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CN118006485A - 一株植物乳杆菌st10-7及其应用 - Google Patents

一株植物乳杆菌st10-7及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株植物乳杆菌ST10‑7，已于2023年12月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：63842。本发明的优点在于：植物乳杆菌ST10‑7具有较高的血管紧张素转化酶抑制剂合成能力，为高血压的治疗提供新方向，在达到治疗疾病的同时，可以最大程度降低药物带来的一系列副作用，具有广泛的应用开发前景。

Description

一株植物乳杆菌ST10-7及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株具有较高的血管紧张素转化酶抑制剂合成能力的植物乳杆菌及其应用。
背景技术
随着生活质量不断提高，高血压人群的患病率也在不断增长。高血压目前已经是一种多发的损害人体健康的常见病。目前临床上常见的降压药包括以下五种类型：钙离子通道阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、利尿剂和B受体阻滞剂。血管紧张素转化酶抑制剂，简称ACEI。ACEI能够阻止血管紧张素I转化为血管紧张素II，使得血液和组织中血管紧张素II的浓度降低，进而可以降低交感神经兴奋性，血管舒张，使血压下降，还能够抑制血管紧张素转化酶的活性，能够保护血管内皮细胞，逆转心力衰竭、动脉硬化、高血脂和高血压等引起的内皮细胞功能的损伤。ACEI能够使高血压患者对胰岛素的敏感性提高，并降低血浆中的胰岛素水平。
卡托普利是一种主要用于治疗高血压的血管紧张素转化酶抑制剂，存在的问题是热稳定性能较差，副作用较多，例如咳嗽、腹泻、头晕头痛、低血压、恶心、皮疹、血管水肿等，涉及人体多个系统。长期服用药物可能给身体的多个器官带来严重的损害。一些研究表明从益生菌可以合成ACEI，且相比于化学药物副作用小。因此，筛选和研制出副作用小，且能高产ACEI，具有ACE抑制活性的微生物产品具有着广阔的市场前景与价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株具有较高的血管紧张素转化酶抑制剂合成能力的植物乳杆菌。
本发明提供一株植物乳杆菌ST10-7，所述植物乳杆菌ST10-7(Lactiplantibacillus plantarumST10-7)已于2023年12月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：63842。
本发明提供一种包括植物乳杆菌ST10-7的菌剂。
本发明提供一种植物乳杆菌ST10-7或菌剂发酵获得的发酵产物。
本发明提供一种植物乳杆菌ST10-7或菌剂或发酵产物在制备降血压或者抑菌产品中的应用。
进一步的，所述产品为食品、保健品或药品。
本发明有益效果：
本发明从贵州凯里酸汤中分离筛选出的一株植物乳杆菌ST10-7，通过紫外分光光度法测定菌株的体外ACE抑制活性，测得ST10-7的体外ACE抑制率高达85％，表明植物乳杆菌ST10-7具有较高的血管紧张素转化酶抑制剂合成能力，为高血压的治疗提供新方向，在达到治疗疾病的同时，可以最大程度降低药物带来的一系列副作用，具有广泛的应用开发前景。
附图说明
图1为植物乳杆菌ST10-7的菌落形态图；
图2为植物乳杆菌ST10-7的系统进化树。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供一株植物乳杆菌ST10-7，分离自贵州凯里酸汤中，植物乳杆菌ST10-7(Lactiplantibacillusplantarum ST10-7)已于2023年12月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：63842；保藏地址为：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼；联系电话：020-87137633。
本发明提供一种包括植物乳杆菌ST10-7的菌剂。
本发明提供一种植物乳杆菌ST10-7或菌剂发酵获得的发酵产物。
本发明提供一种植物乳杆菌ST10-7或菌剂或发酵产物在制备降血压或者抑菌产品中的应用。
具体的，所述产品为食品、保健品或药品。
下面结合实施例对本发明提供的一株植物乳杆菌ST10-7及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
植物乳杆菌ST10-7的分离纯化、鉴定及保藏
1.菌株的分离和纯化
植物乳杆菌ST10-7分离自贵州凯里酸汤，方法为：装有5mL MRS液体培养基的试管经115℃高压蒸汽灭菌20min，取适量酸汤样品快速接种于试管中，立即塞上胶塞，将试管置于37℃培养24h，150rpm/min。在无菌操作台中吸取100μL已经培养24h且已经混匀的菌液加入到已经分装好的900uL的无菌生理盐水中进行梯度稀释，然后取100μL的105，106，107的稀释液均匀涂布在MRS固体培养基上，每个梯度做三次平行，将涂布好的的固体培养基置于37℃隔水式恒温培养箱中培养24h，待长出单菌落后，用灭过菌的牙签挑取其中的单菌落在MRS固体培养基上划线，放于37℃隔水式恒温培养箱中培养24h，重复用牙签挑取单菌落划线2-3次，直到长出的纯化好的单一菌落。根据菌落的形态、颜色、大小、是否隆起、透明度、边缘是否规则等形态特征的不同挑选单菌落。将单菌落接种至5mL已灭菌的MRS液体培养基中，37℃静置培养48h后，用50％甘油保存至-80℃冰箱备用。
所述MRS液体培养基(g/L)组成：蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，加水1000mL混匀，115℃灭菌20min。
所述MRS固体培养基(g/L)组成：蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，琼脂15g，加水1000mL混匀，115℃灭菌20min。
2.菌株形态学鉴定
革兰氏染色与镜检鉴定表明，该菌株为革兰氏阳性菌，杆状，乳白色，表面光滑湿润，边缘规则，不透明，有光泽。植物乳杆菌ST10-7的菌落形态图如图1所示。
3.菌株分子生物学鉴定
将菌株接种于MRS的液体培养基中，放置到37℃恒温培养箱进行活化培养，然后提取菌株的基因组DNA(DNA提取采用试剂盒QIAamp genomic DNA and RNA kits进行)，使用细菌16S rRNA基因通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’)对所分离菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增。反应体系：2×TaqPCR Master Mix 10μL、上下游引物各0.5μL、DNA模板1μL、ddH2O 8μL；反应程序：95℃5min；94℃1min，55-58℃1min，72℃90s，30个循环；72℃10min。样品中分离培养出的菌株的16S rRNA的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因序列的测定，然后将所测的16S rRNA基因序列在NCBI数据库的GenBank中进行Blast比对，选取与分离菌株相似度最高的细菌标准株，然后将所测的16S rRNA基因序列在NCBI数据库的GenBank中进行Blast比对，选取与分离菌株相似度最高的细菌标准株，确定菌株种类，并应用MEGA7.0软件构建系统进化树，构建系统进化树。植物乳杆菌ST10-7系统进化树如图2所示。
实验结果：经形态学鉴定、分子生物学鉴定，16S rRNA基因序列比对，构建系统进化树，ST10-7鉴定为植物乳杆菌。
4.菌株保藏
植物乳杆菌ST10-7(Lactiplantibacillus plantarum ST10-7)已于2023年12月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：63842；保藏地址为：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼；联系电话：020-87137633。
实施例2
ACE的体外抑制活性试验
原理：ACE在催化分解血管紧张素Ⅰ的模拟物马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)产生马尿酸，该物质在228nm处具有特征吸收峰。当加入ACE抑制剂时，ACE对HHL的催化分解作用受到抑制，马尿酸的生成量减少。通过测定加入抑制剂前后马尿酸含量，可以推算ACE抑制活性。
样品制备：菌株用MRS培养基活化培养，37℃恒温培养24h，培养至菌体浓度达到106CFU/mL，将活化过后的纯菌株按4‰接种至MRS液体培养基中发酵，37℃培养48h，离心取上清。用1mol/L的NaOH调pH至8.3，然后再次离心取上清，用于ACE抑制活性测定。
用硼酸盐缓冲液(pH8.3)将HHL配成5.0mmol/L溶液。在10mL试管中加入200μL的5.0mmol/L的HHL溶液和80μL样品，于37℃保温3min后，再加入20μL ACE溶液(溶解于蒸馏水中，活力为0.1U/mL)，混匀后在37℃保温30min，再加入250μL的1.0mol/L的盐酸溶液以终止反应，再加入1.7mL乙酸乙酯，经15s振荡混匀后静置5min，用移液管吸取1.0mL的乙酸乙酯层，120℃烘箱烘干，加入1.0mL蒸馏水，混匀后在波长228nm处测定吸光度为A。
按照上述方法，只是不添加80μL样品，在波长228nm处测定吸光度为B；按照上述方法，只是不添加80μL样品和20μL ACE溶液，在波长228nm处测定吸光度为C。按照如下公式计算样品的ACE抑制率：
ACE抑制率(％)＝[(B-A)/(B-C)]×100％
式中：A为含有样品和ACE溶液的吸光度；B为不含样品，但含有ACE溶液的吸光度；C为空白对照组溶液的吸光度。
从酸汤样品中分离筛选出12株植物乳杆菌，分别进行了上述ACE的体外抑制活性试验，测定各菌株的ACE抑制率，结果如下表所示：
菌株编号 抑制率(％) 菌株编号 抑制率(％)
L.plantarumS11 — L.plantarumST10-7 85
L.plantarumAY02 41.3 L.plantarumYY4-4 —
L.plantarumAY03 15.9 L.plantarumJSL2-1 17.3
L.plantarumAY04 74 L.plantarumQB3-2 —
L.plantarumYM4-1 43.7 L.plantarumYM5-3 54.6
L.plantarumYM4-2 64.3 L.plantarumYM5-4 58.4
结果表明，ACE抑制率最高的为ST10-7，其抑制率高达85％，效果远远高于其他11株植物乳杆菌。
实施例3
抑菌试验
用牛津杯法测定益生菌的抑菌活性：在平板底部均匀倾倒约10mL MRS固体培养基。晾干后在平板中间放置牛津杯，牛津杯内部加入108CFU/mL的植物乳杆菌ST10-7，待病原菌对应的培养基冷却至40℃时，往培养基中加入适量病原菌，使病原菌终浓度为106CFU/mL。病原菌分别为金黄色葡萄球菌(培养基为BHI固体培养基，采购于广东环凯微生物科技有限公司)、大肠杆菌(培养基为LB固体培养基，采购于广东环凯微生物科技有限公司)和白色念珠菌(培养基为沙氏培养基，采购于广东环凯微生物科技有限公司)，完全冷却凝固后置于37℃恒温培养24h，测量抑菌圈的直径，所有实验重复3个平行。
为了方便对照，除了实验菌株L.plantarum ST10-7外，还选取了L.plantarumAY04、L.plantarum YM4-2、L.plantarum YM5-4、L.plantarum YM5-3和L.plantarum YM4-1这五株植物乳杆菌作为对照实验。分别进行大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌分别进行抑菌试验。测得的不同菌株抑菌圈的直径结果如下表所示：
结果表明，植物乳杆菌ST10-7对大肠杆菌的抑菌作用最强，对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌也有较高的抑菌作用。
实施例4
药敏试验
用药敏纸片琼脂扩散法检测菌株对药物的敏感性，具体步骤如下：将滤纸片裁剪成5mm直径圆形小纸片，121℃灭菌后置于烘箱中干燥。将滤纸片分别浸入不同的药品溶液中，制备成药物含量标准的药敏纸片，干燥备用。菌株用MRS液体培养基活化两次，当活菌数达到1x108CFU/mL时，取1mL菌液离心去上清，用0.9％灭菌生理盐水洗涤两次菌液后，重新悬浮菌液，取适量菌液均匀涂布在MRS固体培养基上。待培养基凝固后，贴放自制的药敏纸片，纸片间距不少于24mm，距平板内缘大于15mm，贴好后迅速放入恒温培养箱中，37℃培养24h后测量抑菌圈直径。以标准敏感菌金黄色葡萄球ATCC25923(Staphylococcus aureusATCC25923)作为对照菌株。ST10-7的药敏试验结果如下表所示：
抗生素 敏感性结果
万古霉素 S
阿莫西林 S
庆大霉素 S
诺氟沙星 I
其中I代表中间抗性；S代表敏感性。
研究发现ST10-7对万古霉素、庆大霉素、阿莫西林具有敏感性，对诺氟沙星具有中间抗性。从结果上看，ST10-7安全性很高，可被后续食品开发利用。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一株植物乳杆菌ST10-7，其特征在于：所述植物乳杆菌ST10-7（Lactiplantibacillus plantarum ST10-7）已于2023年12月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：63842。
2.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的植物乳杆菌ST10-7。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌ST10-7或权利要求2所述的菌剂发酵获得的发酵产物。
4.权利要求1所述的植物乳杆菌ST10-7或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的发酵产物在制备降血压或者抑菌产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品为食品、保健品或药品。
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