CN117987586A - 一种蒙古冰草母系来源特有的snp位点、分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蒙古冰草母系来源特有的SNP位点、分子标记及其应用，属于分子生物学及植物分子育种技术领域。所述SNP位点位于蒙古冰草叶绿体基因组MH285848.1的第27375位碱基处，该SNP位点存在G/A突变。根据该SNP位点设计出一组KASP引物组合，能够实现对冰草母系的溯源鉴定，该方法具有操作简便、成本低廉、检测周期短和标记稳定等优点。同时在基因组水平上拓展了冰草可用标记位点的范围；为冰草种质资源鉴定、育种、亲缘关系评价以及细胞质遗传特性等研究提供了新的思路和方法。

Description

一种蒙古冰草母系来源特有的SNP位点、分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及植物分子育种技术领域，特别是涉及一种蒙古冰草母系来源特有的SNP位点、分子标记及其应用。

背景技术

叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，拥有自身完整的一套基因组，称为叶绿体基因组。叶绿体基因组结构非常保守，DNA一般为双链环状分子，高等植物中叶绿体基因组大小一般为120-160kb。双链环形DNA有4个基本部分组成，分别是大单拷贝区(Largesingle Copy Region，LSC)，小单拷贝区(Small Single Copy Region，SSC)以及两个反向重复区(Inverted Repeats，IRs)。叶绿体基因组信息由于具有以下优势而被广泛应用于植物品种和种质资源鉴定、亲缘关系评价、系统进化以及母系溯源等研究和应用中：(1)叶绿体基因组较小且相对保守，其全序列容易获得；(2)叶绿体基因是母系遗传，不同个体间基因的交换和融合很少发生，叶绿体各基因间有很好的共线性；(3)叶绿体基因组除反向重复区外均为单拷贝基因，几乎不存在旁系同源基因干扰；(4)叶绿体编码区与非编码区进化速度差异显著，存在一些高突变区，可以解决种以下分类单元问题。

冰草属(Agropyron Gaertner)植物是小麦族(Triticeae)中一个重要的多年生属牧草，包括二倍体Agropyronpectiniformessp.pectiniforme(2n＝2x＝14，PP)和Agropyronpectiniforme ssp.mongolicum(2n＝2x＝14，P^mP^m)、四倍体Agropyroncristatum(2n＝4x＝28，PPP^mP^m或PPPP)以及六倍体Agropyron deweyi(2n＝6x＝42，PPPPP^mP^m)。冰草(Agropyron cristatum)是其模式种，有二倍体冰草(Agropyronpectiniforme ssp.pectiniforme)和蒙古冰草(Agropyron pectiniformessp.mongolicum)两个母系来源(Dewey，1984；Han，2022)。冰草不仅具有较高的生态价值和饲用价值，同时还有较高的遗传价值。如何利用这一宝贵的种质对冰草种质资源进行评价和利用，以及培育优良品种等，成为冰草的研究中亟待解决的重要课题，而冰草的亲本溯源是其中需要展开的一个重要的基础性工作。目前在冰草种质资源鉴定的研究和应用中，主要是利用RADP、AFLP、SSR和ISSR等分子标记进行研究。这些分子标记在高通量检测时费力耗材，无法提供高分辨率的遗传多样性和种群结构信息，限制了冰草种质资源的利用和研究。

SNP即单核苷酸多态性，是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记。SNP标记是第三代分子标记技术，相对传统的RFLP和SSR标记等具有在基因组中遗传稳定、数量多、位点专一、易检测以及更适合于高通量的检测分析等优点。利用SNP位点进行基因分型只需要检测样本序列中的部分SNP位点，而Sanger测序或者基因芯片技术经济成本及时间成本都比较高。竞争性等位基因特异性PCR(KASP)使用通用的荧光探针和简单的PCR反应就可以实现高通量、准确可靠的SNP分型，是目前国际上主流的SNP检测方法之一。因此，基于冰草叶绿体基因组开发SNP标记，并建立其高通量检测技术，对冰草种质资源鉴定的研究和应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种蒙古冰草母系来源特有的SNP位点、分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。根据本发明所述的SNP位点可实现对冰草母系的溯源鉴定，为冰草种质资源鉴定、育种、亲缘关系评价以及细胞质遗传特性等研究提供了新的思路和方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种蒙古冰草母系来源特有的SNP位点在鉴定冰草母系来源中的应用，所述SNP位点位于蒙古冰草叶绿体基因组MH285848.1的第27375位碱基处，该SNP位点存在G/A突变。

本发明还提供一种蒙古冰草母系来源特有的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在第123位碱基处存在G/A突变，该位点的基因型包括GG、AA和GA基因型。

本发明还提供一种检测所述分子标记的KASP引物组，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的上游引物K27375-FA、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物K27375-FB和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物K27375-R。

本发明还提供一种所述分子标记的检测试剂盒，包含所述的KASP引物组。

本发明还提供一种所述的KASP引物组或所述的检测试剂盒在鉴定冰草母系来源中的应用。

本发明还提供一种鉴定冰草母系来源的方法，包括如下步骤：

以待测冰草样品的基因组DNA作为模板，利用所述的KASP引物组或所述的检测试剂盒对模板进行荧光定量PCR扩增，PCR扩增完成后读取荧光信号，解析转换荧光信号，鉴定基因型，根据基因型判断冰草母系来源；

若鉴定的基因型为GG，则判断待测冰草样品的母系来源为蒙古冰草；若鉴定的基因型为AA，则判断待测冰草样品的母系来源为二倍体冰草。

进一步地，所述荧光定量PCR扩增的程序为：95℃10min；95℃20s，61～55℃40s，每个循环降低0.6℃，10个循环；95℃20s，55℃40s，30个循环；荧光扫描，30℃30s，一个循环；

所述荧光定量PCR扩增的体系为：DNA模板1μL，2×Master Mix 5μL，10μM KASP混合引物0.5μL和ddH2O 3.5μL，所述KASP混合引物中上游引物K27375-FA、上游引物K27375-FB和下游引物K27375-R的体积比为1:1:3。

本发明还提供一种所述的KASP引物组或所述的检测试剂盒在冰草种质资源鉴定中的应用。

本发明还提供一种所述的KASP引物组或所述的检测试剂盒在冰草亲缘关系评价中的应用。

本发明还提供一种所述的KASP引物组或所述的检测试剂盒在对冰草进行分子标记辅助育种中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过世界范围内具有代表性的64份野生冰草材料，通过高通量测序获得叶绿体基因组序列，比较叶绿体基因组核苷酸多态性，开发鉴定出蒙古冰草母系来源特有的SNP位点，所述SNP位点位于蒙古冰草叶绿体基因组MH285848.1的第27375位碱基处，该SNP位点存在G/A突变。根据该SNP位点设计出一组KASP引物组合，该KASP引物组合能够准确区分出冰草叶绿体基因组的第27375位碱基处的基因型，若该位点基因型为GG，则对应的冰草母系来源为蒙古冰草；若该位点基因型为AA，则对应的冰草母系来源为二倍体冰草。根据此结果可进一步对冰草进行种质资源鉴定、亲缘关系评价或者根据对冰草母系溯源的结果适应性选择目标品种进行育种。

本发明通过设计出的KASP引物组合能够实现对冰草母系的溯源鉴定，该方法具有操作简便、成本低廉、检测周期短和标记稳定等优点。同时在基因组水平上拓展了冰草可用标记位点的范围；为冰草种质资源鉴定、育种、亲缘关系评价以及细胞质遗传特性等研究提供了新的思路和方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为基于叶绿体基因组构建的ML(下)和BI(上)进化树，其中，标红的编号为蒙古冰草，标绿的编号为二倍体冰草，其他编号为四倍体冰草以及一个外类群新麦草(C26)；

图2为KASP分型结果，其中，A和B分别代表2次重复实验的结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1用于冰草母系溯源的叶绿体SNP位点的确定

样品选取：以64份世界范围内具有代表性的野生冰草材料为样品。这64份材料包括6份蒙古冰草、8份二倍体冰草和50份四倍体冰草，由美国国家植物种质资源库和四川农业大学小麦研究所提供，具体物种、编号以及来源信息参见表1。

1.样品基因组DNA提取

从种质资源圃收集上述64份冰草材料的健康和新鲜叶片样品，每种样品取样1-2g，分别采用植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根生物科技有限公司)进行总DNA提取。具体步骤如下：

(1)取冰草新鲜叶片样品100mg，加入液氮充分碾磨。

(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品。

(3)加入700μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min。

(4)小心地步骤(3)所得上层水相转入新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。

(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，弃掉废液。

(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)重复操作步骤(7)。

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，获得样品总DNA。

(11)采用NanoDrop 2000spectrophotometer(Thermo Scientific)分光光度计和全自动核酸蛋白检测仪检测提取的样品总DNA纯度和浓度，A260/280介于1.8-1.9之间(DNA没有蛋白污染，RNA含量低)。

2.总DNA高通量测序

对提取的样品总DNA构建测序文库，利用IlluminaNovaSeq测序平台进行测序，平均每个样本获得约5GB数据。

3.叶绿体基因组组装和注释

高通量测序数据使用SPAdes(Bankevich et al.,2012)和SOAPdenovo2(Luo etal.,2012)两个软件对高通量测序数据进行拼接。基于蒙古冰草(MH285848)和冰草(KY126307)的叶绿体基因组序列利用BLAST程序筛选属于叶绿体基因组的contig；使用映射算法鉴定推定的质体重叠群，并在Geneious 8.1中进行组装(Kearse et al.,2012)。使用DOGMA(Wyman etal.,2004)注释叶绿体基因组。

4.多态位点的确认

使用MAFFT7.0软件进行序列比对，使用DnaSP软件分析叶绿体基因组中的变异位点及多样性(Pi)，得到冰草叶绿体基因组的单核苷酸多态性数据。

5.冰草母系来源类型的确认

基于64份冰草叶绿体基因组序列信息，以新麦草(Psathyrostachys juncea，版本号：NC_043838.1)为外类群，利用MEGA 5.1软件和MrBayes v.3.2.1采用分别以最大似然法(ML)以及贝叶斯法(BI)构建系统进化树。两种方法建立的系统进化树，如图1所示：蒙古冰草材料只聚在Clade2中，在Clade1和Clade3中均有二倍体冰草，表明四倍体冰草有两个母系来源，分别是二倍体冰草和蒙古冰草。

6.冰草母系溯源特异位点的确定

当进化枝内的所有种质均相同且与进化枝外的所有种质不同时，SNP被认为是进化枝的诊断(Oueslati et al.，2016)。由此得到表1的SNP位点信息。所述SNP位点位于蒙古冰草(MH285848)叶绿体基因组第27375位碱基(蒙古冰草所在进化枝此处碱基为G，其它枝此处碱基为A)。包含上述SNP位点的序列片段如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

在如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第123位碱基处为SNP位点(加粗下划线表示)，存在G/A突变，该位点的基因型包括GG基因型、GA基因型和AA基因型。

表1冰草材料及其SNP位点信息

实施例2 SNP分子标记及KASP引物的验证实验

1.样品DNA的制备

随机选取4份蒙古冰草和36份冰草(其中已知3份冰草母系来源为蒙古冰草，其余冰草母系来源为二倍体冰草)作为实验材料，利用CTAB法提取总DNA。采用NanoDrop 2000spectrophotometer(Thermo Scientific)分光光度计和全自动核酸蛋白检测仪检测样品纯度和浓度，A260/280介于1.7-2.0之，并将DNA浓度稀释为50ng/μL。

2.引物设计

根据实施例1中SNP位点位置的上下游100bp的序列，利用primerpremier 5.0软件设计KASP引物组合。KASP引物组合包括上游引物K27375-FA、上游引物K27375-FB和一条通用的下游引物K27375-R。上游引物K27375-FA和K27375-FB的5’端分别连接特异荧光标签FAM序列和HEX序列，3’末端为等位变异碱基。具体引物序列信息具体如下：

K27375-FA：5’-gaaggtgaccaagttcatgctGAATACGAGAGCCCAGAGGAG-3’(SEQ IDNO.2)；

K27375-FB：5’-gaaggtcggagtcaacggattGAATACGAGAGCCCAGAGGAA-3’(SEQ IDNO.3)；

K27375-R：5’-CGATGCTCAATCAAACCCTCTTTT-3’(SEQ ID NO.4)。

上述序列中，下划线部分为荧光标签序列，加粗部分为等位变异碱基。

3.SNP分型和扫描数据分析

利用KASP引物组合在BIO-RAD CFX-96实时荧光定量PCR仪上对随机选取的4份蒙古冰草和36份冰草材料进行扩增并进行基因分型。

反应体系：DNA模板1μL，2×Master Mix(翰辰光翼)5μL，10μM KASP混合引物0.5μL，其中，K27375-FA：K27375-FB：K27375-R＝1:1:3(V/V/V)，ddH₂O 3.5μL。

反应程序：95℃10min；采用降落PCR的方式，95℃20s，61-55℃40s(每个循环降低0.6℃)，10个循环；95℃20s，55℃40s，30个循环；荧光扫描，30℃30s，一个循环。

实验同时设置至少两个反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)。

对扫描数据进行分析，结果如图2所示，本实施例选取的4份蒙古冰草的扩增产物荧光信号均靠近X轴(橙色FAM信号)，另外36份冰草中，已知母系来源为蒙古冰草的3份冰草样品，其扩增产物荧光信号也均靠近X轴，说明这7份样品的叶绿体基因组的第27375位碱基是G，该位点为GG纯合基因型；剩余的已知母系来源为二倍体冰草的冰草样品，其扩增产物荧光信号均靠近Y轴(蓝色HEX信号)，说明其叶绿体基因组的第27375位碱基是A，该位点为AA纯合基因型。左下角显示为黑色的样本为空白对照(NTC)。

由此可知，根据实施例1中SNP位点设计的KASP引物组合能够准确区分出冰草叶绿体基因组的第27375位碱基处的基因型，若该位点基因型为GG，则对应的冰草母系来源为蒙古冰草；若该位点基因型为AA，则对应的冰草母系来源为二倍体冰草。根据此结果可进一步对冰草进行种质资源鉴定、亲缘关系评价或者根据对冰草母系溯源的结果适应性选择目标品种进行育种。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种蒙古冰草母系来源特有的SNP位点在鉴定冰草母系来源中的应用，其特征在于，所述SNP位点位于蒙古冰草叶绿体基因组MH285848.1的第27375位碱基处，该SNP位点存在G/A突变。

2.一种蒙古冰草母系来源特有的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在第123位碱基处存在G/A突变，该位点的基因型包括GG、AA和GA基因型。

3.一种检测权利要求2所述分子标记的KASP引物组，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物K27375-FA、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物K27375-FB和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物K27375-R。

4.一种权利要求2所述分子标记的检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的KASP引物组。

5.一种权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的检测试剂盒在鉴定冰草母系来源中的应用。

6.一种鉴定冰草母系来源的方法，其特征在于，包括如下步骤：

以待测冰草样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的检测试剂盒对模板进行荧光定量PCR扩增，PCR扩增完成后读取荧光信号，解析转换荧光信号，鉴定基因型，根据基因型判断冰草母系来源；

若鉴定的基因型为GG，则判断待测冰草样品的母系来源为蒙古冰草；若鉴定的基因型为AA，则判断待测冰草样品的母系来源为二倍体冰草。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的程序为：95℃10min；95℃20s，61～55℃40s，每个循环降低0.6℃，10个循环；95℃20s，55℃40s，30个循环；荧光扫描，30℃30s，一个循环；

所述荧光定量PCR扩增的体系为：DNA模板1μL，2×Master Mix 5μL，10μM KASP混合引物0.5μL和ddH₂O 3.5μL，所述KASP混合引物中上游引物K27375-FA、上游引物K27375-FB和下游引物K27375-R的体积比为1:1:3。

8.一种权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的检测试剂盒在冰草种质资源鉴定中的应用。

9.一种权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的检测试剂盒在冰草亲缘关系评价中的应用。

10.一种权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的检测试剂盒在对冰草进行分子标记辅助育种中的应用。