CN118028436B

CN118028436B - 一种裂解液及检测生物样本中核酸的试剂盒和方法

Info

Publication number: CN118028436B
Application number: CN202410205820.8A
Authority: CN
Inventors: 谈忠鸣; 周璐; 程晓庆; 聂俊伟; 鲍倡俊
Original assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd; Jiangsu Center For Disease Control And Prevention (jiangsu Institute Of Public Health)
Current assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd; Jiangsu Center For Disease Control And Prevention (jiangsu Institute Of Public Health)
Priority date: 2024-02-26
Filing date: 2024-02-26
Publication date: 2025-02-07
Anticipated expiration: 2044-02-26
Also published as: CN118028436A

Abstract

本公开提供一种裂解液及检测生物样本中核酸的试剂盒和方法，通过向裂解液中添加适量的Sr²⁺，提高了LAMP扩增中，含多糖组分的核酸样本及粘性生物样本中核酸的检测灵敏度和检出率，有利于提高含多糖组分的核酸样本或粘性生物样本中核酸检测效率。

Description

一种裂解液及检测生物样本中核酸的试剂盒和方法

技术领域

本公开涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种裂解液及检测生物样本中核酸的试剂盒和方法。

背景技术

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）基于链置换DNA聚合酶和特殊的引物设计，可在恒温下（通常在60-65℃）进行多轮扩增，短时间内产生大量的目标DNA。与常规的PCR相比，LAMP具有更高的灵敏度和扩增效率，对于低浓度样本的检测准确度更高；且由于LAMP体系中四条引物特异性靶向预扩增DNA序列中六段区域，因此扩增过程中不受非靶标DNA的影响，具有更高特异性；此外，LAMP无需经过模板的热变性、温度循环、电泳等过程，不依赖于精密热循环仪和其他复杂的仪器设备，能极大节约成本和时间，易于在资源匮乏的基层推广应用，且适用于现场快速检测。

目前，LAMP技术作为一种快速、灵敏且特异性高的核酸扩增方法，已被广泛用于生物医药、环境、水质监测、食品安全等领域。LAMP检测中，不需要专门提取DNA，直接利用细胞裂解液即可进行扩增、检测，然而，在针对粘性生物样本（例如口腔拭子）的检测过程中，由于有多糖成分的存在，会对LAMP扩增过程产生抑制作用，从而降低了LAMP检测的灵敏度和检出率。因此，需要开发一种能够提高粘性生物样本中核酸检测效率的方法。

发明内容

为实现上述目的，本公开提供如下技术方案：

一方面，本公开提供一种检测生物样本中核酸的方法，包括：（1）利用裂解液释放粘性生物样本或多糖样本中的核酸，得到样本裂解液；（2）取样本裂解液进行LAMP扩增反应；其中，所述裂解液中包含Sr²⁺。在一些实施方案中，所述生物样本为包含多糖的生物样本。在一些实施方案中，进一步的，所述样本为粘性生物样本。在一些实施方案中，所述样本为口腔拭子生物样本。在一些实施方案中，所述多糖包括硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，所述样本裂解液中目标核酸的浓度选自0.02-2 pg/μL，优选自0.05 pg/μL、0.1 pg/μL、0.2pg/μL、0.3 pg/μL、0.4 pg/μL、0.5 pg/μL、0.6 pg/μL、0.7 pg/μL、0.8 pg/μL、0.9 pg/μL、1.0 pg/μL、1.1 pg/μL、1.2 pg/μL、1.3 pg/μL、1.4 pg/μL、1.5 pg/μL、1.6 pg/μL、1.7 pg/μL、1.8 pg/μL、1.9 pg/μL。

在一些实施方案中，所述裂解液中Sr²⁺的浓度可选自0.5-100 mM，优选为0.5-50mM；更优选为0.5-25 mM。在一些实施方案中，所述Sr²⁺的浓度可选自0.5 mM、1 mM、5 mM、10mM、15 mM、20 mM或25 mM。在一些实施方案中，所述裂解液中的Sr²⁺为添加SrCl₂后产生的。

在一些实施方案中，所述裂解液中还包含缓冲组分、表面活性剂、稳定剂、螯合剂等。

在一些实施方案中，所述缓冲组分为Tris，Tris的浓度为5-50 mM，优选为10-20mM，更优选为10 mM。

在一些实施方案中，所述表面活性剂包括但不限于吐温20、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）、十二烷基磺酸钠、十二烷基肌氨酸钠、十二烷基硫酸锂中的至少一种。优选为SDS，所述SDS的质量分数为0.5-10%，优选为1-5%，更优选为1%。

在一些实施方案中，所述稳定剂包括非离子表面活性剂和/或氨基酸，其中，非离子表面活性剂可选自PEG200、PEG2000、PEG400、PEG4000、PEG800、PEG8000等；氨基酸可选自甘氨酸、赖氨酸等。在一些实施方案中，所述螯合剂可选自EGTA、EDTA·2Na、EDTA·4Na、EDTA、柠檬酸钠、EGTA、HEDTA中的至少一种。优选为非离子表面活性剂PEG200，所述PEG200的质量分数为1-10%，优选为1-5%，更优选为2%。

在一些实施方案中，所述螯合剂优选为EDTA，所述EDTA的浓度为0.5-10 mM的EDTA，优选为1-5 mM，更优选为1 mM。

在一些实施方案中，所述裂解液的pH值为7.0-9.0；优选的裂解液pH值为7.0。

在一些实施方案中，所述裂解液pH值为7.0-9.0，包含5-50 mM的Tris、0.5-10 mM的EDTA、0.5-10 w/v %的SDS、1-10 w/v %的PEG200，以及0.5-100 mM的Sr²⁺。在一些实施方案中，所述裂解液pH为7.0，包含10 mM的Tris、1 mM的EDTA、1 w/v %的SDS、2 w/v %的PEG200，以及0.5-100 mM的Sr²⁺。在一些实施方案中，裂解液中Sr²⁺浓度优选为0.5-50 mM；更优选为0.5-25 mM。在一些实施方案中，所述Sr²⁺的浓度可选自0.5 mM、1 mM、5 mM、10 mM、15 mM、20 mM或25 mM。

在一些实施方案中，所述LAMP扩增反应的扩增体系包含缓冲液、MgSO₄、dNTP、BstDNA聚合酶、引物组及荧光指示剂。在一些实施方案中，在扩增体系中，所述MgSO₄的终浓度为2-10 mM；所述dNTP的终浓度为1-2 mM；所述Bst DNA聚合酶的终浓度为0.16-0.48 U/μL。在一些实施方案中，扩增体系中还包含灭菌无酶水。在一些实施方案中，所述缓冲液中包含Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄及Triton X-100。

在一些实施方案中，所述荧光指示剂可选自羟基萘酚蓝(HNB)、钙黄绿素、SYBRGreen、EvaGreen、Syto等。在一些实施方案中，所述荧光指示剂优选为Syto。

在一些实施方式中，所述引物组为针对目标核酸序列设计的特异性LAMP引物组，包含一对外引物F3/B3、一对内引物FIP/BIP、可选的还包含环引物LoopF和/或LoopB。在一些实施方案中，所述扩增体系中F3/B3引物对的浓度为0.1~0.4 μM，所述FIP/BIP引物对的浓度为0.8~3.2 μM。在一些实施方案中，所述LoopF和/或LoopB引物对的浓度为0.4~1.6 μM。其中“引物对的浓度”是指引物对中每条引物的浓度。

在一些实施方案中，所述LAMP反应的扩增体系包含1×缓冲液、8 mM MgSO₄、1.6 μM FIP/BIP引物对、0.2 μM F3/B3引物对、0.8 μM LoopB引物、1.4 mM dNTP、Syto染料和0.32 U/μL Bst DNA聚合酶。在一些实施方案中，所述1×缓冲液的pH为7.0-9.0，包含10-30mM Tris-HCl、50-150 mM KCl、5-20 mM (NH₄)₂SO₄、1-5 mM MgSO₄及1-3 w/v % Triton X-100。在一些实施方案中，所述1×缓冲液的pH为8.8，包含20 mM Tris-HCl、100 mM KCl、10mM (NH₄)₂SO₄、2 mM MgSO₄及1 w/v % Triton X-100。

本公开所述的粘性生物样本是指源自于生物体中，包含大量的多糖成分的样本。在一些实施方案中，所述粘性生物样本为痰液、宫颈粘液、鼻咽拭子、口腔拭子、生殖器拭子、灌洗液等，优选为口腔拭子生物样本。

在一些实施方案中，本公开所述的方法可用于微量核酸成分样本的检测。在一些实施方案中，所述扩增体系中加入的目标核酸浓度为0.004-0.4 pg/μL。在一些实施方案中，所述扩增体系中加入的目标核酸浓度为0.004-0.4 pg/μL。

另一方面，本公开还提供一种裂解液，包含Sr²⁺。在一些实施方案中，Sr²⁺的浓度可选自0.5-100 mM；优选为0.5-50 mM；更优选为0.5-25 mM。在一些实施方案中，所述Sr²⁺的浓度可选自0.5 mM、1 mM、5 mM、10 mM、15 mM、20 mM或25 mM。在一些实施方案中，所述裂解液中的Sr²⁺为添加SrCl₂后产生的。

在一些实施方案中，所述裂解液适用于含有多糖成分的生物样本。在一些实施方案中，所述多糖包括硫酸葡聚糖。在一些实施方案中，所述裂解液适用于粘性生物样本，所述生物样本优选为痰液、宫颈粘液、鼻咽拭子、口腔拭子、生殖器拭子、灌洗液等生物样本，更优选为口腔拭子生物样本。

在一些实施方案中，所述裂解液还包含缓冲组分、表面活性剂、稳定剂、螯合剂等。

在一些实施方案中，所述裂解液pH为7.0-9.0，包含0.5-50 mM的Tris、0.5-10 mM的EDTA、0.5-10 w/v %的SDS、1-10 w/v %的PEG200以及0.5-100 mM的Sr²⁺。在一些实施方案中，所述裂解液pH为7.0，包含10 mM的Tris、1 mM的EDTA、1 w/v %的SDS、2 w/v %的PEG200以及0.5-100 mM的Sr²⁺。在一些实施方案中，所述Sr²⁺的浓度优选为0.5-50 mM；更优选为0.5-25 mM。在一些实施方案中，所述Sr²⁺的浓度可选自0.5 mM、1 mM、5 mM、10 mM、15 mM、20mM或25 mM。在一些实施方案中，所述Sr²⁺为添加SrCl₂后产生的。

另一方面，本公开还提供一种检测生物样本中核酸的试剂盒，包含：1）如本公开所述的样本裂解液：和2）LAMP扩增体系。在一些实施方案中，所述LAMP扩增体系包含一种或多种缓方案中，所述LAMP扩增体系包含1×缓冲液（pH为7.0-9.0，包含10-30 mM Tris-HCl、50-150 mM KCl、5-20 mM (NH₄)₂SO₄、1-5 mM MgSO₄及1-3 w/v % Triton X-100）、8 mMMgSO₄、1.6 μM FIP/BIP引物对、0.2 μM F3/B3引物对、0.8 μM LoopB引物、1.4 mM dNTP、Syto染料及0.32 U/μL Bst DNA聚合酶。本发明的方法、裂解液或扩增组合物用于提高LAMP扩增中，粘性生物样本中核酸的检测灵敏度和检出率，实现对低载量核酸样本的检测，提高粘性生物样本中核酸检测效率。

有益效果

本公开提供了能提高粘性生物样本中核酸检测效率的方法及其应用，通过向裂解液中添加适量的SrCl₂，减少样本中的多糖组分对扩增反应的抑制，提高LAMP扩增中，粘性生物样本中核酸的检测灵敏度和检出率，实现对低载量核酸样本的检测。

附图说明

图1A-图1B为SrCl₂对Bst酶活性的影响；

图2为SrCl₂对LAMP扩增反应的影响；

图3A-图3C为SrCl₂对含多糖的核酸样本LAMP扩增反应的影响；

图4A-图4C为口腔拭子样本的LAMP扩增反应。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步说明本公开的技术方案。但是，下述实施例仅仅是本公开的示例，并不代表或限制本公开的保护范围。本公开的保护范围以权利要求书为准。在以下实施例中，若无特别说明，所用试剂和耗材均购自本领域普通供应商，所用实验方法和技术手段均为本领域常规方法和手段。

实施例1 SrCl₂对LAMP扩增反应的影响

1.1 SrCl₂对Bst酶活性影响：

（1）引物设计筛选：设计测试Bst酶活的荧光基团和淬灭基团修饰的序列：

5’ FAM-Template序列（SEQ ID NO：1）：CGACGTGTCTGCGGCTCTACCATATCTCCTATGAGCAACGTGTTAGCAGAGCCAAGCCACAACTC

3’ BHQ1-Reporter序列（SEQ ID NO：2）：TGCTCATAGGAGATATGGTAGAGCCGCAGACACGTCG

Cold primer DNA序列（SEQ ID NO：3）：

GAGTTGTGGCTTGGCTCTGCTAACACG。

（2）按照表2配制Bst酶活性测试反应体系：

表1

（3）混匀后在qPCR仪中65℃扩增60 min，每1 min采集一次荧光信号。

检测结果见图1A，荧光曲线的斜率与Bst酶活性正相关，Bst酶活性随SrCl₂（1 mM-5 mM）的增加而降低。

1.2 粘性生物样本裂解液中的SrCl₂对Bst酶活性的影响

（1）引物设计筛选：参考1.1中的步骤（1）。

（2）口腔拭子样本准备：取拭子刮取口腔样本，置于400 μL裂解液(pH 7.0、10 mM的Tris、1 mM的EDTA、SrCl2、1 w/v %的SDS、和2 w/v %的PEG200)中，其中，裂解液中SrCl2的浓度分别为0 mM、0.5 mM、5 mM、50 mM、100 mM的SrCl₂，室温裂解5 min，制成口腔拭子裂解样本。对照为裂解液或Nuclease-free ddH₂O。

（3）按照表2配制Bst酶活性测试反应体系：

表2

（4）混匀后在qPCR仪中65℃扩增60 min，1 min采集一次荧光信号。

检测结果见图1B，荧光曲线的斜率与Bst酶活性正相关。

1.3 SrCl₂对LAMP扩增反应的影响

（1）引物设计筛选：根据SA-GAPA1基因序列设计合成LAMP引物。

FIP（SEQ ID NO：4）：

GTGAAACGACCTTGCATAGTGTCGTAAACGACTTAACAGATGACG

BIP（SEQ ID NO：5）：

GGTGAAGTAGAGGTAGTTGATGGTATTTGCTTGCATCTGGTTC

F3（SEQ ID NO：6）：

GAAGGTCTTGAAGTTGTAGC

B3（SEQ ID NO：7）：

CATCGATATTTAAGTCTTTCCAAG

LoopB（SEQ ID NO：8）：

GTTTCCGCGTAAATGGTAAAGAAGT

（2）按照表3配制LAMP反应体系：

表3

检测结果见图2，1-5 mM的SrCl₂对较高浓度（10 pg/rxn）核酸的LAMP扩增反应无明显影响，但在低浓度（1或0.1 pg/rxn）核酸的扩增过程中，5 mM的SrCl₂对LAMP扩增反应有明显的抑制作用。

实施例2 SrCl₂促进含多糖样本的LAMP扩增反应

（1）引物设计筛选：根据SA-GAPA1基因序列设计合成LAMP引物，参考实施例1中1.3的步骤（1）。

（2）按照表4配制LAMP反应体系：

表4

检测结果见图3A-3C，在含有多糖（0.1%硫酸葡萄糖）的样本中，1和5 mM的SrCl₂均能有效提高LAMP反应的扩增效率和目的核酸检出率。

实施例3 粘性生物样本（口腔拭子）的LAMP扩增反应

（2）口腔拭子样本准备：取拭子刮取口腔样本，置于400 μL裂解液（pH 7.0、10 mM的Tris、1 mM的EDTA、SrCl2、1 w/v %的SDS、和2 w/v %的PEG200）中，其中，裂解液中SrCl₂的浓度分别为0 mM、5 mM、25 mM，室温裂解5 min，制成口腔拭子裂解样本。以空白拭子裂解样本（0 mM SrCl₂）作为对照组，即裂解液对照。

（3）按照表5配制LAMP反应体系：

表5

（4）混匀后在qPCR仪中65℃扩增60 min，每1 min采集一次荧光信号。

检测结果见图4A-4C，用含有5 mM或25 mM SrCl₂的裂解液裂解口腔拭子样本后，能有效提高裂解样本在LAMP检测反应中的扩增效率和目的核酸检出率。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术方案作任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测生物样本中核酸的方法，包括：

（1）利用裂解液释放粘性生物样本中的核酸，得到样本裂解液；（2）取样本裂解液进行LAMP扩增反应；其特征在于，所述裂解液中包含Sr²⁺；

所述裂解液中Sr²⁺的浓度为0.5-25mM；

所述裂解液中的Sr²⁺为添加SrCl₂后产生的；

所述裂解液中还包含缓冲组分、表面活性剂、稳定剂和螯合剂；所述缓冲组分为5-50mM的Tris；所述表面活性剂为0.5-10w/v%的SDS；所述稳定剂为1-10w/v%的PEG200；所述螯合剂为0.5-10mM的EDTA，所述裂解液的pH为7.0-9.0。

2.如权利要求1所述的方法，所述粘性生物样本选自痰液、宫颈粘液、鼻咽拭子、口腔拭子、生殖器拭子或灌洗液。

3.一种裂解液，其特征在于，包含Sr²⁺，所述Sr²⁺的浓度选自0.5-25mM，所述裂解液中的Sr²⁺为添加SrCl₂后产生的；

所述裂解液中还包含缓冲组分、表面活性剂、稳定剂和螯合剂；

所述缓冲组分为5-50mM的Tris；所述表面活性剂为0.5-10w/v%的SDS；所述稳定剂为1-10w/v%的PEG200；所述螯合剂为0.5-10mM的EDTA，所述裂解液的pH为7.0-9.0。

4.一种检测生物样本中核酸的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求3所述的裂解液。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括LAMP扩增体系。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP扩增反应体系包含1×缓冲液、MgSO4、dNTP、Bst DNA聚合酶、引物组及荧光指示剂。