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CN118019842A - 靶向gd2的通用型car-t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

靶向gd2的通用型car-t细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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CN118019842A
CN118019842A CN202280046726.1A CN202280046726A CN118019842A CN 118019842 A CN118019842 A CN 118019842A CN 202280046726 A CN202280046726 A CN 202280046726A CN 118019842 A CN118019842 A CN 118019842A
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CN
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hla
immune effector
cells
seq
gene
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Application number
CN202280046726.1A
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尚小云
李甲璐
蒋海娟
王丹
马少文
马丽
李博
沈慧
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Ningbo Maoxing Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Ningbo Maoxing Biomedical Technology Co ltd
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Publication date
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Abstract

一种经修饰的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞中的T细胞抗原受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHCI，MHCII)在T细胞中的功能受到抑制，且所述经修饰的免疫效应细胞包含靶向GD2的嵌合抗原受体(CAR)。经修饰的免疫效应细胞，识别肿瘤细胞表面抗原的同时，敲除细胞表达的TCR和HLA‑A基因，达到提高CAR‑T细胞的抗肿瘤作用，延长细胞存活时间，同时降低同种异体细胞治疗引起的免疫排斥反应的多重效果。

Description

靶向GD2的通用型CAR-T细胞及其制备方法和应用 技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种靶向GD2的通用型CAR-T细胞及其制备方法和应用。
背景技术
神经节苷脂GD2是一种富含糖链的糖脂化合物，是神经系统细胞膜的重要组成部分，属于神经节苷脂鞘脂类。GD2抗原表达在神经外胚层生成的肿瘤表面，包括神经母细胞瘤、黑色素瘤、骨肉瘤、胶质瘤等肿瘤。其中神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)为节后交感神经系统胚胎性肿瘤，是儿童最常见的颅外实体恶性肿瘤。目前治疗手段以手术切除、放射治疗、化疗为主。NB发病早、恶性程度高、预后差。化疗后仍有10％～20％的患儿发展为难治性NB。弥漫性内生性脑桥胶质瘤(DIPG)为发生于脑干的高度侵袭性神经胶质瘤，好发于5～9岁患儿，预后极差，仅有不到10％的患儿生存期超过2年。H3K27M突变在胶质瘤领域是目前较为前沿的研究热点。H3K27M突变的弥漫性中线胶质瘤(DMG)大多数发生于儿童，偶见于成人。肿瘤常呈浸润性生长，常侵及丘脑、延髓和脊髓，患者预后极差。因此急需寻找新的治疗方法以降低相关肿瘤患者的病死率。
美国斯坦福大学医学院Robbie G.Majzner教授团队公布了一项新的研究结构：anti-GD2 CAR-T治疗DIPG和H3K27M突变DMG儿童和年轻成人患者的疗效和安全性。研究纳入了4例受试者(3例DIPG，1例脊髓DMG，4～25岁)，所有患者均置入Ommaya储液囊监测颅内压。3/4患者神经功能缺损明显改善或恢复，部分患者的影像学结果改善。在另外一项新的研究中，来自美国洛杉矶儿童医院的研究人员开发出一种CAR-T细胞，它在靶向神经母细胞瘤方面显示出了希望：更有效地杀死了癌细胞，同时又不会伤害健康的脑组织。显示出anti-GD2 CAR-T的良好安全性和临床治疗应用前景。而与自体CAR-T细胞产品比较，通用型CAR T细胞是从健康供体分离获得T细胞，制备的CAR-T细胞扩增效率高、活力强；同时同种异体通用型CAR-T细胞可以现货供应，大大降低了制备成本并缩短了制备周期。
然而，病人自体T细胞在体外扩增困难或功能降低，导致制备的CAR-T细胞产品数量不足或质量差。通用型CAR T细胞是从健康供体分离获得T细胞，制备的CAR-T细胞不但扩增效率高、活力强，而且感染阳性率也有提高，但是通用型CAR-T也面临着移植物抗宿主疾病(GVHD)和免疫排斥的问题。CRISPR/Cas9系统是最常用的基因编辑方法，可用于产生TCR缺陷和HLA I类分子缺陷的T细胞，降低同种异体细胞治疗引起的免疫排斥免疫反应。 而与传统的CAR-T细胞产品比较，同种异体通用型CAR-T细胞大大降低了制备成本，缩短了制备周期。通用型CAR-T不仅扩大了抗原的识别范围，也可以通过基因敲除改变免疫抑制微环境，应用于恶性血液肿瘤与实体肿瘤的治疗。
发明内容
本发明的目的在于制备一种靶向GD2的通用型CAR-T细胞，识别肿瘤细胞表面抗原的同时敲除细胞表面的TCR和HLA-A基因，达到提高CAR-T细胞的抗肿瘤作用，延长细胞存活时间，同时降低同种异体细胞治疗引起的免疫排斥反应的多重效果。
一方面，本申请前提供一种免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞中的T细胞抗原受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHCI，MHCII)在细胞中的功能受到抑制，且所述免疫效应细胞包含靶向GD2的嵌合抗原受体(CAR)。
在某些实施方式中，所述CAR包含靶向部分，所述靶向部分包含抗体重链可变区(VH)，所述VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含：包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3。
在某些实施方式中，所述VH包含重链框架区1(HFR1)、重链框架区2(HFR2)、重链框架区3(HFR3)和重链框架区4(HFR4)，所述HFR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR4包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，且所述HFR1、HFR2、HFR3和HFR4选自：
包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的HFR1，包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HFR2，包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HFR3，包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HFR4。
在某些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述靶向部分包含抗体轻链可变区(VL)，所述VL包含轻链互补决 定区1(LCDR1)、轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包含：包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR3。
在某些实施方式中，所述VL包含轻链框架区1(LFR1)、轻链框架区2(LFR2)、轻链框架区3(LFR3)和轻链框架区4(LFR4)，所述LFR1包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LFR2包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LFR3包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LFR4包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，且所述LFR1、LFR2、LFR3和LFR4选自：
包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LFR1，包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的LFR2，包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的LFR3，包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的LFR4。
在某些实施方式中，所述VL包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述靶向部分包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述靶向部分包括全长抗体、Fab、单链可变片段(scFv)或单域抗体(VHH)。
在某些实施方式中，其中所述靶向部分包括scFv。
在某些实施方式中，其中所述靶向部分包含位于VH与VL之间的接头多肽。
在某些实施方式中，其中所述接头多肽包括SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述靶向部分包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CAR包括跨膜域，所述跨膜域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的跨膜域：CD8A、CD8B、CD28、CD3ε(CD3e)、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、 TRAC、TRBC、CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L(CD154)、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64和SLAM。
在某些实施方式中，其中所述跨膜域包含源自CD8A的跨膜域。
在某些实施方式中，其中所述跨膜域包含SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:77中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CAR包括胞内共刺激信号传导结构域，所述胞内共刺激信号传导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内共刺激信号传导结构域：CD28、4-1BB(CD137)、CD27、CD2、CD7、CD8A、CD8B、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD40和MyD88。
在某些实施方式中，其中所述胞内共刺激信号传导结构域源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
在某些实施方式中，其中所述胞内共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:78至SEQ ID NO:110中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CAR包括胞内信号转导结构域，所述胞内信号转导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内信号转导结构域：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14Nef、DAP10、DAP-12和至少包含一个ITAM的结构域。
在某些实施方式中，其中所述胞内信号转导结构域包含源自CD3ζ的信号传导结构域。
在某些实施方式中，其中所述胞内信号转导结构域包含SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:111至SEQ ID NO:121中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CAR在靶向部分和跨膜域之间包括铰链区，所述铰链区包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的铰链区：CD28、IgG1、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8A、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、BTLA、GITR、DAP10、TIM1、SLAM、CD30和LIGHT。
在某些实施方式中，所述铰链区包含源自CD8A的铰链区。
在某些实施方式中，所述铰链区包含SEQ ID NO:122至SEQ ID NO:143中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的非靶向部分包含CD8A分子跨膜域、CD8A的铰链区、4-1BB的胞内共刺激信号传导结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的非靶向部分包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体还包含信号肽片段，所述信号肽片段的C端与所述靶向部分的N端连接。
在某些实施方式中，所述信号肽片段包括CD8A信号肽片段。
在某些实施方式中，所述信号肽片段包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的免疫效应细胞包括人细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些实施方式中，其包括自体的或非自体的免疫效应细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括经修饰的免疫效应细胞，其中所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因：TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
在某些实施方式中，所述经修饰的免疫效应细胞与未经修饰的相应细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的相应细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的相应细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调；和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括：基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫效应细胞中两个TRAC等位基因中的任意一个被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫细胞中两个TRAC等位基因被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫细胞中TRAC基因外显子被敲除并且HLA-A基因外显子被敲除。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰还包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA包含SEQ ID NO:144至SEQ ID NO:158中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA包含SEQ ID NO:159至SEQ ID NO:199中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
在某些实施方式中，其中Cas酶包括Cas9蛋白。
在某些实施方式中，其中所述反义RNA包含SEQ ID NO:200至SEQ ID NO:203中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞为HLA-B纯合子细胞。
在某些实施方式中，其中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子，HLA-B*15纯合子，HLA-B*46纯合子，HLA-B*13纯合子，HLA-B*51纯合子，HLA-B*58纯合子，HLA-B*07纯合子，HLA-B*35纯合子，HLA-B*44纯合子，HLA-B*52纯合子，HLA-B*57纯合子，HLA-B*54纯合子，HLA-B*55纯合子。
在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
在某些实施方式中，其中所述HLA-A纯合子或杂合子包括HLA-A*02纯合子，HLA-A*11纯合子，HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
另一方面，本申请提供一种制备免疫效应细胞的方法，其包括：在向免疫效应细胞中引入编码前述靶向GD2的CAR的多核苷酸序列或包含前述靶向GD2的CAR的多核苷酸序列的载体之前/之后，修饰所述免疫效应细胞，所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述载体是表达载体。
在某些实施方式中，其中所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体。
在某些实施方式中，其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因：TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，下调所述免疫效应细胞中TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，与相应的野生型细胞相比，所述免疫效应细胞的TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，与相应的野生型细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，与相应的野生型细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调；和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括：基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫效应细胞中两个TRAC等位基因中的任意一个被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫细胞中两个TRAC等位基因被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫细胞中TRAC基因外显子被敲除并且HLA-A基因外显子被敲除。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA包含SEQ ID NO:144至SEQ ID NO:158中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA包含SEQ ID NO:159至SEQ ID NO:199中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
在某些实施方式中，其中Cas酶包括Cas9蛋白。
在某些实施方式中，其中所述反义RNA包含SEQ ID NO:200至SEQ ID NO:203中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞包括人细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括自体的或非自体的免疫效应细胞。
在某些实施方式中，其中所述细胞为HLA-B纯合子细胞。
在某些实施方式中，其中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子，HLA-B*15纯合子，HLA-B*46纯合子，HLA-B*13纯合子，HLA-B*51纯合子，HLA-B*58纯合子，HLA-B*07纯合子，HLA-B*35纯合子，HLA-B*44纯合子，HLA-B*52纯合子，HLA-B*57纯合子，HLA-B*54纯合子，HLA-B*55纯合子。
在某些实施方式中，其中所述细胞为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
在某些实施方式中，其中所述HLA-A纯合子或杂合子包括HLA-A*02纯合子，HLA-A*11纯合子，HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
另一方面，本申请提供前述的免疫效应细胞在制备CAR-T细胞中的应用。
另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含前述免疫效应细胞，以及任选地药学上 可接受的载剂。
另一方面，本申请提供前述的免疫效应细胞和/或前述的药物组合物，其用于治疗与GD2的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括与GD2的表达上调相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括癌症。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括GD2阳性肿瘤。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括：神经母细胞瘤，黑色瘤，视网膜母细胞瘤，小细胞肺癌，尤文肉瘤，成神经管细胞瘤，软组织肉瘤，骨肉瘤或胶质瘤。
另一方面，本申请提供前述的免疫效应细胞和/或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与GD2的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括与GD2的表达上调相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括癌症。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括GD2阳性肿瘤。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括：神经母细胞瘤，黑色瘤，视网膜母细胞瘤，小细胞肺癌，尤文肉瘤，成神经管细胞瘤，软组织肉瘤，骨肉瘤或胶质瘤。
另一方面，本申请提供一种预防或治疗与GD2的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的前述的免疫效应细胞和/或前述的药物组合物。
在某些实施方式中，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括与GD2的表达上调相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括癌症。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括GD2阳性肿瘤。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括：神经母细胞瘤，黑色瘤，视网膜母细胞瘤，小细胞肺癌，尤文肉瘤，成神经管细胞瘤，软组织肉瘤，骨肉瘤或胶质瘤。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是本申请所述anti-GD2 CAR基因慢病毒表达载体；
图2显示的是本申请所述anti-GD2 UCAR-T细胞的构建策略。
图3A-3D显示的是本申请所述anti-GD2 UCAR-T细胞表型检测结果(敲除效率，转染效率，扩增倍数，记忆T细胞比例)；
图4显示的是本申请所述anti-GD2 UCAR-T细胞对靶细胞的杀伤结果；
图5A-5C显示的是本申请所述anti-GD2 UCAR-T细胞与靶细胞共培养细胞因子分泌检测结果；
图6显示的是本申请所述显示的是本申请所述anti-GD2 UCAR-T细胞体内抗肿瘤效果；
图7显示的是本申请所述anti-GD2 UCAR-T细胞体内半衰期检测结果；
图8A-8B显示的是本申请所述anti-GD2 UCAR-T细胞体内排异反应结果；
图9显示的是本申请所述anti-GD2 UCAR-T细胞脱靶分析；
图10显示的是本申请所述anti-GD2 UCAR-T细胞染色体易位分析；
图11显示的是本申请所述anti-GD2 UCAR-T细胞核型分析；
图12显示的是本申请所述anti-GD2 UCAR-T细胞Cas9残留分析；
图13显示的是本申请中TRAC基因在Sg9RNA编辑后Sanger测序的结果；
图14显示的是本申请中TRAC基因在Sg9RNA编辑后TA克隆检测的结果；
图15显示的是本申请中TRAC基因在Sg9RNA编辑后流式细胞检测的结果；
图16显示的是本申请中HLA-A02基因在Sg2RNA编辑后Sanger测序的结果；
图17显示的是本申请中HLA-A02基因在Sg5RNA编辑后Sanger测序的结果；
图18显示的是本申请中HLA-A11基因在Sg21RNA编辑后Sanger测序的结果；
图19显示的是本申请中HLA-A11基因在Rsg2RNA编辑后Sanger测序的结果；
图20A-20B显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中同时敲除HLA-A02和TRAC的结果；
图21A-21B显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中HLA-A02和TRAC的蛋白水平；
图22显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中TRAC、HLA-A、B2M和CIITA的 mRNA水平；
图23A-23B显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中B2M和CIITA的蛋白水平；
图24A-24D显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中TRAC、HLA-A、B2M和CIITA的蛋白水平；
图25A-25B显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中TRAC和HLA-A mRNA水平的敲除情况；
图26A-26B显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中CD69和CD137的蛋白水平；
图27显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞与NK细胞共培养的情况；
图28显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞表达IFN-γ的水平；
图29A-29D显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中TRAC、HLA-A、B2M和CIITA的蛋白水平；
图30显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞对CAR的感染效率；
图31显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞的扩增倍数；
图32显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞对CD19阳性靶细胞的杀伤效果；
图33显示的是施用本申请的经修饰的免疫效应细胞的给药方案；
图34显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞对小鼠体内肿瘤的杀伤效果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”通常是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常有两种，其当在免疫效应细胞中时，提供细胞对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性，并产生细胞内信号。在一些实施方案中，CAR包含至少一个细胞外抗原结合结构域(如VHH、scFv或其部分)，跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“胞内信号传导结构域”)，其包含衍生自如下所定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中，该组多肽在相同的多肽链中(例如，包含嵌合融合蛋白)。在一些实施方案中，该组多肽彼此不连续，例如在不同的多肽链中。在一些方面，该组多肽包括二聚化开关，其在二聚化分子的存在下可将多肽彼此偶联，例如可将抗原结合结构域偶联至胞内信号传导结构域。一方面，CAR的刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导 结构域包含一级信号传导结构域(例如，CD3-ζ的一级信号传导结构域)。在一个方面，细胞质信号传导结构域还包含一个或多个衍生自如下定义的至少一种共刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，共刺激分子可以选自4-1BB(即CD137)，CD27，ICOS和/或CD28。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其可以包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和包含衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其可以包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含衍生自共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其可以包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含衍生自一个或多个共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包括嵌合融合蛋白，其可以包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含至少两个衍生自一个或多个共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)上任选的前导序列。在一个方面，CAR进一步包含在细胞外抗原识别结构域的N末端的前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工过程中从抗原识别结构域(例如VHH)切除，并将CAR定位于细胞膜。
在本申请中，术语“双唾液酸神经节苷脂(GD2，pubchem:6450346)”通常是指一种含唾液酸的鞘糖脂，其主要在细胞表面上表达。其在肿瘤细胞对细胞外基质蛋白的附着中发挥重要作用。GD2在神经母细胞瘤(neuroblastoma)上密集，同质且几乎普遍表达的。在正常组织中，GD2的表达很大程度上限制在皮肤黑色素细胞，和外周疼痛纤维髓鞘。在CNS中，GD2似乎是胚胎抗原，但发现在分散的少突胶质细胞中和在垂体后叶中暗淡地表达。这使得GD2非常适合用于靶向抗肿瘤疗法。已经描述了针对GD2的嵌合抗原受体，其抗原结合域基于scFv14g2a(WO 2013/040371和Yvon等人(2009,Clin Cancer Res 15:5852-5860))，靶向GD2的抗原结合片段还记载于国际专利申请公开WO2004/055056，其中的每一个以全文引用的方式并入本申请。
在本申请中，术语“抗体”通常是指在最广泛的意义上加以使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们显示所期望的生物活性(Milleretal(2003)Jour.ofImmunology170:4854-4861)。抗体可以是鼠、人、人源化、嵌合抗体，或源于其它物种。
全长抗体典型地是指由两条“全长抗体重链”和两条“全长抗体轻链”组成的抗体。 “全长抗体重链”通常是这样的多肽，其在N端到C端方向由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2(CH2)，和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；并且在IgE亚类的抗体的情形中，任选地还包括抗体重链恒定结构域4(CH4)。在一些实施方式中，“全长抗体重链”是在N端到C端方向由VH，CH1，HR，CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”通常是在N端到C端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。所述抗体轻链恒定结构域(CL)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。两条全长抗体链通过在CL结构域和CH1结构域之间的多肽间二硫键和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型的全长抗体的实例是天然抗体如IgG(例如，IgG1和IgG2)，IgM，IgA，IgD，和IgE)。
在本申请中，术语“抗原结合片段”(在本文中也被称作“靶向部分”或“抗原结合部分”)通常是指抗体分子的一部分，其包含负责抗体与抗原之间的特异性结合的氨基酸。抗原中由抗体特异性地识别和结合的部分是称作如上文所述的“表位”。抗原结合结构域可典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，其并非必须包含两者。Fd片段例如具有两个VH区并且通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的实例包括(1)Fab片段，具有VL、VH、恒定轻链(CL)和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab’) 2片段，具有由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(3)具有两个VH和CH1结构域的Fd片段；(4)具有抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段，(5)dAb片段(Ward等人,“Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted From Escherichia coli,”Nature 341:544-546(1989)，其以引用的方式整体并入本申请)，其具有VH结构域；(6)分离的互补决定区(CDR)；(7)单链Fv(scFv)，例如源于scFV-文库。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由独立基因编码，但其可通过合成连接子使用重组方法接合，合成连接子使得其被制备为其中VL和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv))(可参见例如Huston等人,“Protein Engineering of Antibody Binding Sites:Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in Escherichia coli,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))；和(8)VHH，“VHH”涉及来自骆驼科(骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼等)重链抗体的可变抗原结合结构域(参见Nguyen V.K.等人，2000，The EMBO Journal，19，921-930；Muyldermans S.，2001，J Biotechnol.，74，277-302以及综述Vanlandschoot P.等人，2011，Antiviral Research 92，389-407)。VHH也可称为纳米抗体(Nanobody)(Nb)和/或单域抗体。这些抗体片段使用所属领域的技术人员已知的常规技术获得，且以与完整抗体相同的方 式评估所述片段的功能。
在本申请中，术语“单域抗体”或“VHH”通常是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体。在某些情形中，单域抗体可以来自双峰驼、单峰驼、羊驼、美洲驼、护士鲨、大星鲨或鳐鱼(例如，可参见康晓圳等，生物工程学报，2018，34(12):1974-1984)。例如，单域抗体可以来自羊驼。单域抗体可由重链可变区(VH)构成。术语“重链可变区”通常是指抗原结合片段的重链的氨基末端结构域。重链可变区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在成为框架区(FR)的更保守的区域中。每个重链可变区可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
在本申请中，术语“单链可变片段”或“scFv”具有其普通和常规的含义，并且可包括但不限于例如包含免疫球蛋白的重链(VH)可变区和轻链(VL)可变区的融合蛋白，其以短接头肽彼此连接。不受限制地，接头可包含甘氨酸(为了柔性)以及亲水性氨基酸(例如丝氨酸或苏氨酸)(为了可溶性)。接头可将VH的N端与VL的C端连接，或者可将VH的C端与VL的N端连接。在一些替代方式中，CAR上存在的配体结合结构域为单链可变片段(scFv)。本申请的CAR可以构造为VH-VL或VL-VH构型，其中具有在接头、铰链、跨膜域、共刺激域和/或传导域的变异，并且该CAR仍然保持其功效。在一些实施方式中，CAR上存在的scFv结构域对肿瘤细胞上存在的GD2而言具有特异性。
本申请的CAR可以包含为了分子的适当间隔和构象而添加的在各个域之间的接头残基，例如包含氨基酸序列的接头，其连接VH域和VL域并提供与两个亚结合域的相互作用相容的间隔区功能，使得所得多肽保持对与包含相同轻链和重链可变区的抗体相同的靶分子的特异性结合亲和力。本申请的CAR可包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个接头。在特别的实施方式中，接头的长度为约1至约25个氨基酸、约5至约20个氨基酸、或约10至约20个氨基酸、或任何介入长度的氨基酸。接头的示例性实例包括甘氨酸聚合物；甘氨酸-丝氨酸聚合物；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；本领域已知的其他柔性接头，例如惠特洛接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可以作为融合蛋白的域(例如本申请的CAR)之间的中性系链。
在本申请中，术语“互补决定区”(CDR)通常是指在抗原结合片段可变区内的互补性决定区。在本申请中，所述重链可变区存在3个CDRs，所述CDRs对于每个可变区命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3。这些CDRs的确切边界已根据不同系统不同地限定。由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health， Bethesda，Md.(1987)和(1991))描述的系统，不仅提供了可应用于抗原结合片段的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定3个CDRs的精确残基边界。这些CDRs可以被称为Kabat CDRs。Chothia和同事(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)以及Chothia等人，Nature 342：877-883(1989))发现尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性，但是Kabat CDRs内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象。这些亚部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区域。这些区域可以被称为Chothia CDRs，所述Chothia CDRs具有与Kabat CDRs重叠的边界。与Kabat CDRs重叠的限定CDRs的其他边界已由Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))描述。另外，其他的CDR边界定义可能不严格地遵循上述系统之一，但仍将与Kabat CDRs重叠，尽管按照特定残基或残基组或甚至整个CDRs并不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以缩短或加长。在本申请中，使用的是IMGT编号系统。
在本申请中，术语“FR”通常是指抗体可变结构域的更高度保守的部分，其被称为框架区。例如，天然重链和轻链的可变结构域各自可以包含四个FR区，即在VH中四个(H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4)，和在VL中四个(L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4)。“框架区”通常是指本领域识别的抗体可变区中存在于分歧性更高的(即高变)CDR之间的部分。此类框架区典型地称为框架1至4(FR1、FR2、FR3和FR4)且提供用于在三维空间中呈现六个CDR(三个来自重链且三个来自轻链)的骨架，以形成抗原结合表面。
在本申请中，术语“同源性”通常可以等同于序列“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。同源性可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中，提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。
为了确定序列同一性，可进行序列比对，其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数，包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。
在本申请中，术语“K D”可与“KD”互换使用，通常是指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，单位为M(mol/L)。K D可通过物质AB和其解离得到的物质A和物质B的浓 度来计算：K D＝c(A)*c(B)/c(AB)。由该公式可知，K D值越大，说明解离越多，代表物质A、B之间的亲和力越弱；反之，K D值越小，说明解离越少，代表物质A、B之间的亲和力越强。
在本申请中，术语“分离的核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“病毒载体”广泛用于指核酸分子(例如转移质粒)或介导核酸转移的病毒颗粒，核酸分子包括病毒衍生的通常促进核酸分子转移或整合到细胞基因组中的核酸元件。病毒颗粒通常包括各种病毒组件，有时还包括除核酸外的宿主细胞组件。病毒载体可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或被转移的核酸本身。
在本申请中，术语“慢病毒”通常是指复杂逆转录病毒的组(或属)。示例性慢病毒包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)；维斯那-梅迪病毒(visna-maedivirus，VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一种实施方式中，基于HIV的载体骨架(即HIV顺式作用序列元件)是优选的。在特别的实施方式中，慢病毒用于将包含CAR的多核苷酸递送至细胞。
在本申请中，术语“宿主细胞”或“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述分离的核酸分子的载体，或者能够表达本申请所述分离的抗原结合片段的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述宿主细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述分离的抗原结合片段即可。所述宿主细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。例如，所述的宿主细胞可以是大肠杆菌细胞。例如，所述的宿主细胞可以是酵母细胞。例如，所述的宿主细胞可以是哺乳动物细胞。例如，所述哺 乳动物细胞可以是CHO-K1细胞。
在本申请中，术语“T细胞”或“T淋巴细胞”可以是任何T细胞，如培养T细胞，例如原代T细胞，或来自培养T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupTI等，或获自哺乳动物的T细胞(优选灵长类动物，物种，包括猴、狗或人)。如果获自哺乳动物，那么T细胞可以获自诸多来源，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或流体。T细胞还可以被富集或被化。T细胞可以通过在体外或体内将造血干细胞成熟化成T细胞而获得。在示范性方面中，T细胞是人类T细胞。在示范性方面中，T细胞是从人类中分离的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，包括NKT细胞，并且可以具有任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞；CDA+辅助T细胞；例如Th1和Th2细胞，CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)；外周血液单核细胞(PBMC)；外周血液白细胞(PBL)；肿瘤浸润细胞(TIL)；记忆T细胞；未处理T细胞等等。优选地，T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些替代方式中，T细胞与接受细胞或待接受细胞(例如所述细胞处于治疗组合物的形式)的接受受试者是同种异体的(来自相同物种的不同供体)；在一些替代方式中，T细胞是自体的(供体和接受者相同)；在一些替代方式中，T细胞是同基因的(syngeneic)(供体和接受者不同，但为同卵双胞胎)。
在本申请中，术语“免疫效应细胞”通常是指参与免疫应答，行使效应功能的免疫细胞。例如所述行使效应功能可以包括清除异物抗原或促进免疫效应子应答等。免疫效应细胞可以包括浆细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。
本申请的免疫效应细胞可以是自体/自身的(autologous/autogeneic)(“自己的”)或非自体的(“非自己的”，例如同种异体的、同基因的或异基因的)。在本申请中，术语“自体的”通常是指来自相同受试者的细胞。“同种异体的”通常是指与相比较的为相同物种但在遗传上不同的细胞。“同基因的”通常是指在遗传上与相比较的细胞相同的不同受试者的细胞。“异基因的”通常是指物种与相比较的细胞不同的细胞。在一些实施方式中，本申请的细胞是自体的或同种异体的。
在本申请中，术语“修饰”通常是指改变细胞的状态或结构和/或细胞的状态或结构的改变。所述改变通常是与相应未经所述修饰的细胞的状态或结构相比，所述改变可以包括内源基因表达水平或功能的变化，例如通过基因工程手段使得细胞内源基因表达水平下调、上调或不表达，所述基因工程手段可以包括同源重组、CRISPR/Cas9系统基因编辑等；所述改变还可以包括细胞蛋白质表达、结构或功能的变化，例如通过所述内源基因表达水平或功能的变化而实现的相应蛋白质表达的变化、结构或功能的变化，例如通过调节蛋白质翻译、翻译 后修饰而实现的蛋白质表达的变化、结构或功能的变化；所述改变还可以包括引入外源基因、表达外源蛋白质等。
在本申请中，术语“TRAC”通常是指T细胞受体α链恒定区(T cell receptor alpha con-stant)。T细胞受体(TCR)通常是指位于T细胞表面的特异性受体，能够识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。TCR通常由两条不同的蛋白质链组成(即异源二聚体)。在人类中，多数T细胞中的TCR由一条α链和一个β链(分别由TRA和TRB编码)组成，这一类T细胞被称为αβT细胞，少数的的T细胞中，TCR由γ链和δ链(分别由TRG和TRD编码)组成，这一类T细胞被称为γδT细胞。通常情况下，αβT细胞约占T细胞总数的95％，γδT细胞约占T细胞总数的5％，该比率在个体发育过程中和患病状态(例如白血病)中发生变化，物种之间也有所不同。组成TCR的每一条链都含有可变区与恒定区，在人类中，编码α链的基因(TRA，例如HGNC:12027所示的信息)位于14号染色体，由多基因片段构成，包括可变段(V)、连接段(J)以及恒定区(C)，TRAC基因通常是指编码T细胞受体α链恒定区(C)的基因序列(例如HGNC:12029所示的信息)，其位于14号染色体(14q11.2；14：22,547,505-22,552,131)。通常编码N段抗原识别域的可变段(V)基因中的1个与连接段(J)中的一个重排产生一个功能性V区外显子，该外显子被转录并通过剪接与恒定区(C)连接，从而形成T细胞受体α链编码序列。
在本申请中，术语“主要组织相容性复合物抗原”(“MHC”，在人类的情况下也称为“人类白细胞抗原”(“HLA”))通常是指在细胞表面上表达的赋予细胞独特抗原身份的蛋白质。MHC/HLA抗原是被T细胞和NK细胞识别为源自于与免疫效应细胞相同的造血干细胞来源(“自身”)或识别为源自于另一种造血重建细胞来源(“非自身”)的靶分子。识别了两种主要类别的HLA抗原：HLA I类和HLA II类。HLA I类抗原(人类中的A、B、C)使每个细胞都可被识别为“自身”，而HLA II类抗原(人类中的DR、DP和DQ)参与淋巴细胞和抗原呈递细胞之间的反应。两者都已经与移植器官的排斥有牵涉。HLA基因系统的一个重要方面是其多态性。每个基因，MHC I类(A、B和C)和MHC II类(DP、DQ和DR)存在着不同的等位基因。HLA等位基因由数字和下标表示。例如，两个不相关的个体可能分别携带I类HLA-B基因B5和Bw41。等位基因产物在α和/或β结构域的一个或更多个氨基酸中有差异。大量的特异性抗体或核酸试剂被用于使用表达I类和II类分子的白细胞对个体的HLA单倍型进行分型。通常用于HLA分型的基因是六种MHC I类和II类蛋白，即HLA-A；HLA-B和HLA-DR各自有两个等位基因。HLA基因簇集在存在于染色体位置6p21上的“超级基因座”中，所述“超级基因座”编码在免疫系统以及一些其他的基本分子和细胞过程的调控中具有重要 作用的6个经典的移植HLA基因和至少132个蛋白质编码基因。完整的基因座粗略度量为3.6Mb，具有至少224个基因座。这种簇集的一个效果是“单倍型”，即存在于单条染色体上的一组等位基因，是从一个亲本遗传来的，倾向于作为一组进行遗传。从每个亲本遗传来的一组等位基因形成一个单倍型，其中一些等位基因倾向于关联在一起。鉴定患者的单倍型可以帮助预测找到匹配供体的概率，并且帮助制定搜索策略，因为一些等位基因和单倍型比其他等位基因和单倍型更常见，而且它们在不同种族和民族中分布的频率不同。
在本申请中，“HLA-A”通常是指一类人类白细胞抗原(human leukocyte antigens)多肽链，由位于人类染色体6p21.3的HLA-A基因(例如HGNC:4931所示的信息)编码。HLA-A是构成人类细胞表面I类MHC分子的三种主要多肽类型之一，其他还包括HLA-B和HLA-C。由HLA-A基因编码的α链和B2M基因编码的β链(β2-微球蛋白)组成的异二聚体即为HLA-A类MHC I分子。所述由HLA-A基因编码的α链可以包含α1结构域、α2结构域域、α3结构域、跨膜区以及胞质区，其中α1结构域、α2结构域可以与肽段结合从而由MHC I分子(例如HLA-A类)将所述肽段呈递给免疫系细胞。在人类中，与大多数哺乳动物相似，MHC I分子的α链为多态性的，其一级结构有较多变化，截至2013年12月，共有2432个已知的HLA-A等位基因，编码1740个活性蛋白和117个无效蛋白。在本申请中，HLA-A等位基因可以包括IMGT/HLA数据库3.38.0版(https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)收录的由WHO HLA因子命名委员会命名的不同HLA-A等位基因的序列信息。
在本申请中，术语“HLA-B”通常是指人类白细胞抗原(HLA)复合物的基因家族的一部分。HLA是主要组织相容性复合体(MHC)的人类版本，MHC是一个存在于许多物种中的基因家族。在这个复杂的基因被分为三个基本组：I类，II类和III类。在人类中，HLA-B基因和两个相关基因HLA-A和HLA-C是MHC I类的主要基因。HLA-B基因位于6号染色体短(p)臂的细胞带21.3，从碱基对31,353,871到31,357,211。HLA-B是供者和受者之间应匹配的三个主要HLA之一。它们是HLA-A、HLA-B(均为I类MHC)和HLA-DR(II类MHC)。如果这两种组织具有编码这三种HLA的相同基因，那么排斥的可能性和严重程度就会降到最低。HLA-B的数百个版本(等位基因)是已知的，每个版本都有一个特定的编号(例如HLA-B27)。密切相关的等位基因被归类在一起；例如，至少有28个非常相似的等位基因是HLA-B27的亚型。这些亚型被指定为HLA-B*2701至HLA-B*2728。
在本申请中，术语“HLA匹配的”是指其中供体和受体之间HLA抗原没有不匹配的供体-受体对，所述供体诸如向需要造血干细胞移植疗法的受体提供造血干细胞移植物的供体。HLA匹配的(即其中所有6个等位基因都是匹配的)供体-受体对具有降低的移植物排斥的风 险，原因是内源性T细胞和NK细胞不太可能将进入的移植物识别为外来的，并且因此不太可能产生针对移植物的免疫应答。
在本申请中，术语“HLA不匹配的”是指其中供体和受体之间至少一种HLA抗原(特别是对于HLA-A、HLA-B和HLA-DR)是不匹配的供体-受体对，所述供体诸如向需要造血干细胞移植疗法的受体提供造血干细胞移植物的供体。在一些实施方案中，一个单倍型是匹配的，而另一个是不匹配的。HLA不匹配的供体-受体对相对于HLA匹配的供体-受体对可能具有增加的移植物排斥的风险，原因是在HLA不匹配的供体-受体对的情况下，内源性T细胞和NK细胞更可能将进入的移植物识别为外来的，并且这样的T细胞和NK细胞因此更可能产生针对移植物的免疫应答。
在本申请中，术语“B2M”通常是指是β2微球蛋白(β2-microglobulin)，是MHC I类分子的组成部分之一。β2微球蛋白(也称为β链)可以与HLA编码的α链组成MHC I类的分子。B2M通常在所有有核的细胞中都有表达。在人类中，β2微球蛋白由位于15q21.1的B2M基因(例如HGNC:914所示的信息)所编码。
在本申请中，术语“CIITA”通常是指Ⅱ类主要组织相容性复合体(MHCⅡ)的反式激活因子。所述反式激活因子可以是具有酸性转录激活结构域、4个LRR(富含亮氨酸的重复序列)和GTP结合结构域的蛋白质。所述蛋白质可位于细胞核中，作为II类主要组织相容性复合体(MHCⅡ)基因转录的正向调节剂，被称为表达这些基因的“主控制因子”。该蛋白质还可结合GTP，并利用与GTP结合来使其自身转运到细胞核中，在细胞核中，其通常使通过乙酰转移酶(AT)活性以类似共激活剂的方式起作用。在人类中，所述蛋白质由位于16p13.13的基因(例如HGNC:7067所示的信息)编码，能够产生几种编码不同同工型的转录物变体。
在本申请中，术语“野生型细胞”通常是指自然存在的或者自然来源的细胞。
在本申请中，术语“核酸”或“多核苷酸”或“核酸分子”通常时指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链形式或双链形式的聚合物。除非特别限定，否则该术语可以包括含天然核苷酸的类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸(例如示出了序列信息)相似的结合特性并且按照与天然存在核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，核酸的序列可以包括其保守方式修饰的变体，例如简并密码子置换、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。
在本申请中，术语“表达”通常是指特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
在本申请中，术语“基因突变”通常是指基因在结构上发生的碱基对组成或排列顺序的改变。例如单个碱基改变所引起的点突变，或多个碱基的缺失、重复和插入等。
在本申请中，术语“基因沉默”通常是指通过调节机制阻止某些基因的表达。主要可以包括两种：一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等因素引起的转录水平上的基因沉默(transcriptional gene silencing,TGS)，另一种是转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性干预而影响基因的表达。通常情况下当基因沉默时，相应基因表达下调/减少。而当基因被敲除时则通常表现为不表达，例如在细胞中，某种特定基因的所有等位基因均被敲除后则表现为该基因的表达消失。基因沉默通常被认为是一种基因敲低机制，通用于沉默基因的方法可以如RNAi等。
在本申请中，术语“内源”指来自生物、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何物质。
在本申请中，术语“外源”指从生物、细胞、组织或系统外部引入或在其外部产生的任何物质。
在本申请中，术语“反义RNA”通常是指一种与转录产物mRNA(信使RNA)互补的单链RNA。反义RNA可通过与mRNA的结合抑制基因的表达。例如，反义RNA与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶Ⅲ的敏感性增加，使其降解；例如，反义RNA与mRNA的上游非编码区结合，从而直接抑制靶mRNA的翻译。
在本申请中，术语“siRNA”通常是指Small interfering RNA(小干扰RNA)或short in-terfering RNA(短干扰RNA)的缩写。siRNA是一类双链非编码RNA分子，长度约为18-28个碱基对，可通过与mRNA的互补结合引起mRNA的降解从而干扰特定基因的表达。在某些实施方式中，siRNA可以是长双链RNA或shRNA经Dicer酶处理得到的产物。在某些实施方式中，siRNA进入细胞与其他蛋白质形成RNA诱导沉默复合体(RISC)，有义链发生降解，反义链可与互补的靶向序列结合，从而实现基因沉默。
在本申请中，术语“shRNA”通常是指short hairpin RNA的缩写，即“短发夹RNA”。shRNA通常包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔，组成发夹结构。通常还可以包括5-6个T碱基作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。在某些实施方式中，shRNA可经由病毒载体或质粒进入细胞中，在聚合酶Ⅱ或聚合酶Ⅲ的作用下进行转录，转录产物自细胞核输出(通常可经由Exportin 5)后经Dicer处理后输送至RISC，有义链发生降解，反义链可与互补的靶向序列结合，从而实现基因沉默。
在本申请中，术语“CRISPR/Cas系统”通常是指包含RNA引导的核酸酶或其他效应分子和gRNA分子的一组分子，所述分子能够指引和实现由RNA引导的核酸酶或其他效应分子在靶序列处修饰核酸，例如引起靶序列降解。在某些实施方式中，CRISPR系统包含gRNA和Cas蛋白，例如，Cas9蛋白。包含Cas9或其功能性突变体的系统在本申请中称作“Cas9系 统”或“CRISPR/Cas9系统”。在某些实施方式中，gRNA分子和Cas分子可以复合，以形成核糖核蛋白(RNP)复合体。
在本申请中，术语“gRNA分子”或“向导RNA”、“指导RNA”、“指引RNA”、“向导RNA分子”、“gRNA”可互换使用，通常是指能够促进特异性指引RNA引导的核酸酶或其他效应分子(一般与gRNA分子复合)至靶序列上的核酸分子。在某些实施方案中，通过gRNA的一部分与DNA(例如，通过gRNA导引结构域)杂交并且通过gRNA分子的一部分与RNA指导的核酸酶或其他效应分子结合(例如，至少通过gRNAtracr)实现所述引导。在某些实施方案中，gRNA分子由单一的连续多核苷酸分子组成，在本文中称作“单一向导RNA”或“sgRNA”等。在其他实施方案中，gRNA分子由本身能够缔合(一般通过杂交)的多个(例如二个)多核苷酸分子组成，在本文中称作“双重向导RNA”或“dgRNA”等。
在本申请中，术语“Cas蛋白”通常是指CRISPR/Cas系统中负责剪切DNA的酶。可以包括来自Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型CRISPR/Cas系统的酶。例如，Cas3、Cas9、Cas10。
在本申请中，术语“Cas9蛋白”通常是指负责剪切DNA的来自细菌II型CRISPR/Cas系统的酶。Cas9可以包括野生型蛋白及其有功能性突变体。
在本申请中，术语“等位基因”通常是指基因座上的基因序列可能具有的不同变化的形式。基因座也称作基因位点或位点，是指染色体上的固定位置，例如某个基因所在。基因座在基因组中的排列位置称为基因图谱(genetic map)。
在本申请中，术语“纯合子”通常是指同源染色体在同一基因座上的两个等位基因相同的基因型个体。一对相对基因可以有AA和aa两种基因型的个体。
在本申请中，术语“杂合子”通常是指二倍体中同源染色体同一位点上的两个等位基因不相同的基因型个体，如Aa。杂合基因型一般比纯合显性或纯合隐性基因型的适应性都要高，这种现象被称为杂合子优势。
在本申请中，术语“肿瘤”和“癌症”可以互换地使用，通常是指以异常细胞快速且失控生长为特征的疾病。癌细胞可以局部地或通过血流和淋巴系统扩散到身体其他部分。本文中描述了各种癌症的例子并且它们包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“癌症”或“肿瘤”包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤，还涵盖实体瘤和非实体肿瘤。
在本申请中，术语“药学上可接受的”通常是指代与合理的益处/风险比相称、在合理医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触而不具有过度毒性、刺激、过敏应答或其 它问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常是指常规使用的那些载剂中的任一种，并且仅受到物理-化学考虑因素(如溶解性和与活性结合剂的反应性的缺乏)限制，并且受给药途径限制。本文所描述的药学上可接受的载剂，例如媒剂、佐剂、赋形剂和稀释剂为所属领域的技术人员所熟知并且公众可容易获得。在一个方面中，药学上可接受的载剂是对医药组合物的活性成分具有化学惰性的载剂，并且是在使用条件下不具有不利的副作用或毒性的载剂。在一些实施例中，当向动物或人类给予时，载剂不产生不良、过敏或其它不适当的反应。在一些方面中，医药组合物不含热原质以及会对人类或动物有害的其它杂质。药学上可接受的载剂包括任何和所有溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等等；其用途在所属领域中是众所周知。
可接受的载剂、赋形剂或稳定剂对接受者无毒性并且优选在所采用的剂量和浓度下是惰性的，并且包括缓冲夜，如磷酸盐、柠檬酸盐或其它有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；盐形成抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。
在本申请中，术语“有效量”或“有效剂量”通常是指足以实现或至少部分实现所需效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”通常是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时促进疾病消退(这通过疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期的频度和持续时间的增加、或者由于罹患疾病而引起的损害或残疾的预防来证明)的任何药物量。
抗GD2 CAR-T细胞的“治疗有效量”或“有效量”也是治疗有益效果超过抗GD2 CAR-T细胞的任何毒性或有害作用例如CRS的量或剂量。术语“治疗有效量”包含有效“治疗”受试者(例如，患者)的量。在一个实施例中，治疗有效剂量是用于治疗受试者的多发性骨髓瘤的抗GD2 CAR-T细胞的最小有效剂量(MED)。在一个实施例中，治疗有效剂量是不会导致受试者有无法解决的CRS的抗GD2 CAR-T细胞的最大耐受剂量(MTD)。
在本申请中，术语“表达上调”通常是指核酸mRNA水平表达的增加或多肽水平表达的增加。该术语也可以涉及增加的多肽活性和/或功能所需的翻译后修饰，例如加上糖部分，磷酸化等。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
在本申请中，术语“受试者”通常是指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴等。
发明详述
免疫效应细胞
一方面，本申请前提供一种免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞中的T细胞抗原受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHCI，MHCII)在细胞中的功能受到抑制，且所述免疫效应细胞包含靶向GD2的嵌合抗原受体(CAR)。
在某些实施方式中，所述VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述HCDR1包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR2包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列
在某些实施方式中，所述HCDR3包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含：包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的HCDR1、包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的HCDR2和包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的HCDR3。
例如，所述免疫效应细胞中的T细胞抗原受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHCI，MHCII)在细胞中的功能受到抑制，且所述免疫效应细胞包含靶向GD2的嵌合抗原受体(CAR)， 所述靶向GD2的嵌合抗原受体(CAR)包含靶向部分，所述靶向部分包含抗体重链可变区(VH)，所述VH可以包含：包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3。
在某些实施方式中，所述VH包含重链框架区1(HFR1)、重链框架区2(HFR2)、重链框架区3(HFR3)和重链框架区4(HFR4)，所述HFR1包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR2包含与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR3包含与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR4包含与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，且所述HFR1、HFR2、HFR3和HFR4选自：
包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的HFR1，包含与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的HFR2，包含与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的HFR3，包含与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的HFR4。
在某些实施方式中，所述VH包含与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
例如，所述免疫效应细胞中的T细胞抗原受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHCI， MHCII)在细胞中的功能受到抑制，且所述免疫效应细胞包含靶向GD2的嵌合抗原受体(CAR)，所述靶向GD2的嵌合抗原受体(CAR)包含靶向部分，所述靶向部分包含抗体重链可变区(VH)，所述VH可以包含VH包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述LCDR1包含与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR2包含与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR3包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包含：包含与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的LCDR1、包含与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的LCDR3。
例如，所述免疫效应细胞中的T细胞抗原受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHCI，MHCII)在细胞中的功能受到抑制，且所述免疫效应细胞包含靶向GD2的嵌合抗原受体(CAR)，所述靶向GD2的嵌合抗原受体(CAR)包含靶向部分，所述靶向部分包含VH和VL，所述VH可以包含：包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3；所述VL可以包含：包含与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的LCDR1、包含与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR3。
在某些实施方式中，所述VL包含轻链框架区1(LFR1)、轻链框架区2(LFR2)、轻链框架区3(LFR3)和轻链框架区4(LFR4)，所述LFR1包含与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列 具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LFR2包含与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LFR3包含与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LFR4包含与SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，且所述LFR1、LFR2、LFR3和LFR4选自：
包含与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的LFR1，包含与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的LFR2，包含与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的LFR3，包含与SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的LFR4。
在某些实施方式中，所述VL包含与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
例如，所述免疫效应细胞中的T细胞抗原受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHCI，MHCII)在细胞中的功能受到抑制，且所述免疫效应细胞包含靶向GD2的嵌合抗原受体(CAR)，所述靶向GD2的嵌合抗原受体(CAR)包含靶向部分，所述靶向部分包含VH和VL，所述VH可以包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；所述VL可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述靶向部分包括全长抗体、Fab、单链可变片段(scFv)或单域 抗体(VHH)。例如，所述靶向部分包括scFv。
在某些实施方式中，其中所述靶向部分包含位于VH与VL之间的接头多肽。
在某些实施方式中，其中所述接头多肽包括SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述靶向部分包含与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
例如，其中所述靶向部分可以包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
又例如，所述免疫效应细胞中的T细胞抗原受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHCI，MHCII)在细胞中的功能受到抑制，且所述免疫效应细胞包含靶向GD2的嵌合抗原受体(CAR)，所述靶向GD2的嵌合抗原受体(CAR)包含靶向部分，所述靶向部分可以包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CAR包括跨膜域，所述跨膜域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的跨膜域：CD8A、CD8B、CD28、CD3ε(CD3e)、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L(CD154)、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64和SLAM。
在某些实施方式中，其中所述跨膜域包含源自CD8A的跨膜域。例如，所述跨膜域可以包含源自CD8A的跨膜域。
在某些实施方式中，其中所述跨膜域包含与SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:77中任一项所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述跨膜域可以包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CAR包括胞内共刺激信号传导结构域，所述胞内共刺激信号传导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内共刺激信号传导结构域：CD28、4-1BB(CD137)、CD27、CD2、CD7、CD8A、CD8B、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD40和MyD88。
在某些实施方式中，其中所述胞内共刺激信号传导结构域源自4-1BB的共刺激信号传导 结构域。
在某些实施方式中，其中所述胞内共刺激信号传导结构域包含与SEQ ID NO:78至SEQ ID NO:110中任一项所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述胞内共刺激信号传导结构域可以包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CAR包括胞内信号转导结构域，所述胞内信号转导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内信号转导结构域：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14Nef、DAP10、DAP-12和至少包含一个ITAM的结构域。
在某些实施方式中，其中所述胞内信号转导结构域包含源自CD3ζ的信号传导结构域。
在某些实施方式中，其中所述胞内信号转导结构域包含与SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:111至SEQ ID NO:121中任一项所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述胞内信号转导结构域可以包含SEQ ID NO:111所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CAR在靶向部分和跨膜域之间包括铰链区，所述铰链区包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的铰链区：CD28、IgG1、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8A、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、BTLA、GITR、DAP10、TIM1、SLAM、CD30和LIGHT。
在某些实施方式中，所述铰链区包含源自CD8A的铰链区。
在某些实施方式中，所述铰链区包含与SEQ ID NO:122至SEQ ID NO:143中任一项所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，铰链区可以包含SEQ ID NO:130所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的非靶向部分包含CD8A分子跨膜域、CD8A的铰链区、4-1BB的胞内共刺激信号传导结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的非靶向部分包含与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体的非靶向部分可以包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其还包含信号肽片段，所述信号肽片段的C端与所述靶向部分的N端连接。例如，所述嵌合抗原受体可以包括CAR包括信号肽、抗GD2scFv、CD8A铰链结构域、CD8A跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ主信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述信号肽片段包括CD8A信号肽片段。
在某些实施方式中，所述信号肽片段包含与SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述信号肽片段可以包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体可以包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的免疫效应细胞包括人细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。例如，所述免疫效应细胞可以是T细胞，如人T细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括自体的或非自体的免疫效应细胞。例如，所述免疫效应细胞可以是非自体的人T细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括经修饰的免疫效应细胞，其中所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因：TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
在某些实施方式中，所述经修饰的免疫效应细胞与未经修饰的相应细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的相应细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的相应细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
例如，所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的相应细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性可以被下调，CIITA基因和B2M基因的表达和/或活性可以未被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
例如，所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性可以被下调，CIITA基因和B2M基因的表达和/或活性可以未被下调。
在某些实施方式中，其中所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调；和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括：基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫效应细胞中两个TRAC等位基因中的任意一个被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫细胞中两个TRAC等位基因被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫细胞中TRAC基因外显子被敲除并且HLA-A基因外显子被敲除。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰还包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA包含与SEQ ID NO:144至SEQ ID NO:158中任一项所示的核苷酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA包含与SEQ ID NO:159至SEQ ID NO:199中任一项所示的核苷酸序列具有至少约90％，约91％，约92％， 约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
在某些实施方式中，其中Cas酶包括Cas9蛋白。
在某些实施方式中，其中所述反义RNA包含与SEQ ID NO:200至SEQ ID NO:203中任一项所示的核苷酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞为HLA-B纯合子细胞。
在某些实施方式中，其中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子，HLA-B*15纯合子，HLA-B*46纯合子，HLA-B*13纯合子，HLA-B*51纯合子，HLA-B*58纯合子，HLA-B*07纯合子，HLA-B*35纯合子，HLA-B*44纯合子，HLA-B*52纯合子，HLA-B*57纯合子，HLA-B*54纯合子，HLA-B*55纯合子。
在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
在某些实施方式中，其中所述HLA-A纯合子或杂合子包括HLA-A*02纯合子，HLA-A*11纯合子，HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
例如，所述免疫效应细胞可以为人T细胞，且所述人T细胞可以为HLA-B纯合子细胞。
免疫效应细胞的制备方法
另一方面，本申请提供制备前述免疫效应细胞的方法，其包括：在向免疫效应细胞中引入编码前述靶向GD2的CAR的多核苷酸序列或包含编码前述靶向GD2的CAR的多核苷酸序列的载体之前/之后，修饰所述免疫效应细胞，所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
例如，所述制备免疫效应细胞的方法可以包括：
(1)向免疫效应细胞中引入前述的核酸分子或前述的载体；
(2)修饰所述免疫效应细胞，所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
例如，所述制备免疫效应细胞的方法可以包括：
(1)采集健康人的外周血，进行PBMC的分离，按照比例加入CD3磁珠孵育，进行CD3+T细胞分选；将CD3/CD28抗体偶联磁珠混匀，按计算的量取出适量磁珠悬液加入到T细胞培养体系中，激活T细胞，过夜培养；
(2)根据GD2 CAR病毒的滴度感染T细胞；
(3)同时敲除TRAC和HLA-A基因；
(4)CD3阴性T细胞分选：按照比例加入CD3磁珠，收集CD3-T细胞(磁珠未结合的细胞)。
在某些实施方式中，其中所述载体是表达载体。
在某些实施方式中，其中所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体.
在某些实施方式中，其中所述载体还包含EF-1α启动子。
在某些实施方式中，其中所述载体还包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。
在某些实施方式中，其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因：TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。例如，所述与免疫排斥相关基因可以包括TRAC和/或HLA-A。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，下调所述免疫效应细胞中TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
例如，所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的相应细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性可以被下调，CIITA基因和B2M基因的表达和/或活性可以未被下调。
在某些实施方式中，与相应的野生型细胞相比，所述免疫效应细胞的TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，与相应的野生型细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，与相应的野生型细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调；和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
例如，所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性可以被下调，CIITA基因和B2M基因的表达和/或活性可以未被下调。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括：基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫效应细胞中两个TRAC等位基因中的任意一个被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫细胞中两个TRAC等位基因被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫细胞中TRAC基因外显子被敲除并且HLA-A基因外显子被敲除。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA包含与SEQ ID NO:144至SEQ ID NO:158中任一项所示的核苷酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA包含与SEQ ID NO:159至SEQ ID NO:199中任一项所示的核苷酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
在某些实施方式中，其中Cas酶包括Cas9蛋白。
在某些实施方式中，其中所述反义RNA包含与SEQ ID NO:200至SEQ ID NO:203中任一项所示的核苷酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞包括人细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。例如，所述免疫效应细胞可以是T细胞，如人T细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括自体的或非自体的免疫效应细胞。
在某些实施方式中，其中所述细胞为HLA-B纯合子细胞。例如，所述免疫效应细胞可以 为人细胞，且所述人细胞可以为HLA-B纯合子细胞。又例如，所述免疫效应细胞可以为人T细胞，且所述人细胞可以为HLA-B纯合子细胞。
在某些实施方式中，其中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子，HLA-B*15纯合子，HLA-B*46纯合子，HLA-B*13纯合子，HLA-B*51纯合子，HLA-B*58纯合子，HLA-B*07纯合子，HLA-B*35纯合子，HLA-B*44纯合子，HLA-B*52纯合子，HLA-B*57纯合子，HLA-B*54纯合子，HLA-B*55纯合子。
在某些实施方式中，其中所述细胞为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
在某些实施方式中，其中所述HLA-A纯合子或杂合子包括HLA-A*02纯合子，HLA-A*11纯合子，HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
用途、药物组合物、治疗方法
另一方面，本申请提供前述的免疫效应细胞在制备CAR-T细胞中的应用。
另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含前述免疫效应细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
另一方面，本申请提供前述的免疫效应细胞和/或前述的药物组合物，其用于治疗与GD2的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括与GD2的表达上调相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括癌症。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括GD2阳性肿瘤。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括：神经母细胞瘤，黑色瘤，视网膜母细胞瘤，小细胞肺癌，尤文肉瘤，成神经管细胞瘤，软组织肉瘤，骨肉瘤或胶质瘤。
另一方面，本申请提供前述的免疫效应细胞和/或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与GD2的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括与GD2的表达上调相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括癌症。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括GD2阳性肿瘤。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括：神经母细胞瘤，黑色瘤，视网膜母细胞瘤，小细胞肺癌，尤文肉瘤，成神经管细胞瘤，软组织肉瘤，骨肉瘤或胶质瘤。
另一方面，本申请提供一种预防或治疗与GD2的表达相关的疾病或病症的方法，其包括 向有需要的受试者施用有效量的前述的免疫效应细胞和/或前述的药物组合物。
在某些实施方式中，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括与GD2的表达上调相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括癌症。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括GD2阳性肿瘤。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括：神经母细胞瘤，黑色瘤，视网膜母细胞瘤，小细胞肺癌，尤文肉瘤，成神经管细胞瘤，软组织肉瘤，骨肉瘤或胶质瘤。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的嵌合抗原受体、免疫效应细胞、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1
1.1抗GD2嵌合抗原受体(CAR)的设计
抗GD2 CAR VLVH(鼠源)结构包括：一个GD2抗原结合区(来源于抗GD2单克隆抗体Scfv)，一个CD8A胞外铰链区，一个CD8A跨膜区，一个4-1BB胞内共刺激域和一个CD3ζ激活信号域，其DNA序列如SEQ ID NO:28所示和氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
1.2 GD2 CAR的慢病毒载体构建
根据GD2序列信息及CAR载体结构，构建GD2 CAR慢病毒表达载体，载体示意图(见图1)。进行优化：选择商业化慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP为骨架，在此载体基础上进行元件改造。首先，将载体的氨苄抗性基因β-内酰胺酶替换为源自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶，使载体具有卡那霉素抗性。其次，我们删除了在体内应用中具有潜在威胁性的CMV启动子及其临近的下游多克隆位点。最后，将原载体中由EF1启动子启动表达的copGFP基因删除，保留SalI酶切位点，并在SalI 5’端加入SmaI酶切位点供载体构建用，形成最终目的载体。加入的SmaI酶切位点是最终目的载体的单一酶切位点，载体的其他序列部分不具有该酶切位点。优化后构建嵌合抗原受体慢病毒表达载体，经sanger测序确证序列无误后，进行慢病毒包装。
1.3设计导向RNA
通过网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，查找并下载相应基因序列，使用SnapGene软件打开基因序列，可在目的基因的不同外显子上设计sgRNA。在本实施例中采用的CRISPR/Cas9系统的sgRNA非限制性的设计原则为：5’-NNN(20)-NGG-3’，NGG被称为原间隔子相邻 基序(PAM)，其中，N表示A、T、C或G。由于在同一外显子上可以设计出较多sgRNA，并且由20个核苷酸序列组成的sgRNA可能会在基因组中重复出现，所以利用网站http://crispr.cos.uni-heidelberg.de来进行sgRNA的设计与评估，将外显子序列粘贴至该网站，网站设计出sgRNA并进行预测评估，在评估中得分越高，则说明可能存在较高的编辑效率和较低的脱靶风险，从中选择得分较高的sgRNA进行试验。靶向TRAC基因的sgRNA如SEQ ID NO:144至SEQ ID NO:158所示，靶向HLA-A02基因的sgRNA如SEQ ID NO:159至SEQ ID NO:180所示，靶向HLA-A11基因的sgRNA如SEQ ID NO:181至SEQ ID NO:191所示，靶向HLA-A24基因的sgRNA如SEQ ID NO:192至SEQ ID NO:199所示，由金斯瑞生物科技公司合成。
实施例2
2.1供体筛选
根据受体的HLA-B分型，选择与受体HLA-B分型匹配的HLA-B纯合子。
首先供者来源基于人群中的HLA-B纯合子，患者HLA-B的其中一个等位基因和供者HLA-B纯合子一致即可，来源于这些供者的细胞能覆盖高数量的患者人群。降低HLA-B亚型不一致引起的排异反应。HLA-B主要选择人群中频率较高的B*40纯合子，B*15纯合子，B*46纯合子，B*13纯合子，B*51纯合子，B*58纯合子，B*07纯合子，B*35纯合子，B*44纯合子，B*52纯合子，B*57纯合子，B*54纯合子，B*55纯合子。HLA-A选择人群中频率较高的A*02纯合子，A*11纯合子及A*02/A11杂合子。
2.2 CD3+T细胞制备
(1)从外周血中分离PBMC
从健康捐献者中采集外周血，用PBS缓冲液按照1：1进行外周血稀释。在新的50mL离心管中先加入稀释后血量1/3的细胞分离液(Ficoll)，然后沿着管壁非常缓慢加入血细胞稀释液，800g常温离心20min(离心机设置升速1、降速0)。离心后离心管中的液体自上而下分为PBS与血清层、白细胞层、淋巴细胞分离液、红细胞层。去除PBS与血清层，将白细胞层移至新的50ml离心管中，加入PBS至40ml清洗细胞，450g离心10min。离心后弃上清，即得到外周血单个核细胞。细胞重悬后进行细胞计数。
(2)复苏冻存的健康人PBMC
将冻存的健康人PBMC细胞在37℃水浴锅中进行复苏，完全融化后将细胞吸到含有10ml含10％FBS的X-VIVO15培养基(购自LONZA)的15ml离心管中，400g离心8min；去上 清，加入2ml X-VIVO15培养基(含10％FBS和终浓度100μg/ml的DNase I)室温孵育15min，孵育的过程中不断振荡；将孵育结束后的溶液用40μm的滤网进行过滤，并吸取10ml PBS缓冲液重悬底部的细胞再加到滤网上，过虑后400g离心8min，离心后弃上清，细胞重悬后进行细胞计数。
(3)CD3 +T细胞分选
使用EasySep TM人T细胞分选试剂盒(购自StemCell Technologies，货号：17951)提取外周血单个核细胞(PBMC)中的T细胞。将PBMC密度调整至5×10 7细胞/ml，PBS缓冲液的添加范围在0.25-2ml；先加cocktail混匀再按照50μl/ml加入isolation cocktail，混匀后室温放置5min；将RapidSpheres用旋涡振荡仪涡旋30s后加按照40μl/ml加入至细胞中混匀；补加缓冲液至2.5ml的倍数，上下轻轻吹打2-3次；按照每管2.5ml分别加到冻存管中，将冻存管置于磁力架上，室温放置3min；轻轻打开冻存管盖，小心持两边拿起磁力架，倒置保持2-3s，将细胞液一次性倒入新的离心管中；用10-20ml缓冲液(视细胞量)重悬细胞后，300g离心10min，弃掉上清，得到CD3 +T细胞。
(4)T细胞激活
激活试剂按培养基:Transact＝99:1体积比进行配置，培养基为X-VIVO15培养基(含5％FBS、200U/ml IL2、10ng/ml IL7和5ng/ml IL15)、Transact购自美天旎。T细胞按每1×10 6个细胞用1ml激活试剂(含有10μl Transact)充分重悬后，放置于37℃、5％CO 2培养箱中孵育1天。
实施例3
3.1转病毒
按照实施例2的方式获得CD3+T细胞(D0天)，并用CD3/CD28抗体磁珠激活，激活后于D1天进行慢病毒载体(实施例1制备的GD2 CAR慢病毒表达载体)转染，D2天洗去慢病毒载体，D3天进行电转。
3.2基因敲除
使用电转试剂盒(购自LONZA，货号V4XXP-3024)通过电转方式将RNP复合体转入3.1制备的激活后T细胞(取D3天的CAR-T细胞为初始细胞)。取样计数后收集细胞离心，用PBS重悬细胞沉淀。提前30min在孔板中预热培养基(X-VIVO15培养基+10％FBS+IL2(200U/ml)+IL7(10n g/ml)+IL15(5ng/ml))。准备电转缓冲液：Nucleofector Solution：Supplement按照82:18进行配置；根据每个电转体系使用1x10 7的细胞进行分配 RNP复合物(Cas9:sgRNA＝2:1)，先将10μg sgRNA加入到PCR管(无RNA酶)中，再加入20μg Cas9蛋白(购自thermo，货号A36499)，轻轻混匀后，室温孵育12min。将上述细胞进行计数，300g离心8min弃上清，加入PBS重悬细胞，吸取1E7个细胞重新300g离心8min，弃上清后用100μl配置好的电转缓冲液重悬细胞。将孵育好的RNP复合体加入上述细胞悬液中，轻柔混匀，然后将混合物轻轻地转移到电转杯中。将电转杯放在Lonza-4D电转仪上，选用EO-115电转程序进行电转。往电转杯中加入预热的培养基，然后用配套吸管将细胞转入孔板中预热的培养基中，然后放置于37℃、5％CO 2培养箱中培养48小时后收细胞，sanger测序检测编辑效率，同时收细胞FACS检测敲除效率。
其中sgRNA序列TRAC sgRNA：AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO:144)，A02sgRNA：CTGACCATGAAGCCACCCTG(SEQ ID NO:161)，A11sgRNA：GGCCCCTCCTGCTCTATCCA(SEQ ID NO:191)。
3.3 CD3阴性T细胞分选
进行CD3阴性T细胞分选，细胞计数后离心，弃上清；用buffer重悬细胞并混匀，按20ul CD3磁珠/10 7的细胞加CD3磁珠，混合均匀后放4度冰箱孵育，加buffer洗涤细胞离心后进行磁珠分离，首先将column放在磁极上，下面对应放离心管，用buffer浸润column(LD)，将细胞加到column上，不要产生气泡，用buffer清洗column 2次，收集清洗下来的液体(CD3-T)于15ml离心管中，取部分细胞进行细胞计数。
3.4细胞培养
镜下观察细胞状态，取细胞进行稀释计数，补充全培养基维持细胞密度在3x10^5-1x10^6个/ml，中间补/换液，放入37℃、5％CO 2培养。细胞收获：收集到细胞离心管中离心后弃上，用生理盐水再次洗涤细胞，离心，配制冻存液，冻存液重悬离心后的细胞，用注射器吸取细胞悬液至终制品用细胞冻存袋中，在细胞冻存袋上贴好标签，进行下一步冻存。
3.5基因敲除效率检测
(1)Sanger测序检测
细胞计数，取3～5×10 4细胞，2000r/min离心5min，尽量去干净上清，然后每管加20μl DE裂解液，细胞裂解后加到PCR管中，瞬时离心后上PCR仪，上机条件：65℃30min，4℃30s、95℃2min、16℃无限。使用引物对TRAC-For/TRAC-Rev，或HLA-A For/HLA-A Rev，将裂解产物作为模板进行PCR，将PCR产物交送金唯智进行Sanger测序。得到sanger测序结果后，使用网站：https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/中的EditR编辑器预测编辑发生的位置以及编辑效率。
(2)流式检测细胞计数
取10E5至10E8细胞，2000rpm离心5min，去上清，然后每管加100μl的PBS缓冲液重悬细胞，再加入anti-human AB TCR-APC(购自eBioscience)抗体5μl，HLA-A02 Monoclonal Antibody(BB7.2)，APC，eBioscince TM(购自invitrogen)抗体5μl，混合均匀后于室温孵育10min。2000rpm离心5min后再以PBS缓冲液洗2遍，重悬细胞并通过BD FACSAria流式细胞仪进行检测，可得细胞表面TCR、HLA-A02表达阳性率。敲除效率＝(A-B)/A×100％；A为对照组表达阳性率；B为敲除组表达阳性率。
结果如图3A-3D所示，anti-GD2 UCAR-T细胞CAR阳性率可达60％以上(图3A)，anti-GD2 UCAR-T细胞中心记忆比例达45％左右(图3B)，anti-GD2 UCAR-T细胞双敲效率高达95％以上(图3C)，平均扩增倍数150X以上(图3D)。
实施例4 anti-GD2 UCAR-T细胞体外细胞毒性分析
4.1 anti-GD2 UCAR-T细胞对靶细胞的杀伤
(1)GD2靶细胞：IMR-32-Luciferase-GFP；调整靶细胞状态至对数生长期，在进行实验前需连续传代2次；
(2)制备anti-GD2 UCAR-T细胞及对照组anti-GD2 CAR-T，T细胞，流式检测敲除效率，转染效率，CD3-T分选效率及记忆T细胞的比例，统计扩增倍数；
(3)离心收集制备的几组细胞，每组6x10^6的细胞；
(4)将靶细胞重悬于1640+10％FBS中，每个靶点取3块24孔板，按照2x10^5/孔的量接种靶细胞。(靶细胞和效应细胞都是2x10^6/ml的密度接种)。然后按照E/T(效靶比，效应细胞：靶细胞)比例，加入效应细胞。每孔补液到最大体积(如600ul)。对照接种同样数量的靶细胞，不加效应细胞(600ul)。将孔板置于5％CO 2、37℃培养箱中，培养24小时。E/T：1:2，1:1，2:1，5:1，10:1铺板，重复三次。
(5)培养24小时，将孔板从培养箱中取出，收集200ul上清。然后通过检测Luciferase活性反映重组CAR-T细胞对靶细胞的裂解能力。
靶细胞裂解百分数计算公式：
结果分析：anti-GD2 UCAR-T对IMR-32-LG细胞有显著的杀伤作用，在效靶比2:1时即可达到95％以上的杀伤效率(见图4)。
4.2 anti-GD2 UCAR-T细胞与靶细胞共培养细胞因子分泌检测
收集上述共培养体系的上清，检测细胞因子分泌水平。结果分析(图5A-5C)：anti-GD2 UCAR-T显著激活，大量分泌IL-2，IFN-γ和TNF-α细胞因子。
实施例5 anti-GD2 UCAR-T细胞体内抗肿瘤效果
8-10周大的NSG小鼠静脉注射肿瘤细胞IMR-32-Luciferase-GFP(1x10^6-1x10^7)，小鼠分成三组，每组5只。肿瘤成功建立后第7天分别向小鼠瘤内注射anti-GD2 UCAR-T细胞，anti-GD2 CAR-T细胞，无基因敲除的T细胞各5x10^6，通过荧光素酶监测小鼠肿瘤消退情况。
结果分析(图6)：回输anti-GD2 UCAR-T细胞的小鼠，肿瘤生长速度明显减缓，anti-GD2 UCAR-T细胞表现出卓越的抗肿瘤效果。
实施例6 anti-GD2 UCAR-T细胞体内半衰期检测
准备人源化免疫系统小鼠(hHSC-NCG)15只，分成3组。制备细胞，实验组anti-GD2 UCAR-T细胞(敲除TRAC+HLA-A02)；对照组1：anti-GD2 CAR-T；对照组2：anti-GD2 UCAR-T细胞(敲除TRAC+B2M)；每只小鼠注射1x10^7细胞，不同的时间点采血D0，2h，D3，D7，D14，D21，D28，D35，D42，D49，D56，D60。提取不同时间点血样中基因组，用QPCR绝对定量的方法计算copy/ng genome DNA，阳性对照用第14天收获的UCAR-T细胞，阴性对照用DEPC水。
结果分析(图7)：anti-GD2 UCAR-T细胞(敲除TRAC+HLA-A02)在小鼠体内存活时间超过7周，并在week4进行二次扩增。
实施例7通用型T细胞的体外安全性验证
(1)GVHD反应：制备TRAC，HLA-A双敲T细胞，无基因敲除的T细胞，辐照同种异体PBMC，分别刺激制备的2组细胞，检测IFN-r的水平。
结果分析：TRAC，HLA-A双敲T细胞组IFN-γ分泌水平很低，表明TRAC敲除降低了GVHD反应。
(2)同种异体反应：同种异体PBMC刺激辐照后的2组细胞，检测IFN-r的水平。
结果分析：TRAC，HLA-A双敲T细胞组IFN-γ分泌水平很低，表明HLA-A的敲除降低了同种异体反应。
实施例8通用型T细胞的体内安全性验证
(1)GVHD反应：制备TRAC，HLA-A双敲T细胞，无基因敲除的T细胞。取8-10周NSG小鼠分别注射1x10^7，通过临床指标：存活率，皮毛纹理和皮肤完整性等，观察移植物抗宿主反应。细胞因子检测：取外周血血清，检测IL6、IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子的水平。取血时间点：回输前，24h，D3，D7，D14，D28，2M。脏器病变检测：观察期结束时(2个月左右)，取小鼠的脾脏，肝脏，皮肤、胃肠道，肺，肾脏进行HE切片染色分析。
结果分析：注射未经处理的T细胞的5只小鼠中，有4只在注入后2个月内发生了致死性异种移植物抗宿主病(GVHD)。而接受TRAC，HLA-A双敲细胞的小鼠中没有一个出现GVHD；TRAC，HLA-A双敲T细胞组细胞因子IL6、IL-2、TNF-α、IFN-γ分泌水平很低；并且小鼠不同器官形态正常。说明TRAC，HLA-A双敲T细胞组很大程度上降低了GVHD反应。
(2)同种异体反应：制备TRAC，HLA-A双敲CAR-T细胞，共同注射1x10^7TCR-HLA-A-双敲CAR-T细胞(辐照)和2x10^6同种异型T细胞到NSG小鼠体内。对照组：注射1x10^7TCR -CAR-T细胞到NSG小鼠体内。
不同时间点取血测CAR拷贝数。比较两组CAR的拷贝数变化。时间点：D1，D5，D7，D10，D14，D24。
结论：D24天，对照组小鼠排异反应明显，基本检测不到拷贝数；而实验组拷贝数仍处在相对稳定水平，说明排异反应明显减弱，实验组细胞在小鼠体内存活时间延长说明TRAC，HLA-A双敲CAR-T细胞组很大程度上降低了排异反应(见图8A-8B)。
实施例9基因编辑的安全性分析
制备TRAC，HLA-A双敲T细胞，无基因敲除的T细胞，检测敲除效率后，进行以下分析：
(1)脱靶：
对照组：转CAS9+ODN标签
实验组：转CAS9+sgRNA(TRAC+HLA-A)+ODN标签
On-target and off-target-WGS:(Whole genome sequencing)：分别取无基因敲除的T细胞、TRAC，HLA-A双敲的T细胞各1×10^6送苏州金维智生物科技有限公司检测。
结果分析：实验组脱靶率很低，而且脱靶主要集中在基因之间和内含子上，对基因功能 的影响不大(见图9)。
(2)染色体易位：采用qPCR方法对同时编辑TRAC和HLA基因座时可能发生的重排进行了定量。两个易位被标记为TRAC:HLA，HLA:TRAC。合成的模板质粒中的阳性参考样品作为检测对照进行评估。以HLA基因组靶区两侧的扩增片段作为内对照。提取基因组DNA进行实时定量PCR，根据标准曲线和Cq值计算基因组DNA的基因拷贝数。
结果分析：双敲T细胞(TRAC+HLA-A)在D14(收获)检测是否发生染色体易位，检测结果：两种易位方式检测值都接近零检值，提示基因座没有发生重排(见图10)。
(3)核型分型：分别取铺满度在70-80％的无基因敲除的T细胞、TRAC，HLA-A双敲的T细胞各1×10^6装于2个T25瓶中，加满培养液，盖上全密封盖子，缠上封口膜，寄送至浙江如耀生物科技有限公司检测。
结果分析：和对照组比，实验组核型正常(见11)。
(4)Cas9蛋白残留：细胞制备时，取敲除前、敲除后以及收获前三个时间点的细胞各1×10^6进行裂解，随后用蛋白定量试剂盒(NOVATEINBIO，货号NB-E1372PR)进行定量，将各组样品调整至相同上样量2μg，根据说明书用CRISPR/Cas9蛋白ELISA试剂盒进行检测。样品中的Cas9蛋白被牢固稳定地点在试纸孔上。然后使用检测抗体识别被绑定的Cas9蛋白，然后显影剂进行显影。Cas9比值与吸光度成正比，通过与Cas9对照品比较来定量Cas9蛋白的绝对量。
结果分析：双敲T细胞(TRAC+HLA-A)分别在电转前(D3)、电转后换液前(D5)、D9、D14(收获)四个时间点检测spCas9的残留，除了电转后换液前(D5)检测到微量残留，其余三个时间点均未检出。(见图12)。
实施例10制备单基因敲除的T细胞
使用电转试剂盒(购自LONZA，货号V4XXP-3024)通过电转方式将RNP复合体转入实施例2制备的激活后T细胞。提前30min在孔板中预热培养基(X-VIVO15培养基+10％FBS+IL2(200U/ml)+IL7(10n g/ml)+IL15(5ng/ml))。电转缓冲液按照Nucleofector Solution：Supplement＝82:18进行配置。准备RNP复合体：TRAC的sgRNA序列为sg9(如SEQ ID NO:144所示)，HLA-A的sgRNA序列为HLA-A02 Sg2(如SEQ ID NO:160所示)或HLA-A02Sg5(如SEQ ID NO:161所示)或HLA-A11sg21(如SEQ ID NO:191所示)或HLA-A11Rsg2(如SEQ ID NO:190所示)，先将20μg sgRNA加入到PCR管(无RNA酶)中，再加入10μg Cas9蛋白(购自thermo，货号A36499)，轻轻混匀后，室温孵育12min。将实施例2培养的激活后T细胞进行计数，300g离心8min弃上清，加入PBS重悬细胞，吸取1E7个 细胞重新300g离心8min，弃上清后用100μl配置好的电转缓冲液重悬细胞。将孵育好的RNP复合体加入上述细胞悬液中，轻柔混匀，然后将混合物轻轻地转移到电转杯中。将电转杯放在Lonza-4D电转仪上，选用EO-115电转程序进行电转。往电转杯中加入预热的培养基，然后用配套吸管将细胞转入孔板中预热的培养基中，然后放置于37℃、5％CO 2培养箱中培养。
实施例11基因敲除效率检测方法的比较
(1)Sanger测序检测
细胞计数，取3～5×104细胞，2000r/min离心5min，尽量去干净上清，然后每管加20μl DE裂解液，细胞裂解后加到PCR管中，瞬时离心后上PCR仪，上机条件：65℃30min，4℃30s、95℃2min、16℃无限。使用引物对TRAC-For/TRAC-Rev，或HLA-A For/HLA-A Rev，将裂解产物作为模板进行PCR，将PCR产物交送金唯智进行Sanger测序。得到sanger测序结果后，使用网站：https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/中的EditR编辑器预测编辑发生的位置以及编辑效率。
(2)TA克隆测序检测
利用AxyPrepTM PCR产物清洁试剂盒(购自AXYGEN)，将PCR产物纯化，随后用试剂盒(DNA A-Tailing Kit，购自TaKaRa)将纯化后的PCR产物加粘性末端，通过DNA Ligation Kit Ver2.1(购自TaKaRa)将产物连接至T载体(pMDTM19-T Vector Cloning Kit购自TaKaRa)，连接产物转化感受态细胞(DH5alpha)，然后涂布于含氨苄抗性的LB板，在37℃培养箱培养约12小时后挑单菌落，并将单菌落菌液交由金维智进行测序。敲除效率＝突变克隆数/总克隆数。
(3)流式检测细胞计数
取10E5至10E8细胞，2000rpm离心5min，去上清，然后每管加100μl的PBS缓冲液重悬细胞，再加入anti-human AB TCR-APC(购自eBioscience)抗体5μl，HLA-A02 Monoclonal Antibody(BB7.2)，APC，eBioscince TM(购自invitrogen)抗体5μl，混合均匀后于室温孵育10min。2000rpm离心5min后再以PBS缓冲液洗2遍，重悬细胞并通过BD FACSAria流式细胞仪进行检测，可得细胞表面TCR、HLA-A02表达阳性率。敲除效率＝(A-B)/A×100％；A为对照组表达阳性率；B为敲除组表达阳性率。
TRAC单基因敲除的三种检测结果如图13至图15所示，敲除效率计算结果如表1所示，三种检测方法基本相同，后续试验仅采用Sanger测序方法检测编辑效率。
表1基因敲除效率检测方法结果
针对HLA-A02基因编辑的Sanger测序方法结果如图16-17所示，编辑效率均为90％；针对HLA-A11基因编辑的Sanger测序方法结果如图18-19所示。
实施例12制备TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞
使用电转试剂盒(购自LONZA，货号：V4XXP-3024)通过电转方式将RNP复合体转入实施例2制备的激活后T细胞。提前30min在孔板中预热培养基(X-VIVO15培养基+10％FBS+IL2(200U/ml)+IL7(10ng/ml)+IL15(5ng/ml))。电转缓冲液按照Nucleofector Solution：Supplement＝82:18进行配置。准备RNP复合体：分别将20μg TRAC sgRNA(TRAC Sg9)，20μg HLA-A sgRNA(HLA-A02 Sg2或HLA-A02 Sg5或HLA-A11sg21或者靶向HLA-A*24:02:01、HLA-A*30:01:01:01、HLA-A*33:01:01:01、HLA-A*03:01:01:01、HLA-A*01:01:01:01或HLA-A*26:01:01:01的sgRNA)加入到PCR管(无RNA)中，再各自加入10μg Cas9蛋白(购自thermo，货号A36499)，轻轻混匀后，室温孵育12min。将实施例2培养的激活后T细胞进行计数，300g离心8min弃上清，加入PBS重悬细胞，吸取1E7个细胞重新300g离心8min，弃上清后用100μl配置好的电转缓冲液重悬细胞。将孵育好的TRAC与HLA-A的RNP复合体加入上述细胞悬液中，轻柔混匀，然后将混合物轻轻地转移到电转杯中。将电转杯放在Lonza-4D电转仪上，选用EO-115电转程序进行电转。往电转杯中加入预热的培养基，然后用配套吸管将细胞转入孔板中预热的培养基中，然后放置于37℃、5％CO 2培养箱中培养。
通过测序检测双基因敲除效率，可得到双基因敲除效率均不低于80％的TRAC阴性、HLA-A阴性的T细胞。结果如图20-21所示。其中图20A显示的是利用HLA-A02 Sg5敲除HLA-A02的结果，其中上一行显示的是对照组结果(即没有使用HLA-A02 Sg5进行敲除)；下一行显示的是同时敲除HLA-A02和TRAC的结果；其中图20B显示的是利用TRAC Sg9敲除TRAC的结果，其中上一行显示的是对照组结果(即没有使用TRAC Sg9进行敲除)；下一行显示的是同时敲除HLA-A02和TRAC的结果。图21A-21B显示了敲除HLA-A02和 TRAC蛋白水平的敲除情况，其中NEG指阴性对照，WT指没有经任何敲除处理的情况，TRAC+HLA-A双敲指同时敲除HLA-A02和TRAC的结果。
实施例13双基因敲除的T细胞中TRAC基因，HLA-A基因，B2M基因和CIITA基因与相应细胞中的相应基因的表达区别
(1)利用实施例2制备的激活后T细胞，分为两组，一组作为对照，另一组按照实施例5的方法制备TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞，按照实施例4步骤(1)的方式进行Sanger测序。依据测序结果获得TRAC和HLA-A双基因敲除的细胞。将制备的双基因敲除T细胞与相应TRAC和HLA-A抗体孵育，通过流式分选或磁珠分选，可以得到双基因敲除的细胞株。
(2)检测双基因敲除的T细胞与对照组相比mRNA表达水平的变化。使用RNA提取试剂盒(购自QIAGEN，货号：74004)提取RNA，使用逆转录试剂盒(购自Applied Biosystems，货号：4368814)对RNA进行逆转录得到cDNA，以cDNA为模板进行定量PCR检测。
(3)检测双基因敲除的T细胞与对照组相比蛋白表达水平的变化。使用全蛋白提取试剂(购自Thermo Scientific，货号：87787)提取蛋白，通过Western Blot方法或流式方法检测蛋白表达水平，使用的抗体分别为TRAC抗体(购自eBioscience货号：17-9986-42)、HLA-A抗体(购自Merck货号：17-9876-41)、B2M抗体(购自Invitrogen货号：A15770)和CIITA抗体(购自OriGene货号：CF812200)。
Sanger测序检测双基因敲除的T细胞中TRAC和/或HLA-A基因的核苷酸序列相对于对照组发生了变化；定量PCR显示双基因敲除的T细胞中TRAC和/或HLA-A基因mRNA表达量下调，而B2M和/或CIITA基因的mRNA表达量没有下调。FACS和Western Blot结果显示双基因敲除的T细胞中蛋白表量下调，B2M和/或CIITA蛋白表达量没有下调。
结果如图22-23所示。其中，图22显示的是基因表达的mRNA水平测定，其中图22显示了TRAC、HLA-A、B2M和CIITA的mRNA水平；其中WT指没有经任何敲除处理的情况，双敲组指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结果。图23显示的是基因表达的蛋白水平测定，其中图23A-23B分别显示了B2M和CIITA的蛋白表达水平；其中NEG指阴性对照，WT指没有经任何敲除处理的情况，TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结果。
实施例14制备TRAC基因、HLA-A/B2M基因和CIITA基因三基因敲除的T细胞并验证其中相应三种基因的表达变化
(1)按照实施例13步骤(1)的方式准备对照组和TRAC基因、HLA-A基因和CIITA基因三基因敲除的细胞，以及TRAC基因、B2M基因和CIITA基因三基因敲除的细胞。
(2)按照实施例13步骤(3)的方式通过FACS和Western Blot方法检测蛋白表达水平变化。
相对于对照组细胞，TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的T细胞中TRAC、HLA-A和CIITA基因的蛋白表达量下调；相对于对照组细胞，TRAC、B2M和CIITA三基因敲除的T细胞中TRAC、HLA-A和CIITA基因的蛋白表达量下调。
(3)使用TRAC(购自eBioscience，货号：17-9986-42)、HLA-A(购自Merck，货号：17-9876-41)、B2M(购自：Invitrogen，货号：A15770)抗体通过流式细胞术检测实施例13中的双基因敲除细胞和本实施例中的两种三基因敲除细胞的敲除效率，结果显示在单细胞水平同时实现多基因敲除的效率，双基因敲除明显高于三基因敲除。
结果如图24A-24D所示。其中图24A-24C依次为TRAC、HLA-A和B2M蛋白质水平的敲除情况。其中，WT指没有经任何敲除处理的情况，TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结果；TRAC+HLA-A+CIITA三敲指TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的T细胞的结果；其中TRAC+B2M+CIITA三敲指B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的T细胞的结果；TRAC+HLA-A敲低指实施例16制备的TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞的结果。图24D显示了CIITA蛋白质水平的敲除情况。
图24的结果显示，和WT对照组相比，TRAC、HLA-A、CIITA和B2M的蛋白质水平下调。同时，与TRAC+HLA-A+CIITA三敲或TRAC+B2M+CIITA三敲相比，TRAC+HLA-A双敲的敲除效率更高。
实施例15设计反义RNA序列
通过数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/或www.ensembl.org/，获得相应基因(TRAC基因和HLA-A基因)的转录RNA序列，参考如下原则设计siRNA：
尽量避免起始密码子下游50-100个核苷酸与终止密码子上游100个核苷酸的序列；选择长度小于30个核苷酸的序列；避免4个或以上的连续相同碱基；避免内含子区域；避免重复序列；避免单核苷酸多态性(SNP)位点；序列GC含量30％-60％之间，优先选择序列模式AA(N<sub>19)、NA(N<sub>21)或NAR(N<sub>17)YNN，A为腺苷酸；T为胸腺苷酸；R为 腺苷酸或鸟苷酸(嘌呤类)；Y为胸腺苷酸或胞苷酸(嘧啶类)；N为腺苷酸、胸腺苷酸、鸟苷酸或胞苷酸；对选择的序列进行同源性比较分析，避免反义RNA与其他基因或序列具有显著的同源性，由此造成脱靶效应。同源性分析利用NCBI Blast tool:Nucleotide-nucleotide BLAST(blastn)，UCSC Blat tool或Ensembl Blast进行。
设计获得的反义RNA序列包括HLA-A-homo-551(其包含SEQ ID NO:200所示的核苷酸序列)；HLA-A-homo-NEG(其包含SEQ ID NO:201所示的核苷酸序列)；TRAC-homo-375(其包含SEQ ID NO:202所示的核苷酸序列)；TRAC-homo-NEG(其包含SEQ ID NO:203所示的核苷酸序列)。
实施例16制备TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞
利用通过实施例15设计的反义RNA进行双基因敲低。公司制备TRAC基因和HLA-A基因反义RNA序列的慢病毒(吉玛)。按照实施例2的方式制备CD3 +T细胞(D0天)，并用CD3/CD28抗体磁珠激活，将携带TRAC基因和HLA-A基因的反义RNA序列的慢病毒转染激活的T细胞(D1天)，D2天洗去慢病毒载体，继续培养至D5天。收集培养至D5天的T细胞，通过定量PCR或Western Blot等方法对基因敲低效率进行检测。对获得的T细胞进行相应TRAC和HLA-A抗体标记，通过流式分选或磁珠分选的方式可以得到TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞。结果显示，TRAC和HLA-A基因敲低组中TRAC和HLA-A的mRNA和蛋白表达水平均下调。其中，图25A-25B依次为TRAC和HLA-A mRNA水平的敲除情况。其中，WT指没有经任何敲除处理的情况，TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结果。其中，为TRAC和HLA-A蛋白质水平的敲除水平可以参见图24的结果。
实施例17不同T细胞活性的区别
制备实施例2、12、14和16中的无基因敲除、双基因敲除、三种基因敲除和双基因敲低的T细胞，比较几种T细胞活性各组细胞计数并分别各取1*10 6细胞接种24孔板中，每孔加入PHA(0.3μg/ml)(离子霉素+)或5ng/ml的PMA和50ng/ml的ionomycin于细胞中，继续培养5小时后，使用CD69(早期活化)(购自BD Biosciences，货号：FN50)、CD137(偏晚期)(购自BD Biosciences，货号：4B4-1)抗体，流式检测细胞的活化状态。结果表明，双基因敲除、双基因敲低的T细胞活性优于三基因敲除的T细胞。
CD69和CD137的蛋白质水平表达情况分别参见图26A-26B。其中，WT指没有经任何敲除处理的情况，TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结 果；TRAC+HLA-A+CIITA三敲指TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的T细胞的结果；其中TRAC+B2M+CIITA三敲指B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的T细胞的结果；TRAC+HLA-A敲低指实施例16制备的TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞的结果。
实施例18不同T细胞对异体NK细胞反应性的区别
对实施例2、12、14和16中的无基因敲除、双基因敲除、三种基因敲除和双基因敲低的T细胞进行CFSE(invitrogen，C34554)标记，细胞计数，分别取1*10 6细胞并以1：1比例与NK细胞(NK92MI)进行共培养，24小时后收集共培养的各组细胞，流式细胞检测混合细胞中CFSE阳性细胞的比率。
结果表明，NK细胞对双基因敲除、双基因敲低的T细胞的杀伤毒性低于三基因敲除的T细胞。结果如图27所示。其中，NK+T指将NK细胞与没有经任何敲除处理的T细胞共培养的情况；NK+TRAC+HLA-A敲低指将NK细胞与实施例16制备的TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞的结果共培养的情况；NK+TRAC+HLA-A双敲指将NK细胞与TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞共培养的情况；NK+TRAC+HLA-A+CIITA三敲指将NK细胞与TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的T细胞共培养的情况；NK+TRAC+B2M+CIITA三敲指将NK细胞与B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的T细胞共培养的情况。
实施例19不同的T细胞异体免疫排斥反应的区别
供者1来源的外周血制备实施例2、12、14和16中的无基因敲除、双基因敲除、三种基因敲除和双基因敲低的T细胞。供者2来源的外周血制备CD3 +T细胞。将供者1外周血制备的各组细胞分别与供者2外周血按照实施例2制备的CD3 +T细胞等比例混合，24小时后检测细胞混合体系中的IFN-γ的表达水平。结果显示，双基因敲除的T细胞组IFN-γ的表达水平低于三基因敲除的T细胞组。
结果如图28所示，WT指没有经任何敲除处理的情况，TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结果；TRAC+HLA-A+CIITA三敲指TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的T细胞的结果；其中TRAC+B2M+CIITA三敲指B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的T细胞的结果；TRAC+HLA-A敲低指实施例16制备的TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞的结果。
实施例20制备TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞，TRAC基因，HLA-A基因和CIITA基因三基因敲除的CAR-T细胞以及TRAC基因，B2M基因和CIITA基因敲除的CAR-T细胞
(1)按照实施例2的方式获得CD3 +T细胞(D0天)，并用CD3/CD28抗体磁珠激活，激活后于D1天进行慢病毒载体(包含CD19-CAR、CD20-CAR或BCMA-CAR等的慢病毒)转染，D2天洗去慢病毒载体，D3天对CAR阳性的T细胞进行分选并继续培养至D5天。
(2)取D5天的CAR-T细胞为初始细胞，分别按照实施例12和实施例14中的方式制备TRAC基因和HLA-A基因双基因基因敲除的细胞，TRAC基因、HLA-A基因和CIITA基因以及TRAC基因、B2M基因和CIITA基因三基因敲除的CAR-T细胞。
(3)通过流式细胞技术检测可得到上述双基因敲除和三基因敲除的CAR-T细胞，其中双基因敲除CAR-T细胞的得率高于三基因敲除CAR-T细胞。
结果如图29A-29D所示。其中，图29A-29C依次为TRAC、HLA-A和B2M蛋白质水平的敲除情况。图29D显示了CIITA蛋白质水平的敲除情况。其中，WT指没有经任何敲除处理的情况，TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞的结果；TRAC+HLA-A+CIITA三敲指TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的CAR-T细胞的结果；其中TRAC+B2M+CIITA三敲指B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的CAR-T细胞的结果。
其中，CD19CAR的转染效率如图30A-30B所示。其中，CAR30％+即代表CD19CAR的转染效率。
图31显示了不同细胞的扩增倍数。其中，TRAC基因和HLA-A基因双基因基因敲除的CAR-T细胞扩增倍数最高。
实施例21 TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞抗肿瘤效果
制备实施例21中的TRAC基因和HLA-A基因双敲除的CAR-T细胞(靶向CD19、CD20或BCMA)，接种表达荧光素酶基因的靶细胞(靶基因阳性的白血病或淋巴瘤细胞系，如Raji、Jurkat、MM1S等)至孔板中，再分别以不同效靶比(1∶2.5，1∶1，5：1，10：1)加入双基因敲除的CAR-T细胞、三基因敲除的CAR-T细胞或无基因敲除的T细胞，共培养24小时后将细胞转移至检测孔板中，加入荧光素酶底物，酶标仪检测荧光值。杀伤效率＝1-靶细胞T细胞共培养荧光值/单独培养的靶细胞荧光值。
结果显示TRAC基因和HLA-A基因双敲除的CAR-T细胞对肿瘤细胞有显著的杀伤效 果。
图32显示了对CD19靶细胞Raji-Luciferase的杀伤效果，其中TRAC基因和HLA-A基因双敲除的CAR-T细胞的杀伤效果最为显著。其中每个E/T比下从左到右依次是A-D的图注所对应的结果。
实施例22 TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞抗肿瘤效果
NSG小鼠静脉注射肿瘤细胞，肿瘤成功建立后向小鼠体内回输TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞、三基因敲除的CAR-T细胞或无基因敲除的T细胞，监测小鼠肿瘤体积。
回输双基因敲除CAR-T细胞的小鼠，肿瘤生长速度明显减缓。
结果如图33-34所示。其中，图33显示了对小鼠的给药方式，i.v.表示静脉注射，CAR-T细胞代表表达CD19CAR的双基因敲除的CAR-T细胞、三基因敲除的CAR-T细胞。图34显示了小鼠在施用CAR-T细胞后体内肿瘤的体积情况。其中，图34从左至右列依次显示了分别施用生理盐水、未改造的T细胞、TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CD19CAR-T细胞、TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的CD19CAR-T细胞、B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的CD19CAR-T细胞后，小鼠体内肿瘤的体积情况。结果发现回输TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞的小鼠，肿瘤生长的速度明显减缓。
综上，
1.本申请首次构建了高效率双敲除TCR，HLA-A的GD2-UCAR-T细胞，做到一种安全型货架式即用型治疗剂，提高了抗肿瘤效果，用于神经母细胞瘤、骨肉瘤、胶质瘤等肿瘤的治疗。
2.本申请提供了一种慢病毒表达载体。以pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP为骨架，将载体的氨苄抗性基因β-内酰胺酶替换为源自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶，使载体具有卡那霉素抗性；删除了在体内应用中具有潜在威胁性的CMV启动子及其临近的下游多克隆位点；将原载体中由EF1启动子启动表达的copGFP基因删除，保留SalI酶切位点，并在SalI 5’端加入SmaI酶切位点供载体构建用，形成最终目的载体。
3.本申请优化了蛋白质RNA复合体电转染技术。获得了原代T细胞中90％以上的双基因敲除效率。
4.本申请供者来源基于人群中高频出现的HLA-B纯合子，患者HLA-B其中一个等位基因和供者纯合子一致即可，来源于这些供者的细胞能覆盖高数量的患者人群，且能够降低HLA-B引起的排异反应。
5.本申请筛选出了与排异高度相关的HLA-A分子进行敲除，而保留了其他HLA-I类分子，既减少了异体细胞的排异，也避免了HLA分子完全敲除被NK细胞清除的发生，大大延长了同种异体CAR-T细胞在体内的半衰期。

Claims (122)

  1. 免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞中的T细胞抗原受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHCI，MHCII)在细胞中的功能受到抑制，且所述免疫效应细胞包含靶向GD2的嵌合抗原受体(CAR)。
  2. 根据权利要求1所述的免疫效应细胞，所述CAR包含靶向部分，所述靶向部分包含抗体重链可变区(VH)，所述VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
  3. 根据权利要求2所述的免疫效应细胞，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
  4. 根据权利要求2-3中任一项所述的免疫效应细胞，所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
  5. 根据权利要求2-4中任一项所述的免疫效应细胞，所述VH包含：包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3。
  6. 根据权利要求2-5中任一项所述的免疫效应细胞，所述VH包含重链框架区1(HFR1)、重链框架区2(HFR2)、重链框架区3(HFR3)和重链框架区4(HFR4)，所述HFR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
  7. 根据权利要求6所述的免疫效应细胞，所述HFR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
  8. 根据权利要求6-7中任一项所述的免疫效应细胞，所述HFR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
  9. 根据权利要求6-8中任一项所述的免疫效应细胞，所述HFR4包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
  10. 根据权利要求2-9中任一项所述的免疫效应细胞，所述VH包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，且所述HFR1、HFR2、HFR3和HFR4选自：
    包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的HFR1，包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HFR2，包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HFR3，包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HFR4。
  11. 根据权利要求2-10中任一项所述的免疫效应细胞，所述VH包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
  12. 根据权利要求2-11中任一项所述的免疫效应细胞，所述靶向部分包含抗体轻链可变区(VL)，所述VL包含轻链互补决定区1(LCDR1)、轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述LCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
  13. 根据权利要求12所述的免疫效应细胞，所述LCDR2包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
  14. 根据权利要求12-13中任一项所述的免疫效应细胞，所述LCDR3包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
  15. 根据权利要求12-14中任一项所述的免疫效应细胞，所述VL包含：包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR3。
  16. 根据权利要求12-15中任一项所述的免疫效应细胞，所述VL包含轻链框架区1(LFR1)、轻链框架区2(LFR2)、轻链框架区3(LFR3)和轻链框架区4(LFR4)，所述LFR1包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
  17. 根据权利要求16所述的免疫效应细胞，所述LFR2包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
  18. 根据权利要求16-17中任一项所述的免疫效应细胞，所述LFR3包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
  19. 根据权利要求16-18中任一项所述的免疫效应细胞，所述LFR4包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
  20. 根据权利要求16-19中任一项所述的免疫效应细胞，所述VL包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，且所述LFR1、LFR2、LFR3和LFR4选自：
    包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LFR1，包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的LFR2，包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的LFR3，包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的LFR4。
  21. 根据权利要求16-20中任一项所述的免疫效应细胞，所述VL包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
  22. 根据权利要求2-21中任一项所述的免疫效应细胞，所述靶向部分包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
  23. 根据权利要求2-22中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述靶向部分包括全长抗体、Fab、单链可变片段(scFv)或单域抗体(VHH)。
  24. 根据权利要求2-23中中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述靶向部分包括scFv。
  25. 根据权利要求2-24中中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述靶向部分包含位于VH与VL之间的接头多肽。
  26. 根据权利要求25所述的免疫效应细胞，其中所述接头多肽包括SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
  27. 根据权利要求2-26中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述靶向部分包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
  28. 根据权利要求1-27中任一项所述的免疫效应细胞，所述CAR包括跨膜域，所述跨膜域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的跨膜域：CD8A、CD8B、CD28、CD3ε(CD3e)、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L(CD154)、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64和SLAM。
  29. 根据权利要求28所述的免疫效应细胞，其中所述跨膜域包含源自CD8A的跨膜域。
  30. 根据权利要求28-29中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述跨膜域包含SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:77中任一项所示的氨基酸序列。
  31. 根据权利要求1-30中任一项所述的免疫效应细胞，所述CAR包括胞内共刺激信号传导结构域，所述胞内共刺激信号传导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内共刺激信号传导结构域：CD28、4-1BB(CD137)、CD27、CD2、CD7、CD8A、CD8B、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD40和MyD88。
  32. 根据权利要求31所述的免疫效应细胞，其中所述胞内共刺激信号传导结构域源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
  33. 权利要求31-32中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述胞内共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:78至SEQ ID NO:110中任一项所示的氨基酸序列。
  34. 根据权利要求1-33中任一项所述的免疫效应细胞，所述CAR包括胞内信号转导结构域，所述胞内信号转导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内信号转导结构 域：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef、DAP10、DAP-12和至少包含一个ITAM的结构域。
  35. 根据权利要求34所述的免疫效应细胞，其中所述胞内信号转导结构域包含源自CD3ζ的信号传导结构域。
  36. 根据权利要求34-35中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述胞内信号转导结构域包含SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:111至SEQ ID NO:121中任一项所示的氨基酸序列。
  37. 根据权利要求1-36中任一项所述的免疫效应细胞，所述CAR在靶向部分和跨膜域之间包括铰链区，所述铰链区包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的铰链区：CD28、IgG1、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8A、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、BTLA、GITR、DAP10、TIM1、SLAM、CD30和LIGHT。
  38. 根据权利要求37中任一项所述的免疫效应细胞，所述铰链区包含源自CD8A的铰链区。
  39. 根据权利要求37-38中任一项所述的免疫效应细胞，所述铰链区包含SEQ ID NO:122至SEQ ID NO:143中任一项所示的氨基酸序列。
  40. 根据权利要求1-39中任一项所述的免疫效应细胞，所述嵌合抗原受体的非靶向部分包含CD8A分子跨膜域、CD8A的铰链区、4-1BB的胞内共刺激信号传导结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。
  41. 根据权利要求1-40中任一项所述的免疫效应细胞，所述嵌合抗原受体的非靶向部分包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
  42. 根据权利要求1-41中任一项所述的免疫效应细胞，所述嵌合抗原受体还包含信号肽片段，所述信号肽片段的C端与所述靶向部分的N端连接。
  43. 根据权利要求42所述的免疫效应细胞，所述信号肽片段包括CD8A信号肽片段。
  44. 根据权利要求42-43中任一项所述的免疫效应细胞，所述信号肽片段包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
  45. 根据权利要求1-44中任一项所述的免疫效应细胞，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
  46. 根据权利要求1-45中任一项所述的免疫效应细胞，所述的免疫效应细胞包括人细胞。
  47. 根据权利要求1-46中任一项所述的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
  48. 根据权利要求1-47中任一项所述的免疫效应细胞，其包括自体的或非自体的免疫效应细胞。
  49. 根据权利要求1-48中任一项所述的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞包括经修饰的免疫效应细胞，其中所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
  50. 根据权利要求49所述的免疫效应细胞，其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因：TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
  51. 根据权利要求49-50中任一项所述的免疫效应细胞，所述经修饰的免疫效应细胞与未经修饰的相应细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
  52. 根据权利要求49-51中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的相应细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
  53. 根据权利要求49-52中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的相应细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
  54. 根据权利要求49-53中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
  55. 根据权利要求49-54中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
  56. 根据权利要求49-55中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
  57. 根据权利要求49-56中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调；和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
  58. 根据权利要求49-57中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述修饰包括：基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
  59. 根据权利要求49-58中任一项所述的免疫效应细胞，所述修饰包括所述免疫效应细胞中两个TRAC等位基因中的任意一个被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
  60. 根据权利要求49-59中任一项所述的免疫效应细胞，所述修饰包括所述免疫细胞中两个 TRAC等位基因被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
  61. 根据权利要求49-60中任一项所述的免疫效应细胞，所述修饰包括所述免疫细胞中TRAC基因外显子被敲除并且HLA-A基因外显子被敲除。
  62. 根据权利要求49-61中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9系统。
  63. 根据权利要求49-62中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用CRISPR/Cas9系统。
  64. 根据权利要求63所述的免疫效应细胞，其中所述修饰还包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
  65. 根据权利要求64所述的免疫效应细胞，其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA包含SEQ ID NO:144至SEQ ID NO:158中任一项所示的核苷酸序列。
  66. 根据权利要求63-65中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
  67. 根据权利要求66所述的免疫效应细胞，其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA包含SEQ ID NO:159至SEQ ID NO:199中任一项所示的核苷酸序列。
  68. 根据权利要求63-67中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
  69. 根据权利要求68所述的免疫效应细胞，其中Cas酶包括Cas9蛋白。
  70. 根据权利要求62所述的免疫效应细胞，其中所述反义RNA包含SEQ ID NO:200至SEQ ID NO:203中任一项所示的核苷酸序列。
  71. 根据权利要求1-71任一项所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞为HLA-B纯合子细胞。
  72. 根据权利要求71所述的免疫效应细胞，其中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子，HLA-B*15纯合子，HLA-B*46纯合子，HLA-B*13纯合子，HLA-B*51纯合子，HLA-B*58纯合子，HLA-B*07纯合子，HLA-B*35纯合子，HLA-B*44纯合子，HLA-B*52纯合子，HLA-B*57纯合子，HLA-B*54纯合子，HLA-B*55纯合子。
  73. 根据权利要求1-72中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
  74. 根据权利要求73所述的免疫效应细胞，其中所述HLA-A纯合子或杂合子包括HLA-A*02纯合子，HLA-A*11纯合子，HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
  75. 一种制备免疫效应细胞的方法，其包括：在向免疫效应细胞中引入编码权利要求1-74中任一项靶向GD2的CAR的多核苷酸序列或包含编码权利要求1-74中任一项靶向GD2的CAR的多核苷酸序列的载体之前/之后，修饰所述免疫效应细胞，所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
  76. 根据权利要求75所述的方法，其中所述载体是表达载体。
  77. 根据权利要求75-76中任一项述的方法，其中所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体。
  78. 根据权利要求75-77中任一项述的方法，其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因：TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
  79. 根据权利要求75-78中任一项所述的方法，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，下调所述免疫效应细胞中TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性。
  80. 根据权利要求75-79中任一项所述的方法，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
  81. 根据权利要求75-80中任一项所述的方法，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
  82. 根据权利要求75-81中任一项所述的方法，与相应的野生型细胞相比，所述免疫效应细胞的TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
  83. 根据权利要求75-82中任一项所述的方法，与相应的野生型细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
  84. 根据权利要求75-83中任一项所述的方法，与相应的野生型细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
  85. 根据权利要求75-84中任一项所述的方法，其中所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调；和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
  86. 根据权利要求75-85中任一项所述的方法，其中所述修饰包括：基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
  87. 根据权利要求75-86中任一项所述的方法，所述修饰包括所述免疫效应细胞中两个TRAC等位基因中的任意一个被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
  88. 根据权利要求75-87中任一项所述的方法，所述修饰包括所述免疫细胞中两个TRAC等位基因被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
  89. 根据权利要求75-88中任一项所述的方法，所述修饰包括所述免疫细胞中TRAC基因外显子被敲除并且HLA-A基因外显子被敲除。
  90. 根据权利要求75-89中任一项所述的方法，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9系统。
  91. 根据权利要求75-90中任一项所述的方法，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用CRISPR/Cas9系统。
  92. 根据权利要求91所述的方法，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
  93. 根据权利要求92所述的方法，其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA包含SEQ ID NO:144至SEQ ID NO:158中任一项所示的核苷酸序列。
  94. 根据权利要求91-93中任一项所述的方法，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
  95. 根据权利要求94所述的方法，其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA包含SEQ ID NO:159至SEQ ID NO:199中任一项所示的核苷酸序列。
  96. 根据权利要求91-95任一项所述的方法，其中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
  97. 根据权利要求96所述的方法，其中Cas酶包括Cas9蛋白。
  98. 根据权利要求90所述的方法，其中所述反义RNA包含SEQ ID NO:200至SEQ ID NO:203中任一项所示的核苷酸序列。
  99. 根据权利要求75-98中任一项所述的方法，其中所述免疫效应细胞包括人细胞。
  100. 根据权利要求75-99中任一项所述的方法，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
  101. 根据权利要求75-100中任一项所述的方法，所述免疫效应细胞包括自体的或非自体的免疫效应细胞。
  102. 根据权利要求75-101中任一项所述的方法，其中所述细胞为HLA-B纯合子细胞。
  103. 根据权利要求102所述的方法，其中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子，HLA-B*15纯合子，HLA-B*46纯合子，HLA-B*13纯合子，HLA-B*51纯合子，HLA-B*58纯合子，HLA-B*07纯合子，HLA-B*35纯合子，HLA-B*44纯合子，HLA-B*52纯合子，HLA-B*57纯合子，HLA-B*54纯合子，HLA-B*55纯合子。
  104. 根据权利要求75-103中任一项所述的方法，其中所述细胞为HLA-A纯合子或杂合子细 胞。
  105. 根据权利要求104所述的方法，其中所述HLA-A纯合子或杂合子包括HLA-A*02纯合子，HLA-A*11纯合子，HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
  106. 权利要求1-74中任一项所述经修饰的免疫效应细胞在制备CAR-T细胞中的应用。
  107. 药物组合物，其包含权利要求1-74中任一项所述经修饰的免疫效应细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
  108. 权利要求1-74中任一项所述经修饰的免疫效应细胞和/或权利要求107所述的药物组合物，其用于治疗与GD2的表达相关的疾病或病症。
  109. 根据权利要求108所述的用途，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括与GD2的表达上调相关的疾病或病症。
  110. 根据权利要求108-109中任一项所述的用途，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括癌症。
  111. 根据权利要求110所述的用途，其中所述癌症包括GD2阳性肿瘤。
  112. 根据权利要求110-111中任一项所述的用途，其中所述癌症包括：神经母细胞瘤，黑色瘤，视网膜母细胞瘤，小细胞肺癌，尤文肉瘤，成神经管细胞瘤，软组织肉瘤，骨肉瘤或胶质瘤。
  113. 权利要求1-74中任一项所述经修饰的免疫效应细胞和/或权利要求107所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与GD2的表达相关的疾病或病症。
  114. 根据权利要求113所述的用途，所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括与GD2的表达上调相关的疾病或病症。
  115. 根据权利要求113所述的用途，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括癌症。
  116. 根据权利要求115所述的用途，其中所述癌症包括GD2阳性肿瘤。
  117. 根据权利要求115-116中任一项所述的用途，其中所述癌症包括：神经母细胞瘤，黑色瘤，视网膜母细胞瘤，小细胞肺癌，尤文肉瘤，成神经管细胞瘤，软组织肉瘤，骨肉瘤或胶质瘤。
  118. 预防或治疗与GD2的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1-74中任一项所述经修饰的免疫效应细胞和/或权利要求107所述的药物组合物。
  119. 根据权利要求118所述的用途，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括与GD2的表达上调相关的疾病或病症。
  120. 根据权利要求119所述的方法，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括癌症。
  121. 根据权利要求119中任一项所述的方法，其中所述癌症包括GD2阳性肿瘤。
  122. 根据权利要求120-121中任一项所述的方法，其中所述癌症包括：神经母细胞瘤，黑色瘤，视网膜母细胞瘤，小细胞肺癌，尤文肉瘤，成神经管细胞瘤，软组织肉瘤，骨肉瘤或胶质瘤。
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