CN117987359B - 用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法，其特征在于：包含(1)使用包含硫酸锌和ZSTK474的培养基进行培养的步骤；所述硫酸锌的浓度为0.1mg/L，ZSTK474的浓度为0.5μM；进一步，所述方法还包含(2)在培养过程中使用细胞刺激的步骤。本发明优化了培养基和培养条件，经本申请的方法获得外囊泡数量和囊泡所含蛋白量得到显著提高。由于培养基构成简单，培养刺激操作简单，易进行大范围推广。

Description

用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法

技术领域

本申请涉及医药技术领域，尤其涉及用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法。

背景技术

细胞向细胞外环境排放多种膜(membrane)类囊泡，通常把这些囊泡叫做细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)，细胞外囊泡具有脂质双层膜结构，广泛存在于所有体液中，包括唾液、血液、尿液和母乳等，根据不同来源、大小、生成过程，可分成外泌体(Exosome)、微型囊(Microvesicles)、外膜囊泡(Outer membranevesicles)等，外泌体是细胞内的多泡小体(multivesicular bodies)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外的，大小约30-100nm的囊泡，微囊泡是大小约100-1000nm的囊泡。但外观上的区别不大，都具有向细胞外分泌的囊泡的共性，因此目前统称为“细胞外囊泡”。

目前EVs的主要来源依赖于组织培养工程。一般情况下，人们多采用超速离心、免疫磁珠、差速超速离心、密度梯度离心、微滤、微流体、使用合成肽、识别膜的抗体的组合、超滤、沉淀、超声或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离。

例如现有技术CN111670067B公开了用于从不同生物流体中分离细胞外囊泡(EV)的方法，所述基于镍的分离方法(NBI)是快速的、可扩大规模的，并且允许在生理pH纯化尺寸上异质的EV，保持它们在溶液中的完整性和稳定性。

现有技术CN112717844B公开了用于胞外囊泡富集的磁性纳米材料，包括将具有高亲和性捕获胞外囊泡的分子以及金属离子修饰到磁性纳米材料表面而获得的功能化材料。

现有技术CN113631240B公开了一种从生物样品中提取微泡的方法，所述方法包括以下步骤：将多价阳离子材料加入所述生物样品以形成聚集体，其中所述微泡和所述多价阳离子材料通过电荷力聚集；当包括所述聚集体的所述生物样品通过捕获滤器时通过所述捕获滤器捕获所述聚集体。

现有技术CN116904397A公开了运用密度梯度离心法，分离脐带血单个核细胞制备浓缩的细胞外囊泡。

现有技术CN116694562B公开了脑微血管内皮细胞受到下调miR-31-5p表达的干预后释放的小细胞外囊泡。

现有技术CN115778890B公开了通过差速离心制得洋甘菊胞外囊泡。

现有技术CN114752561B公开了使用一种基于聚多巴胺纳米粒子的细胞外囊泡分离方法。

现有技术CN114672456A公开了利用超声刺激提高脂肪干细胞分泌胞外囊泡效率的方法及应用。

CN 115786254 B公开了在外泌体提取过程中使用刺激培养，所述刺激培养为在细胞培养过程中进行重复磁刺激。

使用超高速离心分离获得的细胞外囊泡纯度较高，但是分离所需设备条件较高，分离过程繁琐。商业化分离试剂盒操作简便，且细胞外囊泡分离效率高，但是细胞外囊泡纯度很低，掺杂很多杂质。其他分离方法如色谱法、微流控法等都很难实现细胞外囊泡的规模化分离。

总之，目前细胞外囊泡的分离缺乏高效、简单的手段。

发明内容

本申请的一个目的是提供一种用于从生物材料中分离细胞外泡的方法，

至少用以解决现有技术中外囊泡的分离缺乏高效、简单的问题。

为实现上述目的，本申请的一些实施例提供了以下几个方面：

第一方面，本申请的一些实施例提供了一种用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法，包含(1)使用包含硫酸锌和ZSTK474的培养基进行培养的步骤。

在某些实施例中，所述硫酸锌的浓度为0.1mg/L，ZSTK474的浓度为0.5μM。

在某些实施例中，还包含(2)在培养过程中使用细胞刺激的步骤。

在某些实施例中，所述刺激包含超声刺激和磁刺激中的一种。

在某些实施例中，所述刺激包含超声刺激和磁刺激。

第二方面，本申请的一些实施例还提供了一种用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法，包含以下步骤：(a)ADSCs细胞分离提取；(b)ADSCs培养，所述ADSCs培养使用包含硫酸锌和ZSTK474的培养基进行培养；(c)刺激培养；(d)外囊泡提取。

在某些实施例中，所述(d)外囊泡提取使用超滤法提取。

在某些实施例中，所述超滤法使用经过100KD的超滤管离心，2000rpm离心20min。

第三方面，本申请的一些实施例还提供了一种用于从生物材料中分离细胞外囊泡的培养基，所述培养基的组分包含10％FBS(胎牛血清)的低糖DMEM、硫酸锌和ZSTK474。

第四方面，本申请的一些实施例还提供了一种外囊泡，所述外囊泡由上述方法分离获得。

相较于现有技术，本申请实施例提供的方案中，至少具有如下有益效果：本发明优化了培养基和培养条件，经本申请的方法获得外囊泡数量和囊泡所含蛋白量得到显著提高。由于培养基构成简单，培养刺激操作简单，易进行大范围推广。

附图说明

图1为本申请实施例1的ADSC鉴定结果，成脂(a)、成骨(b)、成软骨(c)；

图2为本申请实施例1的外囊泡在透射电镜下的外观；

图3为本申请实施例1的NTA检测外囊泡粒子统计图；

图4为本申请实施例1的Western Blot结果显示；

图5为本申请实施例1的HUVECs对ADSC-EV的摄取；

图6为本申请实施例提供的各组外囊泡定量对比图；a囊泡数量；b蛋白定量；

图7为本申请实施例提供的各组对HUVECs的细胞影响及效果对比；a对形成血管数目影响；b对形成血管分支点影响。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

1号培养基：10％FBS(胎牛血清)的低糖DMEM；0.1mg/L硫酸锌，0.5μM ZSTK474。其中ZSTK474购自abcam(货号：ab146194)。

2号培养基：10％FBS(胎牛血清)的低糖DMEM；0.5μM ZSTK474。其中ZSTK474购自abcam(货号：ab146194)。

3号培养基：10％FBS(胎牛血清)的低糖DMEM；0.1mg/L硫酸锌。

4号培养基：10％FBS(胎牛血清)的低糖DMEM。

实施例1脂肪干细胞的分离和培养

(1)无菌条件下，获取抽脂术所得脂肪组织。将脂肪组织用PBS冲洗后，加入5倍体积I型胶原酶和I I I型胶原酶混合液(质量百分数浓度分别为0.05％、0.02％)加入装有脂肪的离心管中，封口后上下颠倒摇晃，充分混匀。在摇床上以37℃消化60min后，再次转移到超净台下，用PBS轻轻吹打使细胞充分从组织团块上脱离下来。

(2)将上述细胞悬液以1000rpm/min离心5min，吸弃上层脂肪和上清液，再加入PBS缓冲液重悬细胞再次离心洗涤，弃上清后向离心后的底部沉淀加入1号培养基重悬细胞。细胞以1×10⁴/ml的密度接种至底面积25cm²的培养瓶中，在5％CO2浓度的37℃恒温培养箱中培养。

(3)细胞生长达到培养瓶底85％时，弃瓶内培养液，加入0.25％胰酶(含0.01％EDTA)；显微镜下见细胞收缩呈圆形，大部分细胞开始从瓶底壁上脱落时，向培养瓶内加入等量的1号培养基，轻轻吹打，使细胞完全脱壁；把细胞悬液置入离心管中以1000rpm/min的速度离心去除上清液，用基础培养基重悬细胞，细胞悬液按1:3比例传入新的培养瓶中。取第3代ADSCs用于实验。

(2.1)针对上述脂肪干细胞(P3)分别通过流式细胞术和三向诱导(成骨、成脂和成软骨)进行鉴定。如图1所示。

(2.2)脂肪干细胞胞外囊泡的提取

第三代脂肪干细胞长满以后，用PBS洗涤细胞两次，然后更换新的1号培养基。进行细胞刺激，所述刺激包含超声刺激和磁刺激，然后持续培养48小时后，收集细胞上清。经过100KD的超滤管离心，2000rpm离心20min，分别提取上述不同处理的细胞上清中的细胞外囊泡，提取好的囊泡溶于PBS中，保存在-80℃冰箱中。

超声刺激的参数：使用1MHz、10Hz脉冲重复频率、60％占空比、9mm²横截面积的超声发生设备对细胞进行超声刺激，具体过程如下：将0.5-1cm厚的耦合剂均匀地涂抹在10cm的细胞培养皿下方，然后将超声发生设备的换能器与耦合剂紧密贴合以排除空气，采用的超声刺激强度为：1.5W/cm²、30s。

磁刺激的参数：调节重复磁刺激的频率12Hz、最大输出强度30％、脉冲200个/12h。

实施例2

除培养基由1号培养基替换成2号培养基外，其余条件与实施例1相同。

实施例3

除培养基由1号培养基替换成3号培养基外，其余条件与实施例1相同。

实施例4

除培养基由1号培养基替换成4号培养基外，其余条件与实施例1相同。

实施例5

除培养中不使用细胞刺激外，其余条件与实施例1相同。

实施例6

除培养中细胞刺激仅包含超声刺激外，其余条件与实施例1相同。

实施例7

除培养中细胞刺激仅包含磁刺激外，其余条件与实施例1相同。

实施例8：脂肪干细胞胞外囊泡鉴定及分析

1、脂肪干细胞胞外囊泡的鉴定

通过透射电镜观察囊泡的形态和大小，Western Blot检测囊泡相关特异性标志物，内吞实验验证胞外囊泡是否能被受体细胞所摄取。内吞实验采用在厂商的指导下利用PKH26红色荧光对ADSC-EV进行标记，将EV悬浮液离心(16000g、4℃、1h)，得到EV沉淀，加入1mL Diluent C重悬沉淀，然后加入10μL PKH26染液吹打均匀，放置于培养箱内避光孵育半小时进行染色，加入BSA溶液终止反应。将悬浮液离心(16000g、4℃、1h)，沉淀用PBS重悬，于共聚焦显微镜下进行观察；纳米颗粒追踪分析(NTA)计算囊泡的平均直径。

2、脂肪干细胞胞外囊泡定量分析

分别通过NTA和蛋白定量两种方法对提取的囊泡进行定量分析

(1)NTA定量：取少量的囊泡溶液，用PBS缓冲液稀释到约300μL体积，分析颗粒数和颗粒直径等的分布，记录上机的稀释倍数，以便于与蛋白定量进行换算。

(2)蛋白定量(BCA法)：采用碧云天公司的BCA蛋白定量试剂盒进行定量检测，配制不同浓度的蛋白标准品，并将囊泡进行一定倍数的稀释，将适当体积的蛋白标准品和囊泡加入到96孔板中，加入工作液进行反应，通过各孔的吸光值计算囊泡的蛋白浓度。

结果如图2所示，透射电镜下显示，超声刺激脂肪干细胞后提取的胞外囊泡呈不规则圆形；NTA检测胞外囊泡显示其平均直径为150nm(图3)；Western Blot结果显示：外囊泡高表达囊泡特异标志物(图4)；内吞实验显示：囊泡可以被皮肤成纤维细胞所摄取(图5)；NTA检测显示：实施例1相对于其他实施例的囊泡数量和所含蛋白量得到了显著提高(图6)。

实施例9：效果验证

脐静脉内皮细胞成管能力的检测

将Matrigel平铺在96孔板的底部，放入培养箱中20min待其凝固后，将脐静脉内皮细胞系(HUVECs)接种到Matrigel上，加入低糖DMEM，实验组加入200ug/ul的实施例1-7的外囊泡，对照组加入等体积的PBS，6h以后镜下观察成管情况并拍照，通过软件统计成管数量。

结果参见图7，实施例1相对于其他实施例的外囊泡，明显地促进了HUVECs的血管生成，血管数目及分支点明显优于其他实施例。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于从生物材料中分离脂肪干细胞外囊泡的方法，其特征在于：包含（1）使用包含硫酸锌和ZSTK474的培养基进行培养的步骤。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述硫酸锌的浓度为0.1mg/L，ZSTK474的浓度为0.5μM。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于，还包含（2）在培养过程中使用细胞刺激的步骤。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述刺激包含超声刺激和磁刺激中的一种。

5.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述刺激包含超声刺激和磁刺激。

6.一种用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，包含以下步骤：（a）ADSCs细胞分离提取；（b）ADSCs培养，所述ADSCs培养使用包含硫酸锌和ZSTK474的培养基进行培养；（c）刺激培养；（d）外囊泡提取。

7.根据权利要求6的方法，其特征在于，所述（d）外囊泡提取使用超滤法提取。

8.根据权利要求7的方法，其特征在于，所述超滤法使用经过100KD的超滤管离心，2000rpm离心20min。

9.一种用于从生物材料中分离脂肪干细胞外囊泡的培养基，其特征在于，所述培养基的组分包含10% FBS（胎牛血清）的低糖 DMEM、硫酸锌和ZSTK474。