CN118064250A - 一种多功能微生物筛选培养系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多功能微生物筛选培养系统，所述培养系统由双面培养皿、可拆卸影印板及原位培养罐组成；模拟自然界中两种及以上的微生物菌株间的相互作用过程，模拟自然生长环境，实现微生物菌株间的共培养及微生物的原位培养，同时易于后期对目标菌株进行分离纯化，筛选未培养微生物，探寻微生物菌株间的互作机制。

Description

一种多功能微生物筛选培养系统

技术领域

本发明涉及微生物分离培养技术领域，具体涉及一种多功能微生物筛选培养系统。

背景技术

现有的微生物分子生态学研究表明海洋中蕴藏着大量微生物资源，这些微生物对地球物质循环、生态平衡和人类健康具有十分重要的意义。但绝大多数微生物尚不能用现有的培养方法和技术进行分离培养，这些微生物被称为未培养微生物。

传统的实验室条件下，通常将微生物限定在营养基质简单、通气、温度、pH等参数恒定的条件下培养，忽略了微生物细胞间代谢产物的交换、信号传递等互作形式对其他物种生长的影响，许多微生物因此丧失了生长的必要条件从而表现为未培养。

共培养、原位培养分离技术应运而生，目前国内外学者已开发出了多种共培养及原位培养技术，多数利用了微孔滤膜、纳米材料及营养基质实现环境与菌株、菌株与菌株间的隔离，在一定程度上提高了对未培养微生物的挖掘和研究。但总体上仍然存在以下几方面的缺陷：（1）技术操作较为复杂，难以重复和普及；（2）易产生污染，难以对待分离的潜在新型菌株进行分离纯化；（3）分离装置难以制作或成本高，且培养环境及设备要求苛刻；（4）对微生物细胞的包埋，会改变细胞周围的气体环境，会影响其生长状态，减少或改变代谢产物的产生。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种多功能微生物筛选培养系统，模拟自然界中两种及以上的微生物菌株间的相互作用过程，模拟自然生长环境，实现微生物菌株间的共培养及微生物的原位培养，同时易于后期对目标菌株进行分离纯化，筛选未培养微生物，探寻微生物菌株间的互作机制。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种多功能微生物筛选培养系统：包括双面培养皿、可拆卸影印板及原位培养罐，其特征在于：所述双面培养皿由皿体、封堵内盖、皿盖A、皿盖B组成；所述皿体由外侧胶条、侧壁、固定模块、支撑网、限位柱、防水条组成组成；所述外侧胶条以可拆卸的方式固定于侧壁外中部位置；所述支撑网通过固定模块固定于皿体内中部位置，并与侧壁密封连接；所述限位柱位于侧壁内上半部分，并标有序号；所述防水条靠近支撑网位于侧壁内下半部分；所述封堵内盖位于皿体下半部分；所述皿盖A位于皿体上方；所述皿盖B与皿盖A相对，通过外侧胶条与皿体相连，所述皿盖外表面有一圈防滑胶圈，所述皿盖内表面有一圈储水条；所述可拆卸影印板放置于皿体上半部分，由手柄、支撑脚和影印板组成；所述影印板边缘有四个限位槽，并标有序号，与限位柱一一对应；所述原位培养罐与双面培养皿配套使用，由密封盖、罐体及置物架组成；所述密封盖由把手、通气阀及卡扣组成；所述罐体内外两侧分别有进水孔和出水孔，且在侧壁内有进、出水管道供水流通过；所述侧壁内进、出水管道的顶端位于罐体口的边缘处，由螺丝密封；

优选地，所述外侧胶条以可拆卸的方式固定于侧壁外中间位置，分为密封型胶条和透气型胶条，透气型胶条有部分通气孔，可使装置内外进行气体交换，同时控制内部培养基水分的散失速度；

优选地，在侧壁上半部分内表面，对应支撑网的横向和纵向网格设有编号，便于对培养基表面菌落进行定位；

优选地，所述防水条为环形，培养基凝固后被包埋在培养基内部，防止液体从边缘渗漏；

优选地，所述封堵内盖为圆台形，内径与皿体内径相同，分为密封、透气及置换三种类型；密封型内表面光滑，透气型内表面由支撑架及细菌滤膜或滤纸等材料做成，密封型和透气型封堵内盖有多种规格，可根据培养基制备厚度、添加的样品量、样品性质，按照侧壁内下半部分序号指示，选择对应规格的封堵内盖；置换型封堵内盖外表面有两个单向止水阀，可外接循环装置，使液体样品由一侧流入另一侧流出，主要在进行原位培养时使用；三种类型的封堵内盖，通过边缘的卡槽与皿体密封连接，卡槽内有防止漏液的密封纹路。

优选地，所述皿体及皿盖均采用可高温灭菌的透明材料，如PC塑料、PP塑料及玻璃等；

优选地，所述培养皿体中部支撑网由可高温灭菌具有一定支撑强度材料制成，如尼龙材料、不锈钢及耐高温塑料等。

优选地，所述固定模块的材料可由橡胶、硅胶、塑料等耐高温材料制作而成，其可发挥固定中部支撑网的作用即可。

优选地，所述皿盖外表面防滑胶圈，可由硅胶、橡胶等耐高温防滑材料制成，镶嵌在皿盖外表面的卡槽中，可拆卸。

优选地，所述皿盖内表面储水条，可由海绵、吸水纸、吸水布料等组成，镶嵌在皿盖内表面的卡槽中，可拆卸。

优选地，所述皿盖B根据侧壁是否有缺口，分为有缺口和无缺口两种类型，有缺口的皿盖配合原位培养罐使用，侧面缺口便于水管链接置换型封堵内盖和原位培养罐内部的进水口及出水口，同时其高度比皿盖A略高，倒扣在双面培养皿上部，起支撑作用，便于多个双面培养皿堆叠放在原位培养罐中；无缺口皿盖B与皿盖A结构一致，在共培养、部分原位培养时使用。

优选地，所述可拆卸影印板的支撑脚有五个，在支撑脚的顶端有磁吸材料，位于中间的为伸缩杆可伸缩，伸缩杆静置状态下其底端与其他四个支撑脚保持水平，在对培养基表面菌落进行影印时，可保证影印板受力均匀；手柄与支撑脚通过螺丝口连接，在支撑脚损坏时便于更换；通过按压按钮可使支撑架与影印板分离，便于更换影印板。

优选地，所述影印板直径与皿体内径相同，分为上下两面，上表面边缘有五个卡槽，卡槽内含有磁吸材料，与支撑脚吸附连接，下表面为较短的纤毛或纱布等容易粘附菌体的材料。

优选地，所述密封盖以卡扣的方式与罐体密封连接，且在密封盖上有通气阀，既可对原位培养罐进行密封，实现厌氧培养，也可使内外连通，进行有氧培养，密封盖上的通气阀关闭进行厌氧培养时，最好用厌氧包去除罐内氧气，不能利用仪器将内部氧气抽出，避免因内外压强变化过大，造成双面培养基的破损，影响后续培养，同时保证软管与各进出口密封连接。

优选地，所述罐体外侧进水孔和出水孔，分别分布在罐体外部的上口边缘和底部，与侧壁的进、出水管道相通，重力作用下可使水样更易流出，以免水流对双面培养基带来较大冲击，造成边缘漏液，影响微生物的生长；每个原位培养罐只有一个进水孔和出水孔，分别与外部水循环装置及蓄水装置相连。

优选地，所述罐体内部的进水孔和出水孔各有多个，由上到下均匀分布在侧壁水流通道的内侧，与水流通道相通，分别连接双面培养皿置换型密封堵头的进水阀及出水阀。

优选地，所述螺丝分别位于进水管道及出水管道的顶端，此种可拆卸的封闭方式，便于对流水通道进行定期清洗，以免造成堵塞。

通过上述技术方案可以得到以下有益效果：

1.通过皿体中间支撑网的作用，培养基凝固后，可将固体培养基固定在皿体的中部，将下部密封型封堵内盖拆除后，培养基的上下两面均可进行微生物的分离、培养及技术操作；

2.通过皿体中间支撑网的孔径，培养基上下两面生长的微生物菌种可实现代谢产物的交换和信息交流，模仿自然界中微生物间的互作现象，探究菌种间的互作机制；

3.通过皿体中间支撑网的支撑，可根据上下两面所培养菌株的生理生化特性或研究目的的不同，制作两面为不同种类或成分的培养基，便于协调不同菌株间的营养差异或实现不同的研究目的；

4.利用有促生作用的菌株分离自然界中未培养微生物时，可将促生菌株与待分离菌株分开两侧，避免污染，便于后期的单独培养和分离纯化；

5.通过培养基两侧同时培养，可用实现两种及以上共生长组合的培养、分离与研究；

6.该装置上下两个皿盖及底部的封堵为可拆卸的结构，使该装置易操作、成本低、可重复性高、易普及；

7.通过上下两面的培养，避免了因包埋造成的促生菌株生理代谢功能的改变，使其促生现象更加明显，且更易于观察；

8.因该装置相较传统培养皿较厚，堆叠放置时更易发生侧滑，造成装置破碎，影响内部样品的准确性，上下皿盖外表面防滑胶圈可增加上下培养皿的摩擦力减少侧滑的发生；

9.在双面固体培养基制备完成后，水分散失速度快于传统培养皿，随着培养时间的延长，内部水分散失，容易引起培养基表面的开裂，通过皿盖内表面储水条及侧壁外侧胶条的作用可以减少培养基水分的散失速度，延长培养基开裂时间；

10.因生长依赖型菌株对促生菌具有依赖作用，该装置中可拆卸影印板可直接将整个培养基的菌落整体转移到新的培养基上，结合网格线的定位作用，使得待分离的生长依赖型菌株的筛选和分离较为容易，大大减少了分离纯化的工作量；

11.微生物菌株营养类型多样，在有氧环境下，皿盖和皿体间利用外侧胶条进行连接，保证通气的同时维持内部的湿度，避免培养基表面的开裂；厌氧环境下，皿盖和皿体以密封型胶条进行连接，便于厌氧培养及厌氧菌的转移使用，两种连接设计增强了该装置的适用范围。

12.因无法确定哪些理化因素或生物因素对特定微生物类群的生长起决定性作用，实验室条件下往往会导致很多类群无法培养，通过该装置可以将部分环境或生物样品，如水样、沉积物、土壤、动植物组织等放在皿体下半部分的培养基表面，并用封堵内盖进行固定或密封，配合原位培养罐，实现原位培养或共培养，倒置培养时，样品中的未知理化因素或生物的代谢产物可以透过培养基渗透到另一侧，既弥补了环境因素的差距，又便于另一侧微生物的分离与培养。

附图说明

图1是本发明中一种多功能微生物筛选培养系统的双面培养皿及可拆卸影印版组合结构示意图；

图2是本发明中双面培养皿皿体部分俯视图；

图3是本发明中可拆卸影印板中影印版的俯视图；

图4是本发明可拆卸影印板中支撑架的结构图；

图5是本发明中缺口型皿盖C的结构示意图；

图6是本发明中原位培养罐结构示意图；

图7是本发明中原位培养罐使用示意图；

图8是本发明中透气型双面培养皿示意图；

图9是本发明中密封型双面培养皿示意图；

图10是本发明中缺口型皿C盖配套双面培养皿示意图；

图11是本发明中封堵内盖结构示意图；

图12是本发明中位置E结构放大示意图；

图13是本发明中位置F结构放大示意图；

图14是本发明中影印板灭菌盒外观图；

其中：防滑胶圈-1；储水条-2；皿盖A-3；按扭-4；手柄-5；支撑脚-6；影印板-7；定位孔-8；磁吸头-9；侧壁-11；限位条-12；密封型外侧胶条-13；透气型外侧胶条-14；支撑网-15；固定模块-16；防渗条-17；标尺-18；透气型封堵内盖-19；密封条-20；密封型封堵内盖-21；置换型封堵内盖-22；单向止水阀-23；皿盖B-24；皿盖C-25；伸缩杆-26；弹簧-27；螺纹口-28；缺口-29；把手-30；通气阀-31；卡扣-32；外侧进水孔-33；外侧出水孔-34；螺丝-35；培养皿支架-36；进水管道-37；出水管道-38；内侧进水孔-39；内侧出水孔-40；软管-41；罐体-42；密封盖-43；换气孔-44；卡槽-45；拆卸舌-46；卡槽-47；卡槽-48；影印板灭菌盒-49。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的说明：

如图1-14所示，一种多功能微生物筛选培养系统，包括双面培养皿、可拆卸影印板及原位培养罐，其中双面培养皿以包埋支撑网的方式制备一体化双面固体培养基，在有氧和厌氧条件下实现微生物菌株的双面培养及原位培养；可拆卸影印板配合双面培养皿使用，可快速筛选出具有互作功能的微生物菌株；原位培养罐主要用于实验室条件下液体样品的原位培养，可用于需氧菌和厌氧菌的分离与纯化。

双面培养皿包括培养皿体及皿盖，皿体为圆柱形的中空结构，皿体的顶部及下部均是敞口，由侧壁11、限位条12、外侧胶条、支撑网15、固定模块16、防渗条17、标尺18及封堵内盖组成；侧壁11通过固定模块16与支撑网15固定连接；所述限位条12、防渗条17、标尺18均位于侧壁内侧，且限位条12与防渗条17、标尺18分布在支撑网15的两侧；

限位条12用来限定影印板7的位置，限位条12旁的序号与影印板7上的定位孔一一对应，使得影印前后两个固体培养基表面生长菌落的位置一致，通过对比影印前后菌落的生长情况，判定培养基两面菌株的互作情况。

外侧胶条分为密封型外侧胶条13和透气型外侧胶条14，均通过侧壁外中部的卡槽45与侧壁11相连；密封型外侧胶条13为H型胶条，通过上下两个卡槽可密封连接皿盖A3、皿盖B24，阻断皿体内外气体交换，在厌氧环境下培养完成后便于转移专性厌氧菌；透气型外侧胶条14上设置有换气孔44，保证双面培养皿内外气体交换的同时，控制内部培养基水分的散失速度，避免培养基表面出现开裂情况。

支撑网15网孔密度会对双面固体培养基表面的开裂产生不同影响，在培养基琼脂浓度为2%时，网孔孔径需大于2mm低于15mm，当培养基琼脂浓度升高时网孔孔径的最低值和最高值会有所提高，但当培养基琼脂浓度降低时，网孔孔径的最低值和最高值会有所降低；配合可拆卸影印板进行菌落影印转移时培养基琼脂浓度应高于1%；配合原位培养罐进行原位培养时，琼脂浓度可提高到4%左右，可使双面固体培养基承压能力上升，提高培养基与侧壁11间的密封程度，防止漏液；为使双面固体培养基在制备过程中内部不留气泡，边缘封闭更紧密，倾倒时培养基温度不宜冷却过低，倾倒前不宜摇晃。

防渗条17为环形，与侧壁11密封连接，固定于支撑网15与密封堵头内表面之间，固体培养基凝固后可将其包埋在内，与固定模块16一同防止液体从固体培养基与侧壁11间的缝隙渗透到培养基的另一面。

标尺18与防渗条17位于同一侧，从支撑网15延伸到皿体下口边缘，用于指示培养基厚度，帮助选择合适厚度的封堵内盖。

封堵内盖包括透气型封堵内盖19、密封型封堵内盖21、置换型封堵内盖22，均通过边缘的卡槽G与侧壁11密封连接，在外侧面均有一个拆卸舌46，便于封堵内盖的安装和拆卸；封堵内盖内径d与皿体下部内径相同，封堵内盖径外径D小于皿盖B24、皿盖C25的内径；封堵内盖的高度H均小于皿盖24、皿盖25的高度h。

当制备培养基时，根据所需培养基的厚度，选择合适规格的密封型封堵内盖21，封闭皿体下部空间，将还未凝固的培养基从皿体上部倒入皿体，凝固后培养基包埋支撑网15及防渗条17制成双面固体培养基，从而实现上下两面同时进行微生物的培养。

当进行原位培养时，双面固体培养基制备完成后，将双面培养皿倒置，打开皿盖B24，放入土壤、植物组织、沉积物等非液体样品，在样品上方用透气型封堵内盖19封堵，保证培养过程中对另一面的微生物菌株进行操作时样品不掉落，便于在培养过程中向样品表面添加水分使样品中的成分渗透到培养基中，同时，允许气体透过避免缺氧对样品造成不良影响。

实施例1：当进行原位培养时，双面固体培养基制备完成后，将双面培养皿倒置，打开皿盖B24，放入液体或含水量较高的样品后，用密封型封堵内盖21封堵，避免对另一面进行微生物操作时样品泄露。

实施例2：当进行原位培养时，双面固体培养基制备完成后，将双面培养皿倒置，打开皿盖B24，放入样品，需要对水样进行定期置换时，用置换型封堵内盖22封堵，用皿盖C25替换皿盖B24，配合原位培养罐最大限度的模拟自然环境分离培养微生物。

皿盖由皿盖A3、皿盖B24和皿盖C25组成，皿盖A3位于皿体上部端口，皿盖B24和皿盖C25位于皿体下部端口，均通过外侧胶条与侧壁11相连；无需配合原位培养罐进行样品置换时，使用皿盖A3和皿盖B24；若需对双面培养皿内部样品进行置换时，使用皿盖A3和皿盖C25，皿盖C25侧壁有缺口29，便于软管41通过，倒置培养时皿盖C25在上，起支撑作用。

可拆卸影印板，包括按扭4、手柄5、支撑脚6、影印板7、定位孔8、磁吸头9及影印板灭菌盒49，使用时将多个影印板7放入影印板灭菌盒49内进行灭菌，灭菌完成后通过磁吸头9与支撑脚6相连，握住手柄5将影印板定位孔8对准限位条12，进行菌落的影印接种，按动手柄5更换影印板7，进行大规模筛选培养。

原位培养罐，包括把手30、通气阀31、卡扣32、外侧进水孔33、外侧出水孔34、螺丝35、培养皿支架36、进水管道37、出水管道38、软管41、罐体42及密封盖43，所述软管41与各接口密封连接；有氧条件下进行原位培养时，双面固体培养基制备完成，扣上皿盖A3，倒置后添加样品，用置换型封堵内盖22封堵双面培养皿的皿体，将软管41连接到置换型封堵内盖22上的单向止水阀23，扣上皿盖C25，堆叠放入原位培养罐培养皿支架36中，装进罐体42，再将软管41与罐体42内的进水孔39及出水孔40连接，用螺丝35密封进水管道37、出水管道38顶端，用密封盖43通过卡扣32密封罐体42，封闭通气阀31，将外侧进水孔33、外侧出水孔34通过软管41分别连接到水泵和储水装置，放于合适的环境中进行微生物的培养；厌氧条件下进行原位培养时，除在将密封盖43封闭罐体42前，向罐体42内加入厌氧包外，其他操作均与有氧条件下进行原位培养类似。

以上所述均为本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的原理前提下，对本发明的各种等价形式的修改均属于本申请所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种多功能微生物筛选培养系统，其特征在于：所述培养系统由双面培养皿、可拆卸影印板及原位培养罐组成；

所述双面培养皿由皿体、封堵内盖、皿盖组成；所述皿体由外侧胶条、侧壁、固定模块、支撑网、限位柱、防水条组成；所述外侧胶条设置在侧壁外中部位置；所述支撑网通过固定模块固定于皿体内中部位置，并与侧壁密封连接；所述限位柱位于侧壁内上半部分；所述防水条靠近支撑网位于侧壁内下半部分；所述封堵内盖位于皿体下半部分；上下皿盖分别位于皿体的上下位置，通过外侧胶条与皿体相连，所述皿盖外表面有一圈防滑胶圈，所述皿盖内表面有一圈储水条；

可拆卸影印板放置于皿体上半部分，由手柄、支撑脚和影印板组成，影印板边缘有定位孔，定位孔与限位条对应设置；

原位培养罐由密封盖、罐体及培养皿支架组成，所述罐体侧边设有进水管道和出水管道，进水管道外侧设有外侧进水孔，进水管道内侧设有进水孔，出水管道的外侧设有外侧出水孔，出水管道内侧设有进水孔，所述双面培养放置在培养皿支架上。

2.根据权利要求1所述的一种多功能微生物筛选培养系统，其特征在于：所述外侧胶条分为密封型胶条和透气型胶条，透气型胶条有部分通气孔，可使装置内外进行气体交换，同时控制内部培养基水分的散失速度。

3.根据权利要求1所述的一种多功能微生物筛选培养系统，其特征在于：封堵内盖为圆台形，内径与皿体内径相同，分为密封型封堵内盖、透气型封堵内盖及置换型封堵内盖三种类型；

密封型封堵内盖的内表面光滑，透气型封堵内盖的内表面由支撑架、细菌滤膜或滤纸材料做成；置换型封堵内盖外表面有两个单向止水阀，可外接循环装置，使液体样品由一侧流入另一侧流出，在进行原位培养时使用；三种类型的封堵内盖，通过边缘的卡槽与皿体密封连接，卡槽内有防止漏液的密封纹路。

4.根据权利要求1所述的一种多功能微生物筛选培养系统，其特征在于：皿体及皿盖均采用可高温灭菌的透明材料，包括但不限于PC塑料、PP塑料及玻璃，固定模块的材料采用橡胶、硅胶、塑料其中一种，皿盖外表面防滑胶圈，由硅胶或橡胶耐高温防滑材料制成。

5.根据权利要求1所述的一种多功能微生物筛选培养系统，其特征在于：皿盖B分为有缺口和无缺口两种类型，有缺口的皿盖配合原位培养罐使用，侧面缺口便于水管链接置换型封堵内盖和原位培养罐内部的进水口及出水口，同时其高度比皿盖A略高，倒扣在双面培养皿上部，起支撑作用，便于多个双面培养皿堆叠放在原位培养罐中；无缺口皿盖B与皿盖A结构一致，在共培养、部分原位培养时使用。

6.根据权利要求1所述的一种多功能微生物筛选培养系统，其特征在于：所述可拆卸影印板的支撑脚有五个，在支撑脚的顶端有磁吸材料，位于中间的为伸缩杆可伸缩，伸缩杆静置状态下其底端与其他四个支撑脚保持水平，在对培养基表面菌落进行影印时，可保证影印板受力均匀；手柄与支撑脚通过螺丝口连接，在支撑脚损坏时便于更换；通过按压按钮可使支撑架与影印板分离，便于更换影印板。

7.根据权利要求1或6所述的一种多功能微生物筛选培养系统，其特征在于：所述影印板直径与皿体内径相同，分为上下两面，上表面边缘有五个卡槽，卡槽内含有磁吸材料，与支撑脚吸附连接，下表面为粘附菌体的材料。

8.根据权利要求1所述的一种多功能微生物筛选培养系统，其特征在于：所述密封盖以卡扣的方式与罐体密封连接，且在密封盖上有通气阀，既可对原位培养罐进行密封，实现厌氧培养，也可使内外连通，进行有氧培养。

9.根据权利要求1所述的一种多功能微生物筛选培养系统，其特征在于：所述罐体外侧进水孔和出水孔，分别分布在罐体外部的上口边缘和底部，与侧壁的进、出水管道相通；每个原位培养罐只有一个进水孔和出水孔，分别与外部水循环装置及蓄水装置相连，罐体内部的进水孔和出水孔数量至少两个，由上到下均匀分布在侧壁水流通道的内侧，与水流通道相通，分别连接双面培养皿置换型密封堵头的进水阀及出水阀，螺丝分别位于进水管道及出水管道的顶端。

10.根据权利要求1所述的一种多功能微生物筛选培养系统，其特征在于：在侧壁上半部分内表面，对应支撑网的横向和纵向网格设有编号，便于对培养基表面菌落进行定位。