CN118086367A - OsLPR2基因和/或其编码蛋白在调控水稻分蘖角度中的应用 - Google Patents
OsLPR2基因和/或其编码蛋白在调控水稻分蘖角度中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及OsLPR2基因和/或其编码蛋白在调控水稻分蘖角度中的应用。本发明构建OsLPR2基因过表达载体和OsLPR2基因沉默载体，分别导入水稻，发现OsLPR2基因沉默的水稻，相比野生型水稻，分蘖角度显著增加，过表达OsLPR2基因的水稻分蘖角度显著低于野生型水稻，过表达OsLPR2基因可以减小水稻分蘖角度，使水稻株型更紧凑，从而有利于水稻密植生产，并提高氮、磷、钾等肥料利用效率，提高农作物的产量。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及OsLPR2基因和/或其编码蛋白在调控水稻分蘖角度中的应用。
背景技术
水稻的株型控制其不同组织在植株上的立体分布，它能对稻田的空间、光、温度、水分、湿度等进行适当的分配与调节，促进植株正常发育。水稻的株型包括分蘖角度，叶序，穗型及株高等，其中分蘖角度是影响株型的一个重要因素。
分蘖角度是指分蘖与主茎和其它分蘖之间的夹角，过大的分蘖角度不仅浪费空间，减少单位面积内的水稻种植密度导致产量降低，而且不利于水稻的机械化收割；反之，过小的分蘖角度会使植株的生长过于局促，通风透光不畅，导致分蘖之间恶性竞争，群体的光合效率降低，湿度大而易于染病。
因此，寻找参与水稻分蘖角度调控的基因，有利于调节水稻群体的密度，提高群体的光合效率，促进水稻生长从而提高产量。
发明内容
本发明的目的在于提供调控水稻分蘖角度的基因和/或其编码蛋白，减小水稻分蘖角度，使水稻株型更紧凑，从而有利于水稻密植生产，提高水稻群体的光合效率，促进水稻生长从而提高产量。
为了实现上述目的，本发明提供了OsLPR2基因和/或其编码蛋白在调控水稻分蘖角度中的应用，所述OsLPR2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述OsLPR2基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述调控水稻分蘖角度包括：正调控OsLPR2基因和/或其编码蛋白降低水稻分蘖角度。
本发明还提供了一种降低水稻分蘖角度的方法，将OsLPR2基因导入水稻组织；所述OsLPR2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述将OsLPR2基因导入水稻组织的方式包括：将含有OsLPR2基因的植物表达载体和/或菌株导入水稻组织。
优选的，所述含有OsLPR2基因的植物表达载体包括过表达植物载体和插入所述过表达植物载体的OsLPR2基因；
所述过表达植物载体包括基础载体和插入所述基础载体的CaMV35S启动子；
所述含有OsLPR2基因的菌株包括含有OsLPR2基因的农杆菌。
优选的，所述基础载体包括pCAMBIA1300。
本发明还提供了一种提高水稻分蘖角度的方法，将敲除或敲低OsLPR2基因的试剂导入水稻组织；所述OsLPR2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述敲除或敲低OsLPR2基因的试剂包括sgRNA和/或含有所述sgRNA的沉默载体；
所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
优选的，用于构建含有所述sgRNA的沉默载体的基础载体包括pl-cas9-hu。
有益效果：
本发明提供了OsLPR2基因和/或其编码蛋白在调控水稻分蘖角度中的应用，所述OsLPR2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建OsLPR2基因过表达载体和OsLPR2基因沉默载体，分别导入水稻，发现OsLPR2基因沉默的水稻，相比野生型水稻，分蘖角度显著增加，过表达OsLPR2基因的水稻水稻分蘖角度显著低于野生型水稻，过表达OsLPR2基因可以减小水稻分蘖角度，使水稻株型更紧凑，从而有利于水稻密植生产，并提高氮、磷、钾等肥料利用效率，提高农作物的产量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为组成型过表达转基因材料的载体35s-pCAMBIA130的质粒图谱；
图2为OsLPR2基因过表达植物载体35S:OsLPR2的质粒图谱；
图3为基因编辑骨架载体pl-cas9-hu的质粒图谱；
图4为OsLPR2基因敲除载体pl-cas9-hu-sgRNA的质粒图谱；
图5为oslpr2突变体与野生型水稻ZH11的测序序列比对结果；
图6为野生型水稻ZH11和OsLPR2过表达转基因株系OsLPR2基因表达量对比图；
图7为野生型水稻ZH11、oslpr2突变体和过表达转基因株系的实物图；
图8为野生型水稻ZH11、oslpr2突变体和过表达转基因株系的分蘖角度的对比图。
具体实施方式
本发明提供了OsLPR2基因和/或其编码蛋白在调控水稻分蘖角度中的应用，所述OsLPR2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，所述OsLPR2基因的CDS核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示；所述OsLPR2基因的全长核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3。本发明所述调控水稻分蘖角度优选包括：正调控OsLPR2基因和/或其编码蛋白降低水稻分蘖角度。
本发明SEQ ID NO.1～3所示的序列信息具体如下：
SEQ ID NO.1：MEKRRFLGVCLLVAVLVLRAAVLGRGDDGGGGGRLLDPG KLEMFVDELPDMPRMRGYGVAEGGKLVAGNLTIGMYETMWKFHRDLPATRVFAYGTSKETATVPGPTIEAMQGVPTYVTWTNHLPPRHFLPWDPTLTAAAPGSGVPAVVHLHGGVQHSGSDGHSLAWFTAGFAATGPRFSSPAAYEYPNQQPPGNLWYHDHAMGLTRVNILAGLLGAYRVASPAEEAALNLPSGEAFDRNLVLFDRDFLADGSLFMNRTGNNPSVHPQWQPEYFGAVVVANGKAWPYLRVRRRRYRLRILNASNARFFRLSLSGGLRFVHVASDSVYLARPVPTRAFLLAPSEIADVVVDFVESGNATAIVLRSDAPAPYPGDPGDKAETVPVMKFVIDDDDDALSTEPDTSSVPARLTSPSQYAKPDAREAVLMRRIAMYEYTKEGTDEPTHLYLNARSYMDPVTETPREGTSELWDVINLTDDNHPLHVHLALFVALEQRSLRDVDDLKECMMARGSGGGGADACGLERHLAGGRKHVVPKQERGWKNVFKVRPGTVTRLLVRFRPLSPPDSRRFPFDVAAGPGYVYHCHILDHEDNEMMRPMKIVR*；
SEQ ID NO.2：5'-ATGGAGAAGAGAAGGTTTCTTGGAGTGTGCTTGCTTGTGGCAGTGTTGGTGTTGCGGGCGGCGGTGCTCGGCCGTGGTGACGACGGCGGCGGCGGCGGCCGGCTGCTGGACCCGGGCAAGCTGGAGATGTTCGTCGACGAGCTGCCGGACATGCCGAGGATGCGCGGCTACGGCGTGGCGGAGGGCGGCAAGCTCGTCGCCGGCAACCTCACCATCGGCATGTACGAGACCATGTGGAAATTCCACCGCGACCTTCCGGCGACGCGAGTCTTCGCCTACGGGACCAGCAAGGAGACCGCCACGGTGCCGGGCCCCACCATCGAGGCCATGCAGGGTGTCCCCACCTACGTGACGTGGACCAACCACCTCCCGCCACGTCACTTCCTCCCGTGGGACCCCACCCTCACCGCCGCGGCACCTGGCAGCGGCGTCCCCGCCGTCGTCCACCTCCACGGCGGCGTGCAGCACTCCGGCTCCGACGGGCACTCGCTCGCCTGGTTCACCGCCGGCTTCGCCGCCACCGGGCCGCGCTTCTCGTCGCCGGCGGCGTACGAGTACCCCAACCAGCAGCCTCCCGGCAACCTCTGGTACCACGACCACGCCATGGGGCTCACCCGCGTCAACATCCTCGCCGGCCTCCTCGGCGCGTACCGCGTGGCCTCCCCGGCGGAGGAGGCGGCGCTCAACCTCCCCTCCGGCGAGGCGTTCGACCGCAACCTGGTGCTGTTCGACCGCGACTTCCTCGCCGACGGCTCGCTGTTCATGAACCGCACGGGGAACAACCCGAGCGTGCACCCGCAGTGGCAGCCGGAGTACTTCGGCGCCGTCGTCGTCGCCAACGGCAAGGCGTGGCCGTACCTCCGCGTCCGCCGCCGCCGCTACCGCCTCCGCATCCTCAACGCCAGCAACGCGCGCTTCTTCCGCCTCTCCCTCTCCGGCGGCCTCCGCTTCGTTCACGTCGCCTCCGACTCCGTCTACCTCGCCAGGCCGGTGCCCACCCGCGCGTTCCTCCTCGCGCCGTCCGAGATCGCCGACGTCGTCGTCGACTTCGTCGAGTCCGGCAACGCCACGGCGATCGTCCTGCGGTCCGACGCCCCGGCGCCGTACCCCGGCGACCCAGGCGACAAGGCGGAGACCGTGCCGGTGATGAAGTTCGTGATCGACGACGACGACGACGCGTTGTCGACGGAGCCGGACACGTCGAGCGTGCCGGCGAGGCTGACGTCGCCGTCGCAGTACGCCAAGCCGGACGCGAGGGAGGCGGTGCTGATGCGGCGGATCGCCATGTACGAGTACACCAAGGAGGGCACCGACGAGCCGACGCACCTGTACCTGAACGCGAGGTCGTACATGGACCCGGTGACGGAGACGCCGAGGGAGGGGACGTCGGAGCTCTGGGACGTGATCAACCTCACCGACGACAACCACCCGCTTCACGTCCACCTGGCGCTGTTCGTGGCGCTGGAGCAGAGGTCGCTGCGGGACGTCGACGACCTCAAGGAGTGCATGATGGCGCGGGGCAGCGGCGGCGGCGGCGCGGACGCGTGCGGGCTGGAGCGGCACCTCGCCGGCGGGAGGAAGCACGTGGTGCCGAAGCAGGAGCGCGGGTGGAAGAACGTGTTCAAGGTGCGGCCGGGCACGGTGACGAGGCTGCTGGTGCGGTTCCGGCCGCTGTCGCCGCCGGACAGCCGCCGCTTCCCCTTCGACGTCGCCGCCGGCCCCGGCTACGTCTACCACTGCCACATTCTGGACCACGAAGACAACGAGATGATGAGGCCGATGAAGATTGTGCGCTAG-3'
SEQ ID NO.3：5'-ATTCTCTCCTCACATCATCTTGATAGATTTTTTTTTTCACTCAATGGAAGCAAGAAAGAACCTAAACCAGAACCAAAATTAGGAGTCAAAAACACATTGGCTGAAAGGTCCAGCTTGTCCCATTGATCTCTCTTCACTGAAATCCAAAGAAACCAATCTAGGAGTACTATCTAGCTTGCTGCAATGGAGAAGAGAAGGTTTCTTGGAGTGTGCTTGCTTGTGGCAGTGTTGGTGTTGCGGGCGGCGGTGCTCGGCCGTGGTGACGACGGCGGCGGCGGCGGCCGGCTGCTGGACCCGGGCAAGCTGGAGATGTTCGTCGACGAGCTGCCGGACATGCCGAGGATGCGCGGCTACGGCGTGGCGGAGGGCGGCAAGCTCGTCGCCGGCAACCTCACCATCGGCATGTACGAGACCATGTGGGTAAGTACGTGAACAGAATTGCAGAAATGATACAGTTCCTGGCACTTGGATTTTCTTGTCTTCTCTCTTTAATTTGTTTTGATTATTATGTGACGCATATCGTGATGGCAACCTGAGTTTGGTACGATACGGTTGTTCATTTTATTCATAGCTCAGCCCTTGTTTATTTCCAAACTTTTTCTTCAAACTTCTAACTTTTCCGTCGCATCAAAACTTTTCTACACACACAAATTTCTAATTTTTTTATCACATCGTTTCAATTTCAACCAAACTTTCAATTTTAGCGTGAACTAAATACACCCTCAGTAGTAGTGAAAATTCTCAGAAATGAAAACGTTAGCTGAAAACTGGAAACAGTTCATGAAAAAGTAGGCAAAACCTGAAGATCTACTGCAGGTAGCTTAGTGCCTGAAAGTTTAAGTACAGACAGTAACTGCTGCCAAGTGCCAACTGAGCAGAAGCTCGTCATGCACTTCGGGCACTCTCGATCCTACTAGTACTAGCAAACTGGAGTAGCTATGCCTATACTACAGTATGGTCATTGCTAAAATTCTAGGCTTCGAGCACTTTTAGGACAAATGGACATTCTATTGTCTAGACAGCTCGAAAATGTTTGAAAGCTACGTGTATTTCTTCAGAAACAATTTTTTTAAGGATATTGCACTATATCTTTCAGCAGTAGTTGTACTGTATAACGTCTCTCAAAAACAAGATATCCAGACCTAATCAAATGATTTTTCTTTTAAAGAAAGGGGCTCACAAGTCACAAGAAACGCAAGTATTTTAGGACCTGGCCAATCCACAAATCACAGGGTCACGTACCACTAACTGCGGTTCACAAGAACTCTGCAAATCTTATTCACTCATAAGTCCTCATGCATAAAAGTAAGATCAGCCTCGGATTATGAAAGCAACACAAGCAGCTGATATTTCTTTTAGCACTGTTACTGCCTAAAATTTCATCACGAAGTCATCTTTAGTACAGTAGTGGTCTATTTTGCTTGAACGGTTACACTCAGAGGGCAATAAAGGTCCGAAGAAAATTTTTTGCATCAACAAACAATCCGTATTTCAAAGATGCAGCTGCTAATAGCCTACCATAACAAGTACAAAAATATCGCATTTCCTTTTTAGTTCCCCCAAATT
TGATCTGATTAGTGACAGATGTTTGCACAAGAAAAGTAGGCCTACTCTGTGCT
GTCATGCAGTGTCTTTGCAAAGTGGAGGGGGACCTCTGTTACTGTTAAATCC
GATGTGGAAATCCTGTACTAAACTGAGCTAAATTTCACTCCATTCTTTTAAATC
AGGATAAGATGATGCTGATTCTATTCTACAATCATGCTACAATTAAACATTTCA
ATCTTCAGAGGGACCCTCCTTTTCTACACTAGAACATCAGGACTTCCTAGAAT
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ATTCACGTTAAACTTTAGGAAGACTTTCTAGCAGCATGATGAGTTTGTGCCTG
TTTCACTTCTTCACAATGTCAGCATCCTAATGGCCAAATCGCAATGCACTAAC
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GTGCCGTGCCGGCCCACGTGCCGAGCCGCCGGCCCAAGCACGGCCCGTGGA
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TGGTCTGGATCCAGGTAGAGTTGCTCGAACTGAGCAGCCAATTCTTGGTTGT
CCGCAGTGTATTGGGCATGTTGTCGAGCAAGCTCCCAGTCTTTAACGCTTAGT
AGCATTTCGACGTGGTCGCTGCGCAGAGTCGTCCTCCGGTCTTCGATGATTC
GGCCGCATAGACTGAAGGCCGATTCGGAGGACACCGTCGACACGGGCACCG
TCGACACATCCCGTGCTAGTTTTGAAAGCACAGGATATGTTATCTTGTGGTCA
TTCCACCACCCGAGGACGTTGAAATCTTGTGCTTCGTGGTGGATGGCGTCGC
TGTCCAAATAACCGGACAACTCTTCGGCCACAACATGCGAAGAGGCGTCTCC
ACTTGTAGCCGACGAACTGCCACCACCTTGGATTGAACTTGAAGACGATCCA
CCCCAAATCCTACCCCACTGTATCTTCTTCTTACCTATAGTGGGGATAGGAGG
GGGTCTCTGCTGGCGAACTTCCTGAAACTTTACTTCATATCTTCCAAAAACCT
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ATATTTTTGTTTCATGTGAAAGACAGGTTCAGTTAGAACGTCATCATTTTCGTA
TTCTTTAAATAAAGTAGCAATTTCAAGAAGGTTGTGCAAAATTATATTAGCAG
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TGTGTCGAAACACTTCCGCTCGCGGTTCCGGAAAATCCTTCCGAAGCTGTCT
CCGCCTGAACCGGTACCTCCTCAACGACAGCCGTATGAACCGGTACCTCCTC
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GTAGTTGGGGTCGAAATCACCCAAGGTGAACGACGGCGACTGGTATGGAAA
GTTCGGATCCATTCTGAAAATTTAAACCGACATAAACAAATTTTCGAATATTTA
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CGCCTTCCCATTCGACCGCCGCCCGCCCTGTCCGCGCCTGACGGGCCGCCGG
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CCATCTCAATTAGACATTCCATTTGCATTTACACGCACGTATTAGTGTACTACCATTCTAGAAGTACTACATTCGTTTTATATT-3'。
本发明构建OsLPR2基因过表达载体和OsLPR2基因沉默载体，分别导入水稻，发现OsLPR2基因沉默的水稻，相比野生型水稻，分蘖角度显著增加，过表达OsLPR2基因的水稻水稻分蘖角度显著低于野生型水稻，过表达OsLPR2基因可以减小水稻分蘖角度，使水稻株型更紧凑，从而有利于水稻密植生产，并提高氮、磷、钾等肥料利用效率。本发明在实施例中以粳稻中花11为例进行说明，但是不能仅将其理解为本发明的全部保护范围。
本发明还提供了一种降低水稻分蘖角度的方法，将OsLPR2基因导入水稻组织；所述OsLPR2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，所述将OsLPR2基因导入水稻组织的方式优选包括：将含有OsLPR2基因的植物表达载体和/或菌株导入水稻组织。本发明所述含有OsLPR2基因的植物表达载体优选包括过表达植物载体和插入所述过表达植物载体的OsLPR2基因；所述过表达植物载体优选包括基础载体和插入所述基础载体的组成型启动子；所述组成型启动子优选由两个CaMV35S启动子，进一步优选由两个花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子串联而成。本发明所述基础载体优选包括pCAMBIA1300。
本发明优选分别在上游引物5'端和下游引物5'端引入限制性内切酶和保护碱基，得到上游扩增引物和下游扩增引物；利用所述上游扩增引物和下游扩增引物对OsLPR2基因进行PCR扩增，得到扩增产物；将所述扩增产物插入所述过表达载体，得到所述含有OsLPR2基因的植物表达载体；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。当所述基础载体为pCAMBIA1300时，所述上游扩增引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6所示；所述下游扩增引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.7所示。
本发明SEQ ID NO.4～7所示的序列信息具体如下：
SEQ ID NO.4：5'-ATGGAGAAGAGAAGGTTTCTTGGA-3'；
SEQ ID NO.5：5'-CTAGCGCACAATCTTCATCGG-3'；
SEQ ID NO.6：5'-gagctcggtacccggggatccATGGAGAAGAGAAGGTTTCTTGG A-3'；
SEQ ID NO.7：5'-acgacggccagtgccaagcttCTAGCGCACAATCTTCATCGG-3'；
其中，小写字母部分为限制性内切酶和保护碱基。
在本发明中，所述PCR扩增的反应体系优选为：ddH2O 19μl、PhantaMasterMix25μl、上游扩增引物2μl、下游扩增引物2μl和模板DNA2μl；所述PCR扩增的反应程序优选为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸2分钟，35个循环；72℃终延伸5分钟。
在本发明中，所述含有OsLPR2基因的菌株优选为含有OsLPR2基因的农杆菌。本发明所述水稻组织优选为水稻愈伤组织。
在本发明中，所述导入的方式优选包括农杆菌介导法。本发明对所述农杆菌介导的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规操作方法即可。导入后，本发明优选进行培养，筛选和收获转基因种子的操作。本发明对所述培养、筛选和收获的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规操作方法即可。本发明在水稻组织过表达OsLPR2基因，水稻分蘖角度显著低于野生型水稻。并且本发明提供的方法能够大大简化工业生产操作，开拓遗传育种密植型水稻的渠道，为遗传育种密植型水稻提供新的生产思路，减小了传统育种过程中的筛选工作。
本发明还提供了一种提高水稻分蘖角度的方法，将敲除或敲低OsLPR2基因的试剂导入水稻组织；所述OsLPR2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，所述敲除或敲低OsLPR2基因的试剂优选包括sgRNA和/或含有所述sgRNA的沉默载体；所述sgRNA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.8所示，具体为：5'-GGTCTCCTTGCTGGTCCCGTAGG-3'。本发明用于构建所述含有所述sgRNA的沉默载体的基础载体优选包括pl-cas9-hu，购买自武汉伯远生物科技有限公司。本发明将敲除或敲低OsLPR2基因的试剂导入水稻组织的方式与前文一致，在此不做赘述。本发明构建OsLPR2基因沉默载体导入水稻，相比野生型水稻，分蘖角度显著增加。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的OsLPR2基因和/或其编码蛋白在调控水稻分蘖角度中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
OsLPR2基因过表达植物载体(35S:OsLPR2)的构建
(1)将表面消毒后的粳稻中花11(ZH11)种子加清水至没过种子，在32℃黑暗条件催芽。每隔8h更换一次清水。种子露白后将温度调至28℃，直至种子芽长度长到3～5mm，然后将萌发的水稻种子播种与细沙中，注入1/4的Hogland营养液，并移到光照条件下培养6天后，收集小苗用于RNA的提取，采用试剂盒进行逆转录合成cDNA，作为后续PCR反应的模板。
(2)利用DNA片段双酶切和连接的方法，通过酶切位点EcoRI和SacI，在pCAMBIA1300多克隆位点中正向插入两个串联的花椰菜花叶病毒组成型启动子CaMV35S，使得启动子CaMV35S成功连接到pCAMBIA1300载体上，改造获得可用于构建组成型过表达转基因材料的载体35s-pCAMBIA1300，质粒图谱如图1所示。
(3)使用SEQ ID NO.6所示的上游扩增引物OsLPR2-F和SEQ ID NO.7所示的下游扩增引物OsLPR2-R，以步骤(1)得到的cDNA序列作为模板，使用诺维赞生物科技股份有限公司的PhantaMasterMix酶进行PCR扩增；
其中，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸2分钟，35个循环；72℃终延伸5分钟；
PCR扩增的反应体系为：ddH2O 19μl、PhantaMasterMix 25μl、OsLPR2-F 2μl、OsLPR2-R 2μl和模板2μl。
(4)将PCR扩增产物送至测序，得到OsLPR2基因的CDS序列(SEQ ID NO.1)，即SEQID NO.3的184bp～1980bp编码区；利用限制性内切酶BamHI和HindIII线性化步骤(2)得到的载体35s-pCAMBIA1300，通过单片段同源重组酶将含有酶切位点同源臂的OsLPR2基因编码区序列与线性化载体连接，得到重组质粒35S:OsLPR2，图谱如图2所示。
实施例2
OsLPR2基因敲除载体(pl-cas9-hu-sgRNA)的构建
合成含有与BsaI限制性酶切产物粘性末端互补的sgRNA的正向及其互补的单链DNA，进行单链DNA磷酸化并退火形成含有粘性末端的双链sgRNA；用BsaI限制性内切酶线性化pl-cas9-hu空载(图谱如图3所示)并使用碱性磷酸酶去磷酸化；使用T4连接酶连接上述双链sgRNA及线性化pl-cas9-hu，构建pl-cas9-hu-sgRNA克隆载体，图谱如图4所示。所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例3
水稻的转化
(1)将0.5μg实施例1制备的35S:OsLPR2质粒转入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系EHA105感受态细胞中，依次冰浴5min，液氮5min，37℃水浴5min和冰浴5min后，加入无抗LB培养基于28℃摇床中活化1h，得含有35S:OsLPR2质粒的农杆菌菌株，用以转化粳稻中花11的愈伤组织，具体步骤如下：
粳稻中花11的愈伤组织诱导与继代采用本领域技术人员熟知的常规操作方法即可。将含有35S:OsLPR2质粒的农杆菌在含有50mg/L的卡那霉素(Kan)和50mg/L的利福平(Rif)的AAM液体培养基中，28℃遮光200r/min振荡培养至D600 nm为0.4～0.6，离心收集菌体并用液体NB-As重悬至D600 nm＝0.1。选取大小合适、状态良好的的愈伤组织，浸入装有农杆菌重悬液的50ml离心管中30min，在无菌滤纸上吸干多余菌液，在愈伤表面覆灭菌滤纸于超净台吹干。吹干后将愈伤组织转移到铺有无菌滤纸的固体NBD-As培养基上，25℃暗培养。3天后用含有150mg/LTimentin的无菌水浸泡10min，将愈伤多余水分吸干，在愈伤表面覆灭菌滤纸于超净台吹干，转移至NBD-As培养基恢复培养4d(32℃光照培养)。之后转移到含有筛选抗生素潮霉素的NBD-T培养基上继续筛选培养，每2周继代1次。待催化的不定芽生长至3～5cm时，将幼苗切割并转入生根培养基RE2中进行生根诱导，获得T0代幼苗。取T0代幼苗叶片提取植物基因组DNA，PCR检测含有潮霉素抗性基因(SEQ ID NO.9为潮霉素抗性鉴定前引物HYG-JD-F：5'-GGAGCATATACGCCCGGAGTC-3'；SEQ ID NO.10为潮霉素抗性鉴定后引物HYG-JD-R：5'-CTGCCCGCTGTTCTACAACCGG-3')，阳性植株为T1代。
(2)参照步骤(1)的方式，将实施例2得到的pl-cas9-hu-sgRNA导入水稻愈伤组织。
实施例4
目的基因表达的分子检测
(1)粳稻中花11(ZH11)和实施例3步骤(1)过表达转基因植株的幼嫩全株小苗取样提取RNA，经逆转录，采用诺维赞生物科技股份有限公司Taq Pro Universal SYBR qPCRMaster Mix进行荧光实时定量PCR检测，以OsActin1基因作为内参，计算OsLPR2基因相对表达量，结果如表1和图5所示；其中，检测体系和所用引物如下：
所用荧光实时定量PCR反应引物：
OsLPR2-qRT-F：5'-CCACGTCCGTGTGCAGTTC-3'(SEQ ID NO.11)；
OsLPR2-qRT-R：5'-TCACGTGGGTAGATACACATATATAGGA-3'(SEQ ID NO.12)
OsActin1-qRT-F：5'-GGGTTCACAAGTCTGCCTATTGT-3'(SEQ ID NO.13)
OsActin1-qRT-R：5'-ACGGGACACGACCAAGGA-3'(SEQ ID NO.14)
荧光实时定量PCR的反应程序：预变性：95℃，30秒；PCR循环：95℃，10秒以及60℃，30秒(40个循环)；熔解曲线使用仪器默认熔解曲线采集程序。
荧光实时定量PCR的反应体系：Taq Pro Universal SYBR qPCR MasterMix 10μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、cDNA 1μl和ddH2O 8μl。
表1野生型和OsLPR2过表达转基因株系OsLPR2基因表达量
(2)选取表达量较高的株系单株收种，获得T2代植株。种植T2代植株，每个株系种植16株，利用潮霉素抗性基因PCR检测，选取阳性苗成熟后单株收种，获得T3代。种植T3代植株，每个株系种植30株，通过潮霉素抗性基因PCR检测考察每个株系的分离情况，选择未发生外源基因分离的植株为纯合阳性株系，进行后续的水稻分蘖角度检测。
实施例5
目的基因敲除的分子检测
粳稻中花11(ZH11)和实施例3步骤(2)OsLPR2基因敲除植株的幼苗的叶片提取植物基因组DNA，采用本领域技术人员熟知的常规操作方法对潮霉素抗性基因进行PCR鉴定获得转化成功的阳性苗。然后使用诺维赞生物科技股份有限公司的GreenMix进行目的基因敲除PCR检测(SEQ ID NO.15为鉴定敲除突变体前引物BA-JD-F：5'-ATGACTTACATTGTGAAACGGAAAA-3'；SEQ ID NO.16为鉴定敲除突变体前引物BA-JD-R：5'-TAGGTGGGGACACCCTGCA-3')
将PCR产物送至生工生物工程股份有限公司测序，测序结果使用Snapgene进行比对分析，并对突变体株系采用本领域技术人员熟知的常规操作方法分析可能的脱靶位点，选择纯合突变体进行单株收种，获得T2代纯合阳性植株，在此过程中获得1株OsLPR2基因突变且未脱靶的纯合oslpr2突变株系，序列表比对结果如图6所示。选择该oslpr2突变体进行后续的水稻分蘖角度检测。
实施例6
水稻分蘖角度的检测
野生型粳稻中花11(ZH11)、实施例4筛选出的水稻种子(35S:OsLPR2)和实施例5筛选出的水稻种子(oslpr2)分别按农户常规栽培方法栽培到土壤中，水稻生长期间农艺管理按农户日常管理方法实施。在播种后90天测量野生型、OsLPR2敲除突变体和过表达转基因株系的分蘖角度，结果如图7～8和表2所示。其中，分蘖角度的具体测定方法为：使用长臂量角器测量水稻主茎与最外侧分蘖之间的夹角。
表2不同水稻植株水稻分蘖角度检测结果
注：表中不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。
根据表2和图7～8可以看出，与野生型水稻ZH11相比，OsLPR2敲除突变体(oslpr2)水稻分蘖角度显著提高，过表达转基因株系的分蘖角度显著降低。、
根据上述内容可以看出，OsLPR2基因可以调控水稻分蘖角度，过表达OsLPR2基因可以减小水稻分蘖角度，使水稻株型更紧凑，从而有利于水稻密植生产，并提高氮、磷、钾等肥料利用效率，提高农作物的产量。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.OsLPR2基因和/或其编码蛋白在调控水稻分蘖角度中的应用，所述OsLPR2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OsLPR2基因的CDS核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述调控水稻分蘖角度包括：正调控OsLPR2基因和/或其编码蛋白降低水稻分蘖角度。
4.一种降低水稻分蘖角度的方法，其特征在于，将OsLPR2基因导入水稻组织；所述OsLPR2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述将OsLPR2基因导入水稻组织的方式包括：将含有OsLPR2基因的植物表达载体和/或菌株导入水稻组织。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述含有OsLPR2基因的植物表达载体包括过表达植物载体和插入所述过表达植物载体的OsLPR2基因；
所述过表达植物载体包括基础载体和插入所述基础载体的组成型启动子；
所述组成型启动子由两个CaMV35S启动子串联而成；
所述含有OsLPR2基因的菌株包括含有OsLPR2基因的农杆菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基础载体包括pCAMBIA1300。
8.一种提高水稻分蘖角度的方法，其特征在于，将敲除或敲低OsLPR2基因的试剂导入水稻组织；所述OsLPR2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述敲除或敲低OsLPR2基因的试剂包括sgRNA和/或含有所述sgRNA的沉默载体；
所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，用于构建含有所述sgRNA的沉默载体的基础载体包括pl-cas9-hu。
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