CN118047869A - 抗pd-l1抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及程序性死亡配体1(PD‑L1)结合分子，尤其是PD‑L1的单域抗体，还涉及编码所述PD‑L1结合分子的核酸，用于表达PD‑L1结合分子的表达载体和宿主细胞，制备所述PD‑L1结合分子的方法，以及所述PD‑L1结合分子的用途。

Description

抗PD-L1抗体及其用途

技术领域

本申请涉及抗体。更具体地，本申请涉及与PD-L1特异性结合的单域抗体、其制备方法及其用途。

背景技术

临床前和临床结果中越来越多的证据表明靶向免疫检查点成为治疗癌症患者的最有前途的方法。

程序性死亡蛋白1(PD-1)是1992年发现的表达在T细胞表面的一个蛋白受体，参与细胞的凋亡过程。PD-l属于CD28家族，与细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxic TIymphocyte antigen 4，CTLA-4)具有23％的氨基酸同源性，但其表达却与CTLA不同，主要表达在活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞上(Agata等，Okazaki等(2002)Curr.Opin.Immunol.14:391779-82；Bennett等(2003)J Immunol 170:711-8)，并且在调节免疫系统中的刺激和抑制信号方面具有关键作用(Okazaki，Taku等(2007)InternationalImmunology 19:813-824)。PD-1通过筛选凋亡细胞中的差异表达而被发现(Ishida等(1992)EMBO J 11:3887-95)。

PD-1有两种已知的配体，即PD-L1(也称为B7-H1或CD274)和PD-L2(也称为B7-DC或CD273)，它们是B7家族中表达在细胞表面上的成员(Freeman等(2000)J Exp Med 192:1027-34；Latchman等(2001)Nat Immunol 2:261-8；Carter等(2002)Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1主要表达于T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞(Dendritic Cell，DC)上，在活化后细胞上的表达能够进行上调。而PD-L2的表达相对较局限，主要表达在抗原呈递细胞上，如活化的巨噬细胞和树突状细胞。

在活化的T细胞上表达的PD-1和在肿瘤细胞上表达的PD-L1的相互作用负调节免疫应答并抑制抗肿瘤免疫。PD-L1在多种人癌症中大量存在(Dong等(2002)Nat.Med 8:787-9)。PD-L1在肿瘤上的表达与食管癌、胰腺癌和其他类型癌症中存活率降低相关，突出显示该途径可作为肿瘤免疫治疗的有希望的靶标。

单域抗体(Single domain antibody，sdAb)，是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体，因其分子量小，也被称为纳米抗体(Nanobody)。20世纪90年代，单域抗体最早在骆驼科动物中被发现。第一个单域抗体是由骆驼科动物中发现的重链抗体改造而来的(Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R(1993)Naturally occurring antibodies devoid of lightchains.Nature 363(6428):446-448.)单域抗体虽然结构简单，但仍像整个抗体一样，它能够选择性结合特定的抗原，可以达到与传统抗体相当甚至更高的与特异抗原结合的亲和力。

相比于传统抗体，单域抗体具有分子量小、稳定性强、易于重组表达等优点。例如，它们通常表现出高溶解度和稳定性，并且还可以容易地在酵母、植物和哺乳动物细胞中产生(Harmsen MM，De Haard HJ(2007)Properties，production，and applications ofcamelid single-domain antibody fragments.ApplMicrobiol Biotechnol 77(1):13–22.)。此外，它们具有良好的热稳定性和良好的组织渗透性。而且它们还在生产中具有成本效益。单域抗体的优势使其适用于各种生物技术和治疗应用。例如，它们可用于治疗疾病，包括但不限于癌症、感染性疾病、炎症性疾病和神经退行性疾病。

虽然已开发出针对PD-L1的抗体，但作为治疗剂仍有改善抗PD-L1抗体的需要。此外，目前针对PD-L1的单域抗体很少，因此开发靶向PD-L1的单域抗体在相关疾病的治疗方面将具有重要的意义。

发明内容

本发明通过提供特异性结合PD-L1的抗体，优选单域抗体满足了上述需求。

在一个方面，本发明提供了一种程序性死亡配体1(PD-L1)结合分子，所述PD-L1结合分子包含重链可变区(VH)，所述VH包含:

a)HCDR1：包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

b)HCDR2：包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

c)HCDR3：包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述PD-L1结合分子包含重链可变区(VH)，所述VH包含:

1)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

2)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

3)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

4)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

5)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

6)SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

7)SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

8)SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

9)SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

10)SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

11)SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述PD-L1结合分子是重链单域抗体(VHH)，所述VHH包含:

a)CDR1：包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

b)CDR2：包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

c)CDR3：包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述PD-L1结合分子是重链单域抗体(VHH)，所述VHH包含:

1)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

2)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

3)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

4)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

5)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

6)SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

7)SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

8)SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

9)SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

10)SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

11)SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述的PD-L1结合分子进一步包含一个或多个氨基酸残基突变但仍保持与PD-L1特异性结合。

在一些实施例中，所述突变中的至少一个在一个或多个VH序列中但不在任一个CDR序列中。

在一些实施例中，所述PD-L1结合分子是PD-1拮抗剂，优选为抗PD-L1抗体。

在一些实施例中，所述PD-L1结合分子是嵌合抗体。

在一些实施例中，所述PD-L1结合分子是人源化抗体。

在一些实施例中，所述PD-L1结合分子是单域抗体，优选为重链单域抗体(VHH)。

在一些具体实施例中，所述VHH来源于骆驼科动物，所述骆驼科动物包含羊驼或美洲驼。

在一些实施例中，所述VH与IgG的Fc结构域融合。

在一些实施例中，所述VH与人IgG的Fc结构域融合。

在一些具体实施例中，所述PD-L1结合分子是来自骆驼科动物的VHH与人IgG的Fc结构域的嵌合抗体。

在一些实施例中，所述PD-L1结合分子是来自骆驼科动物的VHH与人IgG1或IgG4的Fc结构域的嵌合抗体。

在一些实施例中，所述Fc结构域为SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:15所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述PD-L1结合分子包含：

1)SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:16所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

2)SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

3)SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:18所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

4)SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:19所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

5)SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:20所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

6)SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:21所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

7)SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:22所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

8)SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:23所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

9)SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

10)SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

11)SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:26所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供了一种抗体-药物缀合物，其包含本文所述的PD-L1结合分子，其与一个或多个缀合物部分连接。

在一个方面，本发明提供了一种核酸，其编码本文所述的抗PD-L1结合分子。

在一些实施例中，所述的核酸，其包含：

1)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

2)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

3)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

4)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

5)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

6)SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

7)SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

8)SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

9)SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

10)SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

11)SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；或

优选地，所述核酸进一步包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列。

在一个方面，本发明提供了一种表达载体，其包含本文所述的核酸。

在一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本文所述的核酸或本文所述的表达载体。

在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本文所述的PD-L1结合分子，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的核酸，或本文所述的表达载体中的一种或多种和药学上可接受的载体。

在一些实施例中，本文所述的PD-L1结合分子，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的药物组合物在制备用于治疗或预防受试者中与PD-L1相关的疾病；或用于抑制或阻断受试者中PD-L1与PD-1结合；或用于治疗或预防受试者中会受益于免疫应答上调的疾病的药物中的用途。

在一些实施例中，所述药物是经口、鼻、静脉内、皮下、舌下或肌肉内给药。

在一些实施例中，所述疾病是增殖性病症或感染，所述增殖性疾病包含癌症。

在一些实施例中，所述癌症选自：乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、涎腺癌、胃部癌症、神经胶质瘤、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、头颈癌、胃癌和胰腺癌。

在一些实施例中，所述感染是慢性感染。

在一个方面，本发明提供了一种治疗或预防受试者中与PD-L1相关的疾病；或抑制或阻断受试者中PD-L1与PD-1结合；或治疗或预防受试者中会受益于免疫应答上调的疾病的方法，其包含向需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的PD-L1结合分子，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的药物组合物。

在一些实施例中，所述药物是经口、鼻、静脉内、皮下、舌下或肌肉内给药。

在一些实施例中，所述疾病是增殖性病症或感染，所述增殖性疾病包含癌症。

在一些实施例中，所述癌症选自：乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、涎腺癌、胃部癌症、神经胶质瘤、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、头颈癌、胃癌和胰腺癌。

在一些实施例中，所述感染是慢性感染。

在一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本文所述的PD-L1结合分子，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的药物组合物，其用于治疗或诊断与PD-L1相关的疾病。

在一个方面，本发明提供了一种包含药物组合物、处方信息和容器的药盒，其中的药物组合物包含本文所述的PD-L1结合分子，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的核酸，或本文所述的表达载体中的一种或多种和药学上可接受的载体。

附图说明

图1：单域抗体粗提物对人PDL1的结合检测，可见有4个克隆(1E2、2D10、6A7、6F9)对PDL1具有明确的较强的结合；

图2：单域抗体粗提物对人PD1-Fc和PDL1-Fc-biotin的阻断检测，可见克隆2D10对人PD1-Fc和PDL1-Fc-biotin具有明确的阻断效应；

图3：IgG抗体对人PD1-Fc和PDL1-Fc-biotin的阻断效力检测，可见HY00901-1对人PD1-Fc和PDL1-Fc-biotin具有明确的剂量相关的阻断效力，而且阻断EC₅₀值优于对照抗体；

图4：人源化后的IgG抗体对人PD1-Fc和PDL1-Fc-biotin的阻断效力检测，可见各个人源化后的分子均具有明确的阻断效应，均优于对照抗体；

图5：人源化后的IgG抗体对人PD1-biotin和huPDL1-CHO-K1的阻断效力检测，分两次进行了检测，分别检测了HY00901-hz6至HY00901-hz9(图5A)和HY00901-hz10(图5B)，可见各个分子均具有明确的阻断效应，均优于对照抗体；

图6：HY00901-1对猴PD1-Fc和猴PDL1-Fc-biotin的阻断效力检测，可见同对照抗体一样，HY00901-1对猴PD1-Fc和猴PDL1-Fc-biotin具有明确的阻断效应；

图7：抗体对PD1-PDL1相互作用下的胞内NF-AT信号的激活效应测定，可见 HY00901-1-hz9分子对PDL1-PD1相互作用下的胞内NF-AT信号通路具有明确的解除抑制/激活效应，其激活的EC₅₀值为0.141μg/ml，略优于对照抗体Tecentriq(0.199μg/ml)。

具体实施方式

虽然本发明可以以许多不同的形式来实施，但在此公开的是验证本发明原理的其具体的举例说明性实施方式。应该强调的是，本发明不限于所举例说明的具体实施方式。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。

除非在此另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数指示物。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和端点之间的所有值。

通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的术语以及其技术是本领域众所周知和常用的术语。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并如在本说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述进行。参见例如Sambrook J.&Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2000)；Abbas等，Cellular and MolecularImmunology，第6版，W.B.Saunders Company(2010)；Harlow and Lane Using Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1998)；Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，John&Sons，Inc.(2002)；和Coligan等，Short Protocols in Protein Science，Wiley，John&Sons，Inc.(2003)。与本文描述的分析化学、合成有机化学和药物和药物化学有关的术语以及实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的术语。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所描述的主题。

定义

为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。

如本文所用，术语“PD-L1”是指程序性细胞死亡配体1(PD-L1，参见例如Freeman等，(2000)J.Exp.Med.192:1027)。PD-L1的替代名称或同义词包括PDCD1L1、PDL1、B7H1、CD274和B7-H等。人PD-L1的代表性氨基酸序列在NCBI登录号NP_054862.1中公开，编码人PD-L1的代表性核酸序列显示在NCBI登录号：NM_014143.3下。PD-L1在胎盘、脾脏、淋巴结、胸腺、心脏、胎儿肝脏中表达，并且也在许多肿瘤或癌细胞中发现。PD-L1结合其受体PD-1或B7-1(其在活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞上表达)。PD-L1和其受体的结合诱导信号转导以抑制TCR介导的细胞因子产生和T细胞增殖的激活。因此，PD-L1在特定事件(例如妊娠、自身免疫疾病、组织同种异体移植物)期间抑制免疫系统中起主要作用，并且被认为允许肿瘤或癌细胞绕过免疫检查点并逃避免疫应答。

如本文所用，术语“抗体”或“Ab”通常是指表现出所需生物学或结合活性的任何形式的抗体。它包括但不限于人源化抗体、完全人抗体、嵌合抗体和单域抗体。抗体可以包含重链和轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1，CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区(FR))间隔开的高变区(称为互补决定区(CDR))。每个VH和VL由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N端到C端的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。氨基酸在各种区域或结构域中的分布遵循Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987and1991))或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等，(1989)Nature 342:878-883中的定义。抗体可以具有不同的抗体同种型，例如IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文所用，术语“抗PD-L1抗体”是指能够特异性结合PD-L1(例如人，猴或猴PD-L1)的抗体。有利的是，抗PD-L1抗体以足以提供诊断和/或治疗用途的亲和力与PD-L1特异性结合。

如本文所用，术语“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合PD-1蛋白的分离的抗体基本上不含特异性结合除PD-1蛋白以外的抗原)。但是，特异性结合人PD-1蛋白的分离的抗体可能与其他抗原如来自其他物种的PD-1蛋白具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。

如本文所用的术语“单域抗体”是指一类在骆驼科动物体内发现的天然缺失抗体轻链和重链恒定区的重链抗体。

如本文所用的术语“嵌合抗体”是指其中可变区序列来自一个物种并且恒定区序列来自另一物种，例如其中可变区序列源自小鼠抗体和恒定区序列来源于人抗体的抗体。

如本文所用的术语“人源化抗体”是指其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。

如本文所用的术语“特异性结合”或“特异性结合至”是指两个分子之间例如抗体和抗原之间的非随机结合反应。

如本文所用，术语“载体”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许插入其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时，该载体称为表达载体。该载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)或P1衍生人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒，乳多空病毒(如SV40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列，转录起始序列，增强子序列，选择元件和报道基因。另外，载体可以包含复制起点。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以导入载体的细胞，包括但不限于原核细胞如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，真菌细胞如酵母细胞或曲霉属(Aspergillus)，昆虫细胞如S2果蝇细胞或Sf9，以及动物细胞如成纤维细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、CHO细胞、HEK293细胞或人细胞。CHO细胞是指中国仓鼠卵巢细胞，其包括多种可商购的亚克隆，例如CHO-K1、CHO-S、CHO-DXB11、CHO-DG44等。其中CHO-K1通常被用作表达平台。CHO-K1可从ATCC、ECACC、DSMZ以及多家其他公司商购获得。

如本文所用，术语“T细胞”包括CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、T辅助1型T细胞、T辅助2型T细胞、T辅助17型T细胞和抑制性T细胞。

如本文所用，术语“同一性”、“相似性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“同一性百分比”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。对于这些计算，比对中的空位(如果有的话)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来寻址。可以用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational MolecularBiology，(Lesk，A.M.编)，1988，New York:Oxford University Press；BiocomputingInformaticsand Genome Projects，(Smith，D.W.编)，1993，New York:Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编)，1994，New Jersey:Humana Press；von Heinje，G.，1987，Sequence Analysis inMolecular Biology，New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer，(Gribskov，M.和Devereux，J.编)，1991，New York:M.Stockton Press；和Carillo等，1988，SIAMJ.Applied Math.48:1073中描述的那些。

如本文所用，术语“免疫原性”是指刺激生物体中特异性抗体或致敏淋巴细胞形成的能力。它不仅指抗原刺激特定免疫细胞活化、增殖和分化以最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的性质，还指抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答可以在用抗原刺激生物体后在生物体的免疫系统中形成。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原是否能够成功诱导宿主中产生免疫应答取决于三个因素：抗原的性质，宿主的反应性和免疫手段。

如本文所用，术语“转染”是指将核酸引入真核细胞特别是哺乳动物细胞的过程。用于转染的方案和技术包括但不限于脂质转染和化学和物理方法如电穿孔。许多转染技术在本领域是公知的并且在本文中公开。参见例如Graham等，1973，Virology 52:456；Sambrook等，2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，同上；Davis等，1986，BasicMethods in Molecular Biology，Elsevier；Chu等，1981，Gene 13:197。

如本文所用，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指其中与某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合的分泌的Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且对于这种杀伤是绝对需要的。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)第464页的表3中。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的测定。可用于此类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选或另外地，感兴趣分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在如Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)公开的动物模型中评估。

术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活由补体系统的第一组分(C1q)与结合其同源抗原的抗体(适当的亚类)结合而启动。为了评估补体活化，可以执行CDC测定，例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述的。

如本文所用，术语“EC₅₀”，也被称为“半数最大有效浓度”，是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50％的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。在本申请的上下文中，EC₅₀的单位为“nM”。

如本文所用，术语“与PD-L1关联的病症”或“与PD-L1相关的病症”是指由PD-L1(如人PD-L1)的增加或减少的表达或活性引起、加重或以其它方式与其相关的任何病症。

如本文所用，术语“癌症”是指引发医学疾病的任何肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移介导的实体瘤和非实体瘤(如白血病)。

如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物，优选人。

如本文所用，“抑制结合”或“阻断结合”的能力是指抗体抑制两个分子(例如人PD-L1和抗PD-L1抗体)的结合至任何可检测的程度的能力。在一些实施方式中，阻断两个分子之间结合的抗体将两个分子之间的结合相互作用抑制至少50％。在一些实施方式中，该抑制可以大于60％，大于70％，大于80％或大于90％。

本文在治疗疾病的情况中使用的术语“治疗”一般涉及人或动物的治疗和疗法，其中实现了一些期望的治疗效果，例如，抑制疾病进展，包括进展速度下降，进展速度停滞，疾病消退，疾病改善和疾病治愈。还包括了作为预防措施(即预防、防止)的治疗。对于癌症，“治疗”可能是指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移或其某种组合。对于肿瘤，“治疗”包括去除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延迟肿瘤的发展或其某种组合。

如本文所用，术语“治疗有效量”涉及活性化合物或包含活性化合物的材料、组合物或剂型的量，其在按照所需的治疗方案施用时有效用于产生与合理的益处/风险比相称的某些所需的治疗效果。具体而言，“治疗有效量”意指抗体有效治疗人PD-L1相关疾病或病症的量或浓度。

如本文所用，术语“药学上可接受”是指媒介物、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。

如本文所用，术语“药学上可接受的载剂和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载剂和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR，第19版，Pennsylvania:Mack Publishing Company，1995)，并且包括但不限于pH调节剂，表面活性剂，佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文所用，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，其在与抗原一起递送至生物体或被提前递送至生物体时可以增强生物体中的对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。存在多种佐剂，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)，短小棒状杆菌，脂多糖，细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂更常用于临床试验。

PD-L1结合分子

在一些方面，本发明包含PD-L1结合分子。

一般来说，PD-L1结合分子可以包括任何特异性结合PD-L1的分子。在一些情况下，“PD-L1结合分子”可以包括“PD-L1拮抗剂”。“PD-L1拮抗剂”是指阻断PD-L1与免疫细胞(T细胞、B细胞或NKT细胞)上表达的PD-1结合的任何化合物或生物分子。PD-L1结合分子或PD-L1拮抗剂可以是多肽或蛋白质，例如抗体，更具体地说是抗PD-L1抗体。

抗体包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体或单域抗体。在具体的实施方式中，PD-L1结合分子是单域抗体，其通常是指由单个单体可变抗体结构域组成的抗体。像整个抗体一样，单域抗体能够选择性结合特定抗原。

更具体而言，PD-L1结合分子是单域抗体，优选为重链单域抗体，其可与术语“VHH”、“VHH抗体”、“VHH结构域”、“VHH抗体片段”、“VHH”或“纳米抗体”等互换使用。来自骆驼科抗体的VHH分子是已知的最小完整抗原结合结构域之一(约15kDa，或是常规IgG的1/10)，因此非常适合递送至致密组织和进入大分子之间的有限空间。

本文公开的本发明的单域抗体可由本领域技术人员根据本领域已知的方法或任何未来的方法制备。例如，可以使用本领域已知的方法获得VHH，例如通过免疫骆驼并从中获得杂交瘤，或者通过使用本领域已知的分子生物学技术克隆本发明的VHH的文库，然后通过使用噬菌体展示进行选择。

例如，可通过用所需抗原免疫美洲驼或羊驼并随后分离编码重链抗体的mRNA来获得单域抗体。通过逆转录和聚合酶链反应，产生含有数百万克隆的单域抗体的基因文库。筛选技术如噬菌体展示和核糖体展示有助于鉴定结合抗原的克隆。一种技术是噬菌体展示，其中在噬菌体上合成(优选人)抗体文库，用感兴趣的抗原或其抗体结合部分筛选文库，并分离结合抗原的噬菌体，从其中可以获得免疫反应性片段。用于制备和筛选这种文库的方法是本领域众所周知的，并且用于产生噬菌体展示文库的试剂盒可商购获得(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；以及Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。还有其他方法和试剂可用于产生和筛选抗体展示文库(参见例如Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978-7982(1991))。

当最有效的克隆被鉴定时，例如通过亲和力成熟或人源化优化其DNA序列。人源化可以防止人体对抗抗体的免疫反应。

因此，可通过以下方式获得单域抗体：(1)分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)通过天然存在的VHH结构域的“人源化”(如下所述)或通过表达编码这种人源化VHH结构域的核酸；(4)通过来自任何动物物种，特别是哺乳动物物种，例如来自人的天然存在VH结构域的“骆驼化”，或通过表达编码这种骆驼化VH结构域的核酸；(5)通过如Ward等(上文)描述的“结构域抗体”或“Dab”的“骆驼化”，或通过表达编码这种骆驼化VH结构域的核酸；(6)使用合成或半合成技术制备蛋白质、多肽或其他氨基酸序列；(7)通过使用用于核酸合成的技术制备编码VHH的核酸，然后表达由此获得的核酸；和/或(8)通过前述的任何组合。基于本文的公开内容，用于执行前述内容的合适方法和技术对于本领域技术人员将是清楚的，并且例如包括下文更详细描述的方法和技术。

单域抗体通常通过从免疫动物获得的血液、淋巴结或脾cDNA PCR克隆可变结构域库至噬菌体展示载体中而产生。通常通过在固定化抗原(例如包被在试管塑料表面的抗原，固定在链霉抗生物素蛋白珠上的生物素化抗原或细胞表面上表达的膜蛋白)上淘选相文库来选择抗原特异性单域抗体。通过体外模拟该策略可以提高adAb的亲和力，例如通过CDR区的定点诱变和在增加的严格性条件(更高温度，高或低盐浓度，高或低pH和低抗原浓度)下对固定化抗原进行进一步的淘选(Wesolowski等.，Single domain antibodies:promisingexperimental and therapeutic tools in infection and immunity.Med MicrobiolImmunol(2009)198:157-174)。

用于制备特异性结合抗原或表位的VHH的方法描述于参考文献中，参见例如：R.van der Linden等.，Journal of Immunological Methods，240(2000)185-195；Li等.，JBiol Chem.，287(2012)13713-13721；Deffar等.，African Journal of BiotechnologyVol.8(12)，pp.2645，17June，2009和WO94/04678。

在一些实施方式中，PD-L1结合分子中的VHH与抗体的Fc结构域(例如IgG(例如IgG4或IgG1)的Fc结构域)融合。在具体实施方式中，Fc-结构域是人IgG4的Fc-结构域。通过将VHH融合至Fc结构域，可以更有效地募集效应功能。而且，VHH与Fc结构域的融合可以帮助PD-L1结合分子形成二聚体，并且还可以帮助延长PD-L1结合分子的体内半衰期。

在一些实施方式中，本文提供的抗体进一步包括一个或多个缀合物部分。缀合物部分是可与抗体连接的部分。例如可检测标记(例如发光标记、荧光标记、酶-底物标记)、调节剂(例如聚合物，如延长半衰期的PEG)或其它治疗剂。经考虑，多种缀合物部分可与本文提供的抗体或其抗原结合片段连接(参见例如“缀合物疫苗(Conjugate Vaccines)”，对微生物学与免疫学的贡献(Contributions to Microbiology and Immunology)，J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(编)，纽约(New York)的卡格出版社(Carger Press)，(1989))。这些缀合物部分可通过共价结合、亲和力结合、嵌入、配位结合、复合、结合(association)、掺合(blending)或添加等方法与抗体或其抗原结合片段连接。

在一些实施方式中，本发明的抗体阻断人PD-L1与PD-1的结合，从而提供生物学活性，包括例如从活化的T细胞(例如CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞)诱导细胞因子产生，诱导活化的T细胞(例如CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞)的增殖，以及逆转T reg的抑制功能。示例性的细胞因子包括IL-2和IFNγ。术语“IL-2”是指白细胞介素2，其是免疫系统中调节白血球(例如白细胞)活性的一类细胞因子信号传导分子。术语“干扰素γ(IFNγ)”是由自然杀伤细胞(NK)、NK T细胞、CD4⁺和CD8⁺T细胞产生的细胞因子，其是巨噬细胞的关键激活剂和主要组织相容性复合体(MHC)分子表达的诱导剂。细胞因子产生可以使用本领域已知的方法确定，例如通过ELISA确定。方法也可用于检测T细胞的增殖，包括[³H]胸苷掺入测定。

包含CDR的抗PD-L1抗体

在一些实施方式中，本发明的程序性死亡配体1(PD-L1)结合分子，其中所述PD-L1结合分子包含重链可变区(VH)，所述VH包含：

a)HCDR1：包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

b)HCDR2：包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

c)HCDR3：包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在一些具体的实施例中，所述PD-L1结合分子是重链单域抗体(VHH)，所述VHH包含:

a)CDR1：包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

b)CDR2：包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

c)CDR3：包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

除非另有说明，否则将氨基酸分配给每个CDR可以根据以下提供的编号方案之一：Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版)，USDept.of Health and Human Services，PHS，NIH，NIH Publication no.91-3242；Chothia等，1987，PMID:3681981；Chothia等，1989，PMID:2687698；MacCallum等，1996，PMID:8876650；或Dubel编(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies，第3版，Wily-VCHVerlag GmbH and Co.。

抗体序列中的可变区和CDR可以根据本领域已经开发的一般规则(如上所述，例如Kabat编号系统)或通过将序列与已知可变区的数据库比对来鉴定。在Kontermann和Dubel编，Antibody Engineering，Springer，New York，NY，2001和Dinarello等，CurrentProtocols in Immunology，John Wiley and Sons Inc.，Hoboken，NJ，2000中描述了鉴定这些区域的方法。抗体序列的示例性数据库描述于并可获自www.bioinf.org.uk/abs上的“Abysis”网站(由英国伦敦的伦敦大学学院生物化学和分子生物学系(Department ofBiochemistry&Molecular Biology University College London，London，England)的A.C.Martin维护)和VBASE2网站www.vbase2.org，如Retter等，Nucl.Acids Res.，33(Database issue):D671-D674(2005)中所述。优选使用Abysis数据库分析序列，其整合了来自Kabat、IMGT和蛋白质数据库(PDB)的序列数据与来自PDB的结构数据，参见Dr.AndrewC.R.Martin所著的书中的Protein Sequence and Structure Analysis of AntibodyVariable Domains.In:Antibody Engineering Lab Manual(Ed.:Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg，ISBN-13:978-3540413547，也可在网站bioinforg.uk/abs上获得)。Abysis数据库网站还包括已经开发用于鉴别可以根据本文的教导使用的CDR的一般规则。除非另有说明，否则本文所述的所有CDR均根据Kabat的Abysis数据库网站获得。

由VHH序列定义的抗PD-L1抗体

在一些具体的实施例中，所述PD-L1结合分子是重链单域抗体(VHH)，所述VHH包含:

1)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

2)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

3)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

4)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

5)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

6)SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

7)SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

8)SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

9)SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

10)SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

11)SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.，4:11-17(1988))确定，该算法已被并入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以通过Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))确定，其已并入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。

抗体变体

在某些实施方式中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除，和/或插入和/或替代。可以进行删除，插入，和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。

a)替代，插入，和删除变体

在某些实施方式中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR(Hyper-Variable Region)和FR。保守替代在表A中在"优选替代"的标题下显示。更实质的变化在表A中在"示例性替代"的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。

表A

初始残基	示例性替代	优选替代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Asp；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu；Asn	Glu
			Cys(C)	Ser；Ala	Ser
Gln(Q)	Asn；Glu	Asn
			Glu(E)	Asp；Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；D-Nle	Leu
			Leu(L)	D-Nle；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Val；Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；D-Nle	Leu

依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，IIe；

(2)中性，亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gin；

(3)酸性的：Asp，Glu；

(4)碱性的：His，Lys，Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；

(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。

非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。

一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力，降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。

可以对HVR做出变化(例如，替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR"热点"，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或接触抗原的残基做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等，于Methods in Molecular Biology 178:l_37(O'Brien等编，Human Press，Totowa，NJ，(2001))。在亲和力成熟的一些实施方式中，通过多种方法(例如，易错PCR，链改组，或寡核苷酸指导的诱变)将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方式中，可以在一个或多个HVR内发生替代，插入，或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。例如，此类变化可以在HVR中的抗原接触残基以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方式中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1，2或3处氨基酸替代。

在一些进一步的实施方式中，抗PD-L1抗体可以包含重链和/或轻链的可变区中的氨基酸的保守取代或修饰。本领域理解的是，可以进行某些不消除抗原结合的保守序列修饰(参见例如Brummell等(1993)Biochem 32:1180-8；de Wildt等(1997)Prot.Eng.10:835-41；Komissarov等(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870；Hall等(1992)J.Immunol.149:1605-12；Kelley和O’Connell(1993)Biochem.32:6862-35；Adib-Conquy等(1998)Int.Immunol.10:341-6和Beers等(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43)。

本文使用的术语“保守取代”是指氨基酸取代，其不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。用于鉴定氨基酸保守取代的方法在本领域中是公知的(参见例如Brummell等，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等，ProteinEng.12(10):879-884(1999)；和Burks等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

在一些具体的实施方式中，所述VHH由1)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成；2)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成；3)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成；4)SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列组成；5)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成；6)SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成；7)SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列组成；8)SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成；9)SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列组成；10)SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列组成；11)SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列组成。

b)糖基化变体

在某些实施方式中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。

在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的，双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright等，TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖，和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构"主干"中的GIcNAc的岩藻糖。在一些实施方式中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。

c)Fc区变体

在某些实施方式中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如，人IgGl，IgG2，IgG3或IgG4Fc区)。

在某些实施方式中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Tmmunol〃9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(见例如Hellstrom,I等，Proc.Nat'I Acad.Sci USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等，Proc.Nat'I Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5，821，337(见Bruggemann,Μ等，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACT ITM非放射性细胞毒性测定法(Cell Technology，Inc.Mountain View，CA；和CytoTox96非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison，WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等，Proc Nat'I Acad Sci USA 95:652-656(1998)的。也可以实施Clq结合测定法以确认抗体不能结合Clq，并且因此缺乏CDC活性。见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的Clq和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(见例如Gazzano-Santoro等，J〃Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,ΜS.等，Blood 101:1045-1052(2003)；及Cragg,Μ〃S〃和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见例如Petkova，S.B.等，Int'I.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。

在一些具体的实施方式中，所述Fc结构域为SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:15所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体

在某些实施方式中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，"thioMAb"，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方式中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。

e)抗体衍生物

在某些实施方式中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊环，聚-1，3，6-三口恶烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，和右旋糖苷或聚(η-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能，抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。

在另一些具体的实施方式中，所述抗PD-L1抗体是嵌合抗体，其包含融合到人IgG1或IgG4的Fc结构域的一个VHH。在一个实施方式中，所述抗PD-L1抗体是由一个VHH和人IgG4的Fc结构域组成的嵌合抗体，并且该抗体在本发明的情形中命名为“HY00901-1”。

编码本发明抗体的核酸分子

在一些方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的VHH的核酸序列。

本发明的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，编码这种抗体的核酸可以从基因文库中回收。

本发明的示例性核酸分子是：1)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；2)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；3)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；4)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；5)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；6)SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；7)SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；8)SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；9)SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；10)SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；11)SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；或优选地，所述核酸进一步包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列。在一些实施方式中，所述核酸与上述氨基酸序列的核苷酸编码序列具有至少80％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性。在一些实施方式中，同一性百分比源自遗传密码的简并性，并且编码的蛋白质序列保持不变。

载体

可以使用本领域已知的重组技术将编码抗PD-L1抗体的核酸分子插入载体以进一步克隆(扩增DNA)或用于表达。在另一个实施方式中，抗体可以通过本领域已知的同源重组产生。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规方法分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体重链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。许多载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列，复制起点，一个或多个标记基因，增强子元件，启动子(例如SV40，CMV，EF-1α)，和转录终止序列。选择标记基因有助于选择导入了载体的宿主细胞(参见例如美国专利号4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常选择标记基因赋予载体已经导入其中的宿主细胞对药物(例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性。选择标记基因可以包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

在一些实施方式中，载体系统包括哺乳动物、细菌、酵母系统等，并包括质粒，例如，但不限于，pALTER，pBAD，pcDNA，pCal，pL，pET，pGEMEX，pGEX，pCI，pCMV，pEGFP，pEGFT，pSV2，pFUSE，pVITRO，pVIVO，pMAL，pMONO，pSELECT，pUNO，pDUO，Psg5L，pBABE，pWPXL，pBI，p15TV-L，pPro18，pTD，pRS420，pLexA，pACT2.2等等，以及其他实验室和商业可用的载体。合适的载体可以包括质粒或病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。在本发明的一个实施方式中，载体可以是pET，例如含有六组氨酸标签和c-Myc-标签基因的pETbac。

宿主细胞

包含编码PD-L1结合分子的核酸序列的载体可以被引入宿主细胞用于克隆或基因表达。用于在本文的载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞是原核生物、酵母或高等真核生物细胞。用于该目的的合适原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科如埃希氏菌属(例如大肠杆菌)，肠杆菌属，欧文氏菌属，克雷伯氏菌属，变形杆菌属，沙门氏菌属如鼠伤寒沙门氏菌，沙雷氏菌属如粘质沙雷氏菌，和志贺氏菌属，以及芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，假单胞菌属如铜绿假单胞菌和链霉菌。

除了原核生物以外，真核微生物如丝状真菌或酵母是合适的用于抗PD-L1抗体编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其它属、种和菌株通常是可获得的并且可用于本发明，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如乳克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维氏酵母(K.marxianus)；西洋蓍霉(yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070)；念珠菌属(Candida)；Trichoderma reesia(EP244,234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺氏酵母属(Schwanniomyces)如西方许旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，例如链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、Tolypocladium以及曲霉属宿主如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

用于表达本文提供的抗PD-L1抗体的其他合适的宿主细胞来源于多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。目前已经从下述宿主中鉴定了大量的杆状病毒株和变体以及相应的容许型昆虫宿主细胞：草地夜蛾(Spodoptera Frugiperda，毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti，蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus，蚊子)、Drosophilamelanogaster(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。用于转染的各种病毒株是公众可获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且根据本发明，这些病毒可以用作本文的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛花、番茄和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。

用上述用于抗PD-L1抗体产生的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在根据需要修改的常规营养培养基中培养，以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。

用于产生本文提供的抗PD-L1抗体的宿主细胞可以在各种培养基中培养。诸如Ham's F10(Sigma)，极限必需培养基(Minimal Essential Medium，MEM)，(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM，Sigma)的商业上可获得的培养基适于培养宿主细胞。此外，Ham等，Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90/03430；WO 87/00195；或U.S.Pat.Re.30,985中描述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。需要时可以在任意这些培养基中补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素，转铁蛋白或表皮生长因子)，盐(如氯化钠，钙，镁和磷酸盐)，缓冲液(如HEPES)，核苷酸(如腺苷和胸苷)，抗生素(如庆大霉素(GENTAMYCINTM)药物)，微量元素(定义为无机化合物，通常以微摩尔范围内的终浓度存在)和葡萄糖或等同能量来源。任何其他必需的补充剂也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包含在内。诸如温度、pH等的培养条件是与之前选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对普通技术人员而言将是明显的。

当使用重组技术时，抗体可以在细胞内，在周质空间中产生，或者直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，作为第一步，例如通过离心或超滤除去微粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的方法。简而言之，在约30分钟内，在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下解冻细胞糊状物。细胞碎片可以通过离心去除。在抗体分泌到培养基中的情况下，通常首先使用商购可得的蛋白质浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自这种表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂例如PMSF可包括在任何前述步骤中以抑制蛋白水解，并可包含抗生素以防止外来污染物的生长。

可以使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换层析、硫酸铵沉淀、盐析和亲和层析来纯化从细胞制备的抗体，其中亲和层析是优选的纯化技术。

在任何一个或多个初步纯化步骤之后，包含目标抗体和污染物的混合物可以使用pH介于约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液进行低pH疏水相互作用层析，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行。

药物组合物

在一些方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种如本文所公开的PD-L1结合分子和药学上可接受的载体。

药物组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或药物。本发明的药物组合物还可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗组合施用，使得抗PD-L1抗体增强对疫苗的免疫反应。药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载剂、水性介质、非水性介质、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮/分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒的辅助物质，本领域已知的各种组分的组合或更多。

合适的组分可以包括例如抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、巯基山梨糖醇、丁基甲基苯甲醚、丁基化羟基甲苯和/或丙基砷酸盐。如本发明所公开的，本发明包含抗体的组合物包含一种或多种抗氧化剂，如甲硫氨酸，以减少抗体的氧化。氧化减少可以防止或减少结合亲和力的降低，从而增强抗体稳定性并延长保质期。因此，在一些实施方式中，本发明提供了包含一种或多种抗体和一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的组合物。本发明进一步提供了多种方法，其中将抗体与一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸混合，从而可以防止抗体被氧化，以延长其保质期和/或增加活性。

为了进一步说明，药学上可接受的载剂可以包括例如水性载剂，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液，非水性载剂如植物来源的不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油，抑菌剂或抑真菌浓度的抗微生物剂，等渗剂如氯化钠或葡萄糖，缓冲剂如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，抗氧化剂如硫酸氢钠，局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因，悬浮剂和分散剂如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如聚山梨酯80(TWEEN-80)，多价螯合剂或螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)，乙醇，聚乙二醇，丙二醇，氢氧化钠，盐酸，柠檬酸或乳酸。用作载剂的抗微生物剂可以添加到处在包含苯酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵的多剂量容器中的药物组合物中。合适的赋形剂可以包括例如水，盐水，右旋糖，甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可以包括例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，稳定剂，溶解度增强剂或诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。

施用、制剂和剂量

本发明的药物组合物可以通过各种途径体内施用至有需要的受试者，所述途径包括但不限于口服、静脉内、动脉内、皮下、肠胃外、鼻内、肌内、颅内、心内、心室内、气管内、口腔、直肠、腹膜内、皮内、局部、经皮和鞘内、或者通过植入或吸入。本发明组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。根据预期的应用和治疗方案可以选择合适的制剂和施用途径。

用于肠内施用的合适制剂包括硬或软的明胶胶囊，丸剂，片剂，包括包衣片剂，酏剂，混悬剂，糖浆剂或吸入剂及其控释剂型。

适用于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括活性成分溶解、悬浮于其中或以其他方式提供的(例如，在脂质体或其他微粒中)的水性或非水性、等渗、无热原、无菌液体(例如溶液、混悬液)。这些液体可以另外含有其它药学上可接受的成分，例如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、悬浮剂、增稠剂和使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等。适用于此类制剂的等渗载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或乳酸林格氏注射液。类似地，特定剂量方案(即剂量、时间和重复)将取决于具体个体和个体的病史以及诸如药代动力学(例如半衰期、清除率等)的经验考虑。

施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且基于减少增殖或致瘤细胞的数量，维持这种肿瘤细胞的减少，减少肿瘤细胞的增殖或延迟转移的发展。在一些实施方式中，施用的剂量可以被调节或减少以控制潜在的副作用和/或毒性。备选地，本发明治疗组合物的持续连续释放制剂可能是合适的。

本领域技术人员将会理解，合适的剂量可因患者而异。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性，施用途径，施用时间，化合物清除速率，治疗持续时间，其他联合使用的药物、化合物和/或材料，疾病的严重程度，以及物种，患者的性别、年龄、体重、疾病、一般健康状况和以前的病史。化合物的量和施用途径最终由医生、兽医或临床医师决定，但通常选择剂量以达到实现所需效果的作用部位处的局部浓度，而不会导致实质性的有害或不利副作用。

通常，PD-L1结合分子可以以各种范围施用。在一些实施方式中，本文提供的PD-L1结合分子可以以约0.01mg/kg至约100mg/kg(例如约0.01mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、或约100mg/kg)的治疗有效剂量施用。在这些实施方式的某些中，抗体以约50mg/kg或更低的剂量施用，并且在这些实施方式中的某些中，剂量为10mg/kg或更低，5mg/kg或更低，1mg/kg或更低，0.5mg/kg或更低，或者0.1mg/kg或更低。在某些实施方式中，施用剂量可以在治疗过程中改变。例如，在某些实施方式中，初始施用剂量可以高于后续施用剂量。在某些实施方式中，取决于受试者的反应，施用剂量可以在治疗过程中变化。

无论如何，本发明的抗体优选根据需要施用于有需要的受试者。本领域技术人员可以确定施用频率，例如主治医生基于所治疗的疾病、所治疗受试者的年龄、所治疗疾病的严重程度、所治疗受试者的一般健康状况等的考虑。

在某些优选的实施方式中，涉及本发明的抗体的治疗过程将包含在数周或数月的时间内施用的多剂量的所选药物产品。更具体地说，本发明的抗体可以每天、每两天、每四天、每周、每十天、每两周、每三周、每月、每六周、每两个月、每十周或每三个月施用一次。就此而言，可以理解的是，可以基于患者响应和临床实践来改变剂量或者调整时间间隔。

在给予一次或多次施用的个体中也可凭经验确定所公开的治疗组合物的剂量和方案。例如，可给予个体增量剂量的如本文所述产生的治疗组合物。在选定的实施方式中，剂量可分别根据经验确定或观察到的副作用或毒性逐渐增加或减少或减轻。为了评估所选择的组合物的功效，可以如前所述跟踪特定疾病、病症或疾病的标志物。对于癌症，这些包括通过触诊或视觉观察直接测量肿瘤大小，通过X射线或其他成像技术间接测量肿瘤大小；通过直接肿瘤活组织检查和肿瘤样本的显微镜检查评估的改善；测量根据本文所述方法鉴定的间接肿瘤标志物(例如用于前列腺癌的PSA)或致瘤性抗原，疼痛或麻痹的减轻；与肿瘤相关的言语、视力、呼吸或其他失能的改善；食欲增加；或通过接受的测试测量的生活质量的提高或生存期的延长。本领域技术人员将明白，剂量将根据个体、肿瘤疾病的类型、肿瘤疾病的阶段、肿瘤疾病是否已开始转移至个体中的其他位置以及过去使用的治疗和并行使用的治疗而变化。

用于肠胃外施用(例如静脉内注射)的相容制剂可包含浓度为约10μg/ml至约100mg/ml的如本文提供的PD-L1结合分子。在一些实施方式中，PD-L1结合分子的浓度可包括20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml或1mg/ml。在其他优选的实施方式中，PD-L1结合分子的浓度将包括2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、14mg/ml、16mg/ml、18mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。

本发明的应用

本发明的PD-L1结合分子具有许多体外和体内用途。例如，可以将这些分子体外或离体施用于培养细胞，或例如体内施用于人受试者，以增强各种情况下的免疫力。免疫应答可以被增强、刺激或上调。

优选的受试者包括需要增强免疫应答的人患者。所述方法特别适用于治疗患有可通过增强免疫应答(例如T细胞介导的免疫应答)治疗的病症的人患者。在一个具体的实施方式中，所述方法特别适合于体内治疗癌症。为了实现免疫的抗原特异性增强，可以将抗PD-L1抗体与感兴趣的抗原一起施用，或者抗原可能已经存在于待治疗的受试者中(例如携带肿瘤或病毒的受试者)。当抗PD-L1抗体与另一种药剂一起施用时，两者可以以任何顺序施用或同时施用。

本发明进一步提供了用于检测样品中PD-L1抗原的存在或测量人PD-L1抗原的量的方法，包括在允许PD-L1结合分子与PD-1之间形成复合物的条件下使样品和对照样品与PD-L1结合分子接触。然后检测复合物的形成，其中与对照样品相比，样品之间的差异复合物形成表明样品中存在PD-L1抗原。此外，本发明的PD-L1结合分子可用于通过免疫亲和纯化来纯化人PD-L1。

治疗癌症

与PD-L1相关的疾病和病症可以是与免疫相关的疾病或病症。

在一些实施方式中，与PD-L1相关的病症和病症包括肿瘤和癌症，包括但不限于：乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、涎腺癌、胃部癌症、神经胶质瘤、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、头颈癌、胃癌和胰腺癌。

更具体地，与PD-L1相关的疾病和病症包括：非小细胞肺癌，小细胞肺癌，肾细胞癌，结直肠癌，卵巢癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，膀胱癌，食道癌，间皮瘤，黑色素瘤，头颈癌，甲状腺癌，肉瘤，前列腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，胸腺癌，白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，真菌病毒，梅克尔细胞癌和其他血液恶性肿瘤，如经典霍奇金淋巴瘤(CHL)，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤，富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤，EBV阳性和阴性PTLD以及EBV相关弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，浆细胞淋巴瘤，结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻咽癌和HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，中枢神经系统(CNS)肿瘤如原发性CNS淋巴瘤，脊髓轴肿瘤或脑干胶质瘤。在某些实施方式中，肿瘤和癌症是转移性的，特别是表达PD-L1的转移性肿瘤。

与化疗组合使用

所述抗体可以与化学疗法或放射疗法组合使用。抗体可以与抗癌剂、细胞毒性剂或化学治疗剂组合使用。

术语“抗癌剂”或“抗增殖剂”意指可用于治疗细胞增殖性病症例如癌症的任何药剂，并且包括但不限于：细胞毒性剂，细胞抑制剂，抗血管生成剂，减积剂(debulkingagents)，化学治疗剂，放射疗法和放射治疗剂，靶向抗癌剂，BRM，治疗性抗体，癌症疫苗，细胞因子，激素疗法，放射疗法和抗转移剂和免疫治疗剂。应该理解的是，在如上所述的选定实施方式中，此类抗癌剂可以包含缀合物并且可以在施用之前与公开的位点特异性抗体结合。更具体而言，在一些实施方式中，将选择的抗癌剂连接至工程化抗体的不配对半胱氨酸以提供如本文所述的工程化缀合物。因此，这样的工程化缀合物被明确地包括在本发明的范围内。在其他实施方式中，所公开的抗癌剂将与包含如上所述的不同治疗剂的位点特异性缀合物组合施用。

如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指对细胞有毒并降低或抑制细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。在一些实施方式中，该物质是源自活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实例包括但不限于细菌(例如，白喉毒素，假单胞菌内毒素和外毒素，葡萄球菌肠毒素A)，真菌(例如α-八叠球菌素，局限曲霉素)，植物(相思豆毒蛋白，蓖麻毒素，蒴莲根毒素，槲寄生素，美洲商陆抗病毒蛋白，皂草素，白树毒素，momoridin，天花粉蛋白，大麦毒素，油桐(Aleurites fordii)蛋白，石竹素蛋白，Phytolacca mericana蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜抑制剂，麻风树毒蛋白，巴豆毒素，石碱草抑制剂，白树毒素，mitegellin，局限曲霉素，酚霉素，新霉素和单端孢霉烯族化合物)或动物(例如细胞毒性RNA酶，如胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段和/或变体)的小分子毒素或酶促活性毒素。

为了本发明的目的，“化学治疗剂”包括非特异性降低或抑制癌细胞的生长、增殖和/或存活的化学化合物(例如细胞毒性剂或细胞抑制剂)。这些化学试剂通常针对细胞生长或分裂所需的细胞内过程，因此对于通常快速生长和分裂的癌细胞特别有效。例如，长春新碱使微管解聚，从而抑制细胞进入有丝分裂。通常，化学治疗剂可以包括抑制或被设计用于抑制癌细胞或可能变成癌性或产生致瘤后代(例如TIC)的细胞的任何化学药剂。这些药剂通常是组合使用的，并且通常是最有效的，例如，在诸如CHOP或FOLFIRI的方案中。

可以与本发明的位点特异性构建体组合使用的抗癌剂(作为位点特异性缀合物的组分或未缀合状态)的实例包括但不限于烷化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺、多聚乙酰(acetogenins)、喜树碱、苔藓抑素、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、多拉司他汀、多卡米星、艾榴素(eleutherobin)、水鬼蕉碱、沙克迪因(sarcodictyin)、海绵素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔类抗生素、dynemicin、双膦酸盐、埃斯波霉素、色素蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡拉宾辛(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素类(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、博地霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗-代谢物、埃罗替尼、威罗菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依鲁替尼、恩杂鲁胺、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗-肾上腺素、叶酸补充剂如弗林酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、贝斯布希(bestrabucil)、比生群、依达曲沙、迪夫法明(defofamine)、秋水仙胺、地吖醌、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋铵、爱波喜龙、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美坦生类化合物(maytansinoids)、米托胍腙、米托蒽醌、莫丹摩尔(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基肼、丙卡巴肼、多糖复合物(JHSNatural Products，Eugene，OR)、雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；卡西托欣(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱，长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸；类视色素；卡培他滨；考布他汀；甲酰四氢叶酸；奥沙利铂；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制剂(其减少细胞增殖)，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这一定义中还包括的是用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂，抑制调节肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，和抗-雄激素；以及曲沙他滨(1，3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、核酶诸如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗，rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；长春瑞滨和埃斯波霉素，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

与放射疗法组合使用

本发明还提供了抗体与放射疗法(即，用于在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，例如γ-照射，X-射线，UV-照射，微波，电子发射等)的组合。还考虑了使用放射性同位素至肿瘤细胞的定向递送的联合疗法，并且所公开的缀合物可以与靶向的抗癌剂或其他靶向手段结合使用。通常，放射疗法在约1周至约2周的时间段内以脉冲方式施用。放射疗法可以对患有头颈癌的受试者施用约6至7周。任选地，放射疗法可以作为单剂量或作为多个顺序剂量施用。

诊断

本发明提供了用于检测、诊断或监测增殖性病症的体外和体内方法以及筛选来自患者的细胞以鉴定肿瘤细胞包括致瘤细胞的方法。这样的方法包括鉴定用于治疗的患有癌症的个体或监测癌症的进展，包括将患者或从患者获得的样品(体内或体外)与本文所述的抗体接触，并检测样品中与结合的或游离的靶分子的结合的抗体的存在或不存在或结合水平。在一些实施方式中，抗体将包含如本文所述的可检测标记或报道分子。

在一些实施方式中，抗体与样品中特定细胞的结合可表示样品可能含有致瘤细胞，从而表明患有癌症的个体可用本文所述的抗体有效治疗。

可以通过多种测定法分析样品，例如放射免疫测定法，酶免疫测定法(例如ELISA)，竞争结合测定法，荧光免疫测定法，免疫印迹测定法，Western印迹分析和流式细胞术测定法。相容的体内诊断或诊断测定可以包括本领域公知的成像或监测技术，例如本领域技术人员已知的磁共振成像，计算机化断层摄影(例如CAT扫描)，正电子断层扫描(例如PET扫描)，放射线照相术，超声波等。

药物包装和试剂盒

还提供了包括包含一个或多个剂量的抗体的一个或多个容器的药物包装和试剂盒。在一些实施方式中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的组合物，所述组合物包含例如抗体，具有或不具有一种或多种其他试剂。对于其他实施方式，这种单位剂量以一次性使用的预充式注射用注射器供应。在其他实施方式中，单位剂量中包含的组合物可以包含盐水、蔗糖或类似物；缓冲液，如磷酸盐等；和/或配制在稳定和有效的pH范围内。备选地，在一些实施方式中，缀合物组合物可以作为冻干粉末提供，其可以在加入合适的液体(例如无菌水或盐溶液)后重构。在一些优选的实施方式中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。容器上或与容器相关联的任何标签指示封装的缀合物组合物用于治疗选择的肿瘤疾病状况。

本发明还提供了用于产生位点特异性缀合物以及任选地一种或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单元的试剂盒。该试剂盒包括容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，小瓶，注射器等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料，并且包含药学有效量的所公开的缀合或非缀合形式的缀合物。在其他优选实施例中，容器包括无菌存取口(例如容器可以是静脉内注射液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。这样的试剂盒通常在合适的容器中包含工程化缀合物的药学上可接受的制剂，并且任选地在相同或不同的容器中包含一种或多种抗癌剂。试剂盒还可以含有其他药学上可接受的制剂，用于诊断或组合治疗。例如，除了本发明的抗体之外，这样的试剂盒可以含有任何一种或多种抗癌剂，例如化学治疗剂或放射治疗剂；抗血管生成剂；抗转移剂；靶向抗癌剂；细胞毒性剂；和/或其他抗癌剂。

更具体地说，试剂盒可以具有含有所公开的抗体的单个容器，其含有或不含另外的组分，或者它们可以具有用于每种所需试剂的不同容器。在提供用于联合的组合治疗剂的情况下，可以按摩尔当量组合或一种组分多于另一种的方式预混合单一溶液。备选地，试剂盒的缀合物和任何任选的抗癌剂可以在施用于患者之前分开保存在不同的容器中。试剂盒还可以包含用于容纳无菌药学上可接受的缓冲液或其他稀释剂例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器装置。

当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，液体溶液优选为水溶液，特别优选无菌水溶液或盐水溶液。然而，试剂盒的组分可以作为干粉提供。当试剂或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。可以设想溶剂也可以提供于另一个容器中。

如上简要所述，所述试剂盒还可含有向患者施用抗体和任何任选组分的工具，例如一种或多种针，静脉内(I.V.)注射袋或注射器，或者甚至滴眼器、移液管或其他类似装置，通过其可以将制剂注射或引入动物体内或将其施用于身体的患病区域。本发明的试剂盒通常还包括用于容纳小瓶或类似物的装置以及用于商业销售的其他紧密封闭的部件，例如注塑或吹塑塑料容器，其中放置并且保持所需的小瓶和其他装置。

序列表概述

本申请附带有包含许多核酸和氨基酸序列的序列表。下表B提供了所包含的序列的概述。

表B

实施例

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。这些实施例并不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。

实施例1 PD-L1单域抗体的制备和筛选

1.1羊驼的免疫

使用人PDL1-His蛋白(购自北京义翘神州，10084-H08H)免疫小羊驼(Alpaca)。前三次免疫剂量均为0.5mg每次，后两次免疫剂量均为0.25mg每次，共免疫五次，免疫间隔为每两周一次。初次免疫时使用完全佐剂，其余均采用不完全佐剂。

1.2血清免疫效价测定

自第二次免疫开始，每次注射免疫1周后取血5ml用于血清免疫效价测定。即将1.1内的PDL1-His抗原蛋白coat在ELISA板上，200ng每孔，封闭和清洗后，加入由1:2000比例开始梯度稀释的血清样品，孵育结合和清洗后，使用抗驼单域抗体的二抗(金斯瑞，A01861)进行显色。

1.3噬菌体文库构建

在第五次免疫一周后，取羊驼外周血50ml，用于构建单域抗体的噬菌体展示文库：先进行RNA抽提，即使用淋巴细胞分离液(索莱宝，P8610)分离得到淋巴细胞，对淋巴细胞使用RNA提取试剂(TaKaRa，9109)处理裂解，使用氯仿去除杂质和使用异丙醇沉淀RNA，对沉淀用75％乙醇清洗，室温干燥后使用注射用水溶解；接着使用反转录试剂盒(ThermoScientific,K1622)对RNA进行反转录，制备得到cDNA；然后使用巢式PCR方法扩增出含单域抗体可变区基因的DNA，对其使用Sfi I酶切，然后和Sfi I酶切后的展示载体进行T₄ DNA连接酶连接；连接产物纯化后电转TG1感受态细胞，使用M13KO7辅助噬菌体侵染，制备得到噬菌体展示文库。

最终所构建文库库容为4.2E+09。

1.4噬菌体文库的淘选

将抗原(PDL1-Fc，义翘神州，10084-H02H)包被在高吸附96孔ELISA板上，1μg每孔，加入4.2E+12cfu的来自于上述1.3的文库噬菌体，室温摇动孵育结合，使用含0.1％吐温-20的PBST洗液洗涤6次，每次摇动2min，共洗涤12min。然后洗脱，测定洗脱出的噬菌体的效价，以包被不相关靶点蛋白的孔作为平行对照。

结果如表1所示，在第一轮的淘选后，PDL1-Fc孔的洗脱噬菌体相对对照孔即实现了富集，富集倍数为8.5倍。

表1：噬菌体文库淘选数据

1.5单克隆的噬菌体筛选

使用自1.4中结合孔洗脱出的噬菌体，侵染对数期的TG1菌，稀释后涂板，然后挑克隆入含有Carb和M13KO7辅助噬菌体的2YT培养基内过夜培养。第二日，3000rpm离心培养板，取上清进行噬菌体ELISA检测，包被PDL1-His(义翘神州，10084-H08H)的孔作为测定孔，包被无关靶点蛋白的孔作为对照孔，使用偶联HRP(辣根过氧化物酶)的抗-M13抗体(义翘神州，11973-MM05T-H)作为二抗，挑选测定孔读值(OD450 nm)在1.0以上、同时对照孔读值在0.1以下的克隆的菌液进行质粒抽提和基因测序，将测序所得到的序列翻译为氨基酸序列，进行序列比对，去除重复序列或CDR3相差1个氨基酸的相似序列，得到独特序列。最终共得到了10条独特序列。

实施例2基于单域抗体周质腔粗提物的检测

2.1单域抗体粗提物的制备

为了方便的对1.5中得到的独特序列克隆进行快速的功能筛选，制备了基于细菌内诱导表达的单域抗体粗提物，步骤如下：

1)将独特序列对应的TG1菌液接种入2.5ml含Carb和0.5％葡萄糖的2×YT培养基中，37℃、220rpm培养；

2)培养至OD600达到0.4时，加入2.5ml含有IPTG、Carb的2×YT培养基，令IPTG终浓度为0.1mM，28℃、200rpm过夜培养；

3)第二日，离心菌液，弃去培养基上清，使用1ml PBS重悬菌体，然后进行三次-80℃→30℃的冻融循环令周质腔的单域抗体释放；

4)对菌体3000rpm、4℃离心30分钟，吸取上清，弃去沉淀物，即制备得到周质腔单域抗体的粗提物(同时接种不含展示载体的空白TG1菌进行同样操作制备得到空白菌液粗提物对照)。

2.2单域抗体的结合活性检测

使用2.1内制备得到的粗提物对包被在板子上的PDL1-Fc(义翘神州，10084-H02H)进行ELISA结合活性检测，具体步骤如下：

1)使用PBS稀释PDL1-Fc，加入孔板中，200ng、100μL每孔，4℃过夜coat，同时设置未coat抗原的孔作为空白对照；

2)第二日，对板子使用1％BSA(牛血清白蛋白)室温封闭2小时，期间将单域抗体粗提物从原液开始1：3稀释，每个样品共设计四个浓度梯度，分别为原液(1×)、1:3、1:9、1:27，使用靶向不相关靶点的单域抗体的粗提物作为阴性对照，使用不含展示载体的空白TG1菌液粗提物作为空白对照；

3)板子封闭后使用含0.05％吐温-20的PBS清洗3次，加入单域抗体粗提物的梯度稀释液，室温摇动孵育结合1小时；

4)清洗3次，加入1:3000的偶联辣根过氧化物酶的抗6×his二抗(北京百奥莱博，F030104)，室温摇动孵育结合1小时；

5)清洗3次后，加入TMB底物室温摇动显色1分钟，使用1M硫酸液终止显色；

6)使用酶标仪(Biotek，Synergy H1MF)读取450nm下的吸光度值。

结果如图1所示，可见10个克隆中有个8个克隆对PDL1有一定的结合，其中4个(1E2，2D10，6A7，6F9)结合较强。

2.3单域抗体的阻断活性检测

同时使用单域抗体粗提物进行PD1-Fc和PDL1-Fc-biotin的阻断ELISA检测，以从中筛选得到初步的具有阻断功能的分子，具体步骤如下：

1)将PD1-Fc(百普赛斯，PD1-H5257)包被在板子上，200ng每孔，4℃过夜coat；

2)第二日，对ELISA板使用1％的BSA室温封闭2小时，期间取一块96孔样品板，将粗提物与2μg/ml的PDL1-Fc-biotin(义翘神州，10084-H02H-B)等体积混合，室温孵育30min，粗提物从原液开始，1:2稀释，共有原液(1×)、1:2、1:4、0四个浓度点，同时使用浓度20μg/ml起始的Tecentriq生物类似物作为阳性对照，使用靶向不相关靶点的单域抗体粗提物作为阴性对照；

3)对封闭后的ELISA板使用PBST洗液清洗3次，加入粗提物与PDL1-Fc-biotin的孵育液，室温孵育1小时；

4)清洗3次，加入1:3000的偶联辣根过氧化物酶的链亲和素(上海生工，D111054)，室温摇动孵育结合1小时；

5)PBST洗液清洗3次后，加入TMB底物室温摇动显色1分钟，使用1M硫酸液终止显色；

6)使用酶标仪(Biotek，Synergy H1MF)读取450nm下的吸光度值。

结果如图2所示，可见10个克隆中，只有克隆2D10存在明显的对PD1-PDL1的阻断效力。

实施例3 IgG抗体的表达与阻断活性测定

分析克隆2D10的序列，确认其CDR内不存在明显的翻译后修饰位点，然后将其构建到人IgG4 Fc(含S228P突变)之上，进行了HEK293细胞内的瞬时转染与表达纯化，所表达的分子命名为HY00901-1(SEQ ID NO:16)。然后使用该分子，按实施例2.2中的方法进行对PD1-Fc和PDL1-Fc-biotin的阻断检测，IgG的起始工作浓度为60μg/ml，3倍梯度稀释，使用Tecentriq生物类似物作为对照。

结果如图3所示，可见HY00901-1具有与Tecentriq接近的对PD1-Fc和PDL1-Fc-biotin的阻断效力，以质量浓度计算，其EC₅₀是Tecentriq生物类似物的一半左右。

实施例4抗体的人源化和活性测定

4.1抗体的人源化和制备

使用SWISS-MODEL对抗体HY00901-1进行结构模拟，根据得到的结构，对其非CDR区内的驼源氨基酸位点进行人源化突变的评估，使用人的胚系基因V_3-23*01和J₁*01作为人源化突变的目标序列，优先突变位于抗体结构表面并且非邻近CDR的氨基酸位点，置后突变位于抗体结构内部(buried)以及邻近CDR的位点。根据以上原则，设计了若干条人源化后的抗体序列：HY00901-1-hz1至HY00901-1-hz10(如SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:26所示)，然后进行HEK293内的瞬时转染表达。

4.2抗体的分子水平的阻断效力检测

表达完成后，使用实施例3内描述的方法对各个变体分子对人PD1-PDL1的阻断效力进行检测。

结果如图4所示，可见人源化后的各个变体分子均保持了母分子HY00901-1的阻断效力，其中HY00901-1-hz5、HY00901-1-hz7、HY00901-1-hz10的阻断效力相对较好，按质量浓度计算，其EC₅₀值分别为0.401、0.434、0.392μg/ml，约比对照分子Tecentriq生物类似物高4倍(1.83μg/ml)。

4.3抗体的基于细胞的阻断效力的检测

将人PDL1稳定转染使之表达在CHO-K1细胞表面，并使用该huPDL1-CHO-K1细胞检测人源化后各IgG分子对PDL1-PD1的阻断效力，具体步骤如下：

1)细胞收集后，离心去除培养液，PBS洗涤一次；

2)使用含1％BSA的FACS buffer重悬并调整浓度至2E+06细胞/ml；

3)取50μL细胞重悬液加入96孔样品板中，加入50μL梯度稀释的抗体，轻轻吹打混匀，4℃静置孵育1小时；

4)加入100μL 3μg/ml的PD1-biotin(三优生物，P02953B3.19)，4℃静置孵育1小时；

5)离心和使用FACS buffer重悬洗涤细胞，共洗涤3次；

最后一次洗涤后，使用100μL 1:300的PE-链亲和素(Invitrogen，12-4317-087)重悬细胞，4℃避光孵育30分钟；

6)使用FACS buffer洗涤细胞3次，最后用100μL FACS buffer重悬；

7)上流式细胞仪检测，记录平均荧光强度(MFI)和处理数据。

结果如图5A和图5B所示，可见代表性的人源化后的分子(HY00901-1-hz6至HY00901-1-hz10)均具有有效的对细胞上的PDL1和游离的PD1-biotin的阻断效力，从EC₅₀值比较来看(见下面表2和表3)，它们的阻断效力均优于对照药Tecentriq生物类似物，以质量浓度(μg/ml)计算，它们的EC₅₀值约为Tecentriq生物类似物的1/3至1/4。

表2：各分子的基于细胞的对PDL1-PD1的阻断实验的EC₅₀值

抗体	EC50(μg/ml)
		HY00901-1	0.1242
HY00901-1-hz6	0.1533
		HY00901-1-hz7	0.2145
HY00901-1-hz8	0.214
		HY00901-1-hz9	0.1325
Tecentriq生物类似物	0.6247

表3：各分子的基于细胞的对PDL1-PD1的阻断实验的EC₅₀值

抗体	EC50(μg/ml)
		HY00901-1-hz10	0.2189
Tecentriq生物类似物	0.5023

实施例5对猴PD1-PDL1的阻断检测

为了验证HY00901-1对猴PDL1的交叉活性，将猴PD1-Fc(百普赛斯，PD1-C5254)包被在ELISA板上，500ng每孔，4℃过夜coat，第二天使用1％BSA封闭，期间将不同浓度抗体与30μg/ml的猴PDL1-Fc-biotin(义翘神州，90251-C08H-B)等体积混合，室温孵育30min后转移入封闭和清洗后的孔板内，室温孵育1小时，然后洗板，使用链亲和素-HRP进行显色，使用Tecentriq生物类似物作为阳性参照物。

结果如图6所示，可见同Tecentriq生物类似物一样，HY00901-1可以阻断猴PD1与PDL1的结合。

实施例6对胞内NF-AT信号通路的激活效应测定

为了检测抗体在PDL1-PD1相互作用下对淋巴来源细胞的胞内NF-AT信号通路的抑制解除/激活效应，将工程化表达人CD3配体和PDL1的CD3L-PDL1-CHO-K1细胞(20000个每孔)和工程化表达人PD1的NF-AT信号通路报告基因细胞huPD1-NF-AT-Jurkat(100000个每孔)共同加入培养孔中，加入梯度稀释的抗体，于37℃共孵育6h，然后加入50μL Bright-Lite并依据试剂盒(诺唯赞，DD1204-03)说明读取荧光信号。

结果如图7所示，可见HY00901-1-hz9具有明确的对PDL1-PD1相互作用下的胞内NF-AT信号通路的解除抑制/激活效应，其激活的EC₅₀值为0.141μg/ml，略优于对照抗体Tecentriq(0.199μg/ml)。

应当理解，尽管本发明已根据其优选实施例进行了示例性描述，但不应限于上述实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。具体抗体的选择和应用可以根据具体的需要进行相应的调整和改变。因此对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的构思和原则之内，还可做出若干简单替换，这些均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (32)

1.程序性死亡配体1(PD-L1)结合分子，其中所述PD-L1结合分子包含重链可变区(VH)，所述VH包含：

a)HCDR1：包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

b)HCDR2：包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

c)HCDR3：包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的PD-L1结合分子，其中所述VH包含：

1)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

2)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

3)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

4)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

5)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

6)SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

7)SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

8)SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

9)SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

10)SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

11)SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2中所述的PD-L1结合分子，其进一步包含一个或多个氨基酸残基突变但仍保持与PD-L1特异性结合。

4.根据权利要求3所述的PD-L1结合分子，其中所述突变中的至少一个在VH序列中但不在任一个CDR序列中。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的PD-L1结合分子，其中所述PD-L1结合分子是PD-1拮抗剂，优选为抗PD-L1抗体。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的PD-L1结合分子，其中所述PD-L1结合分子是嵌合抗体。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的PD-L1结合分子，其中所述PD-L1结合分子是人源化抗体。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的PD-L1结合分子，其中所述PD-L1结合分子是单域抗体，优选为重链单域抗体(VHH)。

9.根据权利要求8中任一项所述的PD-L1结合分子，其中所述VHH来源于骆驼科动物，所述骆驼科动物包含羊驼或美洲驼。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的PD-L1结合分子，其中所述VH与IgG的Fc结构域融合。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的PD-L1结合分子，其中所述VH与人IgG的Fc结构域融合。

12.根据权利要求9所述的PD-L1结合分子，其中所述PD-L1结合分子是来自骆驼科动物的VHH与人IgG的Fc结构域的嵌合抗体。

13.根据权利要求12所述的PD-L1结合分子，其中所述PD-L1结合分子是来自骆驼科动物的VHH与人IgG1或IgG4的Fc结构域的嵌合抗体。

14.根据权利要求1-13所述的PD-L1结合分子，所述Fc结构域为SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:15所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

15.根据权利要求1-13中任一项所述的PD-L1结合分子，其包含：

1)SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:16所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

2)SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

3)SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:18所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

4)SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:19所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

5)SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:20所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

6)SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:21所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

7)SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:22所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

8)SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:23所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

9)SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

10)SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；

11)SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:26所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

16.一种抗体-药物缀合物，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的PD-L1结合分子，其与一个或多个缀合物部分连接。

17.一种核酸，其编码根据权利要求1-15中任一项所述的抗PD-L1结合分子。

18.根据权利要求17所述的核酸，其包含：

1)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

2)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

3)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

4)SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

5)SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

6)SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

7)SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

8)SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

9)SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

10)SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；

11)SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列；或

优选地，所述核酸进一步包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列。

19.一种表达载体，其包含根据权利要求17或18所述的核酸。

20.一种宿主细胞，其包含根据权利要求17或18所述的核酸或根据权利要求18所述的表达载体。

21.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的PD-L1结合分子，或根据权利要求16所述的抗体-药物缀合物，或根据权利要求17或18所述的核酸，或根据权利要求19所述的表达载体中的一种或多种和药学上可接受的载体。

22.根据权利要求1-15中任一项所述的PD-L1结合分子，或根据权利要求16所述的抗体-药物缀合物，或根据权利要求21所述的药物组合物在制备用于治疗或预防受试者中与PD-L1相关的疾病；或用于抑制或阻断受试者中PD-L1与PD-1结合；或用于治疗或预防受试者中会受益于免疫应答上调的疾病的药物中的用途。

23.根据权利要求22所述的用途，其中所述药物是经口、鼻、静脉内、皮下、舌下或肌肉内给药。

24.根据权利要求22所述的用途，其中所述疾病是增殖性病症或感染，所述增殖性疾病包含癌症。

25.根据权利要求24所述的用途，其中所述癌症选自：乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、涎腺癌、胃部癌症、神经胶质瘤、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、头颈癌、胃癌和胰腺癌。

26.根据权利要求22所述的用途，其中所述感染是慢性感染。

27.一种治疗或预防受试者中与PD-L1相关的疾病；或抑制或阻断受试者中PD-L1与PD-1结合；或治疗或预防受试者中会受益于免疫应答上调的疾病的方法，其包含向需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-15中任一项所述的PD-L1结合分子，或根据权利要求16所述的抗体-药物缀合物，或根据权利要求21所述的药物组合物。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述药物是经口、鼻、静脉内、皮下、舌下或肌肉内给药。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述疾病是增殖性病症或感染，所述增殖性疾病包含癌症。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述癌症选自：乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、涎腺癌、胃部癌症、神经胶质瘤、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、头颈癌、胃癌和胰腺癌。

31.根据权利要求27所述的方法，其中所述感染是慢性感染。

32.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至15中任一项所述的PD-L1结合分子，或根据权利要求16所述的抗体-药物缀合物，或根据权利要求21所述的药物组合物，其用于治疗或诊断与PD-L1相关的疾病。