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CN118005806A - 嵌合抗原受体、人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及其应用 - Google Patents

嵌合抗原受体、人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及其应用 Download PDF

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CN118005806A
CN118005806A CN202410178272.4A CN202410178272A CN118005806A CN 118005806 A CN118005806 A CN 118005806A CN 202410178272 A CN202410178272 A CN 202410178272A CN 118005806 A CN118005806 A CN 118005806A
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CN
China
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chimeric antigen
antigen receptor
pluripotent stem
cells
expressing
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CN202410178272.4A
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金子兵
许佳
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BEIJING INSTITUTE OF OPHTHALMOLOGY
Beijing Tongren Hospital
Original Assignee
BEIJING INSTITUTE OF OPHTHALMOLOGY
Beijing Tongren Hospital
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Publication date
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Abstract

本发明公开了嵌合抗原受体、人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及其应用。本发明所提供的嵌合抗原受体CAR，该嵌合抗原受体为基于双唾液酸神经节苷脂的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞的制备方法，包括如下步骤：将人多能干细胞感染所述的慢病毒；进行阳性克隆筛选，挑选阳性克隆细胞进行培养鉴定；将表达嵌合抗原受体的人多能干细胞分化为小胶质细胞，即得到所述表达嵌合抗原受体的小胶质细胞。本发明所提供的人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞用于人的治疗没有免疫原性，不存在免疫排斥问题等独特的优势。

Description

嵌合抗原受体、人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小 胶质细胞及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别地涉及嵌合抗原受体、人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及其应用。
背景技术
脑胶质瘤是起源于脑神经胶质细胞的实体肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤，5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌。脑胶质瘤发病机制尚不明了，治疗手段仍依赖于手术，放疗和化疗。小胶质细胞是定植在中枢神经系统中的免疫细胞，是神经胶质瘤相关的巨噬细胞，在神经系统发育和疾病发展过程中发挥重要功能。如果能通过改造加强小胶质细胞的功能，使小胶质细胞特异性杀伤肿瘤细胞，改善肿瘤微环境，降低细胞因子风暴的副作用，将为胶质瘤患者造福。
双唾液酸神经节苷脂GD2是一种主要表达在胶质瘤(脑瘤，视网膜母细胞瘤等中枢神经母细胞瘤、黑色素瘤等肿瘤)上的抗原，在正常组织中表达量低且局限，是神经胶质瘤免疫治疗理想的肿瘤抗原，目前已有针对GD2的特异性抗体用于神经母细胞瘤的免疫治疗，但是由于抗体治疗主要存在于外周血中难以精准进入肿瘤组织或肿瘤微小残留部位，且抗体易降解无法长期存在体内，增加了治疗的困难性。此前CN 106536563A
和CN 108948211A公开了GD2结合的嵌合抗原受体均在T细胞上通过转基因技术构建针对GD2的CAR T，虽然在癌症治疗中有一定作用，但是正常中枢神经系统和视网膜中T细胞含量少，即使疾病状态下T细胞从外周血中转移到中枢神经系统和视网膜的T细胞也很难进入实体瘤，难以发挥治疗作用。此前ZL 2023 1 1030988.1公开了表达嵌合抗原受体的小胶质细胞，但是该小胶质细胞是细胞系，因细胞系本身有免疫原性，用于人体会引发严重的免疫排斥问题难以用于人体治疗，且实施例仅针对视网膜母细胞瘤，难以用于中枢神经系统肿瘤的治疗。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供嵌合抗原受体、人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及其应用。
本发明所提供的嵌合抗原受体，为基于双唾液酸神经节苷脂的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种含有嵌合抗原受体的慢病毒。
本发明所提供的含有嵌合抗原受体的慢病毒，包括所述的嵌合抗原受体。
本发明还提供了人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞的制备方法。
本发明所提供的人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞的制备方法，包括如下步骤：将人多能干细胞感染所述的慢病毒；进行阳性克隆筛选，挑选阳性克隆细胞进行培养鉴定；将表达嵌合抗原受体的人多能干细胞分化为小胶质细胞，即得到所述表达嵌合抗原受体的小胶质细胞。
可选地，所述人多能干细胞为人诱导多能干细胞。
所述方法制备得到的人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞也属于本发明的保护范围。
人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞在制备治疗表达双唾液酸神经节苷脂抗原的肿瘤的药物中的应用也属于本发明的保护范围。
可选地，所述肿瘤为表达双唾液酸神经节苷脂抗原的人脑星形胶质细胞母细胞瘤。
进一步可选地，所述人脑星形胶质细胞母细胞瘤为人脑星形胶质细胞母细胞U87MG细胞。
可选地，所述肿瘤为表达双唾液酸神经节苷脂抗原的视网膜母细胞瘤。
进一步可选地，所述视网膜母细胞瘤为为视网膜母细胞瘤Y79。
本发明所提供的嵌合抗原受体嵌合抗原受体，经过进一步的优化改造，以特异性靶向表达GD2的肿瘤细胞，杀伤肿瘤细胞能力强。
本发明所提供的人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞，其可精准地识别和杀伤人脑星形胶质细胞母细胞U87MG细胞或视网膜母细胞瘤Y79，且用于人的治疗没有免疫原性，不存在免疫排斥问题等独特的优势。
附图说明
为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：
图1为嵌合抗原受体的构建图。
图2为表达嵌合抗原受体的载体pCDH CAR-GD2的构建图。
图3为表达嵌合抗原受体的载体pCDH CAR-CD19的构建图。
图4为表达CAR-GD2和CAR-CD19的人诱导多能干细胞分化小胶质细胞PCR产物电泳鉴定结果。
图5为人诱导多能干细胞分化的小胶质细胞表达小胶质细胞标志分子IBA1(紫色)和CD68(红色)，而不表达GD2(绿色)；标尺30μm。
图6为流式细胞术检测表达CAR-GD2和CAR-CD19的人诱导多能干细胞分化小胶质细胞鉴定图。
图7为流式细胞术检测人诱导多能干细胞分化小胶质细胞表达CAR鉴定图。
图8为流式细胞术检测视网膜母细胞瘤肿瘤细胞Y79表达GD2，不表达CD19；人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87MG表达GD2，不表达CD19。
图9为人诱导多能干细胞分化的CAR-GD2和CAR-CD19小胶质细胞杀伤视网膜母细胞瘤细胞Y79的活细胞成像图。
图10为人诱导多能干细胞分化的CAR-GD2和CAR-CD19小胶质细胞杀伤人脑星形胶质母细胞瘤U87MG细胞的杀伤率结果。
具体实施方式
以下对本发明的描述仅旨在说明本发明的各种实施例。因此，所讨论的具体修改不应被解释为对本发明范围的限制。对于所属领域的技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围的情况下可以作出各种等效物、改变和修改，并且应理解，此类等效实施例将包括在发明中。本发明引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均以全文引用的方式并入本发明中。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买获得的常规产品。
A.一般定义
如本文所用，术语“包含”在提及组合物、方法以及对所述方法或组合物来说必不可少的其相应组分时使用，但对于包括未指明的要素，无论是否必要，仍然是开放的。
术语“由……组成”是指如本文所描述的组合物、方法和其相应组分，其排除未在所述实施例的描述中叙述的任何要素。
术语“约”或“大致”意指给定值或范围的20％内，优选10％内，并且更优选5％内。
如本文所用的术语“细胞”是指单个细胞、细胞系或衍生自此类细胞的培养物。
实施例1、构建嵌合抗原受体
通过全基因合成信号肽序列、GD2抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、2A序列、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，构建嵌合抗原受体(CAR)，如图1所示，即信号肽(Signal peptide)
-Anti-GD2scFv-CD8α跨膜区(CD8αTM)-CD86-FcγR1-T2A-EGFP，氨基酸序列如SEQID NO.1所示：
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLQSGPELEKPGASVMISCKASGSSFTGY
NMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHL
KSLTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQ
SPATLSVSPGERATLSCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNR
FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELK
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAG
TCGVLLLSLVITLYCKWKKKKRPRNSYKCGTNTMEREESEQTKKREKIHIPER
SDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCFRKELKRKKKWDLEISLDSGHEKKVISSLQE
DRHLEEELKCQEQKEEQLQEGVHRKEPQGATEGRGSLLTCGDVEENPGPMVS
KGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPV
PWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYK
TRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKN
GIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK。
其中：
信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
MALPVTALLLPLALLLHAARP。
针对肿瘤表面抗原GD2的单链抗体(Anti-GD2scFv)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：
EVQLLQSGPELEKPGASVMISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELK。
linker序列为多个GGGGS(G4S)的重复序列，在重链可变区和轻链可变区中间加入3个GGGGS，起连接作用，具有灵活性，在组成CAR分子时使抗体容易接触抗原。
铰链区的功能是提供灵活性，以克服空间阻碍，并对CAR的长度有贡献，以便允许抗原结合结构域接触到靶表位。铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD。
跨膜结构域为CD8α跨膜区(CD8αTM)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示：
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC。
共刺激信号传导结构域为CD86信号传导结构域和FcγR1信号传导结构域的组合，即CD86-FcγR1的顺序组合，CD86-FcγR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示：
KWKKKKRPRNSYKCGTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRV FKSSKTSSCDKSDTCFRKELKRKKKWDLEISLDSGHEKKVISSLQEDRH LEEELKCQEQKEEQLQEGVHRKEPQGAT。
T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示：
EGRGSLLTCGDVEENPGP。
增强型绿色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示：
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK。
鉴于胶质瘤不表达CD19抗原，本发明采用表达CD19的嵌合抗原受体包括抗CD19抗体scfv段，CD8α跨膜区和CD86胞内段小胶质细胞为对照组细胞。
对照组细胞CD19嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、2A序列串联而成，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体如下：
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKWKKKKRPRNSYKCGTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCFRKELKRKKKWDLEISLDSGHEKKVISSLQEDRHLEEELKCQEQKEEQLQEGVHRKEPQGATEGRGSLLTCGDVEENPGP。
实施例2、嵌合抗原受体载体构建
本发明中用于构建嵌合抗原受体表达所选载体名称pCDH-EF1α-puro(购自宁波安诺柏德生物医药科技有限公司)，将全基因合成的嵌合抗原序列作为模板，设计引物进行扩增，上游引物(带EcoRI内切酶序列)序列为F：
GATTCGAATTCGCCGCCACCATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCT GC(SEQ ID NO.10)；下游引物序列(带XbaI内切酶序列)为R：GAATTTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGT(SEQID NO.11)，扩增后的PCR产物电泳后，切胶回收产物。将PCR回收产物用EcoRI和XbaI限制性内切酶进行酶切，同时将pCDH-EF1α-puro载体用EcoRI和XbaI限制性内切酶进行酶切，酶切反应条件为37℃，2小时。PCR产物和载体酶切后进行电泳，切胶回收酶切产物，进行连接反应。用T4连接酶将PCR酶切产物和载体酶切产物进行连接反应，16℃，12小时。连接产物进行转化，感受态菌株为Stbl3(购自天根生化科技(北京)有限公司)，转化步骤为：
1、将感受态放在冰上融化，将连接产物全部加入感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上放置30分钟。
2、42℃热激1min30s，迅速放冰上孵育2min。
3、加入不含抗生素的LB培养基500μl，37℃摇床摇30分钟。
4、离心后弃300μl上清，其余重悬后将菌液均匀涂到LB氨苄阳性的琼脂板上，37℃过夜培养。12h后观察菌生长情况，挑选单独的、大且饱满的菌到LB氨苄阳性的培养基中摇12h后，一部分菌液加20％甘油冻存，另一部分菌液送公司(北京擎科生物科技有限公司)进行测序，将鉴定正确的菌复苏小摇后进行大提标记为pCDH CAR-GD2和pCDH CAR-CD19。载体图谱如图2和图3所示。
实施例3、慢病毒包装
本实施例使用HEK-293T细胞系来生产慢病毒。pCDH CAR-GD2和pCDH CAR-CD19分别是慢病毒载体，再加入慢病毒骨架质粒转染293T细胞后可以包装成慢病毒，该慢病毒就含有CAR。(参考文献Gene Ther.2011Jun；18(6):531-8.)。
(1)将生长状态良好的HEK293T细胞(记载过HEK293T细胞的非专利文献是：GeneTher.2011Jun；18(6):531-8.)用0.25％的胰酶消化2分钟，加入含有10％FBS的DMEM培养基(购自赛默飞世尔科技公司)终止消化，并将培养皿底细胞吹打成单细胞，计数1×107接种到10cm皿中，12h后进行转染包装病毒。为了多收集慢病毒，根据实际情况，可以多培养几皿细胞。
(2)制备转染试剂和质粒的复合物
a.将待转染的病毒质粒35μg(10μg pCDH CAR DNA载体质粒，10μgpMD2.G(购自武汉枢密脑科学技术有限公司)和15μg psPAX2(购自武汉枢密脑科学技术有限公司))溶于Opti-MEM培养基(购自赛默飞世尔科技公司)，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min，得到含有质粒的混合液。
b.取脂质体转染试剂lipofectamin2000(购自赛默飞世尔科技公司)中的转染试剂100μl和增强试剂200μl溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min。
c.将含有质粒的混合液加入含有转染试剂的混合液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。
(3)取出培养皿，将以上配好的DNA转染试剂混合物加入步骤(1)的HEK293T细胞中。
(4)转染后换液：6h后吸去培养基，用PBS洗一次，加入10ml新鲜含有10％FBS的DMEM培养基，放入37℃5％ CO2培养箱中培养。
实施例4、慢病毒的提取和浓缩
慢病毒提取：
1)收集转染后48h、72h(转染时为0小时)的HEK293T细胞上清液，分装入50ml离心管中。3500rpm室温离心10min，除去细胞和大的碎片。
2)以0.45μm滤膜过滤上清液于超速离心管中。
超速离心浓缩病毒：
3)30,000rpm，4℃离心2h，可观察到管壁一侧有白色的病毒沉淀。
4)弃上清，离心管倒扣在灭菌过的吸水纸上，去除未弃干净的上清。每管根据沉淀量添加磷酸盐缓冲液(DPBS)，80μl～120μl/管，用封口膜封住管口，4℃溶解沉淀过夜。
5)按要求分装病毒，-80℃冰箱保存。
实施例5、慢病毒滴度测定
采用定量PCR的方法测定细胞中的整合的病毒基因组的拷贝数，根据病毒加入的体积，感染时的细胞量从而推断原初的病毒滴度。采用载体上的WPRE序列检测病毒基因组，在HEK293T细胞中不存在WPRE序列。
1)感染前一天，按每孔1×105个细胞接种24孔板。
2)分别取病毒10μl，1μl，0.1μl加入到各一个细胞培养孔中，随后加聚凝胺(Polybrene)(购自默克公司)。病毒可以先稀释，再加入。
3)感染24小时后，换液继续培养。
4)感染48h后弃细胞上清。将细胞收集下来，抽提293T细胞基因组；
5)以得到的基因组为模板，定量其中的内参基因和病毒序列WPRE，通过相对定量的方法用2-ΔΔCt法计算病毒基因组数和细胞基因组数的比例。
结果：本发明中使用的慢病毒滴度为1×108TU/ml，含有CAR的慢病毒分别命名为lenti CAR-GD2和lenti CAR-CD19。
实施例6、CAR-小胶质细胞的制备
将人诱导多能干细胞(参考文献PNAS Nexus.2022Aug
17；1(4):pgac162；Stem Cell Reports.2018Apr 10；10(4)：1267-1281.)加入干细胞培养基TeSR-E8(购自干细胞公司)，接种于6孔板中，每孔5×105个细胞，培养24h后分别感染lenti-CAR GD2和lenti-CAR CD19(20μl/孔)，随即加入聚凝胺(10ug/ml)，轻轻摇晃六孔板使其混合均匀。病毒感染6h后去掉病毒上清液，更换新鲜干细胞培养基TeSR-E8(购自干细胞公司)。慢病毒载体有绿色荧光蛋白GFP和嘌呤霉素抗性，细胞培养48h后，观察感染慢病毒细胞中有表达绿色荧光的细胞，随即对感染慢病毒细胞孔和未感染慢病毒细胞孔加入嘌呤霉素进行筛选，加入嘌呤霉素第一天可以看到一些细胞死亡，待未感染慢病毒细胞孔细胞均死亡时停止筛选，继续培养，待感染慢病毒细胞孔可以挑克隆时，挑选单克隆细胞进行培养，待单克隆细胞可以传代时，收集细胞提取DNA，进行PCR产物鉴定，测序。PCR鉴定引物为F：TTCTCAAGCCTCAGACAGTGGT(SEQ ID NO.12)；
R：AGCGCATGCTCCAGACTGCCTT(SEQ ID NO.13)，将PCR产物电泳，电泳图见图4所示，可见挑选的单克隆干细胞含有特异性CAR序列。
随后将含有CAR-GD2和CAR-CD19的干细胞分化为小胶质细胞(小胶质细胞分化方法参见专利文献CN 114752565 A，CN114426951A及参考文献Sci.China Life Sci.2022.65(6),1057-1071.)。具体方法为：当培养的人诱导多能干细胞达到80％的密度时，使用0.5mMEDTA消化细胞。为了形成拟胚体(EBs)，将hiPSCs转移到含有拟胚体培养基(含10μMY-27632)的悬浮培养板上。每天仔细更换拟胚体培养基。第5天，将EBs用单核细胞培养基重悬转移到用0.1％明胶预包被100mm细胞培养皿中生成髓前细胞。每周更换培养基，单核细胞培养基培养4周后上清中出现造血祖细胞。通过每周收集上清来收获这些造血祖细胞，这个过程大约持续两个月。为了使小胶质细胞分化和成熟，将收集的造血祖细胞置于含有小胶质细胞成熟培养基的悬浮培养板中，培养1周后小胶质细胞成熟可进行实验。人诱导多能干细胞分化的小胶质细胞用特异性标志物IBA1和CD68进行免疫荧光染色，结果如图5所示，可以看出小胶质细胞表达IBA1(紫色)，CD68(红色)，同时检测小胶质细胞表达GD2抗原情况，可以看出人诱导多能干细胞分化的小胶质细胞不表达GD2(绿色)。用小胶质细胞特异性标志物CD11b和CD45进行染色，通过流式细胞术鉴定干细胞分化的小胶质细胞纯度高，比例达到90％以上，如图6所示。CAR分子含有EGFP有绿色荧光，进一步用流式细胞术鉴定表达EGFP情况，如图7所示，如此获得表达CAR-GD2和对照组CAR-CD19的人诱导多能干细胞分化来源的小胶质细胞。
实施例7、人诱导多能干细胞分化的CAR-GD2小胶质细胞的体外杀伤实验
视网膜母细胞瘤Y79(购自丰晖生物公司)用GD2(购自达科为生物技术有限公司)和CD19(购自达科为生物技术有限公司)的特异性流式抗体标记Y79细胞，随后用流式细胞术进行检测，如图8所示，Y79表达GD2，不表达CD19。流式细胞术检测方法：收集Y79细胞200g离心5分钟，弃上清，用磷酸盐缓冲液DPBS(购自赛默飞公司)重悬后，200g离心5分钟，弃上清，再用细胞标记缓冲液(购自达科为生物技术有限公司)重悬细胞并计数使细胞达到1×107个/ml,取100ul细胞用5ul GD2流式抗体和5ul CD19流式抗体，室温20分钟，避光，孵育。随后加入500ul细胞标记缓冲液，300g离心5分钟，弃上清后用500ul细胞标记缓冲液重悬细胞进行流式细胞术检测。将CAR-GD2小胶质细胞，CAR-CD19小胶质细胞分别与Y79细胞进行共培养通过活细胞成像观察CAR-小胶质细胞对肿瘤细胞Y79的杀伤性，如图9所示，CAR-小胶质细胞有绿色荧光，Y79染色CellTrace violet表达蓝色荧光，图9上部分图片表示CAR-小胶质细胞与Y79共培养时的图片，可以看出细胞均匀分布，图9下部分图片为CAR-小胶质细胞与Y79共培养100小时的图片，可以看出CAR-GD2小胶质细胞明显杀伤Y79细胞，Y79几乎没有残存细胞。
实施例8、人诱导多能干细胞分化的CAR-GD2小胶质细胞的体外杀伤实验
已有文献报道(Cancers(Basel).2020Oct 31；12(11):3211.)人脑星形胶质细胞母细胞瘤U87MG细胞是恶性神经胶质瘤，表达GD2。我们对购买的U87MG细胞(购自镜像绮点(上海)细胞技术有限公司)表达GD2和CD19的情况进行检测，用GD2和CD19的特异性流式抗体标记U87MG细胞，随后用流式细胞术进行检测，如图8所示，流式直方图可以看出人脑星形胶质母细胞瘤U87MG细胞表达GD2，表达比例为89％以上，几乎不表达CD19。将人胚胎干细胞分化的CAR-GD2小胶质细胞、CAR-CD19小胶质细胞分别以10:1、5:1的比例与U87MG细胞(标记蓝色荧光Celltrack violet(购自赛默飞世尔科技公司))共培养24h后，通过活细胞成像计数后发现，与CAR-GD2小胶质细胞共培养的U87MG细胞明显死亡，残留的U87MG细胞比例明显低于对照组(图10)。
上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体为基于双唾液酸神经节苷脂的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种含有嵌合抗原受体的慢病毒，其特征在于：包括权利要求1所述的嵌合抗原受体。
3.人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞的制备方法，所述表达嵌合抗原受体的小胶质细胞为表达权利要求1所述的嵌合抗原受体的小胶质细胞，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将人多能干细胞感染权利要求2所述的慢病毒；进行阳性克隆筛选，挑选阳性克隆细胞进行培养鉴定；将表达嵌合抗原受体的人多能干细胞分化为小胶质细胞，即得到所述表达嵌合抗原受体的小胶质细胞。
4.根据权利要求3所述的人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞的制备方法，其特征在于：所述人多能干细胞为人诱导多能干细胞。
5.权利要求3或4所述的方法制备得到的人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞。
6.人多能干细胞分化的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞在制备治疗表达双唾液酸神经节苷脂抗原的肿瘤的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为表达双唾液酸神经节苷脂抗原的人脑星形胶质细胞母细胞瘤。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述人脑星形胶质细胞母细胞瘤为人脑星形胶质细胞母细胞瘤U87MG细胞。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为表达双唾液酸神经节苷脂抗原的视网膜母细胞瘤。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述视网膜母细胞瘤为视网膜母细胞瘤Y79。
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