CN117987337A - 一种多基因缺失的肠炎沙门菌、其构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时缺失spiC基因、purL基因、sifA基因、trmE基因、rfbE基因中的两种或两种以上的多基因缺失的肠炎沙门菌。本发明还公开了其上述多基因缺失的肠炎沙门菌在制备肠炎沙门菌灭活疫苗中的应用。本发明公开的五基因同时缺失的肠炎沙门菌减毒株毒力较野生型肠炎沙门菌显著下降，在宿主体内定殖时间明显缩短，接种后鸡只无不良反应，对强毒力肠炎沙门菌提供良好的保护作用，可有效清除强毒力菌株感染。应用于肠炎沙门菌灭活疫苗具有良好的免疫原性，可对雏鸡可提供坚实的免疫保护效果。

Description

一种多基因缺失的肠炎沙门菌、其构建方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种多基因缺失的肠炎沙门菌、其构建方法及应用。

背景技术

沙门菌病是由沙门菌引起动物和人类急性和慢性疾病的总称。人类感染沙门菌主要表现为恶心、呕吐、腹泻等症状；动物感染沙门菌后，临床上则多表现为败血症和肠炎，也可使怀孕母畜发生流产(焦新安.沙门菌病[M].中国农业出版社,2015.)。沙门菌病作为重要的人兽共患病，在全球范围都是重要的动物疫病和重大的公共卫生问题，该病不仅给畜禽养殖业带来重大经济损失，而且会对人类健康构成严重的威胁。多年来，针对不同的沙门菌病，全球很多国家先后采用了生物安全、免疫预防、抗生素防治等措施预防和控制沙门菌病。虽然该病的流行在一定程度上得到了控制，但由于各种原因，该病的防控仍然是一项长期而艰巨的任务。

沙门菌是一种革兰氏阴性菌，宿主谱广泛，且危害严重。在众多的沙门菌血清型中，以肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌为主的非伤寒沙门菌(NTS)能够通过各种畜禽产品危害人类健康(Balasubramanian R,Im J,Lee JS,et al.The Global Burden andEpidemiology of Invasive Non-typhoidal Salmonella Infections[J].Hum VaccinImmunother,2019,15:1421-1426.)。肠炎沙门菌能够引起成年鸡隐性感染，并通过粪便向外界环境排菌，造成环境污染，同时也导致病原菌难以净化；受肠炎沙门菌感染的雏鸡则表现为严重的全身性感染和高死亡率(Crump JA,Sjolund-Karlsson M,Gordon MA,etal.Epidemiology,Clinical Presentation,Laboratory Diagnosis,AntimicrobialResistance,and Antimicrobial Management of Invasive Salmonella Infections[J].Clin Microbiol Rev,2015,28:901-937.)。近年，有报道指出，肠炎沙门菌正在逐渐替代鼠伤寒沙门菌成为最常见的食源性沙门菌血清型；然而，大多数科学研究仍围绕鼠伤寒沙门菌展开，对肠炎沙门菌致病机制及防控研究较少(Voetsch AC,Van G,Angulo FJ,etal.FoodNet Estimate of the Burden of Illness Caused by NontyphoidalSalmonella Infections in the United States[J].Clin Infect Dis,2004:127-134.)。因此，加强关于肠炎沙门菌防控基础的研究势在必行。

目前，由于我国之前预防沙门菌的防控主要依赖于抗生素，但随着抗生素的大量使用，会出现多重耐药甚至全耐药的沙门菌及国外疫苗的技术封锁。我国自主的疫苗研制是免疫预防和治疗沙门菌的主要途径，通过接种疫苗可以减少沙门菌在机体的定殖和入侵，并减少粪便排菌和环境污染来降低公共卫生风险。

沙门菌疫苗主要分为灭活疫苗、亚单位疫苗以及减毒活疫苗。其中与灭活疫苗和亚单位疫苗相比，减毒活疫苗免疫原性好，除能够诱导机体产生体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫外，还可作为疫苗载体，是预防沙门菌的重要手段(马湘海,尹佳彤,汪珏楚,等.禽沙门菌疫苗研究进展[J].畜禽业,2021,32:8-9.)。

有研究表明，trmE基因缺失后沙门菌高度减毒，并且该缺失株免疫小鼠后可诱发高水平的IgG1和IgG2a，保护小鼠免受高致死剂量的野生型沙门菌攻击(DC Shippy,NMEakley,CT Lauhon,et al.Virulence characteristics of Salmonella followingdeletion of genes encoding the tRNA modification enzymes GidA and MnmE[J].Microb Pathog,2013,57:1-9.)。因此，trmE基因有希望成为减毒活疫苗或广谱抗菌药物的靶点。

有研究发现purL基因的缺失使LPS结构发生改变并且该基因可能与细菌毒力和宿主全身性感染有关(HN Tuntufye,S LeaLer,PS Gwakisa,et al.Identification ofAvian pathogenic Escherichia coli genes that are induced in vivo duringinfection in chickens[J].Appl Environ Microbiol,2012,78(9):3343-3351.)。Cepas等发现purL基因的突变导致大肠杆菌的生物膜缺损，证明purL是大肠杆菌生物膜形成的关键基因，同时认为其是一个潜在的抗菌靶点(V Cepas,V Ballén,Y Gabasa,etal.Transposon insertion in the purL gene induces biofilm depletion inEscherichia coli ATCC 25922[J].Pathogens,2020,9(9):774.)。

spiC基因被认为是影响沙门菌毒力的重要基因，其编码的效应蛋白作用与宿主膜泡运输相关。SpiC蛋白对沙门菌在吞噬细胞中的生存是必需的，其被T3SS2分泌到宿主细胞的胞质溶胶中，与宿主蛋白相互作用，干扰宿主细胞的运输并抑制吞噬细胞与溶酶体之间的融合(Geng SZ,Qian S,Pan ZM,et al.Preparation of monoclonal antibodiesagainst SpiC protein secreted by T3SS-2 of Salmonella spp[J].MonoclonalAntibodies in Immunodiagnosis&Immunotherapy,2015,34(6):432-435.)。rfbE基因都是LPS相关基因，能参与脂多糖的生物合成。rfbE基因的缺失都会导致LPS的完整性遭到破坏，细菌表型从光滑型变为粗糙型。研究显示，spiC基因是沙门菌重要的毒力基因，且rfbE基因都是LPS相关基因，也与沙门菌的毒力相关；SifA是沙门菌维持SCV膜完整性的重要SPI2效应蛋白，缺失sifA的沙门菌可以增强炎性小体的活化(宋佩烜,胡桂秋,秦晓霞,等.sifA基因缺失沙门菌增强巨噬细胞炎性体活化研究[J].动物医学进展,2016,37(05):1-4.)。

因此，选择这些基因的原因如下：第一点，这些基因的缺失都可能导致沙门菌的毒力下降。第二点，经过多基因的筛选组合及无痕敲除的构建方式，其构建的突变株会显著影响毒力。第三点，五基因的疫苗突变株，在鸡体内进行基因回复的能力减弱，这些都为研发减毒疫苗提供了可能。

国内常采用药物控制法，造成了细菌耐药性和药物残留等一系列问题。最近几年，许多国家逐渐转向使用疫苗预防来控制沙门菌，取得了很好的效果。近年来，利用基因工程技术将强毒株毒力相关基因敲除构建的新型减毒沙门菌用作疫苗的研究备受关注，新型减毒活疫苗安全性好、不易返祖；在减毒的同时不丧失免疫原性，并且可在免疫期内于免疫动物体内繁殖，能刺激机体产生全面的系统免疫反应和局部免疫反应，可对病原体的多种抗原产生免疫应答；免疫力坚实，免疫期长，比灭活疫苗和亚单位疫苗在预防控制鸡沙门菌的感染方面更有优势，因而是较为理想的疫苗。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足，本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种同时缺失spiC基因、purL基因、sifA基因、trmE基因、rfbE基因中的两种或两种以上的多基因缺失的肠炎沙门菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述多基因缺失的肠炎沙门菌的构建方法和应用。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种多基因缺失的肠炎沙门菌，所述肠炎沙门菌同时缺失spiC基因、purL基因、sifA基因、trmE基因、rfbE基因中的两种或两种以上。

进一步地，所述的多基因缺失的肠炎沙门菌，所述肠炎沙门菌同时缺失spiC基因、purL基因、sifA基因、trmE基因、rfbE基因。

进一步地，所述spiC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述purL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述sifA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述trmE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述rfbE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了上述多基因缺失的肠炎沙门菌菌株的构建方法，包括步骤：将肠炎沙门菌Z11的spiC基因、purL基因、sifA基因、trmE基因、rfbE基因中的两种或两种以上敲除。

进一步地，所述敲除基因的方法采用同源重组的方法敲除基因。

进一步地，所述敲除基因的方法采用自杀质粒的方法敲除基因。

本发明还提供了上述多基因缺失的肠炎沙门菌在制备肠炎沙门菌灭活疫苗中的应用。

本发明还提供了一种肠炎沙门菌灭活疫苗，含有上述的任一多基因缺失的肠炎沙门菌。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明提供的五基因同时缺失的肠炎沙门菌减毒株毒力较野生型肠炎沙门菌显著下降，在宿主体内定殖时间明显缩短，接种后鸡只无不良反应，对强毒力肠炎沙门菌提供良好的保护作用，可有效清除强毒力菌株感染。应用于肠炎沙门菌灭活疫苗具有良好的免疫原性，可对雏鸡可提供坚实的免疫保护效果。

附图说明

图1为SPF鸡接种SEΔ5-E和Z11后的脏器内细菌载量结果图，其中A为肝脏结果，B为脾脏结果，C为盲肠结果；

图2为SPF鸡接种SEΔ5-E和Z11后平均体重变化结果图；

图3为SPF鸡接种SEΔ5-E和Z11后血清抗体IgG的检测结果图；

图4为SPF鸡接种SEΔ5-E和Z11的腿肌注射点观察结果图；

图5为SPF鸡接种SEΔ5-E和Z11的胸肌注射点观察结果图；

图6为SPF鸡接种SEΔ5-E和Z11的肝脏表型观察图；

图7为SPF鸡接种SEΔ5-E和Z11的脾脏表型观察图；

图8为疫苗候选株SEΔ5-E免疫雏鸡后肝脏、脾脏和盲肠的病理学变化图(200×)；

图9为疫苗候选株SEΔ5-E与亲本株Z11感染鸡的血清与O₉商品化抗原产生PAT结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的一个端点以及一个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

实施例1肠炎沙门菌Z11突变株的构建

肠炎沙门菌Z11来源：江苏省人兽共患病学重点实验室分离保存。所述肠炎沙门菌为肠炎沙门氏菌(Salmonella sp.)SE-E-YZ20231212，简称Z11，于2023年12月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20232643。

1.1细菌构建及命名

本实施例通过基因工程方法构建肠炎沙门菌基因缺失株，构建同时缺失spiC基因(SEQ ID NO.1：AACGTTTATTTACTACCATTTTATACCCCACCCGAATAAAGTTTATGGTGATTGCGTATTACATTTTTTAAAATGCAAGTTAAAGCCAGGTGTTTTTCTATCTCAATAGCAATAAGCTCAGAGCTACTACTTGTGGTATAATAACCGTTTAACCATCCCCCATCCGCTGTGAGCTGTATAGCATAATCATGGACGTCCGGGTGTGCTGCAAGCAGTAGTGTCACATAGGCAAGACAAGGCTTAGGTAAGCTTTCCAGGTCATTTAAGAACAAAGAAATAGAAAATGCTTCTGAGAAAATTTCTCCTCTGGCAGGATGCCCATCAATAGTCATTATCCAGGATCGGCTATTACCTTCGGCCTTGATATCCTGAATTAATGCAATGCCTTTTAAAACTGCCAGCATGAATCCCTCCTCAGACATAAATGGGAGTTTCTATCAAATTCGCTCACAACCACATCCGTAAAAAGCCTGATTCACA)、purL基因(SEQ ID NO.2：TCTCAGGAGCTTAGCGAGGGTCTGGAGTGAAATGTAATGGCAACAATTAAAGATGTAGCGAAACGAGCAAACGTTTCCACTACAACTGTATCACACGTAATCAACAAAACGCGTTTTGTCGCTGAAGAAACGCGTAACGCGGTCTGGGCGGCAATTAAAGAGCTGCACTACTCTCCCAGCGCCGTCGCGCGTAGCCTGAAGGTTAACCATACCAAGTCGATAGGCTTACTGGCGACCAGCAGCGAAGCGGCCTATTTTGCCGAAATTATCGAGGCGGTTGAAAAAAACTGTTTCCAGAAAGGCTATACGCTGATTTTAGGCAACGCCTGGAATAACCTGGAAAAACAGCGCGCCTACCTGTCCATGATGGCGCAAAAGCGCGTGGATGGCCTGCTGGTGATGTGTTCTGAGTATCCAGAACCTCTGCTTTCCATGCTGGAAGAGTATCGCCATATTCCGATGGTGGTGATGGACTGGGGTGAAGCGAAGGCCGATTTTACCGACACGGTGATTGATAACGCCTTTGCAGGCGGCTATATGGCGGGTCGTTATCTGGTTGAGCGCGGCCACCGGGATATCGGCGTTATTCCCGGCCCGCTGGAGCGCAACACCGGCGCGGGCCGGCTGGCAGGCTTTATGAAAGCCATGGAGGAGGCGCTGATCAACGTGCCGGACAACTGGATTGTTCAGGGCGACTTCGAGCCGGAATCCGGTTACCACGCGATGCAGCAAATTTTATCGCAGTCACATCGCCCTACCGCCGTTTTCTGCGGCGGCGATATTATGGCGATGGGCGCGCTTTGCGCGGCTGACGAAATGGGGCTTCGCGTACCGCAGGACGTTTCGGTGATCGGTTATGACAATGTGCGTAACGCCCGTTACTTTACCCCGGCGCTGACGACGATTCACCAGCCCAAAGACTCTTTAGGCGAAACCGCATTTAATATGCTATTGGATCGCATCGTCAATAAGCGCGAAGAGTCACAGTCTATTGAAGTTCATCCACGCCTGGTTGAGCGTCGCTCGGTCGCTGACGGCCCGTTCCGCGACTATCGGCGTTAATCCCCGCTGTCGGGAGCC)、sifA基因(SEQ ID NO.3：ATTAATATGCCGATTACTATAGGGAATGGTTTTTTAAAAAGTGAAATCCTTACCAACTCCCCAAGGAATACGAAAGAAGCATGGTGGAAAGTTTTATGGGAAAAAATTAAAGACTTCTTTTTTTCTACTGGCAAAGCAAAAGCGGACCGTTGTCTACATGAGATGTTGTTTGCCGAACGCGCCCCCACACGAGAGCGGCTTACAGAGATTTTTTTTGAGTTGAAAGAGTTAGCCTGCGCATCGCAAAGAGATAGATTTCAGGTTCATAATCCTCATGAAAATGATGCCACCATTATTCTTCGCATCATGGATCAAAACGAAGAGAACGAATTGTTACGTATCACTCAAAATACCGATACCTTTAGCTGTGAAGTCATGGGGAATCTTTATTTTTTAATGAAAGATCGCCCGGATATTTTAAAATCGCATCCACAAATGACGGCCATGATTAAGAGAAGATATAGCGAAATCGTAGACTACCCCCTCCCTTCGACATTATGTCTCAATCCTGCTGGCGCGCCGATATTATCGGTTCCATTAGACAACATAGAGGGGTATTTATATACTGAATTGAGAAAAGGACATTTAGATGGGTGGAAAGCGCAAGAAAAGGCAACCTACCTGGCAGCGAAAATTCAGTCTGGGATTGAAAAGACAACGCGCATTTTACACCATGCGAATATATCCGAAAGTACTCAGCAAAACGCATTTTTAGAAACAATGGCGATGTGTGGATTAAAACAGCTTGAAATACCACCACCGCATACCCACATACCTATTGAAAAAATGGTAAAAGAGGTTTTACTAGCGGATAAGACGTTTCAGGCATTCCTCGTAACGGATCCCAGCACCAGCCAAAGTATGTTAGCTGAGATAATCGAAACCATCTCTGATCAGGTTTTTCACGCCATTTTTAGAATAGACCCCCAGGCTATACAAAAAATGGCGGAAGAACAGTTAACCACGCTACACGTTCGCTCAGAACAACAAAGCGGCTGTTTATGTTGTTTTTTATAAAAT)、trmE基因(SEQ IDNO.4：TGCAACAAAGTTGAGACTAACCATGAGCCATAACGACACTATCGTCGCCCAGGCAACCCCACCGGGACGCGGTGGCGTGGGTATCCTGCGTATTTCCGGTCTGAAGGCGCGCGACGTTGCGCAAGAGGTGCTGGGCAAGCTGCCGAAGCCGCGCTATGCCGACTACCTGCCGTTTAAAGATGTTGACGGCAGCGCGCTGGATCAGGGTATTGCGCTGTGGTTCCCCGGCCCGAACTCCTTCACCGGTGAAGATGTGCTGGAGCTACAAGGGCACGGCGGTCCGGTGATTCTGGACCTGCTGTTAAAACGTATCCTGACGCTTCCAGGCGTGCGCATTGCCCGACCGGGCGAGTTCTCCGAGCGAGCGTTCCTCAACGATAAGCTCGATTTAGCCCAGGCGGAAGCCATTGCCGACCTGATCGATGCCAGTTCCGAACAGGCGGCGCGTTCGGCGCTAAACTCGTTACAGGGGGCATTTTCCGCCCGCGTTAACCACCTTGTGGAAGCACTTACTCACCTGCGAATCTACGTCGAAGCGGCTATCGATTTTCCGGATGAGGAGATCGACTTTCTCTCTGACGGCAAAATCGAAGCGCAGCTCAATGGTGTCATCGCCGATCTTGACGCCGTGCGCACCGAAGCGCGCCAGGGCAGCCTGCTGCGCGAAGGGATGAAGGTAGTGATTGCCGGACGCCCGAATGCCGGGAAATCCAGCCTGCTGAATGCGCTGGCAGGCCGTGAAGCGGCCATTGTTACCGATATCGCCGGCACCACGCGCGACGTGTTGCGCGAGCATATTCACATCGACGGGATGCCGCTGCATATCATCGATACCGCCGGACTGCGCGACGCCAGCGACGAAGTTGAGCGTATCGGCATCGAACGCGCCTGGCAGGAGATTGAACAGGCCGATCGCGTGCTGTTTATGGTGGATGGCACCACGACGGACGCCGTTGACCCTGCCGACATCTGGCCGGACTTTATCGCCCGTCTGCCCAAAAATCTACCGATTACCGTGGTACGTAACAAGGCGGATATCACCGGCGAAACGTTGGGTATTAGTGAAGTAAACGGTCACTCACTGGTTCGCCTCTCGGCGCGTACCGGCGAAGGCGTCGACGTGTTGCGTAACCACCTCAAGCAGAGCATGGGGTTTGATACCAATATGGAAGGCGGCTTCCTGGCCCGCCGCCGTCACCTACAGGCGCTGGCGGAAGCCGCTGAACACCTTGAGCAGGGCAAAGCGCAGCTATTAGGCGCATGGGCGGGGGAACTGCTGGCGGAAGAGTTGCGCCTGGCGCAGCAAATCTTAAGCGAGATTACCGGCGAGTTTACCTCCGACGACCTGCTGGGACGGATTTTCTCCAGCTTCTGTATCGGCAAATAACGTTGTGTTGCCCGGTGGCGCGATGCTTACCGGGCCTACAAAACCCGTAAGCC)、rfbE基因(SEQ ID NO.5：GTGTCGGATCCGCACCATCCCCATATCCAGACGCACAACGCGTGGGTGGAGTTCCCTATCTTCGACGCCAAGTCACGTTCGCTGAAGAAGGCGGTCCTGGGTAAAGCGGGCGGCACCATCGGGCGCAACAACTCCAACGTCGTCGTCATCGAAGCGTTGCGCGACATCACCATGGAGCTGAACCTGGGTGACCGGGTCGGTCTGGTCGGACACAACGGAGCCGGCAAATCGACGCTGCTACGCCTGCTTTCGGGCATCTACGAGCCCACCCGCGGCTGGGCGAAGGTCACCGGAAGGGTGGCGCCGGTCTTCGATCTGGGCATCGGCATGGACCCCGAGATCTCCGGCTACGAGAACATCATCATTCGTGGGCTGTTTCTGGGACAGACCCGCAAACAGATGCAGGCGAAAGTGGATGAGATCGCCGAATTCACCGAATTGGGCGAGTACCTTTCGATGCCGCTGCGCACCTATTCCACCGGGATGCGAGTCCGCCTGGCGATGGGCGTGGTCACCAGCATCGACCCAGAGATCCTGTTGCTCGACGAAGGCATCGGCGCCGTGGACGCCGACTTCCTGAGGAAGGCCCAGTCCCGGCTGCAGAATTTGGTCGAACGTTCCGGGATCCTGGTTTTCGCAAGCCATTCCAACGAGTTTTTGGCTCGACTATGCAAGACCGCGATATGGATTGACCATGGCGTCATCAGGCTCGCCGGTGGTATCGAAGAGGTGGTACGGGCCTACGAGGGTGAGGACGCCGCCCGGCACGTGCGCGAAGTACTGGCCGAGACCCAGGCCGACAGACAGAACGTCCAGGGATGA)的肠炎沙门菌株。利用5个基因内外侧引物进行PCR验证。通过利用各基因外侧引物进行PCR，基因缺失株扩增条带小于亲本株扩增出条带；而利用内侧引物，缺失株没有扩增条带，亲本株则有扩增条带。

通过PCR内外侧引物及测序验证，证实了Z11ΔspiCΔpurLΔsifAΔtrmEΔrfbE成功构建，将两株基因缺失株简写见表1：

表1两株基因缺失株简写命名

1.1.1生化试验

挑取纯培养的单菌落，以革兰氏阴性生化鉴定卡鉴定其生化特性，结果如下表2所示。

表2生化特性鉴定

注：“+”代表阳性；“－”表示阴性

2.肠炎沙门菌Z11缺失株的筛选与鉴定

2.1肠炎沙门菌Z11缺失株的构建

2.1.1引物

根据GeneBank上已发表的沙门菌基因组序列(NC_011294.1)，用引物设计软件Primer 5.0设计出特异性的基因上下游同源臂序列，引物见表3：

表3用于PCR扩增的引物序列

注：下划线部分为与pDM4 Xba I酶切位点侧翼序列互补配对片段

2.1.2 spiC、purL、sifA、rfbE基因上下游同源片段的PCR扩增与纯化

将Z11于LB固体培养基上复苏，37℃培养20h。随后，挑取单菌落于含有4mL LB液体培养基的试管中，37℃，180rpm，振荡培养约12h。使用细菌DNA提取试剂盒按照说明书提取Z11的基因组，作为PCR扩增的模板，表2中的引物系列(基因内in/基因外侧out)进行PCR扩增，扩增反应体系如下表4所示：

表4 PCR反应体系

反应结束后，用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收各靶基因PCR产物，回收产物于-20℃保存。

2.1.3 pDM4质粒提取和酶切

pDM4质粒(addgene公司)于LB固体培养基(Cm，100μg/mL)上复苏，37℃培养箱内过夜培养。随后，挑取单菌落于含有相应抗生素的LB液体培养基中，37℃，180rpm，振荡培养约12h。1：50扩大培养，采用OMEGA(欧美加)公司质粒中提试剂盒提取pDM4质粒，随后使用XbaI限制性核酸内切酶进行酶切，酶切体系和反应条件如下表5所示。

表5酶切体系

通过DNA片段纯化试剂盒回收，pDM4质粒按体系酶切3次，回收产物于-20℃保存。

2.1.4质粒与目的片段的连接

pDM4质粒的酶切产物与各靶基因PCR回收的基因上下游同源片段，通过一步法连接酶进行连接。连接反应体系如下表6所示：

表6连接反应体系

2.1.5阳性重组菌的筛选

使用超级感受态试剂盒(购自上海生物工程有限公司)制备E.coliχ7213感受态，将spiC、purL、sifA、trmE、rfbE基因重组质粒热转入E.coliχ7213感受态中，即将基因重组片段与100μL感受态细胞混合，冰浴30min，热击45s，迅速将37℃预热的SOC培养基加入混匀，180rpm摇床内振荡培养2h。然后涂布于含Cm(50μg/ml)和DAP(50μg/ml)的LB固体培养基上，37℃过夜培养。用各基因的up-F、down-R(表2)引物以及进行PCR验证，筛选阳性重组菌。

2.1.6接合转移

将筛选得到的阳性重组菌接种于4mL(含Cm和DAP)的LB液体培养基中，将Z11接种于4mL的LB液体培养基中，180rpm，37℃过夜摇振培养。重组菌与Z11按1：1比例混匀，分装至1.5mL离心管中，4,500rpm，离心5min。弃上清，加入200μL的LB液体培养基重悬，滴于滤膜中央(置于含DAP的LB培养基上)，30℃培养24h-36h。用1ml的PBS将滤膜上的菌苔洗脱，梯度稀释到合适的浓度进行涂板(Cm，100μg/mL)。24h后出现菌落，挑取单菌落接种于4mL的LB肉汤(不含NaCl、含15％蔗糖)中，180rpm，37℃过夜摇振培养。将菌液离心稀释，涂布于含有15％蔗糖的LB培养基上。使用pDM4引物进行PCR鉴定单菌落。鉴定正确的菌落持续传代，直至pDM4质粒脱干净，并验证正确的菌落即为所求的缺失株Z11ΔspiCΔpurLΔsifAΔsifAΔrfbE，命名为SEΔ5-E。

实施例2肠炎沙门菌Z11突变株的安全型试验

安全性试验：7日龄SPF鸡的致死率试验

1、将实施例1制备的疫苗候选株SEΔ5-E与亲本株Z11的毒力比较

将SEΔ5-E和亲本株Z11分别接种于LB液体中，37℃培养12h，再扩大培养，将菌液以1：50比例加入LB液体中，37℃180rpm培养4h后，离心用无菌PBS洗涤，并调整细菌浓度，分别以1.0×10¹⁰CFU、1.0×10⁹CFU、1.0×10⁸CFU、1.0×10⁷CFU、1.0×10⁶CFU不同剂量肌肉注射感染7日龄雏鸡(江苏勃林格殷格翰维通生物技术有限公司)，100μL/羽，5羽/组，设立PBS对照组。连续观察2周记录死亡情况，计算半数致死量LD₅₀以评价菌株毒力。最大剂量组剂量对数值记作Xm，相邻一组剂量高剂量与低剂量之比的对数(相邻一组对数剂量的差值)记作i，各组动物死亡率总和用ΣP表示，LD50公式如下：LD50＝log-1[Xm-i(ΣP-0.5)]，结果如下表7所示：

表7疫苗候选株SEΔ5-E对SPF鸡LD₅₀测定

注：“—”表示阳性对照

SPF鸡的LD₅₀分析显示，基因缺失株SEΔ5-E的LD₅₀为5.0×10⁹CFU/羽，亲本株Z11的LD₅₀为5.0×10⁶CFU/羽，基因缺失株SEΔ5-E毒力相比于亲本株Z11下降了1,000倍。

2、肠炎沙门菌Z11对SPF鸡、海兰白鸡、京粉8号鸡的毒力的初步探索

将亲本株Z11分别接种于LB液，37℃培养12h，再扩大培养，将菌液以1：50比例加入LB液体中，37℃180rpm培养4h后，离心用无菌PBS洗涤，并调整细菌浓度，分别以1.0×10⁹CFU剂量肌肉注射感染7、14、21、28日龄的SPF鸡、海兰白鸡(南京药械厂)和京粉8号鸡，100μL/羽，10羽/组，设立PBS对照组，观察一周，结果如下表8所示。

表8 Z11对不同品种鸡的不同日龄的毒力评价

注：“—”表示无此项实验操作

结果分析显示：亲本株Z11对三种不同品种的鸡在不同的日龄都有很强的毒性，致死率为100％。

实施例3肠炎沙门菌Z11突变株SEΔ5-E在宿主体内的定殖试验

1、雏鸡的感染

将SEΔ5-E和Z11分别接种于LB液，37℃培养12h，再扩大培养，将菌液以1：50比例加入LB液体中，37℃180rpm培养4h后，用无菌PBS洗涤并调整细菌浓度为1.0×10⁶CFU，100μL/羽，肌肉注射免疫7日龄SPF雏鸡，空白组肌注无菌PBS。

2、脏器内细菌载量分析

分别在感染后d3、d7、d14、d21和d28处死实验鸡，3羽/组，无菌取脾脏、肝脏、盲肠，称重，加入1mL无菌的PBS充分匀浆。10倍梯度稀释，选取3个合适的稀释度(10^-3，10^-4，10^-5)，涂布于XLT4培养基，进行细菌计数，分析菌株在雏鸡内脏器官(脾脏、肝脏、盲肠)中的定殖与清除规律。结果如图1所示。

结果显示：SEΔ5-E接种雏鸡后，在第3、7、14、21天可在肝脏和脾脏中分离到细菌。SEΔ5-E在肝脏中的定殖周期维持在21d左右，随后即被机体清除；在脾脏中的定殖周期也维持在21d左右，随后即被机体清除。

3、体重差异分析

感染7日龄SPF雏鸡后观察，结果如图2所示。SEΔ5-E组的体重与空白对照组相比体重变化基本一致，均无显著性差异，表明五基因缺失接种雏鸡不影响其生长。

实施例4肠炎沙门菌Z11突变株SEΔ5-E的免疫保护试验

1、免疫原性试验：IgG抗体检测

实验方法：利用间接ELISA方法检测血清IgG效价。首先使用5％戊二醛(5mL 25％戊二醛加95mL 0.1mol/L NaHCO3)处理ELISA板条，100μL/孔，37℃孵育2h，蒸馏水洗涤3次，拍干去除水分。随后用无菌PBS将过夜培养肠炎沙门菌Z11刮下洗涤，并调整菌液浓度至1×10⁸CFU/mL。然后包被抗原，ELISA板条中加入细菌悬液，50μL/孔，置于56℃烘干。

封闭：ELISA板条加入预冷的的无水甲醇，100μL/孔，室温作用15min，无菌蒸馏水洗涤3次；每孔加入200μL 1％BSA，37℃孵育2h，PBST洗3次，每次5min，最后一次拍干。

加样：将待检血清样品按1:10稀释后加入稀释板中，将样品在孔中依次进行倍比稀释，随后转移到ELISA板条中，同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照，37℃孵育2h后，PBST洗涤5次，每次5min，最后一次拍干。

二抗孵育：加入HRP标记的兔抗鸡IgG抗体(工作浓度1:5,000)，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤7次，每次5min，最后一次拍干。

显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光显色10min。

终止：以2mol/L浓H₂SO₄溶液终止反应，50μL/孔。检测：使用全自动酶标仪测OD450nm值。结果如图3所示。

肠炎沙门菌疫苗候选株SEΔ5-E和Z11分别以1.0×10⁶CFU/羽的浓度接种SPF鸡后，在第3d、第7d、第14d、第21d、第28d对免疫后的雏鸡进行无菌采血，检测血清IgG抗体效价，结果显示免疫后2周可检测到IgG抗体，抗体水平也随之升高。

2、肠炎沙门菌Z11突变株SEΔ5-E免疫保护效力及10-100倍安全剂量评价实验

2.1肠炎沙门菌疫苗株SEΔ5-E及亲本株Z11的准备及免疫和攻毒

1、提前三天从-70℃复苏SEΔ5-E和Z11，挑取冻存菌液三区划线接种于LB固体平板，放置37℃恒温培养箱24h后，取出备用。

2、SPF雏鸡7日龄前一晚挑取SEΔ5-E单菌落接菌于4ml LB液体中，37℃180rpm培养12h后，再扩大培养，将菌液以1：50比例加入LB液体中，37℃180rpm培养4h后，离心用无菌PBS洗涤，并调不同浓度口服、肌肉注射7日龄SPF雏鸡。

3、21/28日龄前一晚挑取Z11单菌落接菌于4ml LB液体中，37℃180rpm培养12h后，再扩大培养，将菌液以1：50比例加入200ml LB液体中，37℃180rpm培养4h后，离心用无菌PBS洗涤并调整菌液浓度至1×1010CFU/ml，100μL/羽，肌肉注射21/28日龄SPF雏鸡。

(注：疫苗保护效率＝(对照组死亡率-接种组死亡率)/对照组死亡率×100％)

表9 SEΔ5-E不同免疫剂量在7日龄免疫21/28日龄鸡攻毒后免疫保护效率(肌注)

注：“—”表示无此项实验操作

表10 SEΔ5-E不同免疫剂量在7日龄免疫21/28日龄攻毒后免疫保护效率(口服)

注：“—”表示无此项实验操作

以1.0×10⁵CFU/羽、1.0×10⁶CFU/羽、1.0×10⁷CFU/羽的剂量，肌肉注射疫苗候选株SEΔ5-E免疫7日龄SPF雏鸡，同时设立对照组。观察发现疫苗候选株SEΔ5-E组注射点肌肉与空白组对比颜色状态均一致，直接攻毒亲本株Z11对照组出现肌肉坏死的显著现象。注射点观察结果(疫苗株-腿肌\亲本株-胸肌)见图4，图5。

以1.0×10⁵CFU/羽、1.0×10⁶CFU/羽、1×10⁷CFU/羽的剂量肌肉注射免疫7日龄SPF雏鸡疫苗候选株SEΔ5-E，同时设立对照组。观察发现疫苗候选株SEΔ5-E组肝脏脾脏表型与空白组对比一致，直接攻毒亲本株Z11对照组出现脾脏坏死、肿大等现象。肝脏、脾脏表型观察见图6，图7。

将接种疫苗候选株SEΔ5-E后的SPF鸡的肝脏、脾脏和盲肠制成病理切片，使用显微镜以200倍的放大倍数进行观察，结果如图8所示。接种疫苗候选株SEΔ5-E组与空白组相比，肝脏、脾脏和盲肠均无明显病变，亲本株Z11攻毒组与空白组相比其肠组织密度不均，严重的中性粒细胞浸润，脏器病变较为严重，局部出现坏死灶。

亲本株Z11感染鸡之后的血清与O₉商品化抗原产生凝集反应，而疫苗候选株免疫鸡之后的血清不发生凝集反应，说明疫苗株具有DIVA功能，能区分野生感染和疫苗接种的动物。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种多基因缺失的肠炎沙门菌，其特征在于，所述肠炎沙门菌同时缺失spiC基因、purL基因、sifA基因、trmE基因、rfbE基因中的两种或两种以上。

2.根据权利要求1所述的多基因缺失的肠炎沙门菌，其特征在于，所述肠炎沙门菌同时缺失spiC基因、purL基因、sifA基因、trmE基因、rfbE基因。

3.根据权利要求1或2所述的多基因缺失的肠炎沙门菌，其特征在于，所述spiC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述purL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述sifA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述trmE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述rfbE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求1或2所述的多基因缺失的肠炎沙门菌菌株的构建方法，其特征在于，包括步骤：将肠炎沙门菌Z11的spiC基因、purL基因、sifA基因、trmE基因、rfbE基因中的两种或两种以上敲除。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述敲除基因的方法采用同源重组的方法敲除基因。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述敲除基因的方法采用自杀质粒的方法敲除基因。

7.权利要求1或2所述的一种多基因缺失的肠炎沙门菌在制备肠炎沙门菌灭活疫苗中的应用。

8.一种肠炎沙门菌灭活疫苗，其特征在于，含有权利要求1或2所述的任一多基因缺失的肠炎沙门菌。