的隔离结构来代替。
参考图3，下面解释从一个样品体积中纯化几种分析物的方法的可能的实施。在图3中，实际涉及用于从样品体积中分离两种不同分析物类的方法的步骤显示在分界线T的右边，而用于制备样品体积的方法显示在分界线T的左边。本申请的流体模块的实施例具有流体结构以执行图3所示的方法。然而，该方法不需要具有图3中所示的所有过程，并且特别地，在分界线T左侧所示的过程步骤可以被认为是全部或部分可选的。
将血样转移到流体模块60。进行血浆分离以获得血浆62，其中分离细胞和细胞片段64。随后，可以进行血小板分离以从血浆中分离血小板，66。随后，可以进行蛋白酶K(PK)的蛋白质消化，用于蛋白质消化，68，从而获得PK处理的血浆，70。这样获得的血浆现在可以经受具有大孔径的粗过滤，例如通过如图2所示的过滤器结构54。这种过滤(在图3中称为过滤1)产生渗余物72和滤液74。滤液74代表生物样品的样品体积，从该生物样品中首先分离出EV，然后分离出NA。在所示的例子中，初级分离通过过滤进行，在图3中被称为过滤2。在该方法中，使用离心力将任选预先制备的样品压过一个或多个滤膜。滤膜可以由不同的材料制成，并且具有不同的孔径，例如在20nm和10μm之间。用于膜的潜在材料是聚酯(PES)、回收材料(RC)、阳极化氧化铝(AAO)或TEPC(织物等效材料)。如果使用几个滤膜，则样品被一个接一个地压过不同的滤膜，首先是具有较大孔径的滤膜，然后是具有较小孔径的滤膜。例如，具有大直径的基质组分(例如细胞、细胞碎片或蛋白质聚集体)可以通过上游过滤1分离，而EV和cfNA通过过滤器，例如图2中的附加过滤器结构54。代表第一隔离结构的最终过滤器具有孔尺寸，使得较小的污染物(例如单独的蛋白质)和cfNA通过膜，但保留了EV。这种过滤在图3中被称为过滤2。该过滤2产生渗余物76和滤液78。滤液78代表被引导到第二隔离结构的残留液体。
为了进一步消耗渗余物76中的基质组分，可以使用水溶液、洗涤缓冲液进行洗涤步骤。以这种方式纯化的EV然后可以通过洗脱缓冲液从过滤器中分离出来，用于进一步分析，并作为EV洗脱液80转移到流体模块的收集室。通过过滤器的流(即滤液78)除了剩余的样品基质之外，还含有cfNA，其现在可以使用进一步的方法浓缩和纯化。在离心微流体筒，流体模块上，例如在珠粒上的cfNA固相分离，可以使用各种方法。在这种固相分离中，cfNA与珠粒结合，然后用洗涤缓冲液洗涤并用洗脱缓冲液洗脱，并转移到流体模块的收集室中作为cfNA洗脱液82。因此，第一分析物类的分析物和第二分析物类的分析物彼此分开提供，用于随后的分析。
在第二隔离结构可以移出第二隔离室的例子中，在将第二分析物类的分析物与第二隔离结构分离之后，第二隔离结构可以移出第二隔离室，同时第二分析物类的分析物保留在第二隔离室中。在上述实施例中，例如，珠粒形式的固相基质可以在洗脱后转移出隔离室，而洗脱液保留在隔离室中。
如上面已经解释的，血浆分离可以任选地利用离心微流体系统中的离心力在血液样品的上游进行。一方面，这可以进一步减少样品制备所需的人工，另一方面，进一步增加整个分析过程的再现性。与手动血浆分离相反，离心气动操作可用于在旋转下离心全血后除去血浆上清液，这实际上消除了再沉淀效应。集成的上游血浆分离的另一个目的可以是自动实现细胞和细胞片段的分离，其可以被认为是另一类分析物。除了分析健康细胞外，分析疾病相关细胞，例如循环肿瘤细胞、CTC也可以是特别相关的。
在实施例中，循环肿瘤细胞的沉淀不是生物样品的预处理，而是第二分析物类的分析物的分离。在其它实施例中，循环肿瘤细胞的分离代表第三分析物类的分析物的分离，其在作为第一分析物类的分析物的EV的分离和作为第二分析物类的分析物的cfNA的分离之前。
类似于血浆分离，通过使用固有离心力并除去上清液一次或数次，可以将血浆分离成富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)。以这种方式产生的PRP可以作为分离物从药筒中取出，用于分析血小板，并用于例如肿瘤教育的血小板(TEP)的分析。然而，所产生的PPP可以进行分析物类EV和cfNA的连续分离的进一步处理。如果要分析线粒体来源的无细胞DNA(cf-mtDNA)，则这种上游血小板分离对于防止或最小化无细胞线粒体DNA被裂解血小板(mtDNA)的线粒体DNA污染可能是必需的。可将TEP视为第三分析物类的分析物，其在第一和第二分析物类的分析物之前从样品体积中除去。
此外，任选地并且根据基质，可以在过滤前液化和/或匀化生物样品，例如在痰或粪便样品的情况下，或者可以用蛋白酶(例如蛋白酶K)进行酶消化。这分解蛋白质和蛋白质聚集体，这使得难以分离分析物，例如通过堵塞滤膜或结合核酸。通过洗涤步骤，例如图3中所示的洗涤缓冲液，或固相分离(结合-洗涤-洗脱)，可以将酶从分析物中再次分离出来，因此它们不会妨碍进一步的分析。
图4示意性地示出了围绕旋转中心R旋转的旋转体10形式的流体模块10，其具有流体结构，该流体结构被配置为执行cfNA和EV与人类血浆样品形式的单个样品体积的自动、组合隔离。在流体模块中形成的流体结构包括样品入口室83，预过滤室84，用于EV隔离的过滤室85，用于从过滤室85收集滤液的室86，用于除去EV隔离物的收集室87，用于cfNA的固相隔离的室88，用于固相隔离的洗涤流体的收集室89。以及用于去除cfNA隔离物的收集室90。如图4所示，各个腔室通过流体管线相互连接。流体管线被实施为允许利用离心力和可能的其它效应(例如流体动力效应)在各个腔室之间传输液体。用于EV隔离的过滤室85代表如本文所述的第一隔离室，并且室88代表如本文所述的第二隔离室。
过滤膜可以将其中布置有过滤膜的流体室的入口侧部分与该流体室的出口侧部分分开。在实施例中，流体室的入口侧部分和流体室的出口侧部分在穿过旋转中心的旋转轴线的方向上一个在另一个之上地布置。
在操作期间，将血浆样品供给到样品入口室83中，然后依次通过设置在室84和85中的滤膜过滤。布置在室84中的滤膜具有比布置在室85中的滤膜更大的孔径，使得第一和第二分析物类的分析物可以通过，但是保留了更大的基质组分。腔室85中的第二过滤膜被设计成使得cfNA可以通过，但EV被保留。这允许两种分析物从样品中无损失地分离。cfNA滤液收集在室86中并从那里转移到室88用于固相分离。或者，也可以将滤液直接转移到室中进行固相分离。然后用水性缓冲溶液洗涤保留在腔室85中的第二过滤膜上的EV，水性缓冲溶液可以手动或自动地添加到腔室83中以除去可能通过过滤器的基质组分。然后可以在将cfNA滤液转移到室88之后将洗涤溶液收集在室86中。在清洗EV之后，将它们从室85中的过滤器转移到收集室87，可以手动或自动地将它们从收集室87移走。通过使具有cfNA的滤液与表面接触，使其在室88中经受固相分离。在实施例中，固相分离根据结合-洗涤-洗脱方法使用磁性或可磁化颗粒进行，滤液与磁性或可磁化颗粒接触，磁性或可磁化颗粒通过二氧化硅表面结合NA。基质组分，例如蛋白质，可以在一个或多个洗涤步骤中用含溶剂的液体除去。洗涤溶液被收集在室89中。洗涤后，用水性洗脱缓冲液将cfNA从可磁化颗粒中洗脱出来，然后转移到室90中除去。
与现有技术的连续的单一程序相比，其中，例如，细胞外囊泡的分离在第一装置中通过过滤进行，然后在第二装置中通过固相分离进行手动转移和随后的核酸分离，在此提出的组合方法不仅允许在单一装置、离心微流体处理装置中，而且允许在单一消耗品中分离不同的分析物。即呈离心微流体筒形式的流体模块。除了易于处理和降低材料和人员成本的优点之外，预期这种集成的工艺链对分离的再现性具有有利的影响。这方面是高度相关的，因为分析前的变化被认为是循环分析物的临床转换的主要障碍。与组合方法中的现有技术相比，所提出的方法允许从单个样品体积中分离不同的分析物类，而不会负面地影响相应的分析物。具体地，在本文所述的方法中，可以将细胞外囊泡的分析物类与核酸的分析物类分离，并从样品基质中分离，而不会在显著程度上破坏、损害或最小化任一分析物类。所得到的各个分析物类的高质量分离物允许在单一和多分析物水平下的精确和可再现性分析，以增加灵敏度和具体性，而不会不期望地增加样品体积。
参照图5A和图5B，描述了离心微流体系统的实施例，其利用或包括如本文所述的流体模块。换句话说，图5A和图5B的系统中的流体模块可以是这里描述的任何流体模块。
图5A示出了具有流体模块110的装置，该流体模块110为具有基板112和盖114的旋转体的形式。基板112和盖114在平面图上可以是圆形的，具有中心开口，旋转体110可以通过该中心开口经由传统的固定装置116连接到驱动装置120的旋转部件118。旋转部件118可旋转地安装在驱动装置120的固定部件122上。驱动装置120例如可以是传统的离心机，其可以具有可调节的旋转速度，或者CD或DVD驱动器。可以提供控制装置124，其被构造成控制驱动装置120以将不同旋转频率的旋转或多个旋转传递到旋转体110。对于本领域的技术人员来说显而易见的是，控制设备124可以由例如适当编程的计算设备或用户专用集成电路来实现。控制装置124还可以被配置成响应于来自用户的手动输入来控制驱动装置120以实现旋转体的所需旋转。在任一情况下，控制装置124可构造成控制驱动装置120以向旋转体赋予所需的旋转，从而实现如本文所述的本发明的实施例。驱动装置120可以是仅具有一个旋转方向的传统离心机。
旋转体110具有所需的流体结构。所需的流体结构可以由盖114、基板112或基板112和盖114中的空腔和通道形成。在实施例中，例如，可以在基板112中形成流体结构，而在盖114中形成填充开口和通气口。在实施例中，结构化基板(包括填充开口和通气口)布置在顶部，并且盖布置在底部。
在图5B所示的可选实施例中，流体模块132插入转子130中，并与转子130一起形成旋转体110。流体模块132可以各自具有基板和盖，在其中可以形成相应的流体结构。由转子130和流体模块132形成的旋转体110又可以通过由控制装置124控制的驱动装置120进行旋转。
在图5A和图5B中，流体模块或旋转体可绕其旋转的旋转中心再次由R表示。
图5A和图5B中所示的装置表示处理装置，该处理装置构造成根据需要将旋转赋予流体模块以执行本文所述的方法。处理装置可以包括一个或多个固定或可移动的磁体140，其被构造成有助于将颗粒与第二隔离室中的残余液体混合。为此，磁体140可以位于驱动装置120的静止部分的适当位置，该位置穿过第二隔离室，使得其磁场可以作用在第二隔离室中的可磁化粒子上。
在本发明的实施例中，包括流体结构的流体模块或旋转体可以由任何合适的材料形成，例如塑料，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚氯乙烯(PVC)或聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃等。旋转体110可以被认为是离心微流体平台。在优选实施例中，流体模块或旋转体可以由热塑性塑料形成，例如聚丙烯(PP)、PC、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)或聚苯乙烯(PS)。
因此，本文所述的流体模块允许从相同的样品体积中分离几种分析物类，并在单独的分离物中从该过程中除去几种分析物类。直到现在，为了产生几种每种只有一个分析物类的分离物，要么将样品分成几个子体积而导致灵敏度的损失，或者将更大的样品体积分成几个子体积，以获得相同的灵敏度，但由于患者的负担或样品资源有限，这在实践中是不可行的。在离心微流体技术中尚没有已知的技术能够提供实现不同分析物类的分离(离心、除去上清液、单级和多级过滤和固相分离)的所有原理，并允许将它们组合在集成的自动化的工艺链中。特别地，令人惊讶的是，这里提出的加工链的各个步骤，即EV过滤和cfNA固相分离以及各种任选的步骤，在很大程度上不会对彼此产生负面影响。例如，令人惊讶地的事，通过过滤纯化EV不会由于在过滤器表面或在过滤器体积中的吸收而导致cfNA的显著损失。
本申请的实施例提供了一种集成一个或多个串联连接的用于过滤的过滤器结构的旋转体，该旋转体可以借助于离心力而流过，并且该旋转体的过滤器孔的直径在20nm和200nm之间，并且在该旋转体中提供了用于流通的收集结构。收集结构可以包含隔离结构，以将流通物与缓冲液混合，并且随后使缓冲液流通混合物与(活性)表面接触，以结合该表面的核酸。此外，旋转体可以具有集成的另外的流体结构，以从该另外的流体结构中的隔离结构收集缓冲液流过混合物，并且还收集至少一个冲洗(活性)表面的冲洗缓冲液。在实施例中，(活性)表面可以由磁性或可磁化颗粒形成。在实施例中，可将磁体集成到用于施加旋转的装置中，该装置可以是可移动的并且可以支持珠粒与液体的混合。在实施例中，活性表面可以是二氧化硅膜。
在实施例中，本文所述的第二隔离结构可以是如DE102018219091A1中所述的隔离结构。在实施例中，第一和第二隔离结构可由本身已知并且在开始处描述的隔离结构形成。
不需要单独的解释的是，在这里描述的室，例如隔离室和流体室，可以各自具有几个室部分，或者可以由几个室形成。经由流体管线连接的腔室(例如流体腔室或隔离腔室)不必经由流体管线直接连接，而是可以在其间布置另外的流体腔室。
尽管已经根据设备特征或方法特征描述了本发明的特征中的每一个，但是对于本领域技术人员显而易见的是，相应的特征也可以是方法或设备的一部分。因此，该设备可以被配置为执行相应的方法步骤，并且该设备的相应功能可以表示相应的方法步骤。
在以上详细描述中，在实施例中已经将各种特征部分地分组在一起以合理化本申请。这种类型的公开不应被解释为旨在所要求保护的实施例具有比在每个权利要求中明确陈述的更多的特征。相反，如以下权利要求所反映的，主题可以在于少于单个公开实施例的所有特征。因此，下面的权利要求被结合到详细的描述中，其中每个权利要求可以表示为其自己的单独的例子。尽管每个权利要求可以表示为其自己的单独的实施例，但是应当注意，尽管权利要求中的从属权利要求引用了与一个或多个其他权利要求的特定组合，但是其他实施例还包括从属权利要求与任何其他从属权利要求的主题的组合，或者任何特征与其他从属或独立权利要求的组合。这样的组合被包括在内，除非指出特定的组合不是预期的。此外，权利要求的特征与任何其它独立权利要求的组合也旨在被涵盖，即使该权利要求不直接从属于独立权利要求。
上述实施例仅用于说明本发明的原理。应当理解，对所描述的布置和细节的修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，本申请旨在仅由所附权利要求书限制，而不是由出于描述和解释实施例的目的而阐述的具体细节限制。

Claims (21)

1.一种用于从离心微流体系统中的生物样品的相同样品体积中分离第一分析物类分析物和第二分析物类分析物的方法，所述第一分析物类分析物是细胞外囊泡和/或循环肿瘤细胞，所述第二分析物类分析物是无细胞核酸，所述离心微流体系统包括具有第一隔离室(12，85)和第二隔离室(14，88)的流体模块(10，110，132)，所述第一隔离室(12，85)包含第一隔离结构(16；40)，所述第二隔离室(14，88)包括第二隔离结构(18，44)，所述方法包括：将所述样品体积导入所述第一隔离室(12，85)，使得所述第一分析物类的分析物被所述第一隔离结构(16，40)保留，而所述第二分析物类的分析物不被所述第一隔离结构(16，40)保留，并且作为残留液体的一部分通过所述第一隔离结构(16，40)；将所述残留液体导入所述第二隔离室(14，88)，使得所述第二分析物类的分析物被第二隔离结构(18，44)保留；并且将所述第一分析物类的分析物与所述第一隔离结构(16，40)分离，并将所述第二分析物类的分析物与所述第二隔离结构(18，44)分离，以彼此独立地提供所述第一分析物类的分析物和所述第二分析物类的分析物，用于随后的分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一隔离结构(16，40)是具有在20纳米至200纳米范围内，优选在20纳米至45纳米范围内的孔径的过滤器。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一隔离结构(16)包括被配置为结合所述第一分析物类的分析物的捕获结构。
4.根据权利要求2或3所述的方法，包括通过洗涤溶液洗涤保留在所述第一隔离结构(16，40)处的所述第一分析物类的分析物，通过洗脱溶液从所述第一隔离结构(16，40)洗脱分析物，以及将从所述第一隔离结构(16，40)分离的分析物转移到第一收集室(32，42，87)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一隔离结构(16)具有所述第一隔离室(12)的体积限定的室几何形状，用于所述第一分析物类的分析物的沉淀。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述第二隔离结构(18，44)是用于结合分析物的表面。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述表面由流体模块(10，110，132)的颗粒、柱、膜或表面形成。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述表面由所述颗粒形成，所述颗粒是可磁化的，所述方法包括旋转所述流体模块(10，110，132)以借助于处理装置的一个或多个固定或可移动磁体(140)来移动所述第二隔离室(14，88)中的可磁化的所述颗粒，以帮助所述颗粒与所述残留液体混合。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，包括：将所述样品体积与结合缓冲液混合，将产生的混合物与所述表面接触，以将所述第二分析物类的分析物结合至所述表面，使用洗涤缓冲液来洗涤具有结合分析物的所述表面，使用洗脱缓冲液从所述表面洗脱分析物，并且转移从所述第二隔离结构(18，44)分离的分析物至第二收集室(34，46，90)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，包括：在将所述样品体积引导到所述第一隔离室(12，85)中之前，将所述样品体积引导通过上游过滤器(54)，所述上游过滤器(54)对于所述第一分析物类的分析物和所述第二分析物类的分析物是可渗透的，以便从所述样品体积中过滤细胞、细胞碎片、颗粒和杂质。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，包括制备所述生物样品，其中，制备包括以下过程中的一种或多种：
对所述生物样品进行血浆分离以获得血浆，从所述血浆中得到所述样品体积；
对凝固后的所述生物样品进行血浆分离以获得血清，从所述血清中得到所述样品体积；
对所述血浆进行血小板分离以获得血小板贫乏的血浆，从所述血小板贫乏的血浆中得到所述样品体积；
对所述血浆进行血小板分离以获得富含血小板的血浆，从所述富含血小板的血浆中得到所述样品体积；
酶解所述生物样品中的蛋白质和蛋白质聚集体，以得到所述样品体积；
和对所述生物样品进行液化和/或均化，以得到所述样品体积。
12.一种用于从离心微流体系统中的相同样品体积的生物样品中分离第一分析物类分析物和第二分析物类分析物的流体模块(10，110，132)，所述第一分析物类分析物是细胞外囊泡和/或循环肿瘤细胞，所述第二分析物类分析物是无细胞核酸，所述流体模块(10，110，132)包括：
包含第一隔离结构(16，40)的第一隔离室(12，85)；
包含第二隔离结构(18，44)的第二隔离室(14，88)；
第一流体管线(22，47)，所述第一流体管线用于将所述样品体积引导到所述第一隔离室(12，85)中，使得所述第一分析物类的分析物被所述第一隔离结构(16，40)保留，而所述第二分析物类的分析物不被所述第一隔离结构(16，40)保留，并且作为残留液体的一部分穿过所述第一隔离结构(16，40)；
第二流体管线(24，48)，所述第二流体管线用于将残留液体引导到第二隔离室(14，88)中，使得第二分析物类的分析物被第二隔离结构(18，44)保留；
第一收集室(32，42，87)，所述第一收集室连接到所述第一隔离室(12，85)，所述第一收集室用于接收从所述第一隔离结构(16，40)分离的所述第一分析物类的分析物；
第二收集室(34，46，90)，所述第二收集室连接到所述第二隔离室(14，88)，所述第二收集室用于接收从所述第二隔离结构(18，44)分离的所述第二分析物类的分析物，或用于接收第二隔离结构，所述第二分析物类的分析物已经从所述第二隔离结构分离。
13.根据权利要求12所述的流体模块(10，110，132)，其中，所述第一隔离结构(16，40)是具有在20纳米至200纳米范围内，优选在20纳米至45纳米范围内的孔径的过滤器。
14.根据权利要求12所述的流体模块(10，110，132)，其中，所述第一隔离结构(16)包括被配置为结合所述第一分析物类的分析物的捕获结构。
15.根据权利要求12所述的流体模块(10，110，132)，其中，其中，所述第一隔离结构(16)具有所述第一隔离室(12)的体积限定的室几何形状，用于所述第一分析物类的分析物的沉淀。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的流体模块(10，110，132)，其中，所述第二隔离结构(18，44)是用于结合分析物的表面。
17.根据权利要求16所述的流体模块(10，110，132)，其中，所述表面由流体模块(10，110，132)的颗粒、柱、膜或表面形成。
18.根据权利要求17所述的流体模块(10，110，132)，其中，一个或多个磁体以固定或可移动的方式布置在所述第二隔离室(14，88)外部，以便在所述流体模块(10，110，132)的旋转期间支持可磁化的所述颗粒与滤液的混合，和/或在将所述第二分析物类的分析物转移到所述第二收集室中的过程中来支持所述可磁化的所述颗粒保持在所述第二隔离室(14，88)中。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的流体模块(10，110，132)，包括以下中的至少一个：
配置用于将结合缓冲液引入到所述第二隔离室(14，88)中以支持所述第二分析物类的分析物与表面结合的流体结构，
配置用于将用于洗涤具有结合分析物的表面的洗涤缓冲液引入所述第二隔离室(14，88)中的流体结构，
配置用于将用于从表面洗脱分析物的洗脱缓冲液引入到所述第二隔离室(14，88)中的流体结构，
配置用于在洗涤具有结合分析物的表面之后接收洗涤缓冲液的流体结构。
20.根据权利要求12至19中任一项所述的流体模块(10，110，132)，包括流体连接到所述第一隔离室(12，85)的输入侧的至少一个过滤器(54)，所述过滤器(54)对于所述第一分析物类的分析物和所述第二分析物类的分析物是可渗透的，并且被配置用于从所述样品体积中过滤细胞、细胞碎片、颗粒和杂质。
21.根据权利要求12至20中任一项所述的流体模块(10，110，132)，包括以下中的至少一个：
配置用于对所述生物样品进行血浆分离以获得血浆的流体结构，从所述血浆中得到所述样品体积；
配置用于对凝固后的所述生物样品进行血浆分离以获得血清，从所述血清中得到所述样品体积；
配置用于对所述血浆进行血小板分离以获得血小板贫乏的血浆的流体结构，从所述血小板贫乏的血浆中得到所述样品体积；
配置用于对所述血浆进行血小板分离以获得富含血小板的血浆的流体结构，从所述富含血小板的血浆中得到所述样品体积；
配置用于酶解所述生物样品中的蛋白质和蛋白质聚集体以得到所述样品体积的流体结构；和
配置用于对所述生物样品进行液化和/或均化以得到所述样品体积的流体结构。
CN202280068559.0A 2021-08-13 2022-08-09 分离不同分析物类的分析物 Pending CN118103140A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102021208893.7 2021-08-13
DE102021208893.7A DE102021208893B3 (de) 2021-08-13 2021-08-13 Isolieren von Analyten unterschiedlicher Analyt-Klassen
PCT/EP2022/072377 WO2023017049A1 (de) 2021-08-13 2022-08-09 Isolieren von analyten unterschiedlicher analyt-klassen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118103140A true CN118103140A (zh) 2024-05-28

Family

ID=83059279

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280068559.0A Pending CN118103140A (zh) 2021-08-13 2022-08-09 分离不同分析物类的分析物

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240181456A1 (zh)
EP (1) EP4384318A1 (zh)
CN (1) CN118103140A (zh)
DE (1) DE102021208893B3 (zh)
WO (1) WO2023017049A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102022114873A1 (de) 2022-06-13 2023-12-14 Analytik Jena Gmbh+Co. Kg System zum Analysieren eines Analyten in einer Probe
US20240398299A1 (en) * 2023-05-30 2024-12-05 Crown Laboratories, Inc. Methods and systems for point of care exosome isolation

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8617806B2 (en) 2008-01-25 2013-12-31 Hansabiomed Ou Method to measure and characterize microvesicles in the human body fluids
US9422517B2 (en) * 2010-07-30 2016-08-23 The General Hospital Corporation Microscale and nanoscale structures for manipulating particles
CN107002075B (zh) 2014-07-09 2021-07-30 外来体诊断公司 从生物样品中分离微泡和提取核酸的方法
EP4079853A1 (en) 2016-05-13 2022-10-26 Exosome Diagnostics, Inc. Automated and manual methods for isolation of extracellular vesicles and co-isolation of cell-free dna from biofluids
DE102018219091A1 (de) 2018-11-08 2020-05-14 Hahn-Schickard-Gesellschaft für angewandte Forschung e.V. Vorrichtung und verfahren zum transport magnetischer partikel

Also Published As

Publication number Publication date
EP4384318A1 (de) 2024-06-19
WO2023017049A1 (de) 2023-02-16
DE102021208893B3 (de) 2022-11-17
US20240181456A1 (en) 2024-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240082838A1 (en) Nucleic acid extraction and purification cartridges
US20240181456A1 (en) Isolating analytes of different analyte classes
CN110152747B (zh) 微流控芯片以及外泌体的分离方法
AU2017340293B2 (en) Apparatus for high-throughput rapid trapping of circulating tumor cells and method for purifying circulating tumor cells
JP5920895B2 (ja) マイクロ流体捕獲渦を使用して不均一溶液から細胞を単離する方法及びデバイス
JP6041448B2 (ja) 試料調製デバイスおよび方法
KR101533230B1 (ko) 다단 미세유체 칩 및 이를 이용한 시료의 선택적 분리방법
JP7510944B2 (ja) 生体サンプルから構成成分を選択的に抽出する方法および機器
US20140099649A1 (en) Vesicle capturing devices and methods for using same
EP2315848A1 (en) Methods and systems for microfluidic dna sample preparation
SG187322A1 (en) All-in-one sample preparation device and method
JP2002502597A (ja) 統合ミクロ流体装置
US9606032B2 (en) Preparation of samples for analysis and sampling device therefor
CN211771270U (zh) 一种用于外周血液中外泌体分离、富集的微流控芯片
CN107400623A (zh) 循环肿瘤细胞自动捕获微流控芯片及其自动捕获方法
CN107709990A (zh) 用于侦测生物标记的系统及方法
CN205898536U (zh) 一种分离提取外泌体的叠层离心过滤装置
KR101406347B1 (ko) 핵산 추출용 미세유동 칩, 이를 포함하는 핵산 추출 장치, 및 이를 이용하는 핵산 추출 방법
CN209485831U (zh) 医院用的尿液细胞外囊泡富集装置
CN104114687B (zh) 超高速核酸萃取装置及利用此的核酸萃取方法
US20230003734A1 (en) Immunomagnetic sequential ultrafiltration platform for enrichment and purification of extracellular vesicles from biofluids
US20250025834A1 (en) Methods for isolation and concentration of exosomes and other extracellular vesicles
JP2005232156A (ja) 生体成分精製溶液、生体成分分離方法および生体成分分離装置
US20200238279A1 (en) Devices, systems, and methods for specimen preparation and analysis using capillary and centrifugal forces
CN109694808B (zh) 一种dna提取离心盘

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination