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CN117987578B - 一种同时检测致病性大肠杆菌、沙门菌及耐药基因的微流体芯片及其应用 - Google Patents

一种同时检测致病性大肠杆菌、沙门菌及耐药基因的微流体芯片及其应用 Download PDF

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CN117987578B CN202410399477.5A CN202410399477A CN117987578B CN 117987578 B CN117987578 B CN 117987578B CN 202410399477 A CN202410399477 A CN 202410399477A CN 117987578 B CN117987578 B CN 117987578B
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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种同时检测致病性大肠杆菌、沙门菌及耐药基因的微流体芯片及其应用。利用本发明的微流体芯片可达到同时检测肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌及喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类和氯霉素类4类抗生素耐药基因的目的，具有操作简单、快速、高通量、试剂消耗少、准确性高、灵敏度高、重复性好的优点，对于临床动物疫病快速准确诊断、流行病学调查都具有重要意义。

Description

一种同时检测致病性大肠杆菌、沙门菌及耐药基因的微流体 芯片及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种同时检测致病性大肠杆菌、沙门菌及耐药基因微流体芯片及其应用。
背景技术
大肠杆菌是广泛存在于人及多种动物肠道中的一种微生物，致病性大肠杆菌能引起肠道和肠道外感染，引起畜禽局部或全身感染，严重影响畜禽的生长发育，带来巨大经济损失。沙门菌大多数仅能引起畜禽等动物的感染，但部分血清型的沙门菌能引起人的严重感染。致病性大肠杆菌、沙门菌能通过污染的畜禽产品感染人类，导致尿道感染，脓毒病、食物中毒等一系列疾病，危害严重。
抗生素在畜禽养殖临床中的应用，虽然对疾病的预防与控制取得了一些效果，但是，由于抗生素的长期、不合理使用，导致了细菌耐药性的产生和扩散，出现了越来越多的耐药性大肠杆菌与沙门菌株，从而使抗生素疗效降低甚至失效，部分曾经可以治愈的感染性疾病变得无法控制，同时也加剧了抗生素在畜禽体内的残留，严重威胁畜禽产品质量安全和公共卫生安全，给畜禽养殖业的持续发展、人类身体健康及生态安全带来潜在危害。
目前针对致病性大肠杆菌和沙门菌的检测技术主要包括细菌分离培养及生化鉴定、免疫学技术、分子生物学技术等。传统检测手段耗时且检测效率低下，细菌分离培养周期较长，操作繁琐，不能满足快速检测的要求；免疫学技术敏感性和特异性较低，不适合多种病原体混合感染的检测；PCR技术因其特异性强、敏感性高、操作简单、检测快速等优点而被广泛应用。在临床上PCR技术主要是针对单一病原的检测，针对不同病原同时检测的较少，而且由于大肠杆菌、沙门菌等病原的血清型复杂，目前多重PCR技术也只能同时检测有限的几种基因，在多重PCR检测体系中，不同病原之间极易产生干扰，影响结果的准确性。因此，为了提高快速检测致病性大肠杆菌和沙门菌的能力，亟需研发出更加高效、快速、准确的检测手段，来同时监控多种致病性大肠杆菌和沙门菌，快速、准确对该类病原体进行鉴别诊断，有助于动物疫病的预防和控制，对畜牧业的健康发展具有积极的意义。
目前，在细菌耐药性检测中，传统药敏试验具有一定的局限性，此方法由于需要对细菌进行培养和纯化，耗时长，且经验依赖性强，操作也较繁琐，因此不能完全适应临床诊断治疗的需求。细菌对抗菌药物耐药大多数是由于耐药基因的存在或获得产生的，因此耐药基因的检测对耐药菌的确定有重要意义，基因型检测在耐药菌感染和传播的流行病学调查、新的耐药菌株的发现和鉴定方面发挥了重要作用。如果在用药前能够检测出某种耐药基因，将有利于指导临床合理用药，延缓耐药的发展。由于细菌耐药机制相当复杂，由多种耐药基因引起，如果分别对这些耐药基因进行检测，工作量巨大，而且随着临床上多重耐药菌的不断增多，需要对多类抗生素的多个耐药基因同时进行检测。因此，非常有必要改变一对一的检测模式，开发一次多元的检测方法，实现细菌耐药性的快速、准确检测。
基因芯片技术是将大量的靶基因片段有序排列在玻片等载体上，应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，用芯片扫描仪检测荧光信号后，通过计算机软件进行数据分析。基因芯片技术具有集成化、微型化、自动化、快速、高通量等特点。与传统PCR相比，PCR技术与微流体芯片结合应用可以获得更均匀的体系温度，有助于提高扩增产量，使检测更灵敏。微流体芯片将检测全过程集中在一块芯片中，实现了自动化，样品和试剂消耗量少，反应速度快，它以高通量并行检测的方式，可以同时完成多种病原菌的鉴定和耐药菌株的多种耐药基因检测，为病原菌的鉴定及耐药基因分析提供了强有力的工具。
目前，针对致病性大肠杆菌和沙门菌的鉴别诊断及耐药性分别建立了多种检测方法，然而，在临床上还没有可以同时鉴别检测多种致病性大肠杆菌、沙门菌及耐药基因的微流体芯片检测方法的应用。
因此，建立一种针对多种致病性大肠杆菌、沙门菌和耐药基因的微流体芯片检测方法，以期进一步提高诊断效率与准确性，为临床动物疫病诊断、流行病学调查等工作提供更为有效的检测途径，对提升畜禽产品质量安全和公共卫生安全风险监控能力也具有重要意义。
发明内容
一方面，本发明提供了成套引物，包括25套引物组合；
引物组合1由SEQ ID NO：1和2所示的引物组成；
引物组合2由SEQ ID NO：3和4所示的引物组成；
引物组合3由SEQ ID NO：5和6所示的引物组成；
引物组合4由SEQ ID NO：7和8所示的引物组成；
引物组合5由SEQ ID NO：9和10所示的引物组成；
引物组合6由SEQ ID NO：11和12所示的引物组成；
引物组合7由SEQ ID NO：13和14所示的引物组成；
引物组合8由SEQ ID NO：15和16所示的引物组成；
引物组合9由SEQ ID NO：17和18所示的引物组成；
引物组合10由SEQ ID NO：19和20所示的引物组成；
引物组合11由SEQ ID NO：21和22所示的引物组成；
引物组合12由SEQ ID NO：23和24所示的引物组成；
引物组合13由SEQ ID NO：25和26所示的引物组成；
引物组合14由SEQ ID NO：27和28所示的引物组成；
引物组合15由SEQ ID NO：29和30所示的引物组成；
引物组合16由SEQ ID NO：31和32所示的引物组成；
引物组合17由SEQ ID NO：33和34所示的引物组成；
引物组合18由SEQ ID NO：35和36所示的引物组成；
引物组合19由SEQ ID NO：37和38所示的引物组成；
引物组合20由SEQ ID NO：39和40所示的引物组成；
引物组合21由SEQ ID NO：41和42所示的引物组成；
引物组合22由SEQ ID NO：43和44所示的引物组成；
引物组合23由SEQ ID NO：45和46所示的引物组成；
引物组合24由SEQ ID NO：47和48所示的引物组成；
引物组合25由SEQ ID NO：49和50所示的引物组成。
在一些实施方案中，所述成套引物中的正向引物5’端还具有通用标签序列。在一些具体的实施方式中，所述通用标签序列与荧光标记的通用序列一致；更具体地，与PCR反应Master Mix 中FAM荧光标记的通用序列一致。
在一些实施方案中，本发明提供了所述的成套引物的应用，为以下a1-a6中的任意一种：
a1.鉴别12种病原鉴定基因和13种耐药基因；
a2.制备用于鉴别12种病原鉴定基因和13种耐药基因的产品；
a3.鉴定待测病原是否具有12种病原鉴定基因中的一种或多种，或
所述待测病原是否具有13种耐药基因中的一种或多种；
a4.制备用于鉴定待测病原是否具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的产品，或
所述待测病原是否具有13种耐药基因中的一种或多种的产品；
a5.鉴定待测样本是否感染了具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的病原中的至少一种，或
所述待测样本是否感染了具有13种耐药基因中的一种或多种的病原中的至少一种；
a6.制备用于鉴定待测样本是否感染了具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的病原中的至少一种的产品，或
所述待测样本是否感染了具有13种耐药基因中的一种或多种的病原中的至少一种的产品；所述12种病原鉴定基因为phoA、LTI、Sta、eaeA、bfpB、stx1、stx2、invA、Spy、SdfⅠ、speC、glgC；所述13种耐药基因为aac(6’)-Ib-cr、oqxA、oqxB、qnrS、aadA1、aph(3')-IIa、aacC2、aacC4、tetA、tetB、tetM、floR、cmlA。
一方面，本发明提供了一种含有所述的成套引物的试剂盒，所述试剂盒的用途为以下b1-b3中的任意一种：
b1.鉴别12种病原鉴定基因和13种耐药基因；
b2.鉴定待测病原是否具有12种病原鉴定基因中的一种或多种，或
所述待测病原是否具有13种耐药基因中的一种或多种；
b3.鉴定待测样本是否感染了具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的病原中的至少一种，或所述待测样本是否感染了具有13种耐药基因中的一种或多种的病原中的至少一种
在一些实施方案中，包括将各条引物单独包装的步骤。
一方面，本发明提供了一种微流体芯片，所述芯片上固定有所述的成套引物。
在一些实施方案中，本发明提供了所述的微流体芯片的应用，为以下a1-a6中的任意一种：
a1.鉴别12种病原鉴定基因和13种耐药基因；
a2.制备用于鉴别12种病原鉴定基因和13种耐药基因的产品；
a3.鉴定待测病原是否具有12种病原鉴定基因中的一种或多种，或
所述待测病原是否具有13种耐药基因中的一种或多种；
a4.制备用于鉴定待测病原是否具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的产品，或
所述待测病原是否具有13种耐药基因中的一种或多种的产品；
a5.鉴定待测样本是否感染了具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的病原中的至少一种，或
所述待测样本是否感染了具有13种耐药基因中的一种或多种的病原中的至少一种；
a6.制备用于鉴定待测样本是否感染了具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的病原中的至少一种的产品，或
所述待测样本是否感染了具有13种耐药基因中的一种或多种的病原中的至少一种的产品；所述12种病原鉴定基因为phoA、LTI、Sta、eaeA、bfpB、stx1、stx2、invA、Spy、SdfⅠ、speC、glgC；所述13种耐药基因为aac(6’)-Ib-cr、oqxA、oqxB、qnrS、aadA1、aph(3')-IIa、aacC2、aacC4、tetA、tetB、tetM、floR、cmlA。
一方面，本发明提供了一种鉴定待测样本是否感染了具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的病原中的至少一种，或所述待测样本是否感染了具有13种耐药基因中的一种或多种的病原中的至少一种的方法，包括以下步骤：
以待测样本的核酸为模板，将待测样本的核酸与所述的成套引物，或所述的试剂盒，或所述的微流体芯片接触，进行PCR反应后进行如下评判：
如果某一引物的扩增产物或微流体芯片的某一反应孔检出荧光信号，则待测样本感染或疑似感染所述引物或反应孔对应的病原，或待测样本感染或疑似感染的病原具有所述引物或反应孔对应的耐药基因。
所述12种病原鉴定基因为phoA、LTI、Sta、eaeA、bfpB、stx1、stx2、invA、Spy、SdfⅠ、speC、glgC；所述13种耐药基因为aac(6’)-Ib-cr、oqxA、oqxB、qnrS、aadA1、aph(3')-IIa、aacC2、aacC4、tetA、tetB、tetM、floR、cmlA。
在一些实施方案中，所述方法用于非疾病的诊断与治疗。
一方面，本发明提供了一种鉴定待测样本是否感染了具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的病原中的至少一种，或所述待测样本是否感染了具有13种耐药基因中的一种或多种的病原中的至少一种的检测系统，所述检测系统包括以下构件：
1）12种病原鉴定基因和13种耐药基因的检测构件；
2）数据处理构件；
3）结果输出构件；
所述12种病原鉴定基因和13种耐药基因的检测构件含有所述的成套引物，或所述的试剂盒，或所述的微流体芯片，所述12种病原鉴定基因为phoA、LTI、Sta、eaeA、bfpB、stx1、stx2、invA、Spy、SdfⅠ、speC、glgC；所述13种耐药基因为aac(6’)-Ib-cr、oqxA、oqxB、qnrS、aadA1、aph(3')-IIa、aacC2、aacC4、tetA、tetB、tetM、floR、cmlA。
在一些实施方案中，所述数据处理构件被配置为：根据检测构件检测的待测样本中12种病原鉴定基因和13种耐药基因的检出与否，判断待测样品是否感染了具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的病原中的至少一种，或所述待测样本是否感染了具有13种耐药基因中的一种或多种的病原中的至少一种。
本发明中的引物组包含肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌的12个病原鉴定基因和针对喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类等4类抗生素的13个耐药基因的微流体芯片检测用引物组。本发明还涉及一种利用该微流体芯片引物组同时检测致病性大肠杆菌、沙门菌和喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类等4类抗生素耐药基因的微流体芯片检测方法。利用本发明的微流体芯片检测方法可达到同时检测肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌及喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类和氯霉素类4类抗生素耐药基因的目的，具有操作简单、快速、高通量、试剂消耗少、准确性高、灵敏度高、重复性好的优点，对于临床动物疫病快速准确诊断、流行病学调查都具有重要意义。
本发明建立的微流体芯片，可在一次PCR扩增过程中，同时完成25个特定基因的鉴别检测，同时鉴别检测多种致病性大肠杆菌、沙门菌及喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类等4类抗生素耐药基因，实现快速、高通量并行检测，具有快速、特异、敏感、稳定、试剂消耗少等优点，操作简便，克服了现有检测方式单一和费时费力的问题，提高了检测效率与准确性。
附图说明
图1为实施例1中病原鉴定基因扩增结果图，其中：1.大肠杆菌ETEC 337272；2.大肠杆菌EPEC 186733；3.大肠杆菌EPEC 340977；4.大肠杆菌EHEC 3411585；5.肠炎沙门菌DK6；6.鼠伤寒沙门菌ATCC 14028；7.鸡白痢沙门菌526；8.鸡伤寒沙门菌ATCC 9184。
图2为实施例1中耐药基因扩增结果图，其中：1. T-aac(6’)-Ib-cr；2. T-oqxA；3.T-oqxB；4. T-qnrS；5. T-aadA1；6. T-aph(3')-IIa；7.T-aacC2；8. T-aacC4；9. T-tetA；10. T-tetB；11. T-tetM；12. T-floR；13. T-cmlA。
图3为实施例2中12个病原鉴定基因特异性试验结果图。
图4为实施例3中25个基因灵敏度测试结果图。
图5为实施例4中第一次重复性试验检测结果。
图6为实施例4中第二次重复性试验检测结果。
图7为实施例4中第三次重复性试验检测结果。
图8为实施例5中芯片位点排布图。
图9为实施例6中部分盲样检测结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
除非在上下文中清楚地另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”、“所述”包括它们的复数形式。
术语“包括”用于本说明书或权利要求书，其意图以与术语“包含”在所述术语于权利要求书中用作过渡词时所解释类似的方式，包括额外要素或步骤。此外，就使用术语“或”（例如A或B）而言，其意图指“A或B或两者”。当意指“仅A或B而不是两者”时，则采用术语“仅A或B而不是两者”。因此，在本文中术语“或”的使用是包括性的，而不是排他性的使用。当术语“和”以及“或”一起使用时，如在“A和/或B”中，这指示A或B以及A和B。
通用的实验方法
1 材料
1.1 菌株及耐药基因参考品
菌株：肠产毒性大肠杆菌ETEC 337272，肠致病性大肠杆菌EPEC 186733，肠致病性大肠杆菌EPEC 340977，肠出血性大肠杆菌EHEC 341158，肠炎沙门菌DK6，鼠伤寒沙门菌ATCC 14028，鸡白痢沙门菌526，鸡伤寒沙门菌ATCC 9184；耐药基因参考品：针对喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类和氯霉素类4类抗生素，构建的13个耐药基因的阳性重组质粒DNA。
1.2 试剂
芯片检测用2x Master mix（含FAM标记的通用标签），为北京博奥晶典生物技术有限公司产品；细菌培养基，均为北京陆桥技术有限责任公司产品；细菌基因组提取试剂盒，为天根生化科技（北京）有限公司产品。
1.3 主要仪器
芯片覆膜仪，台式多功能离心机PC16，芯片热封仪CHS1，平板PCR仪，芯片扫描仪LuxScan-10K/D，均为北京博奥晶典生物技术有限公司产品。
1.4 微流体芯片
本发明涉及的微流体芯片为IMAP芯片，是由28×4个反应孔构成的检测分析芯片，每排由28个反应孔组成，一张芯片可以同时检测4个样本。该基因芯片为北京博奥晶典生物技术有限公司产品。每个反应孔检测体系为1µL。
检测过程为：设计合成针对目标基因的微流体芯片检测用特异性引物，将待检测基因的引物预点制到反应孔中，通过注样孔注入模板DNA与反应Master Mix，再通过离心将DNA模板与反应Master Mix注入到反应孔中进行扩增反应，最后通过芯片扫描仪检测荧光信号。
2 实验原理
根据不同目标基因的特异性DNA序列设计一对特异性引物，在正向引物5’端添加通用标签序列，且与PCR反应Master Mix 中FAM荧光标记的通用序列一致。在PCR反应过程中，双链的通用序列变性为单链，参与PCR反应，从而使FAM荧光基团和Quencher分离产生荧光信号，并且荧光强度与反应体系中目标DNA分子数呈线性关系。通过芯片扫描仪可以检测发出的信号及其强度，得到信号值，根据信号值以及荧光扫描伪彩图结果，判定测试样品中是否存在特定的序列。
实施例1 引物设计与微流体芯片的制备
1、引物的设计
根据在GenBank中检索到的基因序列，利用分子生物学软件设计了针对肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的微流体芯片检测用12个病原鉴定基因引物，及针对喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类和氯霉素类4类抗生素耐药基因的微流体芯片检测用13个耐药基因引物，并使用网站BLAST工具进行了引物特异性验证。在正向引物5’端添加通用标签序列，与PCR反应Master mix中FAM荧光标记的通用序列一致。引物序列信息见表1。
引物筛选验证结果
针对12个病原鉴定基因和13个耐药基因，分别筛选到特异性较好的引物（如表1所示），均检测出特定的荧光信号，无非特异性信号，与预期一致。结果如图1、图2。
2、菌株及阳性参考品的制备
2.1 菌株的培养
按照细菌分离培养的常规程序进行。
2.2 细菌基因组DNA的提取
分别取标准菌株肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌和临床分离大肠杆菌的细菌培养物进行基因组DNA的提取，按照细菌基因组提取试剂盒说明书进行提取。
2.3 耐药基因的阳性重组质粒DNA的制备
2.3.1菌株及主要试剂：经生化及荧光PCR鉴定为大肠杆菌的13株菌株；E.coliDH5α菌种，为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品；GV Topo-TA载体，为Genview公司产品；DNA纯化回收试剂盒、质粒提取纯化试剂盒、EcoRⅠ、EcoRV限制性内切酶，均为Promega公司产品。
2.3.2耐药基因扩增与克隆
根据在GenBank中检索到的基因序列，利用分子生物学软件设计针对喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类和氯霉素类4类抗生素的13个耐药基因引物，并用网站BLAST工具进行引物特异性验证，克隆用13个耐药基因的相关信息见表2。
提取细菌基因组DNA，PCR扩增13个耐药基因，然后回收、纯化DNA片段。将回收纯化的PCR产物连接到GV Topo-TA载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化后的菌液涂布在含氨苄青霉素的LB平板上，克隆、检测。用13种耐药基因的特定引物进行菌斑PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性克隆的菌斑转接至含氨苄青霉素的LB培养基中，过夜振摇培养，提取质粒DNA。用EcoRⅠ/EcoRV限制性内切酶对质粒进行酶切，鉴定重组子。酶切鉴定为阳性后测序、分析。
3、芯片上引物预点制
将1μM浓度的引物按照表1的顺序分别点制到芯片的孔中，每个孔点制0.14 μL，待晾干后，通过覆膜仪封膜。
4、PCR反应体系和扩增程序
反应体系为：2x Master mix 0.5μL，模板DNA 0.5μL，总体积 1μL。
扩增程序为：95℃ 15min；95℃ 20s，61-55℃ 60s，10个循环（-0.6℃/cycle）；95℃ 20s，55℃ 60s，26个循环；10℃ 60s。
5、PCR扩增
用移液器将配置的反应体系从芯片入口注入到芯片里，将芯片放入到离心机中4000 rpm离心1min；放入芯片热封仪中进行热封1s；放入平板PCR仪上进行扩增反应。
点制饱和荧光染料的反应孔作为阳性质控点，不点引物与荧光染料的反应孔作为阴性质控点。
6、数据采集
PCR扩增程序运行结束后，将微流体芯片放入芯片扫描仪进行扫描检测发出的信号及其强度，得到信号值，根据信号值以及荧光扫描伪彩图结果，判定测试样品中是否存在特定的序列。
阳性判断标准为：信号值≥1000且无非特异性信号值。
7、扩增产物的测序验证
将25个基因进行微流体芯片扩增后，选择阳性样品的PCR产物进行克隆测序。结果显示，25个基因微流体芯片扩增产物均与目标基因对应的序列完全一致。证实了扩增结果的真实性。
实施例2 特异性实验
将12个病原鉴定基因进行特异性试验验证。针对每个基因选择1个目标阳性反应菌，1个属内阴性对照菌，5个属外菌（多杀性巴氏杆菌、变形杆菌、克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌），对实施例1制备的微流体芯片中的12个病原鉴定基因进行特异性验证。结果显示，12个病原鉴定基因与属内阴性对照菌及属外菌均无交叉反应，特异性好（图3、表3）。
13个耐药基因，通过将阳性样品进行常规PCR检测验证和PCR产物克隆测序，证实13个耐药基因与其它相关耐药基因之间无交叉，均无非特异性。
实施例3 灵敏度实验
为验证实施例1制备的25个基因微流体芯片检测方法的灵敏度，针对25个目标基因，将12个病原鉴定基因对应的从标准菌株提取的阳性DNA浓度和13个耐药基因对应的从临床分离大肠杆菌提取的阳性DNA浓度均调整到4 ng/µL，进行10倍梯度稀释，每个目标基因均作10个稀释度，即：4 ng/µL、400 pg/µL、40 pg/µL、4 pg/µL、4×10-1pg/µL、4×10-2pg/µL、4×10-3pg/µL、4×10-4pg/µL、4×10-5pg/µL、4×10-6pg/µL。针对10个不同浓度的DNA在微流体芯片中进行灵敏度测试。
结果显示，25个目标基因检测灵敏度在40 pg/µL至4×10-3pg/µL之间，说明本发明方法具有较高的灵敏度（图4、表4）。
实施例4 重复性实验
将实施例1制备的25个基因微流体芯片进行重复性扩增试验，共3次，且每次进行3个重复，每个目标基因选择1个阳性反应菌，1个阴性对照菌，且设置3个NTC对照。重复检测结果完全一致，25个目标基因均表现出稳定的重复性，重复检测稳定性好（图5、图6、图7）。
实施例5 芯片点制
根据实施例1-4的结果，进行微流体芯片设计和位点排布。
微流体芯片设计和位点排布：每排28个反应孔，共4排。一张芯片可以同时检测4个样品，检测25个基因（12个病原鉴定基因与13个耐药基因）。编号为1和27的反应孔作为阳性质控点，点制饱和荧光染料，第2至第13反应孔点制病原鉴定基因引物，第14至第26反应孔点制耐药基因引物，编号为28的反应孔为空白孔（阴性质控点），不点引物与荧光染料（图8、表5）。
实施例6 临床应用评价
采集临床样本对建立的方法进行应用评价。
从北京地区延庆、顺义的规模化猪场和鸡场采集了200份样品，对分离的63株病原菌采用微流体芯片检测方法进行病原鉴定及耐药基因检测，部分结果见图9。
63株病原菌微流体芯片病原鉴定结果与荧光PCR检测结果完全一致。2种方法均检出大肠杆菌53株，其中肠产毒性大肠杆菌（ETEC）8株、肠致病性大肠杆菌（EPEC）7株、肠出血性大肠杆菌（EHEC）7株，条件致病性大肠杆菌31株；均检出沙门菌10株，其中肠炎沙门菌2株、鼠伤寒沙门菌1株、鸡白痢沙门菌3株、鸡伤寒沙门菌4株。
63株病原菌微流体芯片耐药基因检测结果与常规PCR检测结果完全一致。2种方法从63株病原菌中均检测出13种耐药基因，耐药基因的阳性检出率完全一致。耐药基因的阳性检出率分别为：aac(6’)-Ib-cr（41.3%）、oqxA（42.9%）、oqxB（39.7%）、qnrS（33.3%）、aadA1（69.8%）、aph(3')-IIa（17.5%）、aacC2（31.7%）、aacC4（90.5%）、tetA（66.7%）、tetB（30.2%）、tetM（9.5%）、floR（57.1%）、cmlA（50.8%）。
由此表明，本发明可在一次反应中同时完成25个特定基因的鉴别检测，在具有高灵敏度和特异性的同时，又克服了现有检测方式单一和费时费力的问题，实现了快速、高通量并行检测，操作简便，试剂消耗少。

Claims (8)

1.一种微流体芯片，其特征在于，所述芯片上固定有成套引物，所述成套引物包括以下25套引物组合：
引物组合1由SEQ ID NO：1和2所示的引物组成；
引物组合2由SEQ ID NO：3和4所示的引物组成；
引物组合3由SEQ ID NO：5和6所示的引物组成；
引物组合4由SEQ ID NO：7和8所示的引物组成；
引物组合5由SEQ ID NO：9和10所示的引物组成；
引物组合6由SEQ ID NO：11和12所示的引物组成；
引物组合7由SEQ ID NO：13和14所示的引物组成；
引物组合8由SEQ ID NO：15和16所示的引物组成；
引物组合9由SEQ ID NO：17和18所示的引物组成；
引物组合10由SEQ ID NO：19和20所示的引物组成；
引物组合11由SEQ ID NO：21和22所示的引物组成；
引物组合12由SEQ ID NO：23和24所示的引物组成；
引物组合13由SEQ ID NO：25和26所示的引物组成；
引物组合14由SEQ ID NO：27和28所示的引物组成；
引物组合15由SEQ ID NO：29和30所示的引物组成；
引物组合16由SEQ ID NO：31和32所示的引物组成；
引物组合17由SEQ ID NO：33和34所示的引物组成；
引物组合18由SEQ ID NO：35和36所示的引物组成；
引物组合19由SEQ ID NO：37和38所示的引物组成；
引物组合20由SEQ ID NO：39和40所示的引物组成；
引物组合21由SEQ ID NO：41和42所示的引物组成；
引物组合22由SEQ ID NO：43和44所示的引物组成；
引物组合23由SEQ ID NO：45和46所示的引物组成；
引物组合24由SEQ ID NO：47和48所示的引物组成；
引物组合25由SEQ ID NO：49和50所示的引物组成。
2.如权利要求1所述的微流体芯片，其特征在于，所述成套引物中的正向引物的5’端还具有通用标签序列。
3.一种含有权利要求1或2所述的微流体芯片的试剂盒。
4.权利要求1或2所述的微流体芯片的非疾病诊断目的的应用，为以下a1-a6中的任意一种：
a1.鉴别12种病原鉴定基因和13种耐药基因；
a2.制备用于鉴别12种病原鉴定基因和13种耐药基因的试剂盒；
a3.鉴定待测病原是否具有12种病原鉴定基因中的一种或多种，或
所述待测病原是否具有13种耐药基因中的一种或多种；
a4.制备用于鉴定待测病原是否具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的试剂盒，或
所述待测病原是否具有13种耐药基因中的一种或多种的试剂盒；
a5.鉴定待测样本中是否存在具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的病原，或
所述待测样本中是否存在具有13种耐药基因中的一种或多种的病原；
a6.制备用于鉴定待测样本中是否存在具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的病原的试剂盒，或
所述待测样本中是否存在具有13种耐药基因中的一种或多种的病原的试剂盒；
所述12种病原鉴定基因为phoA、LTI、Sta、eaeA、bfpB、stx1、stx2、invA、Spy、SdfⅠ、speC、glgC；所述13种耐药基因为aac(6’)-Ib-cr、oqxA、oqxB、qnrS、aadA1、aph(3')-IIa、aacC2、aacC4、tetA、tetB、tetM、floR、cmlA。
5.权利要求3所述的试剂盒的非疾病诊断目的的用途，为以下b1-b3中的任意一种：
b1.鉴别12种病原鉴定基因和13种耐药基因；
b2.鉴定待测病原是否具有12种病原鉴定基因中的一种或多种，或
所述待测病原是否具有13种耐药基因中的一种或多种；
b3.鉴定待测样本中是否存在具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的病原，或
所述待测样本中是否存在具有13种耐药基因中的一种或多种的病原；
所述12种病原鉴定基因为phoA、LTI、Sta、eaeA、bfpB、stx1、stx2、invA、Spy、SdfⅠ、speC、glgC；所述13种耐药基因为aac(6’)-Ib-cr、oqxA、oqxB、qnrS、aadA1、aph(3')-IIa、aacC2、aacC4、tetA、tetB、tetM、floR、cmlA。
6.一种非疾病诊断目的的鉴定待测样本中是否存在具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的病原，或所述待测样本中是否存在具有13种耐药基因中的一种或多种的病原的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以待测样本的核酸为模板，将待测样本的核酸与权利要求1或2所述的微流体芯片中的25套引物组合，或权利要求3所述的试剂盒中的25套引物组合接触，进行PCR反应后进行如下评判：
如果25套引物组合中的一种或多种的扩增产物检出荧光信号，则待测样本中存在或疑似存在所述引物组合对应检测的病原，或
所述病原具有所述引物组合对应检测的耐药基因；
所述12种病原鉴定基因为phoA、LTI、Sta、eaeA、bfpB、stx1、stx2、invA、Spy、SdfⅠ、speC、glgC；所述13种耐药基因为aac(6’)-Ib-cr、oqxA、oqxB、qnrS、aadA1、aph(3')-IIa、aacC2、aacC4、tetA、tetB、tetM、floR、cmlA。
7.一种鉴定待测样本中是否存在具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的病原，或所述待测样本中是否存在具有13种耐药基因中的一种或多种的病原的检测系统，其特征在于，所述检测系统包括以下构件：
1）12种病原鉴定基因和13种耐药基因的检测构件；
2）数据处理构件；
3）结果输出构件；
所述12种病原鉴定基因和13种耐药基因的检测构件含有权利要求1或2所述的微流体芯片，或权利要求3所述的试剂盒；
所述12种病原鉴定基因为phoA、LTI、Sta、eaeA、bfpB、stx1、stx2、invA、Spy、SdfⅠ、speC、glgC；所述13种耐药基因为aac(6’)-Ib-cr、oqxA、oqxB、qnrS、aadA1、aph(3')-IIa、aacC2、aacC4、tetA、tetB、tetM、floR、cmlA。
8.如权利要求7所述的检测系统，所述数据处理构件被配置为：
根据检测构件检测的待测样本中12种病原鉴定基因和13种耐药基因的检出与否，判断待测样品中是否存在具有12种病原鉴定基因中的一种或多种的病原，或所述待测样本中是否存在具有13种耐药基因中的一种或多种的病原。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119120742B (zh) * 2024-09-06 2025-06-06 江苏省家禽科学研究所 一种基于res基因的鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌快速鉴别试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104531877A (zh) * 2014-12-31 2015-04-22 南京安阔医疗科技有限公司 一种细菌耐药性筛查pcr芯片
CN105950732A (zh) * 2016-05-25 2016-09-21 中国农业大学 动物源食品致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片
CN112708658A (zh) * 2021-01-27 2021-04-27 中国动物卫生与流行病学中心 一种多重耐药基因检测的液态芯片引物组及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104560981B (zh) * 2015-01-23 2017-07-18 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种检测细菌喹诺酮类耐药基因的引物及试剂盒
CN106244690B (zh) * 2016-08-03 2019-06-18 扬州大学 一种快速鉴定肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的多重pcr检测试剂盒
FR3055339B1 (fr) * 2016-09-01 2020-05-22 Centre National De La Recherche Scientifique Methode de detection et d'identification in vitro d'un ou plusieurs pathogenes cibles presents dans un echantillon biologique
CN108913768B (zh) * 2018-07-23 2021-10-22 广东省实验动物监测所 一种同时检测七个氨基糖胺类耐药基因的多重液相基因芯片引物、试剂盒及其分析方法
CN115786543A (zh) * 2022-08-12 2023-03-14 扬州大学 一种鉴定和区分鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的多重pcr检测试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104531877A (zh) * 2014-12-31 2015-04-22 南京安阔医疗科技有限公司 一种细菌耐药性筛查pcr芯片
CN105950732A (zh) * 2016-05-25 2016-09-21 中国农业大学 动物源食品致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片
CN112708658A (zh) * 2021-01-27 2021-04-27 中国动物卫生与流行病学中心 一种多重耐药基因检测的液态芯片引物组及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
多重PCR方法快速鉴别肠炎，鼠伤寒，鸡白痢及鸡伤寒沙门菌;杨林等;畜牧兽医学报;20141231;第45卷(第2期);第268-273页 *
禽大肠杆菌、肠炎、鼠伤寒、鸡白痢及鸡伤寒沙门菌多重PCR方法的建立及应用;梁华等;微生物学通报;20190420;第4卷(第7期);第960-966页 *

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