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CN118045062A - 一种负载槲皮素的蛋白-多糖三元复合纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种负载槲皮素的蛋白-多糖三元复合纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

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CN118045062A
CN118045062A CN202410147263.9A CN202410147263A CN118045062A CN 118045062 A CN118045062 A CN 118045062A CN 202410147263 A CN202410147263 A CN 202410147263A CN 118045062 A CN118045062 A CN 118045062A
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carboxymethyl starch
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CN202410147263.9A
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甘昌胜
张静文
杨柳
李惠雅
种淇芃
孙世纪
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Hefei University of Technology
Original Assignee
Hefei University of Technology
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Abstract

本发明公开了一种负载槲皮素的蛋白‑多糖三元复合纳米颗粒及其制备方法和应用，包括玉米醇溶蛋白和槲皮素乙醇溶液的制备、明胶溶液的配制、负载槲皮素的明胶修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液的制备、羧甲基淀粉溶液的配制和负载槲皮素的明胶‑羧甲基淀粉双重修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液的制备。本发明槲皮素纳米颗粒显著提高了递药体系的热稳定性、pH稳定性、光稳定性和贮藏稳定性；这种递送槲皮素的三元复合纳米颗粒（玉米醇溶蛋白‑明胶‑羧甲基淀粉）具有更高的pH稳定性，可在pH2‑8均很稳定，此外还展现出了更强的抗氧化活性和更高的体外生物利用度。本发明为递送天然生物活性成分提供一种新的实用技术。

Description

一种负载槲皮素的蛋白-多糖三元复合纳米颗粒及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及槲皮素纳米递药体系技术领域，尤其涉及一种用羧甲基淀粉和明胶双重修饰玉米醇溶蛋白负载槲皮素的蛋白-多糖三元复合纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
槲皮素是一种天然多羟基黄酮类化合物，存在于多种蔬菜和水果中。槲皮素已被证明具有抗氧化、抗炎症、抗癌、抗过敏、降血压等药理活性，在生物医药和功能性食品等领域具有重要的应用价值。然而，槲皮素在水中的溶解度很小，在光照和高温等环境下不稳定，直接口服生物利用度很低，限制了它在实际产品中的应用。设计和开发适当的递送系统是提高其溶解性、稳定性、生物利用度以及生物功效的有效策略。
纳米颗粒是常见的一类纳米级递送系统，通常以高分子聚合物为壁材，可有效包裹并载运天然活性成分。蛋白质和多糖作为两类主要的生物聚合物，来源广泛、安全无毒、生物相容性好、易于制备成纳米材料等优点，被广泛应用于构建纳米级载体用于生物活性物质的保护和递送。
基于玉米醇溶蛋白(zein)的生物活性成分纳米输送体系是近年来的研究热点。玉米醇溶蛋白是玉米的主要储存蛋白，含有超过50％的非极性氨基酸(亮氨酸、丙氨酸和脯氨酸)，可溶于高浓度乙醇水溶液，但不溶于水，这种特性使得玉米醇溶蛋白适合包埋疏水性活性成分。将槲皮素和玉米醇溶蛋白共溶解于高浓度乙醇中，通过反溶剂法，槲皮素被包埋进玉米醇溶蛋白纳米颗粒的疏水性内核中。但玉米醇溶蛋白纳米颗粒由于疏水性较强，易聚集，特别是在其等电点附近稳定性差，而且对药物的包埋率也较低。现有研究通常用生物聚合物涂层来解决上述问题，目前通常使用单一的多糖或蛋白作为玉米醇溶蛋白纳米颗粒的稳定剂，其中多糖，常用的有果胶、海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖等；而用于玉米醇溶蛋白纳米颗粒表面修饰的蛋白，主要是酪蛋白酸钠，也有文献报道了大豆分离蛋白和乳铁蛋白。这些多糖或蛋白的表面修饰，在一定程度上提高了玉米醇溶蛋白对活性成分的包埋率和稳定性，但是，在较低的pH情况下，如pH2～3时仍易聚集，且存在生物利用度不高、粒径较大等问题。
除了以上二元体系，还有少量三元体系的报道，主要是采用层层自组装法，比如蛋白/多糖、多糖/多糖复合体系对玉米醇溶蛋白纳米颗粒进行表面修饰。蛋白/多糖复合体系，蛋白主要就是酪蛋白酸钠，多糖可选用果胶、海藻酸钠、壳聚糖等。蛋白/多糖复合体系显示出了良好的协同效应。多糖/多糖复合体系，由于玉米醇溶蛋白纳米颗粒表面电荷为正电荷，因而第一层修饰使用的是阴离子多糖以静电作用结合，如海藻酸钠、果胶，第二层修饰使用的是阳离子多糖，通常就是壳聚糖，构建的是带正电的三元复合纳米颗粒。
发明内容
本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种负载槲皮素的蛋白-多糖三元复合纳米颗粒及其制备方法和应用，本发明采用反溶剂法结合层层静电堆积法，以明胶、羧甲基淀粉为原料附着到玉米醇溶蛋白纳米颗粒表面制备三元复合纳米颗粒，以提高玉米醇溶蛋白纳米颗粒的稳定性和对槲皮素的包埋率。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种负载槲皮素的蛋白-多糖三元复合纳米颗粒，以玉米醇溶蛋白包裹槲皮素为核，以明胶和羧甲基淀粉组装成壳，构建成具有核壳结构的递送槲皮素的复合纳米颗粒。
一种负载槲皮素的蛋白-多糖三元复合纳米颗粒的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)槲皮素-玉米醇溶蛋白的乙醇溶液的制备
将0.6g玉米醇溶蛋白溶于30mL 80％乙醇水溶液中，然后按槲皮素：玉米醇溶蛋白的质量比1:5-1:30加入槲皮素，充分搅拌使之溶解，得到槲皮素-玉米醇溶蛋白的乙醇溶液；
(2)明胶溶液的配制
将一定量的明胶溶解于20mL去离子水中，40℃搅拌0.5h，然后室温搅拌0.5h，配制成一定浓度的明胶溶液，明胶的质量为12.5mg-100mg；
(3)负载槲皮素的明胶修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液的制备
取5mL步骤(1)中得到的槲皮素-玉米醇溶蛋白的乙醇溶液，缓慢滴加入(2)中得到的20mL明胶溶液中，搅拌速度400-1000转/分钟，时间10-60min；
(4)羧甲基淀粉溶液的配制
将一定量的羧甲基淀粉溶解于25mL去离子水中，过夜搅拌，配制一定浓度的羧甲基淀粉溶液，羧甲基淀粉的质量为25mg-200mg；
(5)负载槲皮素的明胶-羧甲基淀粉双重修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液的制备
将(3)中得到的负载槲皮素的明胶修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液缓慢滴加入(4)中得到的羧甲基淀粉溶液中，搅拌速度400-1000转/分钟，时间30-120min，然后，在旋转蒸发仪上减压除去乙醇，体积用去离子水补足至50mL，即得到负载槲皮素的明胶-羧甲基淀粉双重修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液；
将步骤(5)中得到的负载槲皮素的明胶-羧甲基淀粉双重修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液，经冷冻干燥，得到负载槲皮素的蛋白-多糖三元复合纳米颗粒。
步骤(1)所述的槲皮素与玉米醇溶蛋白的质量比为1:5-1:20；步骤(2)所述的明胶的质量为20mg-50mg；步骤(4)所述的羧甲基淀粉的质量为50mg-150mg。
步骤(3)所述的搅拌速度为500-600转/分钟，时间10-30min；步骤(5)所述的搅拌速度为500-800转/分钟，时间30-60min。
一种负载槲皮素的蛋白-多糖三元复合纳米颗粒在制备抗氧化的药物以及在功能性食品中的应用。
一种钙离子修饰的载药复合纳米粒子制备方法，搅拌所述的负载槲皮素的明胶-羧甲基淀粉双重修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液，在搅拌的同时加入0.1～1mL的氯化钙溶液，使得混合体系的最终钙离子浓度在0.15mM～1.5mM，继续搅拌0.5～2h；在3000rpm下离心10分钟以除去大颗粒，得到钙离子修饰的载药复合纳米粒子。
一种钙离子修饰的载药复合纳米粒子在制备抗氧化的药物以及在功能性食品中的应用。
本发明的技术原理如下：
玉米醇溶蛋白由于含有大量的疏水性氨基酸且结构中的亲水部分和疏水部分分区明显，因此具有独特的自组装特性，可通过反溶剂法制得纳米颗粒并用于封装疏水性物质。明胶亲水性强，在去离子水中表现为带弱负电的蛋白特性，其水溶液pH值基本在4.6-5.3之间，低于玉米醇溶蛋白的等电点，因而无需调节pH，使制备过程更加简单。玉米醇溶蛋白自组装颗粒带正电，明胶通过静电相互作用吸附在玉米醇溶蛋白颗粒表面。羧甲基淀粉是一种水溶性很好的阴离子多糖，可通过静电相互作用吸附到玉米醇溶蛋白/明胶纳米颗粒表面，得到负载槲皮素的玉米醇溶蛋白/明胶/羧甲基淀粉纳米颗粒。
本发明通过反复筛选，确定了明胶和羧甲基淀粉复合体系双重修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒，结果表明显著提高了药物包封率，提高了在不同pH环境下的稳定性以及抵抗热、紫外线以及长期贮藏的稳定性，体外模拟胃肠消化实验也证明生物可及性得到显著提高。这两种生物高分子还未见在类似的纳米体系使用过，二者联合使用更未见报道。
明胶是动物胶原经水解提炼得到的氨基酸与肽类交联形成的直链聚合物。作为天然蛋白的水解产物，明胶具有优良的生物相容性和生物降解性，而且价格低廉、易于获取，广泛用于感光材料、医药食品、日用化工等领域。明胶是由18种氨基酸组成的蛋白质大分子，分子中既含有阴离子官能团，又含有阳离子官能团，剩下的部分为疏水基官能团，三类基团的比例约为1：1：1，这种独特的结构造就了明胶具有各种优异的性能，如胶体保护性、成膜性、表面活性、凝胶与溶胶态可逆转变等，使其在食品和制药辅料等领域得以广泛应用。
明胶纳米颗粒可作为药物及基因递送载体用于缓控释和靶向释放，如输送各种亲水或疏水的抗癌药物，如甲氨蝶呤、阿糖胞苷、喜树碱、姜黄素、环己酰亚胺、阿霉素等，可增强这些物质的细胞摄取作用，从而改善药物治疗效果。然而，未进行交联处理制备的明胶纳米颗粒易发生聚集，因此通常需要交联以得到稳定性高的纳米颗粒，常用的交联剂主要有醛类、京尼平、碳化二亚胺、微生物转谷氨酰胺酶等。
本发明利用明胶这一天然的亲水性高分子，作为玉米醇溶蛋白纳米颗粒的第一层涂层，增加亲水性，减少玉米醇溶蛋白的疏水聚集性。然而，仍然存在蛋白质等电点附近的pH条件下的不稳定性。为此，在此基础上进行第二层涂层，采用阴离子多糖羧甲基淀粉。
羧甲基淀粉，又叫做羧甲基淀粉钠(CMS)，是一种水溶性的阴离子高分子化合物，价格便宜、生物相容性好、无毒、无味，易溶于水形成透明液体，对光、热皆稳定。食品级羧甲基淀粉广泛应用于牛奶、饮料、冷冻食品、快餐食品、糕点、糖浆等产品。羧甲基淀粉作为一种食品添加剂，可以使食物的口感更加黏稠，增加食用口感，还可以增加食品的稳定性，在食品加工过程中，可以使食品的保质期延长。此外，羧甲基淀粉在生理学上是惰性的，没有热值，因此可用来制造低热值的食品。羧甲基淀粉在医药方面的应用也相当广泛，就药物制剂而言，羧甲基淀粉可作为药用辅料、崩解剂和赋形剂等，用于制作胶囊、片剂、颗粒剂、缓控释制剂等。
正因为羧甲基淀粉具有如此优良的性质，本发明采用羧甲基淀粉作为第二层壳材料，以静电、氢键等作用与明胶和玉米醇溶蛋白相互作用，形成三元递送体系，显著提高槲皮素的稳定性、水溶性，此外，经研究发现，还能够显著提高槲皮素在水溶液中的抗氧化活性，以及生物利用度。羧甲基淀粉应用于天然活性成分的纳米载药体系的还较少，杜静以羧甲基淀粉和羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米复合物，用于对胰岛素的口服递送；Li等制备了羧甲基淀粉和盐酸壳聚糖复合纳米凝胶，用于姜黄素的递送，显示出强的pH敏感性；Leonida等用羧甲基淀粉和壳聚糖形成的聚电解质复合物，用于对乙酰氨基酚的结肠给药。据我们检索，还未发现明胶或羧甲基淀粉用于玉米醇溶蛋白纳米颗粒的稳定剂，二者合用更未见报道。
钙离子(Ca2+)具有多种生物学特性，可用于调节胶体复合物的性质。钙离子最常用于海藻酸钠体系，提高流变性能或调节质构，生成凝胶。本发明进一步加入一定浓度的钙离子，与纳米颗粒表面的阴离子多糖静电作用，形成纳米凝胶样结构，提高纳米粒子的稳定性，特别是盐浓度稳定性，并具有良好的缓释效果。
本发明的优点是：本发明针对玉米醇溶蛋白纳米颗粒不稳定、槲皮素包埋率不高以及槲皮素生物利用度低等问题，本发明提供了一种通过反溶剂法与层层静电堆积法相结合的方法，高效制备负载槲皮素的玉米醇溶蛋白/明胶/羧甲基淀粉的三元复合纳米颗粒，对经分析该纳米颗粒具有突出的pH稳定性，以及良好的热稳定性、光稳定性以及贮藏稳定性；此外，还具有很好的抗氧化活性以及生物利用度；本发明所提出的技术方案方法简单、操作安全、溶剂绿色、易于推广。
附图说明
图1为本发明实施例一制备的纳米颗粒透射电镜图；
图2为本发明实施例1～3制备的纳米颗粒分散液图片；
图3为不同处方下槲皮素在模拟胃肠消化液中的释放曲线；
图4为实施例1(Zein/Gel/CMS-Que，载药复合纳米颗粒)和实施例11(Zein/Gel/CMS-Que-Ca2+，钙离子修饰的载药复合纳米粒子)中槲皮素的释放曲线。
具体实施方式
以下实施例描述了本发明的方法，但并不限于此。通常遇到并且对本领域技术人员显而易见的对这些条件和参数的其他适宜修改和改变，都在本发明的精神和范围内。
实施例1
1、实验部分
(1)玉米醇溶蛋白和槲皮素乙醇溶液的制备
将0.6g玉米醇溶蛋白溶于30mL 80％乙醇水溶液中，然后按槲皮素：玉米醇溶蛋白的质量比1：10加入槲皮素，充分搅拌使之溶解。
(2)明胶溶液的配制
将20mg的明胶溶解于20mL去离子水中，40℃搅拌0.5h，然后室温搅拌0.5h，配制成1mg/mL的明胶溶液。
(3)负载槲皮素的明胶修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液的制备
取5mL步骤(1)中得到的槲皮素-玉米醇溶蛋白的乙醇溶液，缓慢滴加入(2)中得到的明胶溶液(体积20mL)，转速500转/分钟，时间20min。
(4)羧甲基淀粉溶液的配制
将50mg羧甲基淀粉溶解于25mL去离子水中，过夜搅拌，配制2mg/mL的羧甲基淀粉溶液。
(5)负载槲皮素的明胶-羧甲基淀粉双重修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液的制备
将(3)中得到的负载槲皮素的明胶修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒缓慢滴加入(4)中得到的羧甲基淀粉溶液，转速700转/分钟，时间30min。然后，在旋转蒸发仪上减压除去乙醇，体积用去离子水补足至50mL。即得到负载槲皮素的三元复合纳米颗粒分散液。
2、表征：
(1)使用英国马尔文动态光散射仪器检测，平均粒径172nm，PDI为0.18。
(2)槲皮素包封率采用如下方法：
新鲜制备的纳米颗粒分散液以12000rpm离心30min，取上清液用无水乙醇稀释至适当浓度。然后，使用紫外-可见分光光度计在373nm处测量稀释溶液的吸光度，以标准曲线y＝0.1077x+0.0056(R2＝0.9998)计算槲皮素的浓度，槲皮素包封率如下式计算：
包封率(EE)＝(槲皮素总量-游离的槲皮素量)/槲皮素总量×100％
经检测，槲皮素包封率为91.6％。
用透射电镜观察纳米颗粒的形貌。将稀释的纳米粒子分散液滴到覆膜铜网上，几分钟后，用滤纸从侧面吸出多余的液体，并自然干燥。使用透射电子显微镜(JEM-1400Flash，Japan)在120kV的加速电压下观察和拍摄样品的形貌，如图1所示。
3、作为对比试验，我们同样采用反溶剂法，制备了负载槲皮素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液，具体步骤如下：
负载槲皮素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液的制备：取5mL实验部分步骤(1)得到的槲皮素-玉米醇溶蛋白的乙醇溶液，缓慢滴加入20mL去离子水中(pH调至4.0～5.0)，搅拌转速500转/分钟，时间20min。然后，在旋转蒸发仪上减压除去乙醇，体积用去离子水补足到25mL。使用英国马尔文动态光散射仪器检测，平均粒径89nm，PDI为0.19，槲皮素包封率59.4％。
由实验部分步骤(3)得到的负载槲皮素的明胶修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒：经分析检测，平均粒径145nm，PDI为0.22，槲皮素包封率72.2％。
综上所述，从负载槲皮素的三元复合纳米颗粒与二元复合纳米颗粒、玉米醇溶蛋白纳米颗粒相比较可知，粒径有所增加，对槲皮素的包封率大幅度提高。
实施例2
(1)玉米醇溶蛋白和槲皮素乙醇溶液的制备
将0.6g玉米醇溶蛋白溶于30mL 80％乙醇水溶液中，然后按槲皮素：玉米醇溶蛋白的质量比1：15加入槲皮素，充分搅拌使之溶解。
(2)明胶溶液的配制
将30mg的明胶溶解于20mL去离子水中，40℃搅拌0.5h，然后室温搅拌0.5h，配制成1.5mg/mL的明胶溶液。
(3)负载槲皮素的明胶修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液的制备
取5mL步骤(1)中得到的槲皮素-玉米醇溶蛋白的乙醇溶液，缓慢滴加入(2)中得到的明胶溶液(体积20mL)，转速500转/分钟，时间20min。
(4)羧甲基淀粉溶液的配制
将80mg羧甲基淀粉溶解于25mL去离子水中，过夜搅拌，配制3.2mg/mL的羧甲基淀粉溶液。
(5)负载槲皮素的明胶-羧甲基淀粉双重修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液的制备
将(3)中得到的负载槲皮素的明胶修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒缓慢滴加入(4)中得到的羧甲基淀粉溶液，转速700转/分钟，时间45min。然后，在旋转蒸发仪上减压除去乙醇，体积用去离子水补足到50mL，即得到负载槲皮素的三元复合纳米颗粒分散液。经分析检测，平均粒径181nm，PDI为0.20，槲皮素包封率94.2％。
实施例3
(1)玉米醇溶蛋白和槲皮素乙醇溶液的制备
将0.6g玉米醇溶蛋白溶于30mL 80％乙醇水溶液中，然后按槲皮素：玉米醇溶蛋白的质量比1：15加入槲皮素，充分搅拌使之溶解。
(2)明胶溶液的配制
将25mg的明胶溶解于20mL去离子水中，40℃搅拌0.5h，然后室温搅拌0.5h，配制成1.25mg/mL的明胶溶液。
(3)负载槲皮素的明胶修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液的制备
取5mL步骤(1)中得到的槲皮素-玉米醇溶蛋白的乙醇溶液，缓慢滴加入(2)中得到的明胶溶液(体积20mL)，转速500转/分钟，时间20min。
(4)羧甲基淀粉溶液的配制
将120mg羧甲基淀粉溶解于25mL去离子水中，过夜搅拌，配制4.8mg/mL的羧甲基淀粉溶液。
(5)负载槲皮素的明胶-羧甲基淀粉双重修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液的制备
将(3)中得到的负载槲皮素的明胶修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒缓慢滴加入(4)中得到的羧甲基淀粉溶液，转速700转/分钟，时间60min。然后，在旋转蒸发仪上减压除去乙醇，体积用去离子水补足到50mL。即得到负载槲皮素的三元复合纳米颗粒分散液。如图2所示，经分析检测，平均粒径186nm，PDI为0.21，槲皮素包封率96.1％。
实施例4
热稳定性实验
取实施例1～3制备的纳米颗粒分散液在四个不同温度(40℃、60℃、80℃和100℃)的水浴中孵育0.5小时，然后冷却至室温。测定了样品的粒径和槲皮素的保留率。以负载槲皮素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液(Zein-Que NPs)为对照。
槲皮素的保留率＝处理后纳米颗粒中的槲皮素含量/处理前的纳米颗粒中的槲皮素含量
表1热稳定性实验结果
由表1可看出，实施例1、实施例2和实施例3制备的三元复合纳米颗粒分散液，在不同的温度下，无论是纳米颗粒大小以及药物的包封率，都表现出良好的稳定性。处理温度升高，稳定性仅有少量下降。
而负载槲皮素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液(Zein-Que NPs)，随着温度升高，粒径明显变大，而且负载的药物量也显著下降。
实施例5
pH稳定性实验
取实施例1～3制备的纳米颗粒分散液，用1MHCl或1MNaOH调节至不同的pH。然后，用动态光散射仪器检测粒径变化。以负载槲皮素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液(Zein-Que NPs)为对照。
表2pH稳定性实验结果
由表2可看出，实施例1、实施例2和实施例3制备的三元复合纳米颗粒分散液，在pH从2到8的整个范围内，一直稳定性很好。只是在pH2和3时，粒径有少量增加，但没有观察到任何聚集和沉淀现象。
而负载槲皮素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液(Zein-Que NPs)，在pH为5-6时，粒径很大，有大量聚集，稳定性差。而这一pH正好是蛋白的等电点，表明在等电点附近的pH条件下玉米醇溶蛋白纳米颗粒的稳定性差。
实施例6
光稳定性实验
取实施例1～3制备的纳米颗粒分散液，放置在紫外灯下(363nm，30W)照射2h。在不同时间点，0.5h、1h、1.5h、2h分别取样检测其中的槲皮素含量，计算槲皮素保留率。以负载槲皮素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液(Zein-Que NPs)以及未包封的槲皮素乙醇溶液为对照。
槲皮素的保留率＝处理特定时间的纳米颗粒中的槲皮素含量/处理前的纳米颗粒中的槲皮素含量
表3光稳定性实验结果
由上表3可看出，实施例1、实施例2和实施例3制备的三元复合纳米颗粒分散液，光稳定性很好，药物包封率没有明显下降。
而负载槲皮素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液(Zein-Que NPs)，随着光照时间的延长，药物包封率有一定幅度的下降，光照2h药物保留率为82％。未包封的槲皮素乙醇溶液，光稳定性最差，药物包封率显著下降，光照2h药物保留率仅为61％。
实施例7
贮藏稳定性实验
取实施例1制备的负载槲皮素的三元纳米颗粒分散液，在4℃贮藏一个月，取样检测粒径以及其中的槲皮素含量，计算槲皮素保留率。粒径由172nm增加到185nm，槲皮素保留率为91％。
取实施例2制备的负载槲皮素的三元纳米颗粒分散液，在4℃贮藏一个月，取样检测粒径以及其中的槲皮素含量，计算槲皮素保留率。粒径由181nm增加到188nm，槲皮素保留率为93％。
取实施例3制备的负载槲皮素的三元纳米颗粒分散液，在4℃贮藏一个月，取样检测粒径以及其中的槲皮素含量，计算槲皮素保留率。粒径由186nm增加到201nm，槲皮素保留率为94％。
以负载槲皮素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液(Zein-Que NPs)为对照，粒径由90nm增加到140nm，槲皮素保留率为72％。
实施例8
DPPH自由基清除活性实验
将4mL样品与4mL DPPH溶液(0.1mM，95％乙醇)混合均匀，并将混合物在室温下避光孵育30分钟。使用紫外-可见分光光度计测量混合物在517nm处的吸光度，吸光度值记为As。将4mL H2O和4mL DPPH的混合物的吸光度值记为Ac，将4mL样品和4mL 95％乙醇的混合物的吸光度值记为A0。DPPH自由基清除活性计算如下：
经分析，实施例1、实施例2、，实施例3制备的负载槲皮素的三元纳米颗粒的DPPH自由基清除率分别为91％、93％和92％，而负载槲皮素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液(Zein-Que NPs)的DPPH自由基清除率为85％，同浓度的槲皮素乙醇溶液的DPPH自由基清除率为83％。
实施例9
ABTS自由基清除活性实验
将ABTS水溶液(7.4mM)和过硫酸钾溶液(2.6mM)以等体积混合，并将混合物在室温下避光放置14小时。然后用PBS(10mM，pH 7.4)稀释，使其在734nm处的吸光值为0.70±0.02，即得ABTS工作液。将40μL样品加入到4mL新制备的ABTS工作液，混合溶液避光反应5分钟。使用紫外-可见分光光度计在734nm处测量溶液的吸光度，吸光度值记为As。Ac是40μLPBS(10mM，pH7.4)和4mL ABTS工作液的混合物在734nm处的吸光度值。ABTS自由基清除活性计算如下：
经分析，实施例1、实施例2、实施例3制备的负载槲皮素的三元纳米颗粒的ABTS自由基清除率为80％、88％、82％，而负载槲皮素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液(Zein-QueNPs)的ABTS自由基清除率为72％，同浓度的槲皮素乙醇溶液的DPPH自由基清除率为67％。
从实施例8和实施例9可以看出，负载槲皮素的玉米醇溶蛋白/明胶/羧甲基淀粉三元纳米颗粒的抗氧化活性高于负载槲皮素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒，也高于槲皮素乙醇溶液。槲皮素是一种亲脂性的天然活性成分，抗氧化活性较高，但由于在水中溶解度很低，造成其水体系的自由基清除活性很低，据文献报道低于30％(Li H,et al.Fabrication ofstable zein nanoparticles coated with soluble soybean polysaccharide forencapsulation of quercetin.Food Hydrocolloids,2019,87,342-351)。通过纳米颗粒载药体系可显著提升脂溶性活性成分在水溶液中的抗氧化性能。
实施例10
体外模拟胃肠消化实验
分别配制体外模拟胃液(SGF)和体外模拟肠液(SIF)。具体配方为：体外模拟胃液：2g/L氯化钠、3.2g/L胃蛋白酶，盐酸调节pH至1.2。体外模拟肠液：1.2mM氯化钙、15mM氯化钠、4.76g/L胰酶、5.16g/L胆汁盐，氢氧化钠(0.1M)调节pH至7.0。
取25mL负载槲皮素的纳米颗粒分散液(实施例1、实施例2)与同体积的模拟胃液混合均匀，将pH值调节至2.0，然后在37℃的摇床内中孵育2h。之后，将体系的pH调至7.4，与50mL的模拟肠液混合，并再孵育4h。在整个孵育过程中，在一定的时间点，取出适量的样品溶液，并补充同体积的模拟胃液或模拟肠液。通过测定不同时间点的样品中槲皮素浓度，计算释放率。
按下述公式，计算生物可及性：
C表示的是模拟胃肠消化后肠消化液中槲皮素的含量，Co表示模拟胃肠道消化前纳米颗粒分散体(或游离槲皮素样品)中槲皮素的含量。
图3中，Que为槲皮素乙醇溶液，Zein-Que为负载槲皮素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒。从图3可以看出纳米颗粒包裹以后，槲皮素在胃肠道消化液中的含量持续增加，实施例1和实施例2的三元纳米颗粒体系释放量要高于玉米醇溶蛋白负载的纳米颗粒，而槲皮素乙醇溶液的释放量很低，可能是由于槲皮素水溶性很差，形成了沉淀，难以在消化液中被检测出来，而且由于槲皮素在模拟胃肠道消化液中的稳定性较差，可能发生了分解破坏，造成槲皮素在模拟消化液中含量一直较低。而纳米颗粒包裹就可以很好的保护槲皮素，并增加槲皮素水溶性，从而达到提高生物可及度的效果。根据在模拟胃肠中的释放量，计算生物可及性，实施例1和实施例2的生物可及性为57.1％和52.1％，负载槲皮素玉米醇溶蛋白纳米颗粒的生物可及性为42.8％，槲皮素乙醇溶液的生物可及性只有24.8％。
实施例11
向实施例1得到的负载槲皮素的明胶-羧甲基淀粉双重修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液中，在搅拌下，加入0.2mL一定浓度的氯化钙溶液，使得混合体系的最终钙离子浓度在0.5mM，继续搅拌1h。在3000rpm下离心10分钟以除去大颗粒，得到钙离子修饰的载药复合纳米粒子。
经分析检测，粒径为264nm，槲皮素的包封率92％。
稳定性考察
热稳定性：取本实施例制备的样品，在80℃水浴中孵育0.5小时，然后冷却至室温。测定了样品的粒径和槲皮素的保留率。粒径保持不变，槲皮素的保留率达99％。
光稳定性：取本实施例制备的样品，放置在紫外灯下(363nm，30W)照射2h。槲皮素的保留率达97％。
贮藏稳定性：取本实施例制备的样品，在4℃贮藏一个月，取样检测粒径以及其中的槲皮素含量，计算槲皮素保留率。粒径为272nm，槲皮素的保留率94％。
盐稳定性：将不同量的NaCl固体直接添加到本实施例制备的样品中，磁力搅拌(500rpm)5分钟，使溶液中的NaCl浓度为0-40mM。所有样品在25℃下放置24小时后，对溶液中的纳米粒子的粒径变化情况进行测定。
当NaCl浓度从10mM到80mM，本实施例制备的钙离子修饰载药复合纳米粒子体系都能保持很好的稳定性，没有沉淀出现，粒径只是轻微增加。NaCl浓度80mM时，粒径为283nm。作为对比，实施例1得到的负载槲皮素的明胶-羧甲基淀粉双重修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液，NaCl浓度30mM时，粒径增大50％；当NaCl浓度为50mM时，体系变得十分浑浊并且出现了沉淀，这可能是由于NaCl破坏了纳米粒子间的静电斥力，从而导致了溶液的不稳定。结果表明，Ca2+的引入提高了复合纳米粒子的离子稳定性。
缓释实验：
按实施例10配制体外模拟胃液和肠液，将25mL新制备的分散体与25mL模拟胃液混合，调节混合溶液的pH至1.5。然后将混合溶液置于37℃摇床中孵育，以120rpm的速率振摇120分钟。将上述溶液与50mL模拟肠液进行混合，调节pH至7.4，继续孵育240分钟。在整个模拟消化的实验中，每隔30分钟进行取样，并用对应的模拟消化液进行补充。对取出的样液以12000rpm离心10分钟，然后用0.45μm的微孔滤膜进行过滤得到上清液，按实施例1中所述方法测定槲皮素的释放量。
由图4看出，加入了Ca2+制得的纳米粒子分散体在模拟胃肠中能减缓槲皮素的释放速度，表明Ca2+的加入可能改变了复合纳米粒子的结构，在表面形成类似凝胶样的结构，从而增强了其对模拟胃肠液的抵抗力，提高了缓释效果。

Claims (8)

1.一种负载槲皮素的蛋白-多糖三元复合纳米颗粒，其特征在于：以玉米醇溶蛋白包裹槲皮素为核，以明胶和羧甲基淀粉组装成壳，构建成具有核壳结构的递送槲皮素的复合纳米颗粒。
2.一种负载槲皮素的蛋白-多糖三元复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
（1）槲皮素-玉米醇溶蛋白的乙醇溶液的制备
将0.6 g玉米醇溶蛋白溶于30 mL 80%乙醇水溶液中，然后按槲皮素：玉米醇溶蛋白的质量比1:5 –1:30加入槲皮素，充分搅拌使之溶解，得到槲皮素-玉米醇溶蛋白的乙醇溶液；
（2）明胶溶液的配制
将一定量的明胶溶解于20mL去离子水中，40 °C搅拌0.5 h，然后室温搅拌0.5 h，配制成一定浓度的明胶溶液，明胶的质量为12.5mg-100mg；
（3）负载槲皮素的明胶修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液的制备
取5mL步骤（1）中得到的槲皮素-玉米醇溶蛋白的乙醇溶液，缓慢滴加入（2）中得到的20mL明胶溶液中，搅拌速度400-1000转/分钟，时间10-60min；
（4）羧甲基淀粉溶液的配制
将一定量的羧甲基淀粉溶解于25mL去离子水中，过夜搅拌，配制一定浓度的羧甲基淀粉溶液，羧甲基淀粉的质量为25mg-200mg；
（5）负载槲皮素的明胶-羧甲基淀粉双重修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液的制备
将（3）中得到的负载槲皮素的明胶修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液缓慢滴加入（4）中得到的羧甲基淀粉溶液中，搅拌速度400-1000转/分钟，时间30-120min，然后，在旋转蒸发仪上减压除去乙醇，体积用去离子水补足至50mL，即得到负载槲皮素的明胶-羧甲基淀粉双重修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液。
3.根据权利要求2所述的一种负载槲皮素的蛋白-多糖三元复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：将步骤（5）中得到的负载槲皮素的明胶-羧甲基淀粉双重修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液，经冷冻干燥，得到负载槲皮素的蛋白-多糖三元复合纳米颗粒。
4.根据权利要求2所述的一种负载槲皮素的蛋白-多糖三元复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的槲皮素与玉米醇溶蛋白的质量比为1:5-1:20；步骤（2）所述的明胶的质量为20mg-50mg；步骤（4）所述的羧甲基淀粉的质量为50mg-150mg。
5.根据权利要求2所述的一种负载槲皮素的蛋白-多糖三元复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的搅拌速度为500-600转/分钟，时间10-30min；步骤（5）所述的搅拌速度为500-800转/分钟，时间30-60min。
6.一种负载槲皮素的蛋白-多糖三元复合纳米颗粒在制备抗氧化的药物以及在功能性食品中的应用。
7.一种钙离子修饰的载药复合纳米粒子制备方法，其特征在于：搅拌所述的负载槲皮素的明胶-羧甲基淀粉双重修饰玉米醇溶蛋白纳米颗粒分散液，在搅拌的同时加入0.1~1mL的氯化钙溶液，使得混合体系的最终钙离子浓度在0.15mM~1.5mM，继续搅拌0.5~2h；在3000rpm下离心10分钟以除去大颗粒，得到钙离子修饰的载药复合纳米粒子。
8.一种钙离子修饰的载药复合纳米粒子在制备抗氧化的药物以及在功能性食品中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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