CN118001408B - 一种水通道蛋白9磷酸化抑制剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种水通道蛋白9磷酸化抑制剂的用途。本发明经研究发现，肝细胞水通道蛋白9存在磷酸化状态，抑制其磷酸化具有拮抗非酒精性脂肪性肝病进展的作用。此外，本发明筛选了水通道蛋白9磷酸化的特异性激酶，并开发了水通道蛋白9磷酸化抑制剂，以有效拮抗非酒精性脂肪性肝病的进展。

Description

一种水通道蛋白9磷酸化抑制剂的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种水通道蛋白9磷酸化抑制剂的用途，特别是涉及水通道蛋白9磷酸化抑制剂在治疗非酒精性脂肪性肝病中的用途。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)已成为世界上最常见的慢性肝病，全球成人患病率约为25%。由于其高患病率，NAFLD目前是世界范围内肝脏相关死亡率增长最快的原因，并成为原发性肝癌、终末期肝病和肝移植的重要原因，造成巨大的健康和经济负担。尽管人们越来越重视，但其发病机制相当复杂，缺乏有效的治疗方法。因此，进一步探索NAFLD发生发展的分子机制，并用于指导开发新的治疗药物和策略，仍是目前面临的巨大挑战。

NAFLD的发生发展与甘油三酯(Triglyceride，TG)的再分布有关。甘油作为合成TG的基本原料，通过自由扩散和水甘油通道进入肝细胞。水通道蛋白9 (Aquaporin 9，AQP9)是肝细胞主要的甘油通道，可加速甘油摄取。当肝脏脂质代谢紊乱时，AQP9的快速甘油摄取功能发挥重要作用。敲除Aqp9可以减缓高脂肪饮食(High-fat diet，HFD)诱导的NAFLD的进展，并拮抗相关代谢变化。因此，AQP9是TG合成的重要影响因子，研究其在肝细胞脂质代谢中的作用具有重要的研究价值。目前尚不清楚肝细胞AQP9的翻译后修饰是否会影响其功能。

因此，目前仍需研究肝细胞AQP9翻译后修饰在NAFLD发病机制中的作用，为开发高效靶向药物和预防策略提供研究基础。

发明内容

为解决上述现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供水通道蛋白9磷酸化抑制剂在治疗非酒精性脂肪性肝病中的用途。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供水通道蛋白9磷酸化抑制剂在制备用于预防、治疗或改善非酒精性脂肪性肝病或其相关病况的药物中的用途，其中，所述抑制剂能够通过直接或间接的方式调控水通道蛋白9磷酸化，从而下调或降低磷酸化水通道蛋白9的量和/或活性，或实现水通道蛋白9的非磷酸化。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述抑制剂包括小分子化合物、核酸、蛋白质、抗体、酶、多肽和基因编辑工具中的至少一种。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述抑制剂选自以下中的至少一种：

(1) 用于水通道蛋白9非磷酸化的突变试剂；

(2) 与水通道蛋白9相关的磷酸化激酶的抑制剂或拮抗剂；

(3) 阻断水通道蛋白9与其相关的磷酸化激酶结合的物质；

(4) 针对磷酸化的水通道蛋白9的抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述预防、治疗或改善包括以下中的至少一种：减少脂滴积累、降低肝小叶结构紊乱程度、降低肝组织甘油三酯含量、降低肝组织总胆固醇含量、降低血清游离脂肪酸含量、降低血清总胆固醇含量、降低血清甘油三酯含量、降低血清低密度脂蛋白胆固醇含量、降低肝脏指数、减少肝纤维化、减少肝细胞气球样变、减少病变肝组织伴随的炎症反应、减少与胰岛素抵抗和遗传易感性相关的获得性代谢应激性肝损伤、以及减少与非酒精性脂肪性肝病相关的体重超重和/或包括内脏性肥胖、空腹血糖增高、血脂紊乱和高血压在内的代谢综合征相关症状。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述水通道蛋白9磷酸化包括水通道蛋白9第292位的丝氨酸磷酸化。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述抑制剂为KN93。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述抑制剂为用于对9磷酸化位点突变的基因药物。

本发明的第二方面，提供水通道蛋白9磷酸化抑制剂与其它治疗剂联合用药在用于预防、治疗或改善非酒精性脂肪性肝病或其相关病况中的用途。

本发明的第三方面，提供一种磷酸化水通道蛋白9的抗体或其抗原结合片段，其能够特异性结合至第292位丝氨酸磷酸化的水通道蛋白9。

在某些实施方案中，根据本发明所述的磷酸化水通道蛋白9的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或鼠源抗体。

本发明的第四方面，提供一种用于水通道蛋白9磷酸化状态的检测产品，其包括能够特异性结合磷酸化水通道蛋白9的试剂，和指示使用所述试剂对待测样本进行检测的说明以及判断水通道蛋白9磷酸化状态的说明书。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于水通道蛋白9磷酸化状态的检测产品，其中，所述检测产品包括试剂盒、试纸或芯片。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于水通道蛋白9磷酸化状态的检测产品，其中，所述试剂包括抗体。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于水通道蛋白9磷酸化状态的检测产品，其中，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或鼠源抗体。

本发明的第五方面，提供一种筛选治疗或改善非酒精性脂肪性肝病或其相关病况的药物的方法，其包括：

a. 测量细胞模型或动物模型中水通道蛋白9磷酸化水平得到第一测量值；

b. 使待测药物与细胞模型或动物模型接触；

c. 测量与待测药物接触后所述模型中水通道蛋白9的磷酸化水平得到第二测量值;

d. 当所述第一测量值大于所述第二测量值时，将所述待测物筛选为预防、治疗或改善非酒精性脂肪性肝病或其相关病况的候选药物。

本发明的第六方面，提供一种调控水通道蛋白9磷酸化的方法，其包括使用试剂处理细胞或动物的步骤，其中所述调控包括通过直接或间接的方式调控水通道蛋白9磷酸化，从而调控磷酸化水通道蛋白9的量和/或活性，或实现水通道蛋白9的非磷酸化或磷酸化。

在某些实施方案中，根据本发明所述的调控水通道蛋白9磷酸化的方法，其中，所述试剂包括水通道蛋白9磷酸化抑制剂，还优选用于水通道蛋白9非磷酸化的突变试剂、与水通道蛋白9相关的磷酸化激酶的抑制剂或拮抗剂、阻断水通道蛋白9与其相关的磷酸化激酶结合的物质、针对磷酸化的水通道蛋白9的抗体或其抗原结合片段，以实现下调磷酸化水通道蛋白9的量和/或活性，或实现水通道蛋白9的非磷酸化。

在某些实施方案中，根据本发明所述的调控水通道蛋白9磷酸化的方法，其中，所述试剂包括水通道蛋白9磷酸化激活剂或促进剂，还优选包括与水通道蛋白9相关的磷酸化激酶的激活剂或促进剂、促进水通道蛋白9与其相关的磷酸化激酶结合的物质、与磷酸化水通道蛋白9过表达相关的基因工程试剂，以实现上调磷酸化水通道蛋白9的量和/或活性，或实现水通道蛋白9的磷酸化，或磷酸化水通道蛋白9的过表达。

本发明经研究发现，肝细胞AQP9的第292位丝氨酸(AQP9 S292)存在磷酸化状态，且抑制AQP9 S292磷酸化具有拮抗NAFLD进展的作用。此外，本发明筛选了AQP9 S292的特异性激酶，并开发了AQP9 S292磷酸化抑制剂，以有效拮抗NAFLD的进展。

附图说明

图1示出了AQP9在肝组织中的蛋白表达水平，其中，图1的A示出了AQP9在NAFLD模型中的表达变化，在约37 kDa处检测到AQP9的两个条带，两个波段的信号都得到了增强，且大分子量波段的增强更为明显；图1的B示出了AQP9表达变化的统计结果；图1的C示出了AQP9表达变化的组织化学染色，造模后肝小叶结构消失，AQP9表达明显升高。

图2示出了小鼠肝脏和Hep G2细胞系AQP9存在磷酸化丝氨酸残基，其中，图2的A和B中，小鼠肝组织AQP9和磷酸化丝氨酸(pSer)的Co-IP(免疫共沉淀)、反向Co-IP，均显示模型组p-AQP9上调；图2的C中，Hep G2细胞AQP9-FLAG和pSer的Co-IP显示OA处理后p-AQP9上调。

图3为肝脏AQP9磷酸化位点筛选，其中，图3的A利用质谱筛选肝脏AQP9磷酸化位点，发现AQP9 S292存在磷酸化；图3的B示出了AQP9 S292在小鼠和大鼠等哺乳动物，以及人中具有较高的保守性。

图4为针对AQP9 S292磷酸化的多克隆抗体的制备，其中，自制抗p-AQP9 S292抗体可以检测到AQP9-WT，但检测S292突变体的效果较差。

图5示出了在肝脏相关代谢疾病动物模型中，AQP9 S292的磷酸化升高，其中，图5的A中，与对照组相比，HFD诱导的肝脏脂肪变性小鼠肝脏AQP9 S292磷酸化和总AQP9(t-AQP9)增加，与t-AQP9相比，p-AQP9的升高更为显著；图5的B中，CDAHFD诱导的肥胖小鼠肝脏AQP9 S292和t-AQP9的磷酸化水平升高，与t-AQP9相比，p-AQP9的增加更为显著；图5的C中，与相应年龄匹配的对照组相比，8周龄或12周龄雄性db/db小鼠肝脏AQP9 S292和t-AQP9的磷酸化水平升高，随着周龄的增加，AQP9 S292磷酸化水平显著升高，然而与8周龄的db/db小鼠相比，12周龄小鼠的t-AQP9降低。

图6示出了在敲减AQP9的基础上，分别转染入AQP9-WT、AQP-S292A和AQP9-S292D的结果，其中，AQP9-WT和AQP9-S292D都积累了较多的脂滴，而AQP9-S292A消除了这一现象。

图7示出了敲除AQP9的小鼠可拮抗饮食诱导的脂质积累，而在Aqp9 ^-/-小鼠转染入AQP9 S292D突变体，而不是AQP9 S292A，则加重NAFLD。

图8肝脏AQP9的磷酸化激酶预测，其中，图8的A中，NetPhos 3.1预测可能磷酸化小鼠AQP9 S292位点的前6个激酶；图8的B中，三个独立IP-MS同时鉴定的在Hep G2细胞中与AQP9相互作用的激酶，CaMKIIδ是三个独立IP-MS实验中鉴定出的12个激酶之一；图8的C中，CaM是三个独立IP-MS实验中鉴定出的唯一钙调蛋白。

图9示出了AQP9与CaMKIIδ具有相互作用，其中，图9的A中，通过Pymol蛋白-蛋白相互作用分析，确定了氢键相互作用，KCC2D(CaMKIIδ)的Phe174和AQP9的Ala118形成氢键。在相互作用力作用下，KCC2D-AQP9的得分为2419.940，表现良好；图9的B和C示出了在Hep G2细胞中表达AQP9-FLAG和CaMKIIδ-HA时的Co-IP和反向Co-IP；图9的D和E示出了小鼠肝脏AQP9和CaMKIIδ的Co-IP和反向Co-IP。

图10示出了CaMKIIδ可以增加AQP9-WT Hep G2细胞的脂滴积累，但不能增加AQP9-S292A HepG2细胞的脂滴积累。

图11为CaMKIIδ与AQP9的体外激酶实验结果，其中，AQP9在体外被CaMKIIδ磷酸化；重组AQP9-FLAG与重组CaMKIIδ-HA体外孵育；使用针对AQP9 S292的磷酸化特异性抗体检测S292的磷酸化；当AQP9和CaMKIIδ同时存在时，检测到S292的磷酸化；然而，当加入KN-93(CaMKII抑制剂)时，S292的磷酸化程度降低，当不存在激酶时，无法检测到磷酸化。

图12示出了在Hep G2细胞中，CaMKIIδ的过表达增强AQP9 S292的磷酸化，而CaMKII抑制剂KN-93剂量依赖性减弱S292的磷酸化水平。

图13为HE和ORO染色结果，其中，CDAHFD+KN93组大鼠脂滴积聚减少，肝小叶结构改善。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

用途

本发明的第一方面，提供水通道蛋白9磷酸化抑制剂在制备用于预防、治疗或改善非酒精性脂肪性肝病或其相关病况的药物中的用途。本发明首先通过研究发现并验证了磷酸化水通道蛋白9能够作为抑制NAFLD的靶点。因此，不受任何理论的束缚，能够通过直接或间接的方式调控水通道蛋白9磷酸化，从而调控(优选下调)磷酸化水通道蛋白9的量和/或活性，或实现水通道蛋白9的非磷酸化的任何试剂均可以作为本发明的抑制剂，以用于预防、治疗或改善非酒精性脂肪性肝病或其相关病况。本文中，非磷酸化包括磷酸化水通道蛋白9的去磷酸化。

除非另有说明，否则本发明涉及的磷酸化位点特别是指水通道蛋白9第292位的丝氨酸磷酸化。

本发明还通过实验验证了与磷酸化密切相关的激酶，在一个具体实施方案中，与水通道蛋白9相互作用的激酶为CaMKIIδ。

本发明中，所述抑制剂选自以下中的至少一种：(1) 用于水通道蛋白9非磷酸化的突变试剂(其实例包括但不限于化学诱变剂、物理诱变剂、生物诱变剂、用于点突变的基因编辑工具、以及用于水通道蛋白9非磷酸化的过表达基因工程试剂等)；(2) 与水通道蛋白9相关的磷酸化激酶的抑制剂或拮抗剂(其实例包括但不限于靶向磷酸化激酶的抗体、靶向磷酸化激酶的核酸、用于敲减或敲低磷酸化激酶的基因编辑工具等)；(3) 阻断水通道蛋白9与其相关的磷酸化激酶结合的物质(其实例包括但不限于靶向磷酸化激酶和/或水通道蛋白9的抗体，或涉及该磷酸化过程上游细胞信号通路的抑制剂，或通过化学修饰相关试剂修饰激酶和/或水通道蛋白9的磷酸化位点等)；(4) 针对磷酸化的水通道蛋白9的抗体或其抗原结合片段。

在一些优选的实施方案中，所述抑制剂包括小分子化合物、核酸、蛋白质、抗体、酶、多肽和基因编辑工具中的至少一种。其中，小分子化合物包括KN93或与其相当的已知的其它具有抑制磷酸化激酶活性的小分化合物(如KN62、STO609、arcyriaflavin A、Myr-AIP、K252a、K252b等)。

本发明中，能够作为抑制剂的核酸的实例包括但不限于针对磷酸化激酶的编码基因的反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、核酸适配体(Aptamer)、诱饵寡核苷酸(Decoy ODN)、shRNA、gRNA等。在某些实施方案中，siRNA的正义和反义序列分别为：5’-UGAUCGAAGCCAUAAGCAA(dTdT)-3’(SEQ ID NO.1)和5’-UUGCUUAUGGCUUCGAUCA(dTdT)-3’(SEQ ID NO.2)。除了上述序列，但本领域技术人员还可以根据已公开的基因或蛋白数据库进行设计并合成相应的序列，或使用本领域已知的任何能够靶向磷酸化激酶的编码基因的核酸。

本发明中，能够作为抑制剂的多肽的实例包括但不限于autocamtide-2-相关的抑制肽等。

本发明中，能够作为抑制剂的基因编辑工具的实例包括但不限于锌指核酸酶(ZFNs)、转录活化剂类(TALENs)、CRISPR-Cas9系统等。此外，用于编辑动物或人的细胞或组织中的AQP9的292位丝氨酸位点的基因编辑试剂或试剂盒也属于本发明的范畴。使用针对该位点的锌指编辑工具、TALEN编辑工具、CRISPR/Cas9及同类家族的基因编辑工具、单碱基编辑工具以及以此制备其的质粒载体、病毒侵染工具等也属于本发明的范畴。

在一个优选的实施方案中，所述抑制剂为KN93。

在一个优选的实施方案中，所述抑制剂为基因药物，还优选促进非磷酸化突变体过表达的基因工程试剂。在具体实施方案中，该突变体为AQP9-S292A突变体。可以理解的是，基因药物包含上述提到的任何核酸分子、包含该核酸分子的表达载体、包含该载体的重组细胞。

在一个优选的实施方案中，编码AQP9-S292A突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

ATGCAGCCTGAGGGAGCAGAAAAGGGAAAAAGCTTCAAGCAGAGACTGGTCTTGAAGAGCAGCTTAGCGAAAGAAACCCTCTCTGAGTTCTTGGGCACGTTCATCTTGATTGTCCTTGGATGTGGCTGTGTTGCCCAAGCTATTCTCAGTCGAGGACGTTTTGGAGGGGTCATCACTATCAATGTTGGATTTTCAATGGCAGTTGCAATGGCCATTTATGTGGCTGGCGGTGTCTCTGGTGGTCACATCAACCCAGCTGTGTCTTTAGCAATGTGTCTCTTTGGACGGATGAAATGGTTCAAATTGCCATTTTATGTGGGAGCCCAGTTCTTGGGAGCCTTTGTGGGGGCTGCAACCGTCTTTGGCATTTACTATGATGGACTTATGTCCTTTGCTGGTGGAAAACTGCTGATCGTGGGAGAAAATGCAACAGCACACATTTTTGCAACATACCCAGCTCCGTATCTATCTCTGGCGAACGCATTTGCAGATCAAGTGGTGGCCACCATGATACTCCTCATAATCGTCTTTGCCATCTTTGACTCCAGAAACTTGGGAGCCCCCAGAGGCCTAGAGCCCATTGCCATCGGCCTCCTGATTATTGTCATTGCTTCCTCCCTGGGACTGAACAGTGGCTGTGCCATGAACCCAGCTCGAGACCTGAGTCCCAGACTTTTCACTGCCTTGGCAGGCTGGGGGTTTGAAGTCTTCAGAGCTGGAAACAACTTCTGGTGGATTCCTGTAGTGGGCCCTTTGGTTGGTGCTGTCATTGGAGGCCTCATCTATGTTCTTGTCATTGAAATCCACCATCCAGAGCCTGACTCAGTCTTTAAGACAGAACAATCTGAGGACAAACCAGAGAAATATGAACTCGCTGTCATCATGTAG。

本发明中，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防或减缓(减少)不期望发生的生理改变或紊乱，例如非酒精性脂肪性肝病的进展。与同等条件下未经治疗的参照组相比，按照任何标准技术来衡量，这种缓解或预防程度至少是5%、10%、20%、40%、50%、60%、80%、90%、95%或100%。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，包括症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及减轻(无论是部分还是全部)。“治疗”还指与不接受治疗时预期的生存期限相比所延长的生存期限。需要治疗的包括那些已经患有非酒精性脂肪性肝病或相关病症的人或者那些需要预防或改善非酒精性脂肪性肝病或相关病症的人。

联合应用

本发明的第二方面，提供水通道蛋白9磷酸化抑制剂联合其它治疗剂在制备用于预防、治疗或改善非酒精性脂肪性肝病或其相关病况的药物中的用途。

本发明中，其它治疗剂包括但不限于维生素、降脂药物、胰岛素增敏药物、抗炎药物、降胆固醇药物、糖尿病药物、实验性NASH抑制剂和减肥药物。其中，所述维生素的实例包括但不限于维生素B、维生素D或维生素E。所述降脂药物的实例包括但不限于利拉鲁肽、艾塞那肽、阿必鲁泰、阿昔莫司、阿托伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、瑞舒伐他汀、帕伐他汀、依折麦布等。所述抗炎药物的实例包括但不限于抗氧化剂药物(例如白藜芦醇、咖啡酸、二氢杨梅素、大豆磷脂等)、抗凋亡药物(例如生长因子、抗氧化物、Caspase家族抑制剂、Bcl 2家族、PARP抑制剂、Calpain阻滞剂等)和抗细胞因子药物(例如IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-ε、GM-CSF、G-CSF)中的至少一种。所述糖尿病药物的实例包括但不限于口服降糖药物和注射制剂，其中，口服降糖药物的实例包括但不限于磺脲类(例如格列齐特、格列美脲)、格列奈类(例如瑞格列奈)、双胍类(例如二甲双胍)、噻唑烷二酮类、α糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖)、DDP-4抑制剂和SGLT-2抑制剂等；注射制剂的实例包括但不限于胰岛素、胰岛素类似物和GLP-1受体激动剂等。所述实验性NASH抑制剂选自法尼酯x受体激动剂、PPAR激动剂、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、C-C趋化因子配体2型和5型拮抗剂、凋亡信号调节激酶(ASK1)抑制剂、赖氨酰氧化酶样2抗体、抗肝纤维化剂和半乳糖凝集素-3抑制剂中的至少一种。减肥药物的实例包括但不限于肽YY或其类似物、神经肽Y受体第2型(NPYR2)激动剂、NPYR1或NPYR5拮抗剂、脂肪酶抑制剂(例如奥利司他)、人类前胰岛肽(HIP)、黑皮质素受体4激动剂(例如司美诺肽)、黑色素凝集激素受体1拮抗剂、类法尼醇X受体(FXR)激动剂(例如奥贝胆酸)、唑尼沙胺、苯丁胺(单独或与托吡酯组合)、正肾上腺素/多巴胺再吸收抑制剂(例如丁胺苯丙酮)、正肾上腺素/多巴胺再吸收抑制剂、GDF-15类似物、胆囊收缩素激动剂、淀粉素及其类似物(例如普兰林肽)、瘦素及其类似物(例如美曲普汀)、血清素激活剂(例如氯卡色林)、甲硫氨酸氨肽酶2(MetAP2)抑制剂(例如贝洛拉尼或ZGN-1061)、苯甲曲秦、安非拉酮、苄非他明、SGLT2抑制剂(例如恩格列净、卡格列净、达格列净、艾格列净、托格列净、依碳酸舍格列净、依碳酸瑞格列净或依格列净)、SGLTL1抑制剂、双SGLT2/SGLT1抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)调节剂、AMP激活的蛋白激酶(AMPK)激活剂、生物素、MAS受体调节剂或升糖素受体激动剂(单独或与另一GLP-1R激动剂(例如利拉鲁肽、艾塞那肽、杜拉鲁肽、阿必鲁肽、利塞那肽或希马鲁肽)的组合)。

水通道蛋白9磷酸化检测抗体及检测方法

本发明的第三方面，提供一种磷酸化水通道蛋白9的抗体或其抗原结合片段，其能够特异性结合至第292位丝氨酸磷酸化的水通道蛋白9，从而其可以作为检测磷酸化水通道蛋白9水平的检测抗体。

本发明中，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或鼠源抗体。

本发明中，所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、scFv、scFv Fc片段或单链抗体ScAb中的至少一种。

本发明制备了能够特异性结合至第292位丝氨酸磷酸化的水通道蛋白9的检测抗体，对于制备方法不特别限定，包括通过人工合成或基因工程方式制备。在某些实施方案中，本发明的抗体通过人工合成方式获得。人工合成抗体的方法在本领域是已知的，例如通过氨基酸直接合成法得到本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，可以采用重组技术来大批量地获得该抗体。示例性的方法是将其编码基因克隆至载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到。

本发明的第四方面，提供一种用于水通道蛋白9磷酸化状态的检测产品，其包括能够特异性结合磷酸化水通道蛋白9的试剂，和指示如何使用所述试剂对待测样本进行检测的说明和判断水通道蛋白9磷酸化状态的说明书。

本发明中，所述检测产品包括但不限于试剂盒、试纸或芯片。

在一个优选的实施方案中，所述试剂包括上述检测抗体。

药物筛选

本发明的第五方面，提供一种筛选用于治疗或改善非酒精性脂肪性肝病或其相关病况的药物的方法，其包括：

a. 测量细胞模型或动物模型中水通道蛋白9磷酸化水平(量和/或活性)得到第一测量值；

b. 使待测药物与细胞模型或动物模型接触；

c. 测量与待测药物接触后所述模型中水通道蛋白9的磷酸化水平得到第二测量值；

d. 当所述第一测量值大于所述第二测量值时，将所述待测药物筛选为预防、治疗或改善非酒精性脂肪性肝病或其相关病况的候选药物。

在一个优选的实施方案中，所述细胞为Hep G2细胞系来源的细胞。

在另一个优选的实施方案中，所述动物模型为小鼠。

调控水通道蛋白9磷酸化的方法

本发明的第六方面，提供一种调控水通道蛋白9磷酸化的方法。在一个实施方案中，该方法为体外方法。在另外的实施方案中，该方法为非治疗或诊断方法，例如用于研究或药物优化(包括药物设计和结构优化、药物筛选等)。

在一个优选的实施方案中，该方法包括使用试剂处理细胞或动物的步骤，其中所述调控包括通过直接或间接的方式调控水通道蛋白9磷酸化，从而调控磷酸化水通道蛋白9的量和/或活性，或实现水通道蛋白9的非磷酸化或磷酸化。

在一个优选的实施方案中，所述试剂包括水通道蛋白9磷酸化激活剂或促进剂，还优选包括与水通道蛋白9相关的磷酸化激酶的激活剂或促进剂、促进水通道蛋白9与其相关的磷酸化激酶结合的物质、与磷酸化水通道蛋白9过表达相关的基因工程试剂，以实现上调磷酸化水通道蛋白9的量和/或活性，或实现水通道蛋白9的磷酸化，或磷酸化水通道蛋白9的过表达。与磷酸化水通道蛋白9过表达相关的基因工程试剂包括能够表达磷酸化水通道蛋白9第292位丝氨酸位点突变的突变体蛋白的核酸分子、含有所述核酸分子的表达载体、和含有所述突变体蛋白、核酸分子、表达载体的宿主细胞中的至少一种。例如，通过使用基因编辑技术，在细胞内对AQP9的基因上对应292位丝氨酸位点的编码序列进行定点突变，或使用基因过表达技术在细胞内过表达AQP9的292位丝氨酸磷酸化的突变体蛋白。在一个具体的实施方案中，该突变体蛋白为AQP9-S292D。

在另一个优选的实施方案中，所述试剂包括水通道蛋白9磷酸化抑制剂，还优选用于水通道蛋白9非磷酸化的突变试剂、与水通道蛋白9相关的磷酸化激酶的抑制剂或拮抗剂、阻断水通道蛋白9与其相关的磷酸化激酶结合的物质、针对磷酸化的水通道蛋白9的抗体或其抗原结合片段、与水通道蛋白9去磷酸化相关的基因工程试剂，以实现下调磷酸化水通道蛋白9的量和/或活性，或实现水通道蛋白9的非磷酸化。与水通道蛋白9的非磷酸化相关的基因工程试剂包括能够表达水通道蛋白9第292位丝氨酸去磷酸化突变的突变体蛋白的核酸分子、含有所述核酸分子的表达载体(包括但不限于质粒载体、噬菌体载体和病毒载体，例如慢病毒载体和腺相关病毒载体)、和含有所述突变体蛋白、核酸分子、表达载体的宿主细胞中的至少一种。例如，通过使用基因编辑技术，在细胞内对AQP9的基因上对应292位丝氨酸位点的编码序列进行定点突变，或使用基因过表达技术在细胞内AQP9的292位丝氨酸去磷酸化的突变体蛋白。在一个具体的实施方案中，该突变体蛋白为AQP9-S292A。

实施例1

本实施例示出了肝细胞AQP9磷酸化位点的分析。

为了分析肝细胞AQP9是否存在磷酸化状态，应用Western Blot实验在约37 kDa处检测到两条相似的AQP9条带(图1的A)，模型组表达水平升高，且大分子量条带更为明显(图1的B)。为了确定磷酸化的AQP9是否为两个条带之一，使用肝组织样本，对AQP9进行免疫沉淀，并对磷酸化丝氨酸残基进行免疫印迹。检测到AQP9丝氨酸磷酸化，并在模型组组中升高(图2的A)。对磷酸化丝氨酸残基进行免疫沉淀，并对肝组织进行AQP9免疫印迹，模型组AQP9磷酸化也增加(图2的B)。然后将AQP9-FLAG转染Hep G2细胞，进行FLAG免疫沉淀和磷酸化丝氨酸残基免疫印迹。结果显示，油酸处理后，AQP9-FLAG磷酸化水平升高(图2的C)。这一结果表明AQP9含有可磷酸化的丝氨酸残基，并且在CDAHFD或OA处理下磷酸化增加。

为了探究具体的AQP9磷酸化位点，应用磷酸化质谱分析后，在小鼠肝组织中AQP9中只鉴定出一个潜在的磷酸化丝氨酸残基S292(图3的A)。S292在一些哺乳动物物种中是保守的(图3的B)，这表明它对AQP9的生物学功能至关重要。

实施例2

本实施例示出了AQP9 S292磷酸化抗体检测效果的分析。

为了表征AQP9 S292位点的磷酸化并评估其潜在的生理和病理意义，本发明开发了一种定制的多克隆抗体(抗p-AQP9 S292)，该抗体特异性地与磷酸化的AQP9 S292发生反应。在表达FLAG标记野生型AQP9、S292A突变体或S292D突变体的Hep G2细胞中，制备的抗体可检测到明显的AQP9-WT，而AQP9-S292A或AQP9-S292D的检测条带非常弱(图4)，符合磷酸化抗体的验证标准。

实施例3

本实施例示出了AQP9 S292磷酸化水平的分析。

为检测AQP9 S292在代谢相关肝脏慢性疾病中的磷酸化水平变化，使用抗p-AQP9S292抗体，首先评估了饮食诱导的NAFLD小鼠肝脏中AQP9的磷酸化状态，包括HFD和CDAHFD诱导的模型。与对照组相比，HFD或CDAHFD组AQP9蛋白水平显著升高(图5的A和B)，更重要的是，磷酸化AQP9 S292 (p-AQP9)的升高更为明显，导致p-AQP9与总AQP9(t-AQP9)之比升高。本发明还评估了糖尿病小鼠肝脏中AQP9在S292位点的磷酸化情况。与对照小鼠相比，8周龄db/db小鼠的S292磷酸化水平更高(图5的C)。随着血液中胰岛素水平的升高，12周龄db/db小鼠的磷酸化升高更为明显，但t-AQP9蛋白没有明显升高。这些结果表明，在NAFLD或糖尿病等代谢功能障碍状态下，AQP9 S292磷酸化升高。

实施例4

本实施例示出了阻断AQP9 S292可拮抗NAFLD进展的研究。

为了探究AQP9 S292在NAFLD中的生物学功能，本发明使用靶向Aqp9的shRNA在HepG2细胞中敲低Aqp9，然后分别引入AQP9-WT、AQP9-S292A和AQP9-S292D。在过表达AQP9-WT或AQP9-S292D的细胞中，脂滴积聚较多，而转染AQP9-S292A的细胞脂滴较少(图6)。说明S292A明显减弱AQP9的甘油摄取能力。进一步研究了AQP9 S292在NAFLD小鼠模型中的生物学功能。在Aqp9 ^-/-小鼠中过表达AQP9-S292A和AQP9-S292D。在此基础上，喂食CDAHFD。形态学上，Aqp9 ^-/-小鼠肝脏脂滴较少，AQP9-S292D过表达的Aqp9 ^-/-小鼠肝脏脂滴较多，然而，在S292A过表达的Aqp9 ^-/-小鼠中没有出现类似的现象(图7)。综上所述，这些数据表明AQP9在S292位点的去磷酸化可以拮抗NAFLD的进展。

实施例5

本实施例示出了筛选肝细胞AQP9 S292的候选激酶。

为了筛选磷酸化AQP9 S292的激酶，本发明利用NetPhos3.1基于S292附近的肽序列预测其潜在的激酶。PKA、GSK3、CaMKII、cdc2、CKII和CKⅠ被确定为候选激酶(图8的A)。本发明还从AQP9-FLAG转染的Hep G2细胞中免疫沉淀AQP9，随后对免疫复合物进行质谱分析，以确定可能相互作用的激酶。与预测结果一致，CaMKIIδ是三个独立的IP-MS实验中鉴定的12个激酶之一(图8的B)。CaM是三个独立的IP-MS实验中唯一鉴定出的钙调素(图8的C)。

实施例6

本实施例示出了AQP9与CaMKⅡδ之间的相互作用分析。

为了分析AQP9与CaMKⅡδ之间的相互作用，本发明通过PyMOL蛋白-蛋白相互作用分析，发现CaMKⅡδ的Phe174与AQP9的Ala118形成氢键，两者结合良好(图9的A)。在Hep G2细胞中共表达的AQP9-FLAG和CaMKⅡδ-HA的Co-IP和反向Co-IP都表明AQP9和CaMKIIδ位于同一个复合体中(图9的B和C)，内源性AQP9和CaMKIIδ在小鼠肝组织中的Co-IP和反向Co-IP进一步证实了它们的相互作用(图9的D和E)。

实施例7

本实施例示出了CaMKⅡδ对AQP9 S292的磷酸化作用。

为了研究CaMKⅡδ是否磷酸化AQP9 S292，本发明以Hep G2细胞系为载体，当CaMKIIδ存在时，AQP9-WT的甘油摄取能力显著增强，导致脂滴合成增多(图10)，由于AQP9-S292A不能被CaMKIIδ磷酸化，因此AQP9-S292A的甘油摄取能力不受影响(图10)。在体外激酶实验中，将纯化的AQP9-c-Myc蛋白在CaMKIIδ-c-Myc蛋白存在或不存在的情况下与ATP孵育。当AQP9和CaMKIIδ同时存在时，AQP9发生磷酸化(图11)。而加入在CaMKII的抑制剂KN93后，p-AQP9 S292的信号减弱(图11)。这些结果强烈表明CaMKIIδ是磷酸化AQP9 S292的激酶。以Hep G2细胞为载体，使用抗p-AQP9 S292抗体，发现转染CaMKⅡδ显著增强了AQP9S292的磷酸化水平(图12)，而KN93以剂量依赖的方式抑制CaMKIIδ介导的S292磷酸化。

实施例8

本实施例示出了CaMKII的抑制剂KN93对NAFLD的治疗作用。

为了明确KN93对NAFLD的影响，本发明采用NAFLD模型并腹腔注射KN93。腹腔注射KN93可显著减轻饮食诱导的肝细胞脂肪变性，减缓NAFLD的进展(图13)。

最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应对理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分技术特征进行等同替换。而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种筛选用于治疗或改善非酒精性脂肪性肝病的药物的方法，其特征在于，包括：

a. 分别测量敲低Aqp9的Hep G2细胞系来源的细胞模型水通道蛋白9磷酸化水平和甘油摄取，得到水通道蛋白9磷酸化水平和甘油摄取的第一测量值；

b. 使待测药物与所述细胞模型接触；

c. 分别测量与待测药物接触后所述细胞模型中水通道蛋白9的磷酸化水平和甘油摄取，得到水通道蛋白9磷酸化水平和甘油摄取第二测量值；

d. 当所述第一测量值大于所述第二测量值时，将所述待测药物筛选为治疗或改善非酒精性脂肪性肝病的候选药物；或者

a’. 测量NAFLD动物模型中水通道蛋白9磷酸化水平和甘油摄取，得到水通道蛋白9磷酸化水平和甘油摄取的第一测量值；

b’. 使待测药物与所述动物模型接触；

c’. 分别测量与待测药物接触后所述动物模型中水通道蛋白9的磷酸化水平和甘油摄取，得到水通道蛋白9磷酸化水平和甘油摄取的第二测量值；

d’. 当所述第一测量值大于所述第二测量值时，将所述待测药物筛选为治疗或改善非酒精性脂肪性肝病的候选药物；

所述水通道蛋白9磷酸化为水通道蛋白9第292位的丝氨酸磷酸化。

2.KN93在制备体外调控水通道蛋白9磷酸化的试剂中的应用，其特征在于，所述应用包括使用试剂处理细胞模型的步骤，其中所述KN93以剂量依赖的方式抑制CaMKIIδ介导的水通道蛋白9第292位的丝氨酸磷酸化。